DE2842940A1 - Verfahren zur herstellung von sarcosin-oxidase - Google Patents

Verfahren zur herstellung von sarcosin-oxidase

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DE2842940A1 DE19782842940 DE2842940A DE2842940A1 DE 2842940 A1 DE2842940 A1 DE 2842940A1 DE 19782842940 DE19782842940 DE 19782842940 DE 2842940 A DE2842940 A DE 2842940A DE 2842940 A1 DE2842940 A1 DE 2842940A1
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Description

PATENTANWÄLTE
DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER · DR.-ING. ANNEKÄTE WEISERT DIPL-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE 15 · D-8O0O MÜNCHEN 71 ■ TELEFON 089/797077-797078 · TELEX 05-212156 kpatd
TELEGRAMM KRAUSPATENT
1987 WK/li
TOYO JOZO KABUSHIKI KAISHA, T a g a t a (Japan)
Verfahren zur Herstellung von Sarcosin-Oxidase
8Q9815/090S
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Herstellungsverfahren für Sarcosin-Oxidase.
Sarcosin-Oxidase (EC 1.5.3.1.Särcosin: Sauerstoffoxidoreductase (Demethylierung)) ist ein bekanntes Enzym, von dem man annimmt, daß es auf die folgende Reaktion einwirkt:
Särcosin + H2O + O2 -—> Glycin + HCHO + H2O2.
Dieses Enzym ist aus der Leber oder der Niere von Mäusen oder aus Kulturmassen von Mikroorganismen der Art Corynebacterium hergestellt worden.
Es würde nun gefunden, daß ein Enzym, das die oben beschriebene Reaktion katalysiert, von einem Bakterienstamm B-0618 der Art genus Bacillus, der aus einer in Sasaki, Pukuchiyama, Kyoto (Japan) gesammelten Erdgruppe isoliert worden ist, erzeugt wird. Es wurde das gereinigte Enzym isoliert.
Der Stamm B-Ö618 hat die folgenden taxonomischen Eigenschaften:
A. Makroskopische Beobachtung auf verschiedenen Medien, 18- bis 24-stündige Kultivierung bei 300C.
1. Bouillonagar-Schrägkultur Wachstum: Gut, fadenförmig Farbe der Kolonien: Grauweiß bis hellbraun Fast kein diffundierbares Pigment
2. Glucosebouillonagar-Schrägkultur Wachstum: Gut, fadenförmig Farbe der Kolonien: Grauweiß bis hellbraun Wenig diffundierbares Pigment
3. Bouillonbrühe
Kulturbrühe: Trüb und Sediment keine Bildung von Häutchen
909816/090$
4. Lakmusmilch
Alkalisierung in etwa 1 bis 2 Wochen
5. Bouillongelatine-Stab
Wachstum: Wächst auf der Oberfläche, schwache, aber trichterartige Verflüssigung
B. Mikroskopische Beobachtung
1. Gestalt und Größe der Zellen: Große und gerade Stäbe, 1,0 - 1,5 X 2,0 - 5 \im, runde Ecken, einfache oder doppelte Bindungen, manchmal kurze Bindungen
2. Polymorphismus: Nein
3. Motilität: Wimperartige Bewegung (beobachtet auf Bouillonagar-Schrägmedium bei 26 C, 18-stündige Kultivierung)
4. Sporen: Zylindrisch oder eikugelig (elliptisch), an der Mitte oder nahe an der Kante der Zelle. Kein Quellen durch die Sporen, 0,8 - 1,0 X 1,2 - 1,6 μΐη
5. Gram1sehe Färbung: Positiv
6. Säureechte Färbung: Negativ
C. Physiologische Eigenschaften: Nitratreduktion: Negativ Denitrifizierungsreaktion: Negativ MR-Test: Negativ VP-Test: Negativ Indolbildung: Negativ Hydrogensulfatbildung: Positiv Stärkehydrolyse: Negativ Gelatinehydrolyse: Positiv Caseinhydrolyse: Negativ Esculinhydrolyse: Negativ Cellulosehydrolyse: Negativ Citratverwertung, Simons-Medium: Negativ
Christensen-Medium: Positiv Nitratverwertung: Positiv Ammoniumverwertung: Negativ
909815/0906
Bildung von Ammonium aus Nitrat: Positiv Wachstums-pH: pH 6,4 bis 9f6 Wachstumstemperatur: 10 bis 42 C Halogentoleranz: NaCl 6,0 % Verhalten in Sauerstoff: aerobisch O-F-Test (Hugh Leifson-Medium): NT O-F-Test*: O (oxidative Zersetzung)
*O-F-Testmedium: Modifiziertes Medium
Aufgrund der Tatsache, daß aus Glucose keine Säure gebildet wurde und daß aus einem anderen Saccharid keine oder nur eine schwache Säurebildung erfolgte, wurde Glycerin als Zukker verwendet. NH4H3PO4 1,0 g, KCl 0,2 g, MgSO4-7H2O 0,2 g, Hefeextraktpulver 1,0 g, Agarpulver 3,0 g, Bromthymolblau (10%-ige wässrige Lösung) 10 ml, destilliertes Wasser 1000 ml, pH 7,2 bis 7,4.
Säure- und Gasbildung aus Zucker*1^ (Keine Gasbildung wurde beobachtet).
L-Arabinose: - Cellobiose: - Dulcit:
Erythrit: - Fructose: + (Säure) Galactose: -
Glucose: - Glycerin: + (Säure) Inocit:
Lactose: - Maltose: - Mannit: + (Säure)
Mannose: - Malecitose: - Melibiose: -
Raffinose: - L-Rhamnose: - Salicin:
L-Sorbose: - Sorbit: - Stärke:
Saccharose: - Trehalose: - Xylose: -
**Grundmedium: NH4H2PO4 1,0 g, KCl 0,2 g, MgSO4^H3O 0,2 g, Hefeextraktpulver 1,0 g, Agarpulver 3,0 g, Bromthymolblau (10%-ige wässrige Lösung) 10 ml, destilliertes Wasser 1000 ml, pH 7,2 bis 7,4
10 g Zucker wurden zugesetzt.
909815/0908
Unter Berücksichtigung der Angaben von Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage, 1974, wird der Stamm B-0618 mit den oben angegebenen taxonomisehen Eigenschaften, insbesondere der Eigenschaften, daß er grampositiv ist, daß ein sporenbildender großer Bazillus vorliegt, daß es sich um wimpernartig bewegende aerobe Bakterien handelt, daß eine Säurebildung aus Glucose erfolgt, als ein Stamm zur Art Bacillus betrachtet.
Nachstehend wird ein Vergleich des Stamms B-0618 mit den anderen ähnlichen Bakterien Bacillus badius, Bacillus freudenreichii und Bacillus macroides durchgeführt.
Bacillus badius ATCC-14574 (Typkultur)
Bacillus freudenreichii ATCC-7053 (Nichttypkultur, nichtursprünglicher Stamm) Bacillus macroides ATCC-12905 (Typkultur)
909815/0305
0-F Test Stamm B-0618 Bacillus
badius
ATCC-14574		 Bacillus
freuden-
reichii
ATCC-7053		 Bacillus
macroides
ATCC-12905		 Bemerkungen
0-F Test keine Säure
bildung		 keine
Säurebild.		 keine SäuJ
rebildung		 keine Säu
rebildung		 Hugh Leifson-
Medium
Katalase 0 0 keine Säu
rebildung		 keine Säu
rebildung		 0-F Testmedium
wie oben beschr.
Oxidase + + + +
urease + + + -
Gelatinverflüssigung + - + -
Stärkehydrolyse + + ( + ) -
Esculinhydrolyse + + + +
fr\. Indolbildung ( + ) - - -
oy H-S-Bildung - - - -
Acetonbildung + — — —
MR-Test - - - -
O Nitratreduktion - - - -
co Citratverwertung - - - -
Bildung von Säure aus Zuckern + + + +
O* Arabinose
Fructose - - - -
Galactose + - - -
Glucose - - - -
Glycerin - - - -
Inosit + + * - - spätere Alkalinisrg.
Lactose - - - -
Maltose - - - -
Mannit - - - -
Mannose + - - -
Sorbit - - - -
Saccharose - - - -
Trehalose - - - -
Xylose - - - -
- - - -
-P-ΙΌ CO
Die charakteristischen Eigenschaften auf Bouillonmedium waren wie folgt.
Stamm B-0618: Schwaches Wachstum, wollartiges Sediment ATCC-14574: Gleichförmig trüb, teilweises Sediment ATCC-7053: Schwaches Wachstum, wollartiges Sediment ATCC-12905: Schwaches Wachstum, gleichförmig trüb, teilweises Sediment
Es ergibt sich daher, daß die taxonomischen Eigenschaften des Stammes B-0618 sich in mehreren Punkten von denjenigen vergleichbarer Stämme in der folgenden Weise unterscheiden.
Bacillus badius ATCC-14574: Bildung von Urease, Säurebildung aus Glycerin (Säurebildung und spätere Alkalinisierung) und Mannit.
Bacillus freudenreichii ATCC-7053: Wachstum auf flüssiger Kultur und Ureasebildung (geringfügig ähnlich), Esculinhydrolyse, Säurebildung aus Fructose, Glycerin und Mannose. Der Stamm ATCC-7053 ist weder eine Typkultur noch ein ursprünglicher Stamm. Er kann daher nicht mit dem Stamm B-0618 identifiziert werden. Somit kann der Stamm nicht zu einer neuen Art gehören.
Der Stamm B-0618 wird daher als Bacillus sp. angesehen und als Bacillus sp. B-0618 bezeichnet. Dieser Stamm wurde beim Institute for Microbial Industry and Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, mit der Hinterlegungsnummer FERM-P Nr. 4049 hinterlegt. Der Stamm wurde auch beim ARS, USA, mit der Hinterlegungsnummer NRRL-3-^-11380 und bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen mit der Hinterlegungsnummer bS'H yf3 S'J hinterlegt.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung des Enzyms Sacrose-Oxidase zur Verfügung zu stellen. Bei dem
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COPY
erfindungsgemäßen Verfahren geht man so vor, daß man einen Sarcosin-Oxidase erzeugenden Mikroorganismus der Art genus Bacillus in einem Nährkulturmedium züchtet und die Sarcosin-Oxidase aus der Kulturmasse isoliert.
Durch die Erfindung wird weiterhin ein Sarcosin-Oxidase produzierender Mikroorganismenstamm Bacillus sp. B-0618 FERM-P Nr. 4049, NRRL B-11380 oder zur Verfügung gestellt.
Die Erfindung wird anhand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 den optimalen pH-Wert der Sarcosin-Oxidase,
Fig. 2 die optimale Temperatur der Sarcosin-Oxidase,
Fig. 3 die pH-Stabilität der Sarcosin-Oxidase,
Fig. 4 die Wärmestabilität der Sarcosin-Oxidase,
Fig. 5 das Ergebnis der quantitativen Analyse von Sarcosin durch Bestimmung von Formaldehyd,
Fig. 6 das Ergebnis der quantitativen Analyse von Sarcosin durch Bestimmung von Hydroperoxid.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird Bacillus sp. B-0618 FERM-P No. 4049 in einem herkömmlichen Medium für die Bildung von Antibiotika oder Enzymen gezüchtet. Für die technische Herstellung ist eine belüftete Untertauchkultur bevorzugt.
Vorzugsweise kann ein herkömmliches Medium für Mikroorganismen verwendet werden. Als Stickstoffquellen können assimilierbare Stickstoffquellen, wie Maisquellflüssigkeit, Sojabohnenpulver, Pepton, Fleischextrakte, Hefeextrakte, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid od.dgl., verwendet werden. Assimi-
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lierbare Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Molassen, Stärkehydrolysate und dgl., können vorzugsweise verwendet werden. Verschiedene anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Kaliumhydrogenphosphat oder KaIiumdihydrogenphosphat, werden gegebenenfalls verwendet. Die Zugabe von Creatin zu dem Medium, vorzugsweise von 0,5 bis 1%, stimuliert die Bildung von Sarcosin-Oxidase.
Die Kultivierungstemperatur kann innerhalb der Bereiche für das Wachstum von Mikrobenzellen und die Produktion eines Enzyms variiert werden. Sie beträgt vorzugsweise 26 bis 33°C. Die Kultivierungszeit kann je nach den Bedingungen variiert werden. Gewöhnlich beträgt sie 15 bis 25 Std. Die Kultivierung sollte naturgemäß beendigt werden, wenn die Sarcosin-Oxidase-Produktion praktisch vollständig ist.
Sarcosin-Oxidase liegt in den Zellen der Mikroorganismen
vor.
Die Extraktion der Sarcosin-Oxidase aus der Kulturmasse
kann beispielsweise wie folgt geschehen. Die Kulturmasse
wird zentrifugiert und die nassen Zellen werden in einem
Puffer, wie einem tris-HCl-Puffer, suspendiert und durch
Behandlung mit Lysozym, Beschallung oder mit einer franz.
Presse aufgebrochen. Die so erhaltene rohe Sarcosin-Oxidase wird durch herkömmliche Isolierungs- und Reinigungsmethoden für Proteine und Enzyme gereinigt. So wird z.B.,nachdem erforderlichenfalls die Nukleinsäure durch Zugabe von Protaminsulfat entfernt worden ist, vorzugsweise eine fraktionierte Ausfällung mit Aceton, Methanol, Äthanol oder Isopropanol und ein Aussalzen mit Ammoniumsulfat durchgeführt. Eine weitere Reinigung kann beispielsweise durch eine Chromatographie erreicht werden, bei der die rohe Sarcosin-Oxidase in tris-HCl-Puffer aufgelöst wird und unter Verwendung von Anionenaustauschern, beispielsweise eines Diäthylaminoäthylcellulose- oder -dextrangels und von Gelfiltrationsmitteln, wie Dextrangel oder Polyacrylamidgel, chromatographiert
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CiCiOV
- -TtT-
A1
wird. Gereinigte Sarcosin-Oxidase kann als lyophilisiertes Pulver gelagert werden.
Die erfindungsgemäße Sarcosin-Oxidase hat die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:
1. Enzymwirkung:
1 Mol Sarcosin verbraucht 1 Mol H2O und 1 Mol Sauerstoff und es erzeugt 1 Mol Glycin, 1 Mol Formaldehyd und 1 Mol Hydroperoxid. Das Enzym katalysiert die Oxidation von Sarcosin unter Bildung von Glycin und Formaldehyd.
CH3NHCH2COOH + O2 + H2O > H2NCH2COOH + HCHO + H3O2
Die Enzymuntersuchung wird wie folgt durchgeführt.
Zu einem Reaktionsgemisch (0,5 ml), bestehend aus 0,2 Mol tris-HCL-Puffer (pH 8,0 , 0,05 ml), r-Aminoantipyrin (3 mg/ ml, 0,05 ml), 0,2% Phenol (0,05 ml), Peroxidase (0,5 mg/ml, 0,05 ml), 1 Mol Sarcosin (0,1 ml) und destilliertem Wasser ( 0,2 ml), wird die Enzymlösung (10 μΐ) gegeben. Es wird 5 min. bei 37 C inkubiert. Äthanol (2,5 ml)wird zugesetzt, um die Reaktion zu beendigen. Die Bildung von Hydroperoxid wird kolorimetrisch mittels der Absorption bei 480 nm gemessen,
Eine Einheit (1 Einheit, 1 E) der Enzymaktivität ist als diejenige Enzymmenge definiert, die .1 μπι Hydro per oxid/min erzeugt.
2. SubstratspezifitätJ _
Zu einem Reaktionsgemisch (0,5 ml), bestehend aus 0,2 Mol tris-HCl-Puffer (pH 8,0, 0,05 ml), 4-Aminoantipyrin (3 mg/ ml, 0,05 ml), 0,2% Phenol (0,05 ml), Peroxidase (0,5 mg/ml,
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0,05 ml), destilliertem Wasser (0,2 ml) und den folgenden Substraten (0,5 Mol, 0,20 ml), wird Sarcosin-Oxidase (0,5 Einheit) und es wird 5 min. bei 37°C inkubiert. Äthanol (2,5 ml) wird zugesetzt, um die Reaktion zu beendigen. Es wird eine kolorimetrische Bestimmung bei 480 nm durchgeführt.
Die relative Aktivität auf mehrere Substrate ist wie folgt: Substrate Relative Aktivität
Sarcosin 100,0
Cholin 0
Betain 0,03
DimethyIglyein 0,01
Glycin 0,06
Serin 0
Threonin 0
Alanin 0
Valin 0
Lysin 0,09
N-Methyläthanolamin 0
N-Dimethyläthanolamin 0
3. Optimaler pH-Wert:
Um einen Effekt von 4-Aminoantipyrin-Phenol-Peroxidase auf Chromogen zu vermeiden, wird die Bildung von Aldehyd nach der Acety1acetonmethode bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt. Der optimale pH-Wert beträgt 8,0 bis 9,5.
Es werden folgende Pufferlösungen verwendet: pH 4 bis 7: Dimethylglutaratpuffer, pH 6 - 8: Phosphatpuffer, pH 7,5 - 9: tris-HCl-Puffer, pH 9 - 10: Glycin - NaOH-Puffer und pH 10 - 11: Natriumcarbonat - Boratpuffer.
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4. Optimale Temperatur:
Etwa 50°C, wie in Fig. 2 gezeigt. Substrat: Sarcosin.
5. pH-Stabilität:
Dimethylglutaratpuffer für pH 5 - 7, Phosphatpuffer für pH 6 - 8, tris-HCl-Puffer für pH 7,5 - 9, Glycin-NaOH-Puffer für pH 9 - 10 und Natriumcarbonat-Boratpuffer für pH 10-11 werden verwendet. Zu 0,1 ml von jedem Puffer werden 100 μΐ Enzymlösung (Protein 100 ug/ml) gegeben und es wird 60 min. bei 37 C stehengelassen. Nach dem Einstellen des pH-Werts durch Zugabe von 1,0 Mol tris-HCl-Puffer (pH 8,0, 0,3 ml) und Abnahme von 20 μΐ Probe wird die Enzymaktivität bestimmt. Sarcosin wird als Substrat verwendet. Wie in Fig. 3 gezeigt ist, beträgt der stabile pH-Wert etwa 6,0 - 10,0.
6. Wärmestabilität:
Die Wärmestabilität des Enzyms wird bestimmt, indem 10 mMol tris-HCl-Puffer (0,5 ml, pH 8,0), der das Enzym (Protein 20 μg/ml) enthält, bei verschiedenen Temperaturen 10 min. unter Verwendung von Sarcosin als Substrat inkubiert wird. Wie in Fig. 4 gezeigt ist, ist das Enzym unterhalb etwa 40 C stabil.
7. Molekulargewicht:
40 000 (gemessen nach der Gelfiltrationsmethode).
8. Isoelektrischer Punkt:
4,7 (Elektrophorese unter Verwendung eines trägerartigen Anpholyts).
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- Tr*-
1 ,0 5 ml
1 ,0 ,0 ml
200 ,0 U.
U.
8 ml
10 ml
9. Identifizierung und Bestimmung der Reaktionsprodukte:
a) Identifizierung von Glycin
Reaktionsgemisch
0,2 Mol tris-HCl-Puffer (pH 8,0
1 mMol Sarcosin Catalase
Sarcosin-Oxidase Destilliertes Wasser Insgesamt
Das obige Reaktionsgemisch (10 ml) wurde 60 min. bei 37°C inkubiert. Danach wurde die Reaktion abgebrochen, indem 5 min. bei 1000C erhitzt wurde. Der gebildete Niederschlag wurde abzentrifugiert und das überstehende Produkt wurde auf das 10-fache konzentriert und sodann auf ein Filterpapier als Fleck aufgebracht. Ein Chromatogram wurde mit wassergesättigtem Phenol über Nacht aufgenommen und durch Erhitzen nach Besprühen mit Ninhydrinlösung gefärbt. Der Rf-Wert wurde als 0,26 beobachtet.
Eine authentische Probe von Sarcosin und Glycin hatte einen Rf-Wert von 0,66 bzw. 0,26. Ein Fleck, der den obigen Rf-Wert hatte, wurde daher als Glycin identifiziert.
b) Bestimmung von Formaldehyd
Reaktionsgemisch
0,2 Mol tris-HCl-Puffer (pH 8,0) 0,05 ml Sarcosin mit aliquoter Konzentration 0,10 ml
Catalase 200 u. .
Sarcosin—Oxidase 3,0 u.
Destilliertes Wasser 0,35 ml
Insgesamt 0,50 ml
Das Reaktionsgemisch wurde 20 min. bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch 5-minütiges Erhitzen abgebrochen. Nach dem Abkühlen wurde Acetatpuffer (pH 5,5, 1,5 ml) zugesetzt. Wei-
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- TT-
terhin wurde die unten beschriebene Chromogenlösung (20 ml) zugesetzt. Nach einer 50-minütigen Inkubierung bei 37°C wurde die Lösung kolorimetrisch bei 412 nm gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 5 dargestellt. Die Bildung von Formaldehyd entspricht der Konzentration von Sarcosin.
Chromogen
Ammoniumacetat 15 g
Essigsäure 0,3 ml
Acetylaceton 0,2 ml
Wasser auf 100 ml
c) Bestimmung von Hydrogenperoxid
Hydrogenperoxid wurde quantitativ durch Kombination von 4-Aminoantipyrin-Phenol-Peroxidase bestimmt.
Reaktionsgemxsch
0,2 Mol tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0) 0,05 ml
3 mg/ml 4-Aminoantipyrin 0,05 ml
0,2% Phenol 0,05 ml
0,5 mg/ml Peroxidase 0,05 ml Sarcosin mit aliquoter Konzentration 0,10 ml
Sarcosin-Oxidase 3,0 u.
Destilliertes Wasser 0,2 ml
Insgesamt 0,5 ml
Das Reaktionsgemisch wurde 20 min. bei 37 C inkubiert. Nach der Zugabe von Äthanol (2,5 ml) wurde das Gemisch kolorimetrisch bei 480 nm gemessen. Wie in Fig. 6 gezeigt ist, entspricht die Bildung von Hydrogenperoxid der Konzentration von Sarcosin.
Wie vorstehend erläutert, katalysiert das Enzym Sarcosin-Oxidase die Oxidation, bei der Sarcosin mit Sauerstoff oxidiert wird (wobei 1 Mol Wasser pro 1 Mol Sarcosin verbraucht wird).
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Es werden Glycin, Formaldehyd und Hydrogenperoxid gebildet. Das Enzym wird daher als das Enzym EC 1.5.3.1 Sarcosin: Sauerstoff-Oxidoreductase (Demethylierung) bestätigt.
Die Sarcosin-Oxidase kann für ein enzymatisches diagnostisches Mittel eingesetzt werden, beispielsweise zur Bestimmung von Creatinin im Blut oder Urin,in Kombination mit Creatinase und Creatininase. Weiterhin kann die Sarcosin-Oxidase zur Bestimmung der Aktivität von Creatininase verwendet werden.
Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. Beispiel 1
Ein Medium (100 ml), enthaltend Creatin (0,5%), lösliche Fischstoffe (0,5%), Hefeextrakt (0,2%), KCl (0,3%), K2HPO4 (0,1%) und MgSO4«7H20 (0,05%) in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben, wurde 20 min. bei 1200C sterilisiert. Ein inokulierter Bacillus sp. B-0618 FERM-P No. 4049 wurde 1 Tag bei 300C als Impfkultür gezüchtet. Diese wurde in das gleiche sterilisierte Medium (20 1) in einen 30 1 Becherfermentator überführt. Es wurde 20 Std. bei 300C und bei 100 Upm sowie unter Belüften mit 20 l/min kultiviert. Die durch Zentrifugieren gesammelten Bakterienzellen (12 g) wurden mit 10 mMol Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und in der gleichen Pufferlösung suspendiert. Lysozym (Endkonzentration 0,2 mg/ml) wurde zugesetzt. Es wurde 30 min. bei 37°C gerührt. Das durch 15-minütiges Zentrifugieren mit 5000 Upm erhaltene überstehende Produkt wurde gesammelt (Sarcosin-Oxidaseaktivität: 1400 u.). Zu dem so erhaltenen überstehenden Produkt wurden 2% Protaminsulfatlösung (2,5 ml) gegeben. Der Nucleinsäureniederschlag wurde abgetrennt.
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Zu dem überstehenden Produkt wurde gesättigte Ammoniumsulfatlösung gegeben und der Niederschlag der Fraktionen der 50 70% Ammoniumsulfatkonzentration wurde gesammelt.
Der Niederschlag wurde in 10 mM tris-HCl-Puffer (pH 8,0, 20 ml) aufgelöst und durch eine Sephadex G-25 Säule (3,5 X 30 cm) entsalzt. Die entsalzte Lösung wurde in einer DEAE-Cellulose-Säule (2,0 X 18 cm, gepuffert mit 10 mM tris-HCl-Puffer, pH 7,0) behandelt, um das Enzym zu adsorbieren. Es wurde mit der gleichen Pufferlösung, die 0,1 Mol KCl enthielt, gewaschen und mit einem Gradient von 0,1 M - 0,5 M KCl-Lösung eluiert.
Die aktive Fraktion, die bei 0,36 M KCl eluiert worden war, wurde gesammelt und 10 Std. lang gegen die Lösung von 10 mM tris-HCl-Puffer (pH 8,0) dialysiert und hierauf gefriergetrocknet, wodurch pulverförmige Sarcosin-Oxidase erhalten wurde.
Gesamtaktivität: 540 Einheiten, Protein: 43 mg, spezifische Aktivität: 12,7 u./mg, Wiedergewinnung 38.6%.
Ende der Beschreibung.
909615/0906

Claims (3)

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von Sarcosin-Oxidase, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Sarcosin-Oxidase erzeugenden Mikroorganismus der Art genus Bacillus sp., insbesondere
den Mikroorganismus Bacillus sp. B-0618, FERM-P Nr. 4049 (OS/7 in einem Nährkulturmedium züchtet, und daß man die auf diese Weise hergestellte Sarcosin-Oxidase aus der Kulturmasse isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium Creatin enthält.
3. Sarcosin-Oxidase erzeugender Mikroorganismus Bacillus sp. B-0618 FERM-P Nr. 4049(i)S/7 Λ 3 Z-S),
90981 S/0906
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