DE3888989T2

DE3888989T2 - Stamm des Genus Thermus, neue Beta-galaktosidase und Verfahren zu dessen Herstellung.

Info

Publication number: DE3888989T2
Application number: DE3888989T
Authority: DE
Inventors: Kouki Horikoshi; Mitsunori Takase
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd; Research Development Corp of Japan; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; Morinaga Milk Industry Co Ltd; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1987-02-09
Filing date: 1988-02-09
Publication date: 1994-08-11
Anticipated expiration: 2008-02-10
Also published as: DE3888989D1; EP0279778A3; EP0279778B1; DK67188A; DK167774B1; DK67188D0; EP0279778A2; JPS63196267A; JPH0761265B2

Description

Diese Erfindung betrifft einen neuen, eine neue β- Galactosidase produzierenden, zur Gattung Thermus gehörenden Stamm, eine neue β-Galactosidase und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Die β-Galactosidase ist ein Enzym, das Lactose zu Glucose und Galactose abbaut und zur Herstellung von Nahrungsmitteln, beispielsweise von Milch mit hydrolysierter Lactose, einer Lösung mit hydrolysierter Lactose etc. verwendet wird. Die β-Galactosidase ist in Tieren und Pflanzen sowie in Mikroorganismen weit verbreitet, beispielsweise in Pilzen, Hefe, Bakterien etc., und die bisher in der Nahrungsmittelindustrie verwendeten β-Galactosidasen, die meistens von Pilzen oder Hefe stammen, weisen nur eine relativ geringe Hitzestabilität auf. Diese β-Galactosidasen sind in der im Amtsblatt bekanntgemachten jap. Patentveröffentl. Nr. 24094/1978 (Fall 1) und der offengelegten jap. Patentanmeld. (Kokai) Nr. 44287/1977 (Fall 2) beschrieben.
Andererseits sind hitzestabile β-Galactosidasen in Biotechnology and Bioengineering [Bd. 26 (1984), S. 1141] (Fall 3), in Journal of Applied Microbiology [Bd. 2 (1980), S. 390] (Fall 4), Canadian Journal of Microbiology [Bd. 22 (817), S. 817] (Fall 5), in der im Amtsblatt bekanntgemachten offengelegten jap. Patentanmeld. (Kokai) Nr. 154991/1981 (Fall 6) und in Journal of Bacteriology [Bd. 110 (1972), S. 691] (Fall 7) beschrieben. Diese bekannten β-Galactosidasen weisen jedoch alle einen oder mehrere der nachstehend beschriebenen Nachteile auf, beispielsweise eine geringe Hitzestabilität, einen engen optimalen pH-Bereich und der Hemmung der Enzymwirkung durch ein Reaktionsprodukt (vgl. Tabelle 2). Daher gibt es für die üblichen β-Galactosidasen keine praktische Verwendung.
Wie vorstehend beschrieben, sind die β-Galactosidasen, die bisher zur Herstellung von Nahrungsmitteln in industriellem Umfang verwendet wurden, Enzyme, die eine relativ geringe Hitzestabilität aufweisen, so daß der Abbau der Lactose üblicherweise bei 55ºC oder darunter durchgeführt wird. Milch oder eine Lactose-Lösung als Ausgangsmaterial ist außerdem eine bevorzugte Nährstoffquelle für Bakterien. Die Fäulnis aufgrund einer Verunreinigung mit Fäulniserregern während der Behandlung ist daher ein ernstes Problem bei der Herstellung von Nahrungsmitteln. Ferner führt eine immobilisierte β-Galactosidase nach Produktionsende dazu, daß sie nur unzureichend gewaschen und sterilisiert wird, was bei der Herstellung von Nahrungsmitteln ebenfalls ein ernstes Problem ist. Zur Lösung dieser Probleme muß ein Substrat mit einer hitzestabilen β-Galactosidase behandelt oder bei einer hohen, die Vermehrung von Fäulniserregern hemmenden Temperatur gewaschen und sterilisiert werden, und es besteht ein großer Bedarf nach der Entwicklung einer industriell verwendbaren hitzestabilen β- Galactosidase.
Zur Erfüllung dieses Bedarfs ist versucht worden, die vorstehend erwähnten, hitzestabile β-Galactosidase zu finden, und es wurden verschiedene hitzestabile β-Galactosidasen ermittelt. Es gibt jedoch keine durch übliche Verfahren erhältliche, hitzestabile β-Galactosidasen, die sämtliche unter den nachstehenden Punkten (1) bis (3) beschriebenen, für die industrelle Verwendung erforderlichen Enzymeigenschaften aufweisen. Das heißt, es gibt keine hitzestabile β-Galactosidase, deren Eigenschaften zur praktischen Verwendung ausreichend sind:

(1) Ausreichende Hitzestabilität:

Da Milch oder entfettete Milch bei einer Temperatur von 78 bis 80ºC koaguliert, muß die Enzymbehandlung bei einer möglichst weit unterhalb davon liegenden Temperatur durchgeführt werden. Daher muß das Enzym eine ausreichende Hitzestabilität bei etwa 70 bis 75ºC aufweisen.

(2) pH-Optimum etwa vom Neutralpunkt bis in den sauren Bereich:

Als Ausgangsmaterialien, die mit β-Galactosidase behandelt werden sollen werden Milch, entfettete Milch, Käsemolke, Lactoselösung etc. verwendet. Diese Ausgangsstoffe weisen einen neutralen (pH-Wert 6,5) bis sauren (pH-Wert 4,5) pH-Wert auf, und die Enzyme sollen daher ausreichende Enzymaktivitäten in diesem Bereich aufweisen.

(3) Geringe Hemmung (der Enzymaktivität durch Reaktionsprodukte:

Die Verringerung der Aktivität der β-Galactosidase durch die Reaktionsprodukte Galactose und Glucose muß bei der Wirkung des Enzyms auf Lactose klein sein.
Mit dem Ziel, eine β-Galactosidase mit den vorstehend beschriebenen Eigenschaften zu produzieren, wurde versucht, einen eine solche β-Galactosidase von Natur aus produzierenden Mikroorganismus rein zu isolieren. Es wurde festgestellt, daß von zahlreichen, β-Galactosidase produzierenden Mikroorganismen ein zur Gattung Thermus gehörender Mikroorganismus als ein extrem thermophiler Mikroorganismus die β-Galactosidase mit den vorstehend beschriebenen Eigenschaften produziert, und somit wurde die vorliegende Erfindung erhalten.
Ein erfindungsgemäßes Ziel betrifft die Bereitstellung eines neuen Mikroorganismus, der eine neue β- Galactosidase (hier nachstehend als "erfindungsgemäßes Enzym" bezeichnet) produziert, die eine hohe Hitzestabilität, ein pH-Optimum im neutralen bis sauren Bereich und eine Enzymaktivität aufweist, die durch die Reaktionsprodukte nicht verringert wird.
Ein weiteres erfindungsgemäßes Ziel betrifft die Bereitstellung des erfindungsgemäßen Enzyms und ein Verfahren zu dessen Herstellung.
Das heißt, die Erfindung betrifft die Bereitstellung eines neuen, zur Gattung Thermus gehörenden Stamms, der gekennzeichnet ist durch die Produktion einer neuen β- Galactosidase mit einem Temperaturoptimum von 75 bis 85ºC, einem pH-Optimum von 4,5 bis 6,5 und einer Enzymaktivität, die sich in Gegenwart von jeweils 50 mM Galactose und Glucose um 10 % oder weniger verringert, wenn die Messung bei pH 6,5 und 70ºC erfolgt, einer neuen β-Galactosidase, die gekennzeichnet ist durch ein Temperaturoptimum von 75 bis 85ºC, einem pH-Optimum von 4,5 bis 6,5 und einer Enzymaktivität, die sich in Gegenwart von jeweils 50 mM Galactose und Glucose um 10 % oder weniger verringert, wenn die Messung bei pH 6,5 und 70ºC erfolgt, und eines neuen Verfahrens zur Herstellung dieser neuen β-Galactosidase, das durch Züchtung dieses vorstehend beschriebenen, neuen, zur Gattung Thermus gehörenden Stamms gekennzeichnet ist.
Erfindungsgemäß kann eine β-Galactosidase mit einer hohen Hitzestabilität, einer Aktivität in einem weiten pH- Bereich und einer geringen Hemmung durch Reaktionsprodukte erhalten werden. Das heißt das erfindungsgemäße Enzym ermöglicht die Behandlung von Lactose enthaltenden Nahrungsmitteln, beispielsweise Milch, entfettete Milch, Käsemolke, Lactoselösung etc., bei einer hohen Temperatur, bei der die Fäulnis durch Fäulniserreger gehemmt ist. Dadurch wird die Steuerung des Produktionsverfahrens während der Behandlung der vorstehend beschriebenen Nahrungsmittel vereinfacht, was für die Nahrungsmittelindustrie von Bedeutung ist.
Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die angefügten Figuren genauer beschrieben, bei denen
Fig. 1 eine graphische Darstellung ist, die die Wirkung des pH-Werts auf das erfindungsgemäße Enzym zeigt,
Fig. 2 eine graphische Darstellung ist, die die Wirkung der Temperatur auf das erfindungsgemäße Enzym zeigt, und
Fig. 3 eine graphische Darstellung ist, die die Hemmung des erfindungsgemäßen Enzyms durch Reaktionsprodukte zeigt.

(1) Erhalt des Mikroorganismus

Aus Bodenproben, die überall im Land gesammelt worden waren, wurden gemäß Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Bd. 1; hier nachstehend als "das Handbuch" bezeichnet) zahlreiche Mikroorganismen isoliert, von denen bekannt war, daß sie β-Galactosidase produzieren. Diese Mikroorganismen wurden zur Erzeugung von β-Galactosidasen gezüchtet und die Produzierten β-Galactosidasen aus dem Medium isoliert. Aufgrund der Untersuchung ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften wurden drei die gewünschte β- Galactosidase produzierende Stämme, d. h., ZK-001, ZK-002 und ZK-003, isoliert. Die Identifizierung dieser Stämme gemäß dem vorstehend erwähnten Handbuch zeigte, daß sie alle aerob und keine Sporen bildenden Bacillen, unbeweglich, gramnegativ und Katalase-positiv waren und eine Wachstumstemperatur von 40 bis 80ºC, eine optimale Wachstumstemperatur von 65 bis 75ºC und ein pH-Optimum für das Wachstum um den Neutralpunkt aufwiesen, wodurch sie als Stämme identifiziert werden können, die zur Gattung Thermus gehörende Mikroorganismen sind. Andererseits wurden sie ausgehend von Testergebnissen bezüglich ihres Wachstums auf 2 % NaCl enthaltenden Flüssigmedien und ihrer Assimilation von Zucker als neue Mikroorganismen eingestuft, die sich von den bekannten zur Gattung Thermus gehörenden Mikroorganismen unterscheiden. Diese Stämme wurden beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, hinterlegt und die Stämme erhielten die nachstehend angegebenen Hinterlegungsnummern: FERM BP-1678 (Bikoken- kinki Nr. 9184) für Thermus sp. ZK-001, FERM BP-1679 (Bikoken-kinki Nr. 9185) für Thermus sp. ZK-002 und FERM BP- 1680 (Bikoken-kinki Nr. 9186) für Thermus sp. ZK-003. Die bakteriologischen Eigenschaften dieser Mikroorganismen sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Thermus sp. 1.Morphologische Eigenschaften Form Größe Mobilität Gramfärbung Flagellum Spore 2. Wachstum auf verschiedenen Medien* Agarplattenmedium Agarschrägmedium Flüssiges Medium Lackmusmilch Bacillus zirkulär, hervorstehend, orange flach, orange gewachsene Zellmasse fällt aus Keine Veränderung zirkulär, hervorstehend, gelb flach, gelb unregelmäßig zirkulär, flach, blaßgelb flach blaßgelb % NaCl enthaltendes flüssiges Medium 3. Wachstums-pH und -temperatur Wachstums-pH Wachstumstemperatur 4. Biochemische Eigenschaften Nitratreduktion Denitrifizierungsreaktion VP-Test Indolbildung Schwefelwasserstoffbildung Stärkehydrolyse Citronensäureverwertung Anorganische Stickstoffquellenverwertung Farbstoffbildung gebildet (orange) gebildet (gelb) gebildet (blaßgelb) Urease Oxidase Katalase O-F-Test Sauerstofferfordernis Gelatineverflüssigung 5. Assimilation von Zucker L-Arabinose D-Xylose D-Glucose D-Mannose D-Fructose D-Galactose Maltose Saccharose Lactose Kein Wachstum unter anaeroben Bedingungen Trehalose D-Sorbit D-Mannit Inosit Glycerin Stärke
In Tabelle 1 bedeutet *, daß Medien (pH-Wert 7,6) mit der nachstehend beschriebenen Zusammensetzung als essentielle Medien ohne Lackmusmilch verwendet wurden:
0,1 % Hefeextrakt, 0,1 % Trypton, 10,0 % anorganische Salzlösung (die 1,0 g Nitrilotriessigsäure 0,6 g CaSO&sub4; x 2 H&sub2;O, 1,0 g MgSO&sub4; x 7 H&sub2;O, 0,08 g NaCl, 1,03 g KNO&sub3;, 6,89 g NaNO&sub3; und 1,11 g Na&sub2;HPO&sub4; pro Liter Lösung enthielt), 1,0 % Eisenchloridlösung (die 0,28 g FeCl&sub3; x 6 H&sub2;O pro Liter Lösung enthielt), 1,0 % Lösung mit Spurenelementen (die 0,5 ml H&sub2;SO&sub4;, 2,2 g MnSO&sub4; x H&sub2;O, 0,5 g ZnSO&sub4; x 7 H&sub2;O, 0,5 g H&sub3;BO&sub3;, 0,016 g CuSO&sub4; x 5 H&sub2;O, 0,025 g Na&sub2;MoO&sub4; x 2 H&sub2;O und 0,046 g CoCl&sub2; x 6 H&sub2;O enthielt), 0,001 % Thiaminhydrochlorid, 0,001 % Nicotinamid, 0,001 % Biotin und 0,001 % p- Aminobenzoesäure.

(2) Erhalt des erfindungsgemäßen Enzyms

Die das erfindungsgemäße Enzym produzierenden Stämme werden in die nachstehend beschriebenen Medien inokkuliert und 12 bis 48 Stunden bei 50 bis 80ºC, vorzugsweise bei 65 bis 75ºC, aerob gezüchtet.
Die Medien enthalten neben einer Kohlenstoff- und Stickstoffquelle gegebenenfalls anorganische Salze und Spurenelemente. Als Kohlenstoffquelle können verschiedene allgemein bekannte Stoffe verwendet werden. Beispielsweise können Glucose, Maltose, Saccharose oder lösliche Stärke als typische Beispiele aufgezählt werden. Für die Wahl einer Stickstoffquelle gibt es ebenfalls keine besondere Beschränkung. Beispielsweise können organischer Stickstoff, beispielsweise Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Aminosäurelösung, Soyabohnenmehl etc. oder anorganischer Stickstoff, beispielsweise Ammoniumsulfat, Harnstoff, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid etc., als kostengünstige und leicht erhältliche Quellen erwähnt werden. Naturlich ist es selbstverständlich, daß die organische Stickstoffquelle sich zu einer Kohlenstoffquelle entwickeln kann. Neben solchen vorstehend beschriebenen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen können außerdem verschiedene, üblicherweise verwendete Salze zugesetzt werden, z. B. anorganische Salze, wie Magnesiumsalz, Kaliumsalz, Phosphat, Eisensalz etc. und Vitamine etc.. Als ein geeignetes Medium kann ein Flüssigmedium verwendet werden, das 0,2 % Glucose, 0,2 % Hefeextrakt, 0,2 % Trypton enthält, 10,0 % anorganische Salzlösung (die 1,0 g Nitrilotriessigsäure, 0,6 g CaSO&sub4; x 2 H&sub2;O, 1,0 g MgSO&sub4; x 7 H&sub2;O, 0,08 g NaCl, 1,03 g KNO&sub3;, 6,89 g NaNO&sub3; und 1,11 g Na&sub2;HPO&sub4; pro Liter Lösung enthält), 1 % Eisenchloridlösung (die 0,28 g FeCl&sub3; x 6 H&sub2;O pro Liter Lösung enthält), 1,0 % Lösung mit Spurenelementen (die 0,5 ml H&sub2;SO&sub4;, 2,2 g MnSO&sub4; x H&sub2;O, 0,5 g ZnSO&sub4; x 7 H&sub2;O, 0,5 g H&sub3;BO&sub3;, 0,016 g CuSO&sub4; x 5 H&sub2;O, 0,025 g Na&sub2;MoO&sub4; x 2 H&sub2;O und 0,046 g CoCl&sub2; x 6 H&sub2;O enthält), 0,001 % Thiaminhydrochlorid, 0,001 % Nicotinamid, 0,001 % Biotin und 0,001 % p-Aminobenzoesäure und einen mit NaOH auf 7,6 eingestellten pH-Wert hat.
Die Isolierung und Reinigung des erfindungsgemäßen Enzyms können beispielsweise wie nachstehend beschrieben durchgeführt werden. Die Zellmassen werden aus einem Kulturmedium durch Zentrifugation, Filtration etc. gewonnen, die erhaltenen Zellmassen in einem Puffer (z. B. in 10 mM Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,0) durch ein übliches Verfahren aufgebrochen und anschließend einer Extraktionsbehandlung unterzogen. Mit einem Überstand des erhaltenen Extrakts wurde zum Erhalt des erfindungsgemäßen Enzyms eine Chromatographie durchgeführt, beispielsweise die häufig verwendete Ionenauschtausch-, Gelfiltrations-Chromatographie etc..
Ein bevorzugtes Verfahren zur Gewinnung des erfindungsgemäßen Enzyms soll wie nachstehend beschrieben erläutert werden. Thermus sp. ZK-001 wird beispielsweise in 5 l eines wie vorstehend beschriebenen Mediums inokkuliert und anschließend 24 Stunden bei 70ºC aerob gezüchtet. Das erhaltene Kulturmedium wird zur Gewinnung der Zellmassen 30 Minuten bei 20ºC mit 12 000 x g zentrifugiert, wobei 55 g Zellmasse erhalten werden.
Den erhaltenen Zellmassen werden etwa 300 ml Phosphatpuffer (10 mM, pH-Wert 7,0) zur Extraktion zugesetzt. Die so behandelten Zellmassen werden zur Extraktion eines Enzyms in einer Mühle aufgebrochen. Der erhaltene Extrakt wird 60 Minuten mit 40 000 x g zentrifugiert und der erhaltene Überstand verwendet. Nach der Extraktion eines Niederschlags durch Zugabe von 200 ml des vorstehend beschriebenen Phosphatpuffers zur Extraktion wird der erhaltene Extrakt in ähnlicher Weise zentrifugiert und der Überstand gewonnen. So werden 480 ml Rohenzymextrakt einschließlich des vorstehend erhaltenen Überstands, erhalten. Diese Rohenzymlösung wird durch Zugabe von 187 g Ammoniumsulfat zu 60 % gesättigt und anschließend zur Niederschlagsbildung über Nacht stehen gelassen. Der Niederschlag wird durch 60-minütige Zentrifugation der so ausgefällten Rohenzymlösung mit 30 000 x g gewonnen. Der gesammelte Niederschlag wird in etwa 200 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst und anschließend gegen diesen Puffer dialysiert. Nachdem ein Niederschlag in der dialysierten Enzymlösung durch 60-minütige Zentrifugation der Lösung mit 40 000 x g verworfen worden ist, wird die so behandelte Enzymlösung auf eine mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) äquilibrierte DEAE- Toyopearl-Säule aufgetragen. Anschließend wird das Enzym gemäß dem Verfahren, in dem ein Konzentrationsgradient verwendet wird, mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0 bis 0,5 M NaCl enthält, eluiert. Die eluierten aktiven Fraktionen werden gesammelt und mit einem Ultrafilter konzentriert, wonach sie über Nacht unter Verwendung von 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,1 M NaCl enthält, dialysiert werden. Die so behandelte Enzymlösung wird zur Isolierung von drei aktiven Fraktionen unter Verwendung einer Sephacryl S-300-Säule gelfiltriert, die mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,1 M NaCl enthält, äquilibriert ist. Die gesammelten drei aktiven Fraktionen werden jeweils über Nacht unter Verwendung von 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert und anschließend auf Sepharose 4B-Säulen aufgetragen, an die mit diesem Puffer äquilibriertes p-Aminophenyl-β-D-thiogalactopyranosid kovalent gebunden ist. Nachdem diese Säulen mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) sorgfältig gewaschen worden sind, wird 0,1 M Boratpuffer durch diese Säulen geleitet, wodurch aktive Fraktionen eluiert und isoliert werden. Die so erhaltenen drei aktiven Fraktionen werden jeweils gereinigt, wobei einzelne Banden in der Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Gelkonzentration: 7,5 %, pH 9,5) erhalten werden. Als Ausbeute an erhaltenem Enzympräparat wird eine Gesamtmenge der drei Enzyme von 3,4 mg erhalten und die Aktivitätsausbeute erreicht 12 %. Das erfindungsgemäße Enzym kann im Hinblick auf die zwei anderen Stämme auch in der gleichen, vorstehend beschriebenen Weise unter unterschiedlich veränderten Kulturbedingungen erhalten werden.

(3) Eigenschaften des erfindungsgemäßen Enzyms

Die Enzymeigenschaften des entsprechend dem Verfahren der Erfindung produzierten erfindungsgemäßen Enzyms sind wie nachstehend beschrieben:

A. Wirkung:

Hydrolyse von Lactose in Galactose und Glucose.

B. Substratspezifität:

Hydrolyse von Lactose, jedoch keine Hydrolyse von Saccharose, Melibiose, Raffinose und Maltose.

C. pH-Optimum und stabiler pH-Bereich:

pH-Optimum ist 4,5 bis 6,5. Stabil im pH-Bereich von 4,0 bis 8,0 für 24 Stunden bei 55ºC. (vgl. die graphische Darstellung in Fig. 1, die die Wirkung des pH-Werts auf die Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms zeigt).

D. Hitzestabilität:

Bei einem pH-Wert von 7,0 bleiben nach 1-stündiger Erwärmung auf 80ºC 100 % Aktivität und nach 1-stündiger Erwärmung auf 85ºC 85 % Aktivität erhalten.

E. Bereich des Temperaturoptimums:

Ein Temperaturoptimum im Bereich von 75 bis 85ºC (vgl. die graphische Darstellung in Fig. 2, die die Wirkung der Temperatur auf die Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms zeigt).

F. Wirkung anorganischer Salze:

Die Enzymaktivität wird durch jeweils 1 mM Eisenchlorid, Manganchlorid, Calciumchlorid und Magnesiumsulfat nicht verändert, sie wird jedoch durch 1 mM Zinkchlorid bzw. Kupfersulfat um 10 % bzw. 30 % verringert.

G. Hemmung durch Reaktionsprodukte:

Die Enzymaktivität wird durch jeweils 50 mM Galactose und Glucose um 10 % oder weniger verringert (vgl. die graphische Darstellung in Fig. 3, die die Hemmung des erfindungsgemäßen Enzyms durch das Reaktionsprodukt zeigt).

H. Molekulargewicht: 55 000 Dalton.

Die Bestimmung des Molekulargewichts des erfindungsgemäßen Enzyms gemäß der Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung einer Sephacryl S-300-Säule (1,6 cm x 100 cm) liefert Werte, die 55 000 ± 5 000 Dalton, 110 000 ± 10 000 Dalton und 440 000 ± 40 000 Dalton entsprechen.
Die physikalisch-chemischen und enzymatischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Enzyms und der von allgemein bekannten Mikroorganismen stammenden β-Galactosidase (Enzyme der vorstehend beschriebenen Falle 1 bis 7) sind in Tabelle 2 im Vergleich dargestellt.
Die Verfahren zur Messung und Anzeige der Aktivität sind wie nachstehend beschrieben.
0,1 ml der erfindungsgemäßen Enzymlösung werden zu 2,4 ml eines 0,1 M Phosphatpuffers (pH 6,5) zugesetzt, der 1,50 % o-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranosid (hier nachstehend als "ONPG" bezeichnete, enthält, und die Reaktion erfolgt 10 Minuten bei 70ºC. Anschließend wird die Reaktion durch Zugabe von 2,5 ml 10 % Na&sub2;CO&sub3;-Lösung beendet. Die gebildete Menge o-Nitrophenol wird aus der Absorption bei 420 nm erhalten und die Enzymmenge, die 1 umol o-Nitrophenol pro Minute freisetzt, wird als eine Einheit definiert.
Wie in Tabelle 2 dargestellt, unterscheiden sich die enzymologischen und physikalisch-chemischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Enzyms von denen sämtlicher bekannter β-Galactosidasen. Das erfindungsgemäße Enzym vereinigt die Eigenschaften einer besonders hohen Hitzestabilität, eines weiten optimalen pH-Bereichs und einer geringen Hemmung durch Reaktionsprodukte. Das heißt, das erfindungsgemäße Enzym weist ausgezeichnete Eigenschaften auf, die die üblichen Enzyme nicht besitzen. Somit ist das erfindungsgemäße Enzym zur Verarbeitung von verschiedenen, Lactose enthaltenden Nahrungsmitteln, wie Milch, entfettete Milch, Käsemolke, Lactoselösung etc. bei hoher Temperatur geeignet, und somit eine industriell nützliche β-Galactosidase.
Die vorliegende Erfindung wird hier nachstehend an Hand von Beispielen genauer beschrieben. Der Schutzbereich der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht auf die nachstehend beschriebenen Beispiele beschränkt.

Beispiel 1

Thermus sp. ZK-001 (FERM BP-1678) wurde in 10 l Flüssigmedium inokkuliert, das 0,2 % Glucose, 0,2 % Hefeextrakt, 0,2 % Trypton, 10,0 % anorganische Salzlösung (die 1,0 g Nitrilotriessigsäure, 0,6 g CaSO&sub4; x 2 H&sub2;O, 1,0 g MgSO&sub4; x 7 H&sub2;O, 0,08 g NaCl, 1,03 g KNO&sub3;, 6,89 g NaNO&sub3; und 1,11 g Na&sub2;HPO&sub4; pro Liter Lösung enthielt), 1 % Eisenchloridlösung (die 0,28 g FeCl&sub3; x 6 H&sub2;O pro Liter Losung enthielt), 1,0 % Lösung mit Spurenelementen (die 0,5 ml H&sub2;SO&sub4;, 2,2 g MnSO&sub4; x H&sub2;O, 0,5 g ZnSO&sub4; x H&sub2;O, 0,5 g H&sub3;BO&sub3;, 0,016 g CuSO&sub4; x 5 H&sub2;O, 0,025 g Na&sub2;MoO&sub4; x 2 H&sub2;O und 0,046 g CoCl&sub2; x 6 H&sub2;O enthielt), 0,001 % Thiaminhydrochlorid, 0,001 % Nicotinamid, 0,001 % Biotin und 0,001 % p-Aminobenzoesäure enthielt und einen mit NaOH auf 7,6 eingestellten pH-Wert aufwies, und anschließend 24 Stunden bei 70ºC unter Belüftung in einem 20 l Flaschen-Fermenter gezüchtet. Die Enzymaktivität der Kulturlösung war 0,84 Einheiten/ml.
Diese Kulturlösung wurde zur Gewinnung der Zellmassen 30 Minuten bei 20ºC mit 12 000 x g zentrifugiert, wobei 107 g Zellmasse erhalten wurden. Den erhaltenen Zellmassen wurden etwa 600 ml Phosphatpuffer (10 mM, pH-Wert 7,0) zur Extraktion zugesetzt. Die so behandelten Zellmassen wurden in einer Mühle aufgebrochen, um ein Enzym zu extrahieren. Der Extrakt wurde 60 Minuten mit 40 000 x g zentrifugiert und der erhaltene Überstand verwendet. Nach der Extraktion eines Niederschlags durch Zugabe von 400 ml des vorstehend beschriebenen Phosphatpuffers zur Extraktion, wurde der Extrakt in ähnlicher Weise zentrifugiert und der Überstand gewonnen. So wurden 975 ml Rohenzymextrakt, einschließlich des vorstehend erhaltenen Überstands, erhalten. Diese Rohenzymlösung wurde durch Zugabe von 380 g Ammoniumsulfat zu 60 % gesättigt und anschließend zur Niederschlagsbildung über Nacht stehen gelassen. Der Niederschlag wurde anschließend durch 60-minütige Zentrifugation mit 30 000 x g gewonnen. Der gewonnene Niederschlag wurde in etwa 30 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst und anschließend gegen diesen Puffer dialysiert. Nachdem ein Niederschlag in der dialysierten Enzymlösung durch 60-minütige Zentrifugation der Lösung mit 40 000 x g entfernt worden war, wurde die erhaltene Enzymlösung auf eine mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) äquilibrierte DEAE-Toyopearl-Säule (5 cm x 45 cm) aufgetragen. Anschließend wurde das Enzym gemäß dem Verfahren, in dem ein Konzentrationsgradient verwendet wird, mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0 bis 0,5 M NaCl enthielt, eluiert. 48,0 ml der eluierten aktiven Fraktion wurden unter Verwendung eines Ultrafilters (PM-10, Amicon Corp.) konzentriert und das erhaltene Konzentrat über Nacht unter Verwendung von 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,1 M NaCl enthielt, dialysiert. Die so behandelte Enzymlösung wurde durch eine Sephacryl S-300-Gelfiltrationssäule (2,6 cm x 95 cm) geleitet, die mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,1 M NaCl enthielt, äquilibriert war, wobei drei aktive Fraktionen isoliert wurden. Diese drei Fraktionen wurden vereinigt, über Nacht unter Verwendung von 10 mM Phosphatpuffer dialysiert und anschließend auf eine Sepharose 4B-Säule aufgetragen, an die mit diesem Puffer äquilibriertes p-Aminophenyl-β-D-thiogalactopyranosid kovalent gebunden war. Nachdem diese Säule mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) sorgfältig gewaschen worden war, wurde 0,1 M Boratpuffer durch die Säule geleitet, wodurch aktive Fraktionen eluiert und isoliert wurden. Als Ausbeute wurden 8,5 mg des erfindungsgemäßen Enzyms erhalten.

Beispiel 2

Thermus sp. ZK-002 wurde in 10 l des gleichen Mediums wie in Beispiel 1 inokkuliert mit der Ausnahme, daß 0,2 % lösliche Stärke anstelle von Glucose verwendet wurden. Die Züchtung wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei (0,64 Einheiten/ml Kulturlösung erhalten wurden. Die Reinigung wurde danach in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei etwa 6,8 mg des erfindungsgemäßen Enzyms erhalten wurden.

Beispiel 3

Thermus sp. ZK-003 wurde in 10 l eines Mediums inokkuliert, das die gleiche wie in Beispiel 1 beschriebene Zusammensetzung aufwies, und unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 gezüchtet, wobei 0,68 Einheiten/ml Kulturlösung erhalten wurden. Die Reinigung wurde danach in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei etwa 7,3 mg des erfindungsgemäßen Enzyms erhalten wurden.
In dieser Erläuterung und in den Ansprüchen bedeutet das Symbol "mM" "Millimol pro Liter". Tabelle 2-1 Erfindungsgemäßes Enzym Enzym von Fall Stamm Temperaturoptimum der Enzymreaktion Hitzestabilität des Enzyms pH-Optimum der Enzymreaktion Hemmung durch das Reaktionsprodukt Molekulargewicht (Dalton) Thermus sp. 15 % Inaktivierung nach 1 Std. bei 85ºC; keine Inaktivierung nach 1 Std. bei 80ºC. Hemmung von 10 % oder weniger durch jeweils 50 mM Galactose und Glucose Kluyveromyces lactis 45 % Inaktivierung nach 10 min bei 50ºC; und 100 % nach 10 min bei 55ºC. Nicht bestimmt Aspergillus oryzae 50 % Inaktivierung nach 15 min bei 50ºC Stamm Thermus 4-1A 72 % Inaktivierung nach 20 min bei 85ºC und 25 % nach 20 min bei 75ºC. Hemmung von 52 % durch 56 mM Galactose und 63 % durch 56 mM Glucose Tabelle 2-2 Enzym von Fall Stamm Temperaturoptimum der Enzymreaktion Hitzestabilität des Enzyms pH-Optimum der Enzymreaktion Hemmung durch das Reaktionsprodukt Molekulargewicht (Dalton) Caldarilla acidophila 50 % Inaktivierung nach 55 Std. bei 85ºC und 50 % nach 55 Std. bei 70ºC. Keine Hemmung durch 100 mM Galactose bzw. Glucose Nicht bestimmt Bacillus stearothermophilus 60 % Inaktivierung nach 10 min bei 60ºC. Hemmung von 20 % durch 10 mM Glucose bzw. 71 % durch 10 mM Galactose Thermus thermophilus 20 % Inaktivierung nach 20 min bei 90ºC und 5 % nach 20 min bei 85ºC; keine Inaktivierung nach 150 min bei 80ºC. Thermus aquaticus 55 % Inaktivierung nach 30 min bei 90ºC und 28 % nach 30 min bei 80ºC.

Claims

1. Neuer Stamm der Lattung Thermus, gekennzeichnet durch die Produktion einer neuen β-Galactosidase mit einem Temperaturoptinum von 75 bis 85ºC, einem pH-Optimum von 4,5 bis 6,5 und einer Enzymaktivität, die in Gegenwart von jeweils 50 mM Galactose und Glucose um 10 % oder weniger erniedrigt ist, denn die Messung bei pH 6,5 und 70ºC erfolgt.

Neuer Stamm der Gattung Thermus nach Anspruch 1, wobei der neue Stamm mindestens die folgenden bakteriologischen Eigenschaften aufweist:

A. Morphologische Eigenschaften:

Form Bacillus

Mobilität -

Gramfärbung -

Flagellum -

Spore -

Säurebeständigkeit -

Größe 0,4 0,6 um x 2-7 um

B. Wachstum auf verschiedenen Medien:

Agarplattenmedium zirkulär bis unregelmäßig zirkulär, hervorstehend bis flach, blaßgelb bis orange

Agarschrägmedium glatt, blaßgelb bis orange

flüssiges Medium gewachsene Zellmasse fällt aus

Lackmusmilch keine Änderung

5 % NaCl enthaltendes flüssiges Medium -

2 % NaCl enthaltendes flüssiges Medium +

C. Wachstums-pH und -temperatur:

Wachstums-pH 5,5 8,5

Wachstumstemperatur 40 80ºC

D. Biochemische Eigenschaften:

Nitratreduktion +

Denitrifizierungsreaktion ±

VP-Test -

Indolbildung -

Schwefelwasserstoffbildung -

Stärkehydrolyse ±

Citronensäureverwertung -

Anorganische Stickstoffquellenverwertung +T(NH&sub4;)

Farbstoffbildung gebildet (gelb, orange)

Urease -

Oxidase +

Katalase +

O-F-Test 0

Sauerstofferfordernis Wächst nicht unter anaeroben Bedingungen

E. Assimilation von Zucker:

D-Glucose +

D-Mannose +

D-Fructose +

Maltose +

Saccharose +

Lactose +

Trehalose +

Glycerin -

Stärke -

3. Neuer Stamm der Gattung Thermus nach Anspruch 1 oder 2, wobei der neue Stamm ausgewählt ist aus FERM BP-1678 (Bikoken-kinki Nr. 9184), FERN BP-1679 (Bikoken-kinki Nr. 9185) und FERM BP-1680 (Bikoken-kinki Nr. 9186).

4. Neue β-Galactosidase, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Temperaturoptimum von 75 bis 85ºC, ein pH-Optimum von 4,5 bis 6,5 und eine Enzymaktivtät aufweist, die in Gegenwart von jeweils 50 mMol Galactose und Glucose um 10 % oder weniger erniedrigt ist, wenn die Messung bei pH 6,5 und 70ºC erfolgt.

5. Neue β-Galactosidase nach Anspruch 1, wobei die neue β- Galactosidase die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften aufweist:

A. Wirkung:

hydrolysiert Lactose in Galactose und Glucose.

B. Substratspezifität:

hydrolysiert Lactose, aber nicht Saccharose, Melibiose, Raffinose und Maltose.

C. pH-Optimum und pH-Stabilitätsbereich:

pH-Optimum bei 4,5 bis 6,5. Stabil in einem pH-Bereich von 4,0 bis 8,0 über einen Zeitraum von 24 Stunden bei 55ºC.

D. Hitzestabilität:

Bei pH 7,0 bleiben 100 % der Enzymaktivität nach 1stündigem Erhitzen auf 80ºC und 85 % der Enzymaktivität nach 1stündigem Erhitzen auf 85ºC erhalten.

E. Temperaturoptimumbereich:

Temperaturoptimum in einem Bereich von 75 bis 85ºC.

F. Wirkung von anorganischen Salzen:

Die Enzymaktivität verändert sich nicht durch 1 mM Eisen(III)-chlorid, Manganchlorid, Calciumchlorid und Magnesiumsulfat, aber wird durch 1 mM Zinkchlorid und Kupfersulfat um 10 % bzw. um 30 % erniedrigt.

G. Hemmung durch Reaktionsprodukte:

Die Erniedrigung der Enzymaktivität durch 50 mM Galactose bzw. Glucose beträgt 10 % oder weniger.

H. Molekulargewicht: 55 000 Daltons.

6. Verfahren zur Herstellung einer neuen β-Galactosidase, gekennzeichnet durch die Züchtung eines Stammes der Gattung Thermus, der eine neue β-Galactosidase produziert mit einem Temperaturoptimum von 75 bis 85ºC, einem pH- Optimum von 4,5 bis 6,5 und einer Enzymaktivität, die in Gegenwart von jeweils 50 mM Galactose und Glucose um 10 % oder weniger erniedrigt ist, wenn die Messung bei pH 6,5 und 70ºC erfolgt, und Gewinnung der produzierten β- Galactosidase.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Züchtung aerob bei einer Temperatur von 50 bis 80ºC durchgeführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Züchtung bei einem pH-Wert von 6 bis 8,5 durchgeführt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 6, 7 oder 8, wobei der Stamm der Gattung Thermus FERN BP-1678 (Bikoken-kinki Nr. 9184), FERN BP-1679 (Bikoken-kinki Nr. 9185) oder FERN BP-16808 (Bikoken-kinki Nr. 9186) oder deren Gemisch ist.

10. Verfahren zur Produktion von Galactose und Glucose aus Lactose, umfassend die Verwendung eines Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einer β-Galactosidase, die gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9 hergestellt wurde.