DE2924470C2 - Lactatoxidase und ihre Herstellung - Google Patents
Lactatoxidase und ihre HerstellungInfo
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Description
2. Verfahren zur Herstellung der Lactatoxidase des Anspruchs 1, dadurch gekennzeichnet, daß man
Pediococcus sp. FERM BP-465, Streptococcus sp. FERM BP-466, Aerococcus viridans IFO-12 219 oder
Aerococcus viridans IFO-12 317 in einem Kulturmedium züchtet und die gebildete Lactatoxidase aus dem
Kulturmedium abtrennt.
Die Erfindung betrifft eine neue Lactatoxidase und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Lactatoxidase (L-Lactat: Sauerstoffoxidoreductase, E.C. 1.132) ist ein bekanntes Enzym, das die Reaktion von
Milchsäure und Sauerstoff unter Bildung von Essigsäure, Kohlendioxid und Wasser katalysiert:
CH3CH(OH)COOH + O2^CH3COOH + CO2 + H2O
und das in der Vergangenheit aus dem Stamm Mycobacterium phlei (E Bakman, Enzyme Handbook, Bd. 1, S.
111,1979) und Mjcobacterium avium (Nature, 170,207) erhalten worden ist
Der Erfindung liegt die Aufgabi zugrunde, eine neue Lactatoxidase zur Verfügung zu stellen, die mindestens
eine Substratspezifizität für Milchsäure aufweist und die Reaktion der Gleichung (1):
L-Milchsäure + O2- Brenztraubensäure + H2O2 (I)
katalysiert.
Erfindungsgemäß soll weiterhin ein Verfahren für die Herstellung der neuen Lactatoxidase jmt Verfügung
gestellt werden.
Es wurde nun gefunden, daß eine neue Lactatoxidase die Reaktion von Lactat zu Pyruvat katalysiert und eine
stöchiometrische Menge von Wasserstoffperoxid erzeugt. Das Enzym kann durch Züchtung von bestimmten
Bakterienstämmen, die zum Genus Pediococcus, Genus Streptococcus und Genus Aerococcus gehören, erzeugt
werden.
Die Erfindung betrifft eine Lactatoxidase, die durch die folgenden Eigenschaften gekennzeichnet ist:
Die Erfindung betrifft eine Lactatoxidase, die durch die folgenden Eigenschaften gekennzeichnet ist:
(a) Substratspezifizität: L-Milchsäure;
(b) Enzymwirkung: sie katalysiert die folgende Reaktion (1)
so L-Milchsäure + O2-* Brenztraubensäure + H2O2 (I);
(c) optimalerpH:6bis7;
(d) optimale Temperatur: 35°C;
(e) isoelektrischer Punkt: pH 4,6 ±03 (bestimmt durch Elektrophorese unter Verwendung eines Trägerampholiten)
und
(f) Molekulargewicht: 80 000± 10 000 (bestimmt durch Gelfiltrationsverfahren unter Verwendung von SephadexG-150).
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Lactatoxidase wie oben definiert, das
dadurch gekennzeichnet ist. daß man Pediococcus sp. FERM BP-465, Streptococcus sp. FERM BP-466, Aerococcus
viridans IFO-12 219 oder Aerococcus viridans IFO-12 317 in einem Kulturmedium züchtet und die gebildete
Lactatoxidase aus dem Kulturmedium abtrennt.
Die neue erfindungsgemäße Enzymlactatoxidase besitzt wesentlich andere Eigenschaften als das obige bekannte
Enzym. Sie katalysiert die folgende Reaktion (I):
CH]CH(OH)COOH + O2 — CH3COCOOH + H2O2 (I)
L-Milchsäure Brenztraubensäure
Das Enzym erfordert nicht die Zugabe von Coenzymen bei seiner Reaktion und es katalysiert direkt die
Reaktion der Substratmilchsäure mit Sauerstoff durch Oxidation von 1 MoI Milchsäure zu Pyruvat und unter
Bildung von 1 Mol Wasserstoffperoxid.
Die die neue Lactatoxidase liefernden Bakterienstämme der Gattungen Pediococcus und Streptococcus
werden nachfolgend auch bezeichnet als Pediococcus sp. B-0667 und Streptococcus sp. B-0668. Diese Stämme
wurden aus einer Bodenprobe isoliert, die in einem Rettichfeld in Ohito-cho, Tagat?, (Japan), gesainmelt wurde.
Die oben erwähnte isolierten Stämme B-0667 und B-0668 besitzen die folgenden taxonomischen Eigenschaften:
A. Beobachtungen auf verschiedenen Medien, Züchtung bei 300C während 2 Tagen
Stamm B-0667 Stamm B-0668
Tryptosojabrühe
Tryptosojaagarschrägkultur
Tryptosojaagarplatte Gelatinestich
BCP-Milch(14Tg.)
Schwaches Wachstum, hcmogen trüb, später wolleartige Präzipitation
Schwaches Wachstum, schwachgelblich.
grau, kein Glanz, keine Bildung von
löslichem Pigment
Kolonie, klein und fiach
Wachstum längs des ausgestochenen
Randes, keine Geiaiineverfiüssigung
keine Änderung
B. Mikroskopische Beobachtung Schwaches Wachstum, homogen
trüb,
später wolleartige Präzipitation
Schwaches Wachstum,
schwachgelblich, grau, kein Glanz,
keine Bildung von löslichem Pigment
Kolonie, klein und flach
Wachstum läng:.des ausgestochenen
Randes, keine Geiaf üieverfiüssigung
keine Änderung
Stamm B-0667 Stamm B-0668
Motilität Sporen Gramsche Verfärbung Säurebeständigkeit, Verfleckung
C. Physiologische Eigenschaften
kugelförmig, eiförmig, Paare, 4formige oder kurze Kette 0,5-1,0x0,5—1,0 μπι
kugelförmig, eiförmig,
Paare, 4formige oder
kurze Kette
0,8- 1,0x1,0- 1,2 μπι
Paare, 4formige oder
kurze Kette
0,8- 1,0x1,0- 1,2 μπι
Stamm B-0667 Stamm B-0668
Wachstumstemperatur 45° C 37° C 300C
26° C 100C 5° C Halogentoleranz, NaCl
10% 6,5% 50% 1,0% 0%
OF-Test Verhalten in Sauerstoff Nitratreduktion Indolbildung Hydrogensulfatbildung
Gelatinehydrolyse Stärkehydrolyse Äscuünhydrolyse Acetoinbildung MR-Test
Catalase Oxidase Urease (SSR) Urea.sc (Christensen)
± oder(-l-) ± oder{ + )
fermentativ fakultativ anaerob fermentativ
fakultativ anaerob
fakultativ anaerob
(Fortsetzung)
Stamm B-0667
Stamm B-0668
Verwendung von Zitronensäure (Christensen)
Säurebildung aus Zucker
Säurebildung aus Zucker
Adonit — —
L( + )-Arabinose — —
Cellobiose + +
ίο Dulcit — —
Mesoeiylhrit — —
Fructose; + +
Fucose — —
Galactose + +
Glucose + +
Glycerin — —
Inosit — —
Inulin — —
Lactose + +
ίο Maltose + +
Mannit + +
Mannose + +
Melezitoüe — —
Melibiose + —
Raffinose + —
L( + )-Rh£imnose — —
Salicin ( + ) -
L-Sorbose — —
Sorbit — —
Stärke — —
Saccharose + +
Trehalose + +
Xylose — —
Toleranz bei 60° C für 30 M in. — +
Aus »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology«, 8. Ausgabe, 1974, und S. T. Cowan und K. J. Steel,
»Manual for the Identification of Medical Bacteria«, Cambridge Press, 1974, folgt, daß die Stämme B-0667 und
B-0668, die die oben aufgeführten taxonomischen Eigenschaften aufweisen, zu dem Genus Pediococcus bzw.
Genus Streptococcus gehören.
Ein Vergleich dieser Stämme mit dem Identifizierungsmanual der obigen Literaturstelle ist wie folgt:
Ein Vergleich dieser Stämme mit dem Identifizierungsmanual der obigen Literaturstelle ist wie folgt:
In der Tabelle:
+ = mehr als 85% positiv. 4J-, — = mehr sils 85% negativ,
d = variiert unter den Stämmen oder Spezies.
Stamm
B-0667
B-0667
Stamm
B-0668
B-0668
Genus
Pediococcus
Pediococcus
Genus Streptococcus
Wachstum bei 45" Z Toleranz bei 6O0C
während 30 Min.
Glycerin (Säurebildung) 55 Arabinose (Säurebildung) Halogentoleranz (NaCl 10%)
Glycerin (Säurebildung) 55 Arabinose (Säurebildung) Halogentoleranz (NaCl 10%)
d d
d d
Der Stamm B-0667 wird somit als Genus Pediococcus oder Streptococcus bezeichnet Aus dem obigen
»Manual for the Identification of Medical Bacteria« und J. Gen. MicrobioL, 26, 185—197 (1961), folgt, daß die
taxonomischen Eigenschaften des Stammes B-0667 fast identisch sind mit denen von Pediococcus urina-equi,
jedoch unterscheiden sich die in »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology«, 8. Ausgabe, 1974, beschriebenen
Eigenschaften etwas davon. Der Stamm B-0667 wird daher als Genus Pediococcus angesehen und als
Pediococcus sp. B-0667 bezeichnet
Der Stamm B-0668 ähnelt dem Genus Streptococcus anstelle des Genus Pediococcus. Aus »Manual for the
Identification of Medical Bacteria« folgt, daß der Stamm B-0668 Streptococcus faecium var. durans ähnelt, doch
werden kein« taxonomischen Eigenschaften in »Bergey's Manual« beschrieben und es ist daher unmöglich, einen
genauen Vergleich durchzuführen. Der Stamm B-0668 wird daher als Streptococcus sp. B-0668 bezeichnet
Die Stämme B-0667 und B-0668 wurden in der Dauerhinterlegungsstelle des Institute for Microbial Industry
and Technology, Agency of Industrial Science and Technology. M.I.T.I. Japan, unter den Nr. l'F.RM-P Nr. 4438
bzw. 1-"KRM-P Nr. 4439 hinterlegt und dort direkt in die Hinterlegungen I7ERM BP-4tö und FIiRM BP-466
umgewandelt. IFO-12 219 und ΙΙΌ-12 317 wurden in dem Institute for Fermentation, Osaka, Japan unter diesen
Nummern hinterlegt.
bzw. 1-"KRM-P Nr. 4439 hinterlegt und dort direkt in die Hinterlegungen I7ERM BP-4tö und FIiRM BP-466
umgewandelt. IFO-12 219 und ΙΙΌ-12 317 wurden in dem Institute for Fermentation, Osaka, Japan unter diesen
Nummern hinterlegt.
Pediococcussp. B-0667 = FERM P-4438 — FERM BP-465;
Streptococcus sp. B-0668 = FERM P-4439-.FERM BP-466.
Anhand der Zeichnungen wird die Erfindung näher erläutert.
F i g. 1 zeigt den optimalen pH-Wert der erfindungsgemäßen Lactase, to
F i g. 2 zeigt die optimale Temperatur der Lactatoxidase,
F i g. 3 zeigt die pH-Stabilität der Lactatoxidase,
F i g. 4 zeigt die Wärmestabilität der Lactatoxidase,
F i g. 5 zeigt das elektrophoretische Muster der Lactatoxidase,
F i g. 6 zeigt das Ergebnis bei der Bestimmung von Wasserstoffperoxid bei einem Bestätigungstest der Was- 15
serstoffperoxidbildung durch die Lactatoxidase, wobei die Standardkurve von O —O: L-Milchsäure als Substrat, · — ·: DL-Milchsäure als Substrat, und Δ — Δ: Substrat durch Wasserstoffperoxid ersetzt ist,
serstoffperoxidbildung durch die Lactatoxidase, wobei die Standardkurve von O —O: L-Milchsäure als Substrat, · — ·: DL-Milchsäure als Substrat, und Δ — Δ: Substrat durch Wasserstoffperoxid ersetzt ist,
F i g. 7 zeigt das Ergebnis der quantitativen Analyse von Brenztraubensäure bei einem Bestätigungstest der
Brenztraubensäurebiidung durch Lactatoxidase, worin die Standardkurve O —O: L-Miicnsäuie als Suusuai, i
Brenztraubensäurebiidung durch Lactatoxidase, worin die Standardkurve O —O: L-Miicnsäuie als Suusuai, i
• — ·: DL-Milchsäure als Substrat und Δ — Δ: Substrat durch Wasserstoffperoxid ersetzt ist. 20 .1
Gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform werden Pediococcus sp. B-0667, Streptococcus sp. B-0668, ■.]
Acrococcus viridans IFO-12 219 oder Aerococcus viridans IFO-12 317 in einem üblichen Medium für die ;
Lnzymbildung gezüchtet. Die Züchtung kann unter Verwendung einer üblichen Flüssigkeitskultur durchgeführt ί
werden. Eine submerse Belüftungskultur ist zur industriellen Erzeugung bevorzugt. Für die Züchtung der
Mikroorganismen wird bevorzugt ein übliches Medium verwendet. 25 ■■;
Mikroorganismen wird bevorzugt ein übliches Medium verwendet. 25 ■■;
Als Kohlenstoffquellen werden bevorzugt assimilierbare Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Saccharose, Lactose,
Maltose, Fructose, Melassen o. ä. verwendet. Als assimilierbare Stickstoffquellen werden bevorzugt Pepton, >
Polypepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Caseinhydrolysat o.a. verwendet. Verschiedene anorganische Salze, :
wie Phosphate, Carbonate. Sulfate, Salze von Magnesium, Calcium, Kalium, Natrium, zweiwertiges Eisen,
Mangan oder Zink können verwendet werden. 30
Mangan oder Zink können verwendet werden. 30
Die Kulturtemperatur kann innerhalb des Bereichs für das Wachstum von Mikrobenzellen und die Bildung :i
von Lactaioxidase ausgewählt werden und beträgt bevorzugt 25—37°C. Die Kulturzeit kann variiert werden,
abhängig von den Bedingungen, und sie wird beendigt, wenn die Lactatoxidaseproduktion im wesentlichen ·;';
abhängig von den Bedingungen, und sie wird beendigt, wenn die Lactatoxidaseproduktion im wesentlichen ·;';
beendigt ist. Sie beträgt normalerweise 10—40Std. J
Zur Abtrennung der Lactatoxidase aus der Kultur wird die Kulturmasse, um die Zellen zu sammeln, filtriert 35 ·,
oder zentrifugiert; diese werden durch Behandlung mit mechanischen Einrichtungen oder mit Enzymen, wie %
Lysoitym, üuseinandergerissen bzw. zerstört. Sofern erforderlich, wird die Lactatoxidase durch Zugabe von |
Äthylen-diamintetraessigsäure (EDTA) und einem oberflächenaktiven Mittel, wie Triton X-IOO (Warenzeichen) %
oder Adecatol SO-120 (Warenzeichen) zur Abtrennung des Enzyms solubilisiert. Die so erhaltene Lösung aus |
Lactatoxidase wird mit oder ohne Konzentrierung weiter aufbereitet und danach wird das Enzym durch 40 ;5
Aussalzen durch Zugabe löslicher Salze, wie Ammoniumsulfat, ausgefällt oder es wird durch Zugabe von mit I
Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Äthanol, Aceton oder Isopropanol, ausgefällt. £
Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht werden durch Dialyse entfernt. Die Reinigung der Lactat- |;
oxidase erfolgt bevorzugt durch Adsorptionschromatographie oder Gelfiltration. Die so erhaltene Enzymlösung S:
wird durch Vakuumkonzentration, Ultrafiltrationkonzentration und Lyophilisierung unter Bildung gepulverter 45 $i
Lactaioxidase behandelt. s
Die erfindungsgemäße Lactatoxidase wird anschließend analysiert. Sie besitzt die folgenden physico-chemi- |
sehen Eigenschaften: i
1. Analyseverfahren %
Reaktionszeit (1,0 ml) |
0.2M Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (pH 6,5) 02 ml |
03 mM L-Milchsäure 0,1 ml |
0,2% (GAQ N,N-Dimethylanilin 0,2 ml |
0,20/o(G/V)4-Aminoantipyrin 0,1ml 55 f
45 U/ml Peroxidaselösung 0.1 ml a
destilliertes Wasser 03 ml I
Zu 1,0 ml des obigen Reaktionsgemisches gibt man Lactatoxidaselösung (10 μ!) und -nkubiert bei 37° C
während 10 Min. 03 ml einer 1 %igen (Gew/Vol.) Cation FB-500 (Warenzeichen) oberflächenaktives Mittel wird 60
zur Beendigung der Reaktion zugegeben. Anschließend gibt man 13 ml destilliertes Wasser zu. Die entstandene
Farbe wird durch colorimetrisches Verfahren bei 565 nm gemessen.
während 10 Min. 03 ml einer 1 %igen (Gew/Vol.) Cation FB-500 (Warenzeichen) oberflächenaktives Mittel wird 60
zur Beendigung der Reaktion zugegeben. Anschließend gibt man 13 ml destilliertes Wasser zu. Die entstandene
Farbe wird durch colorimetrisches Verfahren bei 565 nm gemessen.
Eine Einheit (1 Einheit, 1 U) Enzymaktivität wird als die Aktivität definiert, die 1 μΜοΙ Wasserstoffperoxid pro
Minute erzeugt Die Aktivität wird durch die folgende Gleichung berechnet:
Minute erzeugt Die Aktivität wird durch die folgende Gleichung berechnet:
Enzymaktivität (U/ml) = (JA565/min) χ 153
worin ^5(,5 die Absorptionsänderung bei 565 nm pro Minute bedeutet.
worin ^5(,5 die Absorptionsänderung bei 565 nm pro Minute bedeutet.
2. Substratspezifizität
Im obigen Analysenverfahren wird die Milchsäure in dem Reaktionsgemisch durch die folgenden Substanzen
zur Bestimmung der Substratspezifizität der Lactatoxidase ersetzt. Die Ergebnisse sind als relative Aktivität für
5 Milchsäure angegeben.
L-Milchsäure | 100 |
Brenztraubensäure | 0 |
DL-<*-Alanin | 0 |
Bernsteinsäure | 0 |
Maleinsäure | 0 |
L-Ascorbinsäure | 0 |
DL-Serin | 0 |
Dihydroxyaceton | 2,7 |
DL-Glvcerinsäure | 0 |
)esitzt die Enzymlact 3. |
atoxidase eine höh Enzymreaktion |
Aktivität (%)
25 Das Enzym katalysiert die Oxidationsreaktion von Milchsäure und Sauerstoff unter Bildung von Brenztraubensäure
und Wasserstoffperoxid.
CH3CH(OH)COOH + O2-CH3COCOOH + H2O2
30 4. Optimaler pH
30 4. Optimaler pH
Der Einfluß des pH auf die Lactatoxidaseaktivität wird durch Analyse der Enzymaktivität an Milchsäure
40 mM Acetatpuffer (pH 4 bis 4,5), 40 mM Dimethylgutarat-NaOH-Puffer (pH 4 bis 8, 40 mM Phosphatpuffer
(pH 6,3 bis 8), 40 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7 bis 9) und 40 mM Glycinpuffer (pH 9 bis 10) bestimmt. Die
35 Ergebnisse sind in F i g. 1 dargestellt, aus der folgt, daß der optimale pH-Wert 6 bis 7 beträgt.
5. Optimale Temperatur
Die Lactatoxidaseaktivität auf Milchsäure wird entsprechend dem zuvor beschriebenen Analysenverfahren
40 gemessen. Die Ergebnisse sind in F i g. 2 dargestellt, wobei die optimale Temperatur etwa 35°C beträgt.
6. Isoelektrischer Punkt
pH 4,6±0.3 (bestimmt durch Elektrophorese unter Verwendung eines Trägerampholiten).
7. Molekulargewicht
80 000 ± 10 000 (bestimmt durch Gelfiltrationsverfahren unter Verwendung von Sephadex G-150; Warenzeichen
der Pharmacia Co.). 40 000 ±5000 (bestimmt durch SBS-Polyacrylamidelektrophorese).
50 Diese Werte lassen vermuten, daß das erfindungsgemäße Enzym ein Dimeres ist.
50 Diese Werte lassen vermuten, daß das erfindungsgemäße Enzym ein Dimeres ist.
8. pH-Stabilität
Zu Lactatoxidase (5 μg Protein) gibt man 0,1 ml O1IM Dimethylglutarat-NaOH-Puffer für pH 4 bis 7, 0,1 ml
55 0,1 M Phosphatpuffer für pH 63 bis 8 oder 0,1 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer für pH 7 bis 9, läßt bei 500C während 10
Min. siehen und kühlt in Eis. 10 μΐ Enzymlösung werden entnommen und die Enzymaktivität wird bestimmt. Wie
aus F i g. 3 folgt, ist das Enzym bei pH 6,8 bis 8,5 stabil.
9. Wärmestabilität
Die Wärmestabilität des Enzyms wird bestimmt, indem man in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0. 0,1 ml), der die
Enzymlactatoxidase enthält (Enzymprotein 5 μg), bei jeder Temperatur von 0 bis 80°C während 10 Min. inkubiert
und in Eis kühlt 10 μΐ Enzymlösung werden entnommen und dann wird die Lactatoxidaseaktivität entsprechend
dem zuvor beschriebenen Verfahren bestimmt Wie aus F i g. 4 folgt, ist das Enzym unter 40° C stabil and
65 die Aktivität geht über 40° C schnell verloren.
29 24 47U
10. Einfluß auf verschiedene Substanzen
Der Einfluß auf verschiedene Substanzen der Enzymaktivität wird bestimmt, indem m?n die im folgenden
aufgeführte Substanz zugibt. Die Zugabeoienge beträgt 10 mM für Metallsalz und EDTA, 0,1% (Gew/Vol.) für
oberflächenaktives Mittel und 0,05 mM für p-Chlormercuribenzoat (PCMB), 10 μΜ für Flavinade.iindinucleotid
(FAD)1O1I mM für Flavinmononucleotid(FMN) und Riboflavin.
Zugegebene Substanz | Relative | 107,2 |
Aktivität (%) | 98,2 | |
keine Zugabe | 100,0 | 10,8 |
MnCl2 | 97,4 | 3,7 |
MgCI2 | 101,7 | 88,6 |
CaCI2 | 105,5 | 11. Elektrophorese |
CoCI2 | 95,7 | |
LiCl | 95,3 | |
FeCU | 8,12 | |
EDTA | 98,0 | |
PCMB | 89,7 | |
FAD | 101,3 | |
FMN | 94,0 | |
Riboflavin | 96,4 | |
Natriumlaurylbenzolsulfonat | 21,5 | |
Natriumdodecylsulfat | 1,8 | |
Adekatol SO-120 (Warenzeichen) 102,8 | ||
Triton X-100 (Warenzeichen) | ||
Bridge-35 (Warenzeichen) | ||
Cetyltetraammoniumbromid | ||
Cation FB-500 (Warenzeichen) | ||
Cation DT-205 (Warenzeichen) |
10
20
25
30
35
Die Polyacrylamidscheiben-Elektrophorese wurden unter Verwendung von Polyacrylamid-Gel (pH 7,5) und
Tris-Barbitalpuffer (pH 7,15) bei einem konstanten Strom (4 mA/gel.) durchgeführt. Wie aus F i g. 5 folgt, ist das
elektrophoretisch gewonnene Gel, das durch Amidoschwarz gefärbt wurde, eine einzige dunkelblaue Bande, die
die Enzymlactatoxidase als einziges Protein zeigt.
40
12. Art der Enzymwirkung
Bei dem erfindungsgemäßen Lactatoxidase-Analysenverfahren bzw. -Assayverfahren wird das folgende Reaktionsgemisch
verwendet:
45
DL-Milchsäure oder L-Milchsäure 0 bis 0.4 μΜοΙ
Dimethylgutarat-NaOH-Puffer (pH 6,5) 40 μΜοΙ
4-Aminoantipyrin 300 μg
N,N-Dimethylanilin 200 μg
Peroxidase 4,5 U jo
Lactatoxidase (200 U/mg) 2 U
1,0 ml des obigen Reaktionsgemisches werden bei 37° C während !0 Min. inkubiert. Danach werden 03 ml
einer 1 %igen (Gew/Vol.) Cation FB-500 (Warenzeichen)-Lösung und 1,5 ml destilliertes Wasser zugegeben. Die
entstandene Farbe wird nach einem colorimetrischen Verfahren bei 565 nm bestimmt
Die Standardkurve wird hergestellt, indem man Wasserstoffperoxid anstelle von Milchsäure zugibt
Wie aus F i g. 6 folgt worin O — O die L-Milchsäure, die als Substrat verwendet wurde, bedeutet · — · die
D-Milchsäure, die als Substrat verwendet wurde, bedeutet und Δ — Δ das Wasserstoffperoxid, das anstelle des
Substrats verwendet wird, bedeutet katalysiert die erfindungsgemäße Enzymlactatoxidase die Reaktion, bei der
1 Mol L-Milchsäure gebildet wird.
Weiterhin wird der Sauerstoffverbrauch mit einer Sauerstoffelektrode (YSI-Lösungssauerstoffmeter) gemessen
und 1 MoI Sauerstoff wird bei der Oxidation von 1 Mol Milchsäure verbraucht
Brenztraubensäure wird nach dem folgenden Verfahren nachgewiesen.
1,0 ml Reaktionsgemisch, das Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (40 μΜοΓ), Catalase (400 μg), L-Milchsäure oder
DL-Milchsäure (0 bis 0,5 μΜοΙ) und Lactatoxidase (2 U) enthält wird bei 37° C während 10 Min. inkubiert Das
Reaktionsgemisch wird in kochendem Wasser während 5 Min. zur Beendigung der Reaktion erhitzt Nach dem
Kühlen mit Eis werden 0,1 ml 10 mM NADH2 und 13 ml destilliertes Wasser zugegeben und dann wird das
denaturierte Protein durch Zentrifugieren entfernt Die überstehende Lösung (24 ml) wird in eine Quartzzelle
gestellt, bei 37 C preinkubiert dann wird Lactatdehydrogenase (20 U, Rinderleber, Boehringer Mannheim
GmbH)-Lösung (5 mi) zugegeben, dann wird bei 37° C während 5 Min. inkubiert und nach dem colorimetrischen
Verfahren bei 340 nm gemessen. Die Standardkurve wird hergestellt, indem man Brenztraubensäure anstelle
von L-Milchsäure zugibt.
Wie aus F i g. 7 folgt, worin O — O die als Substrat verwendete Milchsäure bedeutet, · — · die als Substrat
Wie aus F i g. 7 folgt, worin O — O die als Substrat verwendete Milchsäure bedeutet, · — · die als Substrat
verwendete DL-Müchsäure bedeutet, und Δ-Δ Brenztraubensäure bedeutet, wird Brenztraubensäure anstelle
des Substrats verwendet
1,0 ml des obigen Reaktionsgemisches werden bei 37° C während 10 Min. inkubiert und die so gebildete
ar-Ketosäure wird nach dem Hydrazinverfahren unter Verwendung von 2,4-Dinitrophenylhydrazin gemessen. 1
Ό Mol Λ-Ketosäure wird aus 1 Mol L-Milchsäure gebildet Die erfindungsgemäße Enzymlactatoxidase wirkt auf
Ό Mol Λ-Ketosäure wird aus 1 Mol L-Milchsäure gebildet Die erfindungsgemäße Enzymlactatoxidase wirkt auf
L-Milchsäure und katalysiert die Reaktion, bei der 1 Mol Brenztraubensäure gebildet und 1 Mol Sauerstoff g
verbraucht wird. %
Wie zuvor erläutert wurde, wirkt die erfindungsgemäße Enzymlactatoxidase direkt auf Milchsäure zusammen |
nit Sauerstoff und erfordert kein Coenzym bei der Oxidation von L-Milchsäure und Bildung von Brenztrauben- a
säure und Wasserstoffperoxid. Die physico-chemischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Enzyms sowie |
der isoelektrische Punkt von pH 4,6, das Molekulargewicht von 80 000 ± 10 000 usw. zeigen die Unterschiede zu ä"
der bekannten Lactatoxidase an. Hieraus folgt daß die erfindungsgemäße Lactatoxidase ein neues Enzym ist
Bei dem obigen Pestätigungstest für die Art der Wirkung der Lactatoxidase ist die quantitative Analyse des \
freigesetzten Wasserstoffperoxids, Pyruvats und des verbrauchten Sauerstoffs ein Beispiel für die L-Milchsäure- :
analyse. ..;
Beispiel 1 ij
Vier Proben von Kulturmedium (je 100 ml, pH 7), enthaltend Glucose (2%), Pepton (1 %), Hefeextrakt (03%), "ß.
NaCl (0,2%), KH2PO4 (0,1%), K2HPO4 (0,1%), MgSO47H2O (0,05%) und CaCOs (03%), werden in einem %
Erlenmeyer-Kolben bei 120°C während 20 Min. sterilisiert Jedes Medium wird mit einem Stamm von Pediococ- Ij-
cussp.B-0667,Streptococcussp. B-0668, Aerococcus viridans IFO-12219 bzw. Aerococcus viridans IFO-12317 ;]
inokuliert und dann wird bei 30°C während 15 Std. mit 300 Rpm. unter Schütteln gezüchtet Anschließend ΐ!'
werden die gezüchteten Zellen abzentrifugiert mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) gewaschen und dann wird Jj
erneut zentrifugiert Die Bakterienzellen werden gesammelt Die so erhaltenen Zellen werden in 1OmM fjj
Phosphatpuffer (10 mi, pH 8.0), enthaltend 0,02% Lysozym und 0,1% Triton X-IOO, suspendiert und dann wird #
bei 37° C während 60 Min. inkubiert Das überstehende Material, das durch Zentrifugieren erhalten wird und das Nj
Lactatoxidase enthält wird gesammelt Die Enzymaktivität des überstehenden Materials ist in der folgenden ?$
Tabelle angegeben: 'Ä
"Ii
Summ Enzymaktivität (U/ml) ν j
B-0667 0,24 :'·'
B-0668 OJl 1
IFO-12 219 0,42
IFO-12 317 0,43 ;
Beispiel 2 ■.
201 eines Mediums, das die gleichen Komponenten, wie in Beispiel 1 beschrieben, enthält, werden in ein ;
30-1-Fermentationsstandgefäß gegeben. Dann gibt man Disforrn BC-51Y (Warenzeichen) bis zu einer Konzen- '■.'■;
tration von 0,1% zu und sterilisiert mit Dampf. Bei 200 ml Kulturbrühe von Pediococcus sp. B-0667, auf gleiche :-;\
Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet, werden zugegeben und dann wird bei 300C während 15 Std.
so gezüchtet. Die Bakterienzellen werden durch Abzentrifugieren gesammelt (etwa 400 g), in einer Lysozymlösung ':
(0,2 mg/ml, 41) wieder suspendiert, und dann wird Triton X-IOO (Warenzeichen. 4g), EDTA (3g) und IM ■■;
Phosphatpuffer (pH 8,40 ml) zugegeben. Das Gemisch wird bei 37°C während 60 Min. zur Zerstörung der Zellen ■■>',
gerührt Zu der überstehenden, beim Zentrifugieren erhaltenen Lösung (3,7 1,5200 U) gibt man 1,481 Aceton und !
die ausgefallenen Verunreinigungen werden abzentrifugiert. Zu der überstehenden Lösung gibt man bis zu '
65%iger Konzentration Aceton. Der beim Zentrifugieren bei 5000 Rpm während 10 Min. erhaltene Nieder- ·,]
schlag wird in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,400 ml) gelöst und der unreine Niederschlag wird durch Zentrifugie- !■
ren abgetrennt 470 ml gesättigtes Ammoniumsulfat werden zugegeben und dann wird 20 Min. gerührt. Der , j
Niederschlag, der durch Zentrifugieren bei 12 000 Rpm während 10 Min. erhalten wurde, wird in 1OmM .j
Phosphatpuffer (pH 7,100 ml) gelöst. Die Lösung wird gegenüber 10 mM Phosphatpuffer über Nacht dialysicrt ■ ■<
und durch eine Säule (2,6 κ 50 cm) aus DEAE-Cellulose, gepuffert bei pH 7, zur Absorption des Enzyms geleitet j
und ds.nn wird stufenweise eluiert mit einer lonengradientenstärke von 0,1 bis 0.6M KCI. Die Fraktionen, die bei ; ί
etwa 0,5M KCl ablaufen, werden gesammelt und die enthalten die aktive Enzymfraktion (140 ml).
Zu der Lösung gibt man gesättigtes Ammoniumsulfat (185 ml) und der Niederschlag wird abzentrifugiert. Zu
der überstehenden Lösung wird gesättigte Ammoniumsulfatlösung (145 ml) gegeben und der Niederschlug wird
der überstehenden Lösung wird gesättigte Ammoniumsulfatlösung (145 ml) gegeben und der Niederschlug wird
abzentrifugiert.
Nach dem Auflösen des Niederschlags in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0, 50 ml) und Dialyse zum Entsalzen
wird die Lösung auf eine Säule DEA E-Sephadex A-50 (Warenzeichen) (2,6 χ 50 cm), die mit 1OmM Phosphatpuffer gepuffert ist, zur Absorption des Enzyms gegeben und dann wird die Fraktion durch Gradientenclution mit
wird die Lösung auf eine Säule DEA E-Sephadex A-50 (Warenzeichen) (2,6 χ 50 cm), die mit 1OmM Phosphatpuffer gepuffert ist, zur Absorption des Enzyms gegeben und dann wird die Fraktion durch Gradientenclution mit
einer Ionenstärke von 0,2 bis 0.6M KCl Chromatographien. Die Fraktionen, die mit 0,5M KCl abfließen, werden
gesammelt (160 ml). Anschließend wird zur Entsalzung dialysiert und dann wird lyophilisiert. Das lyophilisierte
Pulver wir in einem Gemisch aus 1OM Phosphatpuffer (pH 7.0,5 ml) und 0,1M KCI gelöst und an einer Säule aus
Sephadex G-liiO (Warenzeichen) (24 χ 73 cm, Strömungsrate 8 ml/min, 5,2 ml/Fraktion) Chromatographien. Die
aktiven Fraktionen Nr. 27 bis 35 werden gesammelt, durch Dialyse entsalzt und lyophilisiert. Das lyophilisierte
Enzym zeigt eine einzige Bande bei der Elektrophorese, wie zuvor erläutert Das Reinigungsschema ist wie folgt:
gesammelt (160 ml). Anschließend wird zur Entsalzung dialysiert und dann wird lyophilisiert. Das lyophilisierte
Pulver wir in einem Gemisch aus 1OM Phosphatpuffer (pH 7.0,5 ml) und 0,1M KCI gelöst und an einer Säule aus
Sephadex G-liiO (Warenzeichen) (24 χ 73 cm, Strömungsrate 8 ml/min, 5,2 ml/Fraktion) Chromatographien. Die
aktiven Fraktionen Nr. 27 bis 35 werden gesammelt, durch Dialyse entsalzt und lyophilisiert. Das lyophilisierte
Enzym zeigt eine einzige Bande bei der Elektrophorese, wie zuvor erläutert Das Reinigungsschema ist wie folgt:
Gesamtprotein | Gesamtaktivit | Spezifische Aktivität | |
(mg) | (U) | (U/mg) | |
Zellenextrakt | 34 040 | 5 200 | 0,028 |
Acetonprecipitat | 3 652 | 4 780 | Ul |
1 -Ammoniumsulfatprecipitat | 2 378 | 4 590 | 133 |
DEAE-Cellulose | 663 | 3 672 | 5,80 |
2-Ammoniumsulfatprecipitat | 163 | 3 253 | 193 |
DEAE-Sephadex A-50 | 44,7 | 2 667 | 59,7 |
Sephadex G-150 | 13,07 | 2 614 | 200 |
Hierzu 4 Blatt Zeichnungen |
Claims (1)
1. Lactatoxidase, gekennzeichnetdurch folgende Eigenschaften:
(a) Substratspezifizität: L-Milchsäure;
(b) Enzymwirkung: sie katalysiert die folgende Reaktion (I)
L-Milchsäure + O2 —► Brenztraubensäure + H2O2 (I);
(c) optimaler pH: 6 bis 7;
(d) optimale Temperatur: 35° C;
(e) isoelektrischer Punkt: pH 4,6 ±03 (bestimmt durch Elektrophorese unter Verwendung eines Trägerampholiten)
und
(f) Molekulargewicht: 80 000±10 000 (bestimmt durch Gelfiltrationsverfahren unter Verwendung von
SephadexG-150).
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