DE2164018A1 - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Uricase - Google Patents

Description

ITODA INSTITUTE J¹OR SCIENTIFIC EESEARCH. Noda, Japan

"Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Uricase"

Priorität: 26. Dezember I97O, Japan, Nr. 118 750/70 und 28. Dezember 1970, Japan, Nr. 119 989/70

Uricase (Urate: Op oxidoreductase EC 1·7·3·3)

Ist ein Enzym, das Harnsäure oxidativ in Allantoin überführen kann. Dieses Enzym ist in der Medizin und insbesondere in der auf biochemischen Befunden basierenden Diagnose von Wichtigkeit, da es zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure im Serum oder im Urin verwendet werden kann.

UricasG wurde bisher hauptsächlich aus tierischen Organen gewonnen, und bei der Extraktion und Reinigung des Enzyms traten zahlreiche Schwierigkeiten auf. Es wurde deshalb versucht, Uricase imker Verwendung von Mikroorganismen herzustellen. Als Mikroorganismen wurden z.B. Hefen der Gattung Candida (Agricul-

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tural and Biological Chemistry, Band 3I, (1967), S. 12%), Bakterien der Gattungen Micrococcus und Brevibacterium (Journal of Fermentation Technology (Japan), Band 44, (1966)., S. 789), Bakterien der Gattung Arthrobacter (japanische Patentveröffentlichung ITr. 8062/69), Bakterien der Gattung Pseudomonas (Journal of General Microbiology, Band I7, (1957), S. 1), Bakterien der Gattung Streptomyces (Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan, Band 4-1, (1967), S. 540) und Pilze der Gat-φ ■ tung KTeurospora (Archives of Biochemistry and Biophysics, Band 70, (1957), S. 60J) eingesetzt.

Die aus diesen Mikroorganismen stammende Uricase ist jedoch ein Enzym, dessen Produktion durch Harnsäure induziert wird, und im allgemeinen wird die Biosynthese von Uricase leicht durch die Kulturbedingungen beeinflußt. Ferner· akkumulieren diese Mikroorganismen Uricase im wesentlichen in den Zellen. Zur Isolierung des Enzyms müssen die Zellen aufgebrochen oder ^ lysiert werden. Die Plerstellung von Uricase mittels der vorgenannten Mikroorganismen basiert also auf einem dreistufigen Verfahren, wobei in der ersten Stufe die Züchtung der Zellen, in der zweiten Stufe nach dem Ernten der gezüchte ten Zellen die induzierte Produktion von Uricase in Gegenwart von Harnsäure und in der dritten Stufe die Abtrennung der in den Zellen produzierten Uricase erfolgt. Die Abtrennung und Reinigung der Uricase nach dem dreistufigen Verfahren ist mit beträchtlichen Schwierigkeiten verbunden, da in den Zellen zahlreiche Protcinarten und andere Enzyme in großen Mengen enthalten sind. Die Leistungsfähigkeit dieses Verfahrens ist somit gering.

209831/0.9 23 BAÖ OFHGiNAC

Aufgabe der Erfindung war es daher, Mikroorganismen aufzufinden, die- zur induktiven Produktion stabiler Uricase in guter Ausbeute in einem Nähr©edium bei üblichen Temperaturen befähigt sind. Die Herstellung von Uricase soll nach einem einstufigen Verfahren erfolgen, bei dem die Zellzüchtung, die induktive Produktion des Enzyms und die Abgabe des Enzyms in den extrazellulären Raum gleichze-Itig erfolgt. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Uricase, das dadurch gekennzeichnetist, daß man einen zur Produktion von Uricase befähigten Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium in einer Harnsäure enthaltenden Nährlösung unter aeroben Bedingungen züchtet und die in der Kulturbrühe angereicherte Uricase isoliert.

Erf.indungsgemäi? gelingt es, Uricase im eir. ' igen Verfahren mit guten Ausbeuten herzustellen.

Bei der genauen Untersuchung der Bedingungen, unter denen die erfindT^ngsgemäl; eingesetzten neu aufgefundenen Stämme Uricase produzieren, ivurde festgestellt, daß sich die Leistungsfähigkeit des erfjniungsgemäßen Verfahrens durch den Zusatz mindestens eines Alkohols zum ITährmedium noch beträchtlich erhöhen läßt. Die Dui"cli führung des er findlingsgemäßen Verfahrens mit einem solchen Alkoholzusatz stellt somit eine bevorzugte Ausführungsform dar. Die erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismen akkumulieren beträchtliche Mengen von Uricase im extrazellulären Raum, so daß sich das Enzym in vorteilhafter Weise

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dem EtüLttjrfiltirat gewinnen läßt*

kurzem manäe ©in einstuf iges Verfahren köj?· STerötellxiiig. vt>ii tJ3fica.se üi-fctels. Bacillus; fastidiosus CAnalyfcical BiQ;ehem±Stry,_i Böfid 38, (1970·),» S. 65} beschrieben* Zw? B^clidtitaiiBg dieses Verfahrens sind Jedoch große Heßgea aa Eabrstoffen. imi. aä Sai^tttöättpe iiöä. laage KticlitmigSEei1;eii eirfordei-lich. ^raer ist die Ausbeute an Uricase gering* Bas Terfallen der imrliegeiiden Erfindung hat» verglichen mit dem bekannten einstufigen Verfaii-

Indttktor dienende Harnsäure i₄ die Torteilei daß die als "V und die Hährstoffe in geringen Konzentrationen eingesetzt werden können Und daß diö

EÜchtungszeit verkürzt wird* Nach, dem erfindungsgemäßen Verfahren werden beträchtlich, hohe Uricaseausbeuten erhalten. Erfindungsgemäß kann somit stabile Uricase bei kurzer Züchtungs zeit in hoher Reinheit und mit guten Ausbeuten hergestellt werden, .

Im erfindungsgemäßen Verfahren kann jeder Stamm und jede Variante oder Mutante der Gattung Corynebacterium eingesetzt werden, der zur Produktion von Uricase befähigt ist. Bevorzugte Stämme gehören der Art Corynebacterium uratoxidans an. Ein spezielles Beispiel eines solchen Stammes ist Corynebacterium uratoxidans ü-23, FEBM-P Nr, 789, ATGC 21?49. "PERM-P" ist die Abkürzung für "Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, 5-chome 8-1, Inage, Chiba-shi, Japan", einer öffentlichen Hinterlegungsstelle in Japan; "ATCC" ist- die Abkürzung für "American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, V.St.A,", einer öffentlichen Hinterlegungsstelle in den Vereinigten Staaten von

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ÖAD ORtQtNAt

<5 —

Ämesrika.

Bes? i'Staanm €to3n^paehaete:riimm raratoDxidans J3Ü0G 2iy%9 is* ein neuer, aus Emmas isolierter Stamm, dessen miSx©lbAologIsehe Eigenschaf-" ten joaclistelieaaa. ibeseliFlelbeB. sind. Biese Eigenschaften werden gemäß den iFesirsreiriateei! im "Haimal of 33ic3?ol>iologic"al Methods" {Society of Imeiricaii Eacfceipiologists, MeG-raw—Hill-Book Company, Inc., lew York, 1957) Tsestimmt.

A. Mikroskopische Beobachtungen (0 t>is 48stündige Züchtung auf ■ Agar-nährDoaen "bei 3O⁰C); '

Ί. Zellmorphologie :

i) Gerade bis leicht gekrümmte oder ellipsenförmige Stäbchen mit metachromatischen Granulaten.

ii) Zu Beginn der Züchtung werden pleomorphe Stäbchen beobachtet, die,, bedingt durch das "Schnappen" bei der

als
Zellteilung/Zellen mit keulenförmigen Verdickungen, als natürliche verzweigte Formen, schwach gekrümmte Stäbchen und gewinkelte oder palisadenartige Formen

vorliegen. ■

iii) Beträchtliche Größenunterschiede: 0,8 bis 1,2 und Λ bis 5 Mikron.

2. Begeißelung: fehlt.

3. Kapseln: fehlen. 4-. Beweglichkeit: fehlt.

5. Endosporen: fehlen.

6. Gramfärbung: positiv.

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BÄ# ORIGINAL

- .- 6 7· Säurefestigkeit der Färbung : negativ .

B. Kulturmerkmale;-

1. Agarkolonien (nach 24-stündiger Züchtung bei 3O°C auf einem Agar-Nährboden);
kreisförmig, flach, glatt, zusammenhängend, schwach glänzend und undurchsichtig, 3 bis 4- mm Durchmesser.

Ausstrich
2. Agar- / (nach 24stündiger Züchtung bei 30⁰C auf einem

Agar-Nährboden);

fadenförmiges Wachstum oder geringe Ausbreitung, mäßiges Wachstum. Cremig-weiß in jungen Kulturen bis schwach gelb in alten Kulturen.

3. Kulturbrühe (nach 24-stündiger Züchtung bei 3O⁰C)?

Spärliches Oberflächenwachstum mit Ring, keine Sedimente.

4·. Gelatine-Stichkultur (nach 4- bis 5tägiger Züchtung bei 20⁰C):

bestes Wachstum am oberen Ende, fadenförmig. Gelatine wird unter Schichtenbildung verflüssigt.

5. Lackmusmilch (nach 24-stündiger Inkubation bei 3O⁰C); •keine Reduktion, schwach alkalisch, keine Koagulation.

0- Physiologische Merkmale;

1. Wirkung auf Nitrate: Reduktion.

2. Methylrot-Test: -. negativ oder schwach positiv.

3. Voges-Proskauer-Test: negativ.

4. Indolbildung: negativ.

5· Schwefelwasserstoffbildung : positiv.

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BAR ORIGINAL

6» Stärkehydrolyse: negativ oder sühiiache Hydrolyse* 7» Verv/ertung von Natriumcitrat (Medium nach Eoser und

Christensen): positiv»

8» Verwertung von organisch gebundenem Stickstoff ί positiv» 9. Pigmentbildung: Es werden wasserunlösliche, schwach

gelbliche bis braune Pigmente gebildet»
10* Urease: negativ.

11. Oxidase: positiv.

12. Katalase: positiv. "

13» pH-Bedingungen: Wachstum erfolgt im pH-Bereich 5 bis

9,5> pH-Optimum: 7 bis 8*

14. Temperaturbedingungen (Schüttelkultur in Nährlösung). i) Temperaturoptimum des Wachstums: 27 bis 35°C.

ii) Maximaltemperatur: 37 "bis 4O⁰G; kein Wachstum bei

iii-) Minimaltemperatur: 15°C.

iv) Zum Abtöten notwendige Zeit (Schüttelkultur in ent rahmter Milch):

10 Minuten bei 52°C ausreichend; 10 Minuten bei 50 nicht ausreichend.

15. Verhalten gegen freien Sauerstoff: aerob oder schwach fakultativ anaerob.

16. Hämolyse : negativ.

17. Pathogenität: fehlt.

18. Die Fähigkeit zur Spaltung von Zuckern, Alkoholen und Glycosiden ist in der Tabelle I zusammengestellt.

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BAD ORiGlNAt

Tabelle I

Säurebildung Gasbildung

Arabinose - -

Xylose

Glucose ++ -

Mannose - —

Fructose ++ -

Galactose - -

Maltose + -

Saccharose - -

Lactose - -

Trehalose Sorbit Mannit Inosit Glycerin Stärke ■ Dextrin Inulin Raffinose

Glycogen - -

Salicin - -

19· Besondere physiologische Merkmale: Hohe Aktivität bezüglich der induktiven Bildung von Uricase und der Akkumulation des Enzyms im Nährboden..

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Wenn die vorstehend beschriebenen Merkmale gemäß der Klassifikation in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Ausgabe (1957)" überprüft v/erden, ist es angebracht, den Mikroorganismus in die Gattung Corynebacterium einzuordnen. Der erfindungsgemäß eingesetzte Mikroorganismus kann jedoch nicht als eine bekannte Art identifiziert werden. Der vorliegende Mikroorganismus wird deshalb als neue Art betrachtet. Die Gründe hierfür sind nachstehend im einzelnen erläutert : Der vorliegende Mikroorganismus ist ein gram-positives, aerobes Bacterium, das in Form nichtsporenbildender kleiner Stäbchen mit rnetachromatischen Granulaten vorkommt und Pleomorphismus und "Schnappen" bei der Zellteilung aufweist. Es ist somit in die Familie Corynebacteriaceae einzuordnen. Der vorliegende Mikroorganismus ist ferner nicht pathogen und wirkt nicht*hämolytisch; er ist nicht begeißelt, nicht beweglich und hat keine Filamente bildenden Formen. Er kann ferner keine Cellulose abbauen, unterliegt keiner Änderung bei der Gramfärbung und hat die gewöhnliche Hitzeverträglichkeit. Der vorliegende Mikroorganismus kann somit in die Gattung Corynebacterium eingeordnet werden. Der Mikroorganismus wurde weiterhin nicht aus Tieren, sondern aus pflanzlichem Material isoliert; er kann Nitrat zu Kitrit reduzieren und Gelatine verflüssigen. Es hat somit den Anschein, daß der vorliegende Mikroorganismus analog zu Corynebacterium rathayi oder Corynebacterium agropyri ist. Aus der nachstehenden Tabelle II ist jedoch ersichtlich, daß der vorliegende Mikroorganismus sich von den vorgenannten analogen Arten nicht nur bezüglich der Fähigkeit zur Gelatineverflüssigung, sondern auch in anderen physiologischen Merk-

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malen "beträchtlich unterscheidet. Die Fähigkeit zur Gelatineverflüssigung ist ein wichtiges Kriterium "bei der Klassifikation der analogen Mikroorganismen.

Tabelle. II

	Vorliegender Mikroorganismus AiECC 21749	Coryne- bacterium rathayi	Coryne- bacterium agropyri
Gelatineverflussigung	stark	langsam	ke ine
Gr am-I?är bung	positiv	positiv	variabel
Wachstum in Nährlösung	mäßig	schwach	mäßig
\ Wachstum in Lackmus milch	wird alkalisch reduzierend, braun, Ring.	wird al kalisch, reduzie rend, gelb, Ring.	unverändert Sediment.
Spaltung von Zuckern;
Glucose	+	+	+
Lactose	—	+ .	+
Saccharose	-	+	+
Stärkehydrolyse	—	nicht be schrieben	+

Da die Klassifizierung des vorliegenden Mikroorganismus in
eine der vorgenannten Arten schwierig ist und der Mikroorganismus, wie bereits beschrieben, Harnsäure mit hoher Aktivität
oxidativ abbaut, wird dieser neue Mikroorganismus als Corynebacterium uratoxidans nov.sp. bezeichnet. Der Stamm U-23 erliielt die FERM-P-Nr. 789 und die ATCC Nr. 21749.

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Aus der natürlichen Quelle wurden weitere neue, Uricase-produzierende Mikroorganismen, wie Corynebacterium uratoxidans U-S ATGC 2175O, Corynebacterium uratoxidans U-JO ATTC 21751 und Corynebacterium uratoxidans U-125 ATCC 21752 isoliert. Obwohl zwischen den Stämmen geringe Unterschiede in untergeordneten Merkmalen bestehen, gehören sämtliche dieser Stämme zu den coryneformen Bakterien und weisen alle als besonderes Merkmal eine hohe Uricasebildung auf. Die taxonomisehen Merkmale dieser Stämme sind in der Tabelle III zusammengestellt.

Tabelle III

Stamm

ATCC

21749

Stamm

ATCC

21750

Stamm

ATCC

21751

Stamm

ATCC

21752

Be we gli chke it
Begeißelung

Wirkung auf
Nitrate

fehlt

fehlt

fehlt

fehlt

fehlt

fehlt

fehlt

fehlt

starke starke starke starke Reduktion Ruduktion Reduktion Reduktion

Pigmentbildung schwachauf Agar-Nährboden gelb

schwach gelblichbraun

schwach gräulichcremfarben weiß

Gelatineverflüs	stark	stark	stark	stark
sigung
Aussehen der Ko	kreisför	kreis	kreis	kreis
lonien auf Agar-	mig,	förmig,	förmig ;	förmig 7
Nährboden	flach,	erhöht,	erhöht,	flach,
	schwach	schwach	glänzend	glänzend
	glänzend	glänzend		(butter
				artig )

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Die Stämme ATCC 2175O, 2175I und 21752 unterscheiden sich in

von anderen taxonoinisch wichtigen, physiologischen Merkmalen nichts Corynebacterium uratoxidans ATCC 217^9. Diese Uricase-produzierenden Stämme vmrden deshalb ebenfalls- als zur Art Corynebacterium uratoxidans gehörende Bakterien identifiziert. Der Stamm Corynebacterium uratoxidans ATCC 2174-9 is^ ^ein typischer Vertreter dieser neuen Art.

Die Herstellung von Uricase mittels der vorgenannten Stämme wird gewöhnlich in Submerskultur durchgeführt. Dem Nährmedium kann jede Kohlenstoff- und Stiffstoffquelle zugesetzt werden, die von den Uricase-produzierenden Stämmen verwertet v/erden kann. Spezielle Beispiele solcher Kohlenstoffquellen sind GIy- ! cerin, Glucose, Fructose, Xylose, Arabinose, Mannose, Galactose, Saccharose, Maltose, Lactose, Mannit, Dextrin, Stärkehydrolysat und Melasse. Die Kohlenstoffquellen können einzeln oder als'Gemisch eingesetzt werden. Spezielle Beispiele erfindungsgemäß einsetzbarer Stickstoffquellen sind Ammoniak, Harnstoff und verschiedene anorganische und organische Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat und Ammoniumacetat. Ferner sind zur Züchtung der erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismen und zur Bildung beträchtlicher Uricasemengen natürliche organische Nährstoffe geeignet. Spezielle Beispiele solcher Nährstoffe sind Hefeextrakt, Peptone, Fleischextrakt, Caseinhydrolysat', Maisquellwasser, Fischmehl oder abgebautes , Fischmehl und Quellwasser von Sojabohnen, Weizenkleie oder Humusboden. Diese Nährstoffe können allein oder als Gemisch verwendet werden. Der Nährlösung werden ferner anorganische Salze,

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wie einbasiges Kaliumphosphat, zweibasiges Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid, Eisen(III)- oder Eisen(II)-chlorid oder Eisen(III)- oder Eisen(II)-sulfat, in geeigneten Konzentrationen als Gemisch zugesetzt.

Die "bisher bekannten, zur Bildung von Uricase in den Zellen befähigten Mikroorganismen neigen dazu, daß die induktive Bildung von Uricase in Gegenwart anorganischer und/oder organischer Stickstoffquellen gehemmt wird. Es ist überraschend, daß im erfindungsgemäßen einstufigen Verfahren unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Mikroorganismen die üricasebildung bei geeigneter Anwendung dieser anorganischen und/oder organischen Stickstoffquellen erhöht wird.

Eine zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugte NährlÖ!
Volumen):

te Nährlösung hat die nachstehende Zusammensetzung (Gewicht/

0,1 "bis 5 Prozent Glycerin,

0,01 bis 0,5 Prozent einbasiges Ka-

1iumpho sphat,

0,01 bis . 0,1 Prozent Magnesiumsulfat,

0,0005 bis 0,005 Prozent Eisen(III)-

chlorid und

0,01 bis 1 Prozent Hefeextrakt.

Der pH-Wert der nährlösung beträgt 5>5 bis 9*0 und liegt vorzugsweise im neutralen bis schwach alkalischen Bereich .(pH 6,5 bis 8,0).

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Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die vorgenannten Mikroorganismen zur Herstellung einer Anzuchtkultur 12 bis 24 Stunden bei 25 bis 4O°C in einer Nährlösung der vorstehend angegebenen Zusammensetzung gezüchtet. Mit dieser Anzuchtkultur wird eine Nährlösung der vorstehend angegebenen Zusammensetzung beimpft. Vor oder nach Beginn des Züchtens der Hauptkultur wird die Nährlösung mit 0,01 bis 1,0 Gewichts-Volumprozent Harnsäure versetzt. Vorzugsweise erfolgt das Versetzen der Nährlösung mit Harnsäure während der ersten 8 Stunden, insbesondere während der ersten 5 Stunden nach dem Züchtungsbeginn der Hauptkultur.

Das Züchten kann bei jeder Temperatur durchgeführt werden, bei der die Mikroorganismen wachsen können. Die Züchtungstemperatur beträgt erfindungsgemäß vorzugsweise 20 bis 40⁰C und insbesondere 32 bis 37°C. Im Hinblick auf die Bildung beträchtli-

stabiler
eher Mengen/Uricase wird die Züchtung vorzugsweise nach Zugabe der Harnsäure noch weitere 30 bis 50 Stunden durchgeführt. Die Züchtung erfolgt unter aeroben Bedingungen in Submerskultur oder in Schüttelkultur. Während des einstufigen Züchtens bilden die erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismen beträchtliche Mengen an Uricase und akkumulieren diese nicht nur in den Zellen, sondern auch im extrazellulären Raum.

Die Aktivität der aus den Zellen der erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismen erhaltenen Uricase ist gleich oder*Köher als die Aktivität der Uricase, die aus den Stämmen nach dem bekannten dreistufigen Verfahren erhalten wird. Erfindungsgemäß

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BADiORiGlNAL

kann somit auch die intrazelluläre Uricase in effektiver V/eise isoliert v/erden.

Wenn der vorstehend beschriebenen Nährlösung Alkohole mit 1 bis 8 C-Atomen zugesetzt werden, wird die Bildung von Uricase im erfindungsgemäßen Verfahren beträchtlich erhöht, und es werden große Mengen dieses Enzyms von den Zellen ausgeschieden und in der Nährlösung akkumuliert. Die Züchtung kann in der vorstehend beschriebenen V/eise mit der Ausnahme durchgeführt werden, daß die Nährlösung bei der Hauptkultur mit mindestens einem der vorgenannten Alkohole versetzt wird.

Die Alkohole können der Nährlösung vor oder nach der Zugabe der Harnsäure zugesetzt v/erden. Es ist nicht immer erforderlich, die Nährlösung gleichzeitig mit Harnsäure und den Alkoholen zu versetzen. Die Züchtung der Mikroorganismen in den alkoholhaltigen Nährlösungen wird vorzugsweise nach der Zugabe der Harnsäure noch 20 bis 40 Stunden durchgeführt.

Durch die Zugabe der Alkohole wird, verglichen mit der Uricasebildung in Abwesenheit von Alkoholen, die Uricasebildung beträchtlich gesteigert und die zur Züchtung benötigte Zeit verkürzt. Ferner wird eine große Uricasemenge im extrazellulären Raum angereicherti

Als Alkohole mit 1 bis 8 C-Atomen werden z.B. Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, Amylalkohol, Hexylalkohol, Heptylalkohol, Oktylalkohol und deren Isomere eingesetzt. Vorzugsweise v/erden Alkohole mit 3 bis 6 C-Atomen allein oder als Gemisch einge-

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setzt. Vorzugsweise wird die Nährlösung mit 0,1 bis 3>0 Volumprozent Alkohol versetzt. Wenn die Alkoholkonzentration 3»O Volumprozent übersteigt, wird das Wachstum der erfindungsgemäß · . eingesetzten Mikroorganismen gehemmt. Das Temperaturoptimum bei der Züchtung in Gegenwart von Alkohol beträgt 28 bis 32°C.

Der Einfluß des AlkoholZusatzes auf die Uricasebildung ist in den nachstehenden Vergleichsversuchen beschrieben.

P Vergleichsversuch 1

Eine 1 Gewichts-Volumprozent Fleischextrakt, 0,1 Gewichts-Volumprozent einbasiges Kaliumphosphat, 0,02 Ge-wichts-Volumprozent Magnesiumsulfat, 0,001 Gewichts-Volumprozent Eisen(III)-chlorid und 0,2 Gewichts-Vplumprozent Hefeextrakt enthaltende Nährlösung vom pH 7*0 wird mit Corynebacterium uratoxidans ATCC 21749 beimpft und 20 Stunden bei 3O⁰C unter aeroben Bedingungen inkubiert. Mit der so erhaltenen Anzuchtkultur wird in · einer Konzentration von 1 Volumprozent eine 1 Gewichts-Volum-™ prozent Glxcerin, 0,10 Gewichts-Voluaprozent einbasiges Kaliumphosphat, 0,02 Gewichts-Volumprozent Magnesiumsulfat, 0,001 Gewichts-Volumprozent Eisen(III)-chlorid und 0,2 Gewichts-Volumprozent Hefeextrakt enthaltende Nährlösung vom pH 7»0 "beimpft. Die beimpfte Nährlösung wird bei 32⁰C unter aeroben Bedingungen inkubiert. 3 Stunden nach Beginn der Inkubation wird die Nährlösung mit 0,3 Gewichts-Volumprozent Harnsäure versetzt. Eine andere Nährlösung wird ebenfalls 3 Stunden nach Beginn der Inkubation mit 0,3 Gewichts-Volumprozent Harnsäure und gleichzeitig mit 0,3 Volumprozent 2-Pentanol versetzt. Die

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BADORIGINAt. · ^ ic _n ·

Inkubation wird insgesamt 23 bzw. 40 Stunden unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle XV" zusammengestellt.

Tabelle U

Wirkung des Zusatzes von 2-Pentanol auf die Uricasebildung

	Uricaseaktivität pro ml Kulturbrühe, Einiieit*	ohne 2-Pentanol	insgesamt 4ostündige Inkubation
	mit 2-Pentanol	insgesamt 23- stündige Inku bation	1,20 (96%)
	insgesamt 23- stündige Inku bation	0,7 (87,5%)	0,05 W)
Uricase im Kultur- filtrat	2,3 (97,9%)	0,1 (12,5%)	1,25 (100%)
Uricase in den Zellen (zellfreier Extrakt)**.	0,05 (2,1%)	0,8 (100%)
Summe	2,35 (100%)

* .1 Einheit der Uricaseaktivität ist die Enzymmenge, die in 1 Minute bei 3O⁰C in einem Boratpxtffer (pH 9,0) 1 Mikromol Harnsäure zu Allantoin oxidiert.

** .'Gesamtaktivität der intrazellulären Uricase pro ml der ursprünglichen Kulturbrühe.

Aus der Tabelle IV ist ersichtlich., daß die Alkoholzugabe folgende Effekte hat:

(1) Die Uricasebildung wird auf etwa das Doppelte erhöht.

(2) Die Abscheidung der Uricase aus den Zellen in den extrazellulären Raum wird beträchtlich verstärkt.

BAD OBfQINAL

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Durch die Alkoliolzugabe wird somit die Uricasemenge im extrazellulären Raum beträchtlich erhöht, und die Isolierung der im extrazellulären Raum akkumulierten Uricase folglich wesentlich erleichtert.

Es hat den Anschein, daß die Zellen der Mikroorganismen durch den Alkoholzusatz in gewisser Weise verändert werden, wodurch, die Permeation der Harnsäure, die ein Induktor für Uricase ist, ψ in die Zellen erhöht wird. Hierdurch wird die induktive Uricasebildung verstärkt und die Abscheidung der Uricase aus den Zellen erhöht.

Es ist bekannt, daß organische Lösungsmittel, wie Toluol, Chloroform und Essigsäureäthylester, und oberflächenaktive Mittel die Oberflächenschichten von Zellen von Mikroorganismen verändern und den Austritt von Zellinhaltsstoffen bewirken. Bei den erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismen sind diese Verbindungen jedoch nicht wirksam; nur die vorgenannten Alkohole üben eine bemerkenswerte Wirkung aus.

Vergleichsversuch 2 ·

Die Wirkungen der Zugabe verschiedener Alkohole zu: der Nährlösung werden unter denselben experimentellen Bedingungen wie im Vergleichsversuch 1 untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengestellt. ·

BAD ORIGFNALr

/0323

Tabelle V

Wirkung des Zusatzes von 0,3 Volumprozent Alkohol auf die Bildung extrazellulärer Uricase, Einheiten / ml Kulturfiltrat

Alkohol	insge samt 23stündige Inkubation	insgesamt 40stündige Inkubation
n-Propanol	0,9	1,5
iso-Propanol	0,9	1,5
n-Butanol	1,0	1,2
iso-Butanol	1,2	1,2
sek.-Butanol	1,5	1,5
tert.-Butanol	1,0	1,5
n-Ämy1alkoho1	2,0	2,1
iso-Amylalkohol	2,2	2,1
3-Methylbutano1	0,8	1,5
sek.-Amylalkohol (Diäthylcarbinol)	2,2	2,2
sek.-η-Amylalkohol (2-Pentanol)	2,5	2,4
sek.-iso-Amylalkohol	1,5	1,6
tert.-Amylalkohol	0,9	1,5
sek.-Hexanol (Methyl-iso-butyl-	1,5

carbinol)

keine Alkoholzugabe (Kontrolle)

0,7

1,2

Ähnliche Wirkungen der Älkoholzugabe werden auch mit den anderen erfxndungsgemaßen Mikroorganismen erhalten.

Die Isolierung der Uricase aus der Kulturbrühe wird in folgender Weise durchgeführt. Die Uricase kann erfindungsgemäß nach

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beendeter Züchtung aus der Kulturbrühe nach jeder bekannten Methode isoliert v/erden. Da im erfindungsgemäßen "Verfahren die Uricase hauptsächlich als extrazelluläres Enzym Vorliegt, wird eine Rohenzymlösung durch Entfernen der Zellen aus der Kulturbrühe erhalten. Die so erhaltenen KuIturfiltrate oder die daraus hergestellten lyophilisierten Pulver können als Rohenzym verwendet werden.

Die Rohenzymlösung wird, falls notwendig, konzentriert und dann ^ zur Ausfällung des Enzyms mit einem Lösungsmittel, wie Aceton oder einem Alkohol, versetzt oder z.B. mit Ammoniumsulfat ausgesalzen, wobei ein Rohenzympräparat erhalten wird.

Zur Extraktion der intrazellulären Uricase werden die Zellen .in üblicher Weise aufgebrochen oder mit bakteriolytischen Enzymen behandelt. Die Zellen,können auch mit Toluol geschüttelt zusammen mit Toluol
oder ^v stehengelassen werden, wobei Autolyse eintritt. Die so erhaltene Lösung wird zur Entfernung der festen Bestand-

»teile z.B. filtriert oder zentrifugiert. Falls notwendig,wererhaltenen Lösung den die Nucleinsäuren aus der / entfernt. Die Lösung wird dann zur Fraktionierung z.B. mit Aminoniumsulfat, einem Alkohol oder Aceton versetzt. Das ausgefallene Material wird gesammelt und gegen eine Pufferlösung, z.B. gegen einen Boratpuffer, dialysiert. Das Dialysat wird lyophilisiert, wobei ein ' Rohenzympräparat erhalten wird. Zur weiteren Reinigung dieses Rohenzympräparats können z.B. die nachstehenden Methoden al- * lein oder in Kombination angewendet werden: Chromatographie an einem Ionenaustauscher, wie Diäthylaminoäthylcellulose oder Triäthylaminoäthylcellulose, Gelfiltration an einem üblichen.

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BAD ORIGINAL ^!«^{; v}^ ^i

Molekularsieb, Adsorption-Elution an Hydroxyapatit oder Elektrophorese mit Polyacrylamidgel. Auf diese V/eise kann ein hochgereinigtes Enzympräparat hergestellt werden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Bei spielt

800 ml einer Nährlösung, die 1 Gewichts-Volumprozent Glycerin, · 0,1 Gewichts-Volumprozent einbasiges Kaliumphosphat, 0,02 Gewicht s-Volumpr ο ζ ent Magnesiumsulfat, 0,001 Gewichts-Volumprozent Eisen(III)-chlorid und 0,2 Gewichts-Volumprozent Hefeextrakt enthält und einen pH-Wert von 7 hat, werden in einem •5 Liter fassenden konischen Gefäß 15 Minuten bei einem Druck ' ■< von 1 atü sterilisiert. Die sterilisierte Nährlösung wird mit i

Anzuchtkultur
8 ml einer / beimpft, die durch 24stündiges Vorinkubieren von Corynebacterium uratoxidans ATCC 21749 in einer Nährlösung der vorstehend angegebenen Zusammensetzung erhalten wurde. Die Inkubation wird bei 34⁰C in einer Rotationsschüttelmaschine (I50 UpM) durchgeführt.

3 Stunden nach Beginn der Inkubation wird die Kulturbrühe mit einer Suspension von 2,4 g Harnsäure in 30 ml sterilem Wasser versetzt. Die Inkubation wird weitere 40 Stunden fortgesetzt, ' wobei dann750 ml eines Kulturfiltrats mit einer Uricaseaktivität von 1,2 Einheiten/ml erhalten werden.

Das Kulturfiltrat. wird auf 150 ml eingeengt und dann der Acetonfällung unterworfen. Die bei einem Acetongehalt von.50

BAD ORIQiNAl?⁰⁹⁸³¹

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70 Volumprozent erhaltene Fällung wird isoliert, wobei 155 mg rohe Uricase in Pulverform erhalten v/erden. Das Präparat hat eine Uricaseaktivität von etwa 4,1 Einheiten/mg Protein und eine Gesamturicaseaktivität von 630 Einheiten.

Beispiel.2

700 ml einer Nährlösung, die 1 Gewichts-Volumprozent Glycerin, 0,1 Gewichts-Volumprozent einbasiges Kaliumphosphat, 0,02 Gewichts-Volumprozent Magnesiumsulfat, 0,001 -Gewichts-Volumprο-zent Eisen(III)-chlorid und 0,2 Gewichts-Volumprozent Hefeextrakt enthält und einen pH-Wert von 7,0 hat, v/erden in einem 5 Liter fassenden konischen Gefäß wie in Beispiel 1 sterili-■siert. Die sterilisierte Nährlösung wird mit 3,5 ml einer Anzuchtkultur von Corynebacterium uratoxidans ATCG 2174-9 beimpft, die durch 12stündiges Vorinkubieren in einer Nährlösung der vorstehenden Zusammensetzung hergestellt wurde. Die Inkubation wird bei 3O⁰C auf einer Rotationsschütte!maschine (150 UpM) durchgeführt. · ·

2 Stunden nach Beginn der Inkubation wird die Kulturbriihe mit einer Suspension von 2,1 g Harnsäure in 10 ml TOvolumprozentigem Äthanol '. und 2,1 ml iso-Amylalkohol versetzt. Die Inkubation wird weitere· 22 Stunden fortgesetzt, wobei dann 650 ml eines Kulturfiltrats mit einer Uricaseaktivität von 2,3 Einheiten/ml erhalten werden.

• Liter

6,5/ des so erhaltenen KuIturfiltrats mit einer Uricaseaktivität von 2,3 Einheiten/ml werden auf eine vorher mit 1/25 m-

Boratpufferlösving (pH 9_?O) gepufferte Diäthylaminoäthylcellu-Io se-Säule (4 χ 50 cm) gegeben. Die Säule wird mit der vorgenannten Pufferlösung gewaschen und dann mit einem Natriumchloridgradienten (0 bis 0,7 ei) eluiert, wobei die.Uricase bei einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 bis 0,45 m erhalten wird. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, wobei 5^0 ml einer Enzymlösung mit einer Uricaseaktivität von 19 »4- Einheiten/ml erhalten werden.

Diese Enzymlösung wird der Acetonfällung unterworfen. Die bei einem Acetongehalt von 50 bis 75 Volumprozent erhaltenen Niederschläge werden isoliert und dann in einer 1/25mBoratpufferlösung (pH 9iO) gelöst. Nach dem Abzentrifugieren unlöslicher Bestandteile werden 15 ml einer Enzymlösung mit einer Uricaseaktivität von 627 Einheiten/ml erhalten.

Die so erhaltene Enzymlösung wird der Gelfiltration an einer Säule aus vernetzten Dextran (4 χ 95 cm) unterworfen. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, wobei 156 ml einer gereinigten Enzymlösung mit einer Uricaseaktivität von 42,14 Einheiten/ml und einer Gesamturicaseaktivität von 6573 Einheiten erhalten werden. Die Ausbeute der Uricaseaktivität in der gereinigten Enzymlösung beträgt etwa 44 Prozent, bezogen auf die Uricaseaktivität des Kulturfiltrats. Die spezifische Aktivität der so hergestellten Uricase beträgt 23,36 Einheiten/mg Protein.

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Beispiel 3

Liter
15/ einer Nährlösung, die 1 Gewichts-Volumprozent Glycerin, 0,1 Gewichts-Volumprozent einbasiges Kaliumph.osph.at, 0,02 Gewichts-Volumprozent Magnesiumsulfat, 0,001 Gewichts-Volumprozent Eisen(III)-chlorid und 0,2 Gewichts-Volumprozent Hefeextrakt enthält und einen pH-Wert von 7>0 hat, werden in einem Liter
30 /' fassenden Fermenter aus Glas 15 Minuten "bei einem Druck

von 1 atü sterilisiert. Die sterilisierte Nährlösung wird mit ™ 200 ml einer Anzuchtkultur beimpft, die durch Vorinkubieren von Corynebacteriuiu urutoxidans ATCC 21749 in einem konischen Gefäß, das eine Nährlösung der vorstehenden Zusammensetzung enthält, erhalten wurde. Die Inkubation wird bei 3O⁰C unter Rühren mit 200 UpM und einer Belüftung von 10 Liter/Minute durchgeführt.

3 Stunden nach Beginn der Inkubation wird die Kulturbrühe mit einer Suspension von 30 g Harnsäure in 100 ml

^ gern Äthanol und 4-5 ml iso-Amylalkohol versetzt. Die Inkubation

P Liter

wird weitere 20 Stunden fortgesetzt, wobei dann 14-,2/ eines Kulturfiltrats mit einer Uricaseaktivität von 2,2 Einheiten/ml erhalten werden. Die Gesamtmenge der erhaltenen Zellmasse beträgt 5>6 g, bezogen auf das Trockengewicht, Die Zellen werden einer 5minütigen Ultraschallbehandlung (20 kHz) unterworfen. Die so erhaltene intrazelluläre Uricaseaktivität beträgt 120 Einheiten/g Zellmasse, bezogen auf das Trockengewicht .

Liter
14 / des Kulturfiltrats werden auf eine vorher mit einer

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1/25 m Boratpufferlösung (pH 9>O) gepufferte D i ät hy 1 aminoäthylcellulose-Säule (4 χ 90 cm) gegeben. Die Säule wird mit

Liter
etwa 5/ einer Pufferlösung der vorstehenden Zusammensetzung gewaschen und dann mit einem Natriumchloridgradienten (0 bis 0,7 Di) eluiert, wobei die Uricase bei einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 bis 0,4-5 m erhalten wird. Die aktiven Fraktionen v/erden gesammelt, wobei eine gereinigte Enzymlösung mit einer Uricaseaktivität von 8,5 Einheiten/mg Protein und einer Gesamturicaseaktivität von 26 180 Einheiten erhalten wird. Die gereinigte Lösung "</ird dann gegen eine 1/50 m_#Boratpufferlösung (pH 9₅O) dialysiert und dann lyophilisiert, wobei etwa 3 g rohe Uricase in Pulverform erhalten werden.

Beispiel 4

Die Stämme Gorynebacterium uratoxidans ATGG 21750, 21751 und 21752 werden Jeweils in Gegenwart oder in Abwesenheit von 2-Pentanol oder iso-Amy!alkohol inkubiert. Die Inkubation wird in 800 ml einer sterilisierten Nährlösung mit der im Beispiel 1 angegebenen Zusammensetzung in einem 5 Liter fassenden konischen Gefäß durchgeführt. Die Nährlösung wird mit jeweils 8 .ml Anzuchtkultur der vorgenannten Stämme beimpft. Die Inkubation wird in sämtlichen Fällen auf einer RotationsSchüttelmaschine (150 UpM) bei der in der nachstehenden Tabelle YI angegebenen Inkubationsfcemperabur und Inkubationszeit durchgeführt. 3 Stunden nach Beginn der Inkubation wird die jeweilige Kulturbrühe mit Harnsäure ο·'.[<■:ν mit Harnsäure und Alkohol in Mengen von ?.J\- v\ Εί-ί^ηπαιΗ-β bzw, 2,4 ml Alkohol vernetzt. Die Uricaseakti-■ ■ ■'■'· - '·-. '- -'α' im".: illvixt Λ u> yi-iVfiumnnlan οΐ;ϋ.Λΐΐϊΐ'.-ί sind Ln der

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Tabelle VI zusammengestellt.

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Tabelle VI

Ni O CO 00

co IO

	Corynebacterium uratoxidans ATCC 21-750	iso-Amyl alkohol	40'	Corynebacteriuai uratoxidans ATCC 21751	iso-Amyl alkohol	-	Corynebacteriuin uratoxidans ATCC 21752	iso-Amyl- alkoho1	-
Alkohol	2-Penta- nol	30	0,8	2-Penta- nol	30	34	2-Penta- nol	• 30	34
Inkuba- tions- tenroera- tur'°c	30	24	30	24 '	40	30	24	40
Inkuba tions zeit Stunden	24	1,6	24	1,9	1,2	■ 24	1,2	1,0
Uricase- aktivität, Einhei ten/ml Kultur- filtrat	. I»8		1,5	1,9

cn O OO

Claims (10)

- 28 Patentansprüche

1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Uricase, dadurch gekennzeichnet, daß man einen zur Produktion von Uricase befähigten Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium in einer Harnsäure enthaltenden Nährlösung unter aeroben Bedingungen züchtet und die in der Kulturbrühe angereicherte Uricase isoliert.

_

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus der Art Corynebacterium uratoxidans einsetzt.

3· Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Corynebacterium uratoxidans ATCC 2174-9, ATCC 21750, ATCC 21751 oder ATCC 21752 einsetzt.

4-. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet,

daß man eine Nährlösung einsetzt, die mindestens einen P Alkohol enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 4-, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Nährlösung einsetzt, die einen Alkohol mit 1 bis S C-Atomen enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Nährlösung einsetzt, die einen Alkohol mit 3 "bis 6" C-Atomen enthält.

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7.-Verfahren nach Anspruch 4- bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Nährlösung einsetzt,'die 0,1 "bis 3>OVolumprozent Alkohol enthält.

8. Verfahren nach Anspruch Λ "bis 7i dadurch gekennzeichnet, daß man eine Nährlösung einsetzt, die 0,01 "bis 1,0 Gewichts-Volumprozent" Harnsäure enthält.'

9. Verfahren nach Anspruch 1 "bis 8, dadurch gekennzeichnet,

daß man den Mikroorganismus hei Temperaturen von 20 bis- 40⁰C i und· pH-V7erten von 5,0 bis 9?Ö züchtet.

10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9j dadurch gekennzeichnet, daß man die extrazelluläre Uricase aus dem Kulturfiltrat isoliert.

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