DE3689181T2

DE3689181T2 - Thermostabile Tryptophanase, Verfahren zu deren Herstellung und thermostabile Tryptophanase erzeugender Mikroorganismus.

Info

Publication number: DE3689181T2
Application number: DE86304311T
Authority: DE
Inventors: Teruhiko Beppu; Seibun Suzuki
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1985-06-08
Filing date: 1986-06-05
Publication date: 1994-05-05
Anticipated expiration: 2006-06-06
Also published as: DE3689181D1; EP0206595A3; US4761374A; DK267086D0; EP0206595A2; JPH0364107B2; EP0206595B1; DK267086A; JPS61282076A

Description

Die Erfindung betrifft wärmebeständige Tryptophanase, die geeignet ist zum Beispiel zur industriellen Synthese von Tryptophan, ein Verfahren zur Herstellung der Tryptophanase durch ein Fermentationsverfahren sowie einen thermisch stabile Tryptophanase bildenden Mikroorganismus.
Tryptophanase ist bekannt als ein Enzym, das nicht nur eine α,β-Aufspaltreaktion unter Bildung von Pyruvat, Indol und Ammoniak aus L-Tryptophan in Gegenwart von Pyridoxalphosphat (PLP) katalysiert, sondern auch die umgekehrte Reaktion, die Bildung von L-Tryptophan aus Indol, Pyruvat und Ammoniak. Tryptophanase wurde isoliert aus Mikroorganismen, hauptsächlich aus der Gruppe Enterobacteriaceae wie Escheirichia coli, Aeromanas liguefaciens und Proteus rettgeri (E. E. Shell, Advance of Enzymologie, S. 287 bis 333 und T. Backeriol. 98 (I), S. 167 bis 171, April 1969).
Bekannte Tryptophanasen besitzen eine optimale Temperatur für die Aktivität bei pH 8,0 von etwa 33 bis 35ºC und werden im wesentlich thermisch inaktiviert, wenn sie 40 min bei Temperaturen von mindestens etwa 40ºC bei einem pH-Wert von 8,0 gehalten werden. Der Mangel an Wärmebeständigkeit schränkt die Anwendungsgebiete ein, für die bekannte Tryptophanasen angewandt werden können.
Die vorliegende Erfindung liefert eine thermisch stabile Tryptophanase, die
(1) eine optimale Temperatur für die Aktivität bei pH 8,0 von etwa 70ºC aufweist;
(2) nicht thermisch desaktiviert wird, wenn sie 40 min bei Temperaturen bis zu etwa 65ºC und einem pH-Wert von 8,0 gehalten wird und
(3) aus L-Tryptophan, in Gegenwart von Pyridoxalphosphorsäure, Brenztraubensäure, Indol und Ammoniak bildet.
Die erfindungsgemäße Tryptophanase hat vorzugsweise auch die folgenden Eigenschaften
(4) sie baut Tryptophan, S-Methyl-L-cystein, L-Cystein und 5-Methyl-L-tryptophan ab und
(5) besitzt einen optimalen pH-Bereich von 7,0 bis 7,5 bei 65ºC und einen stabilen pH-Bereich von 6 bis 10 bei 25ºC.
Die erfindungsgemäße Tryptophanase kann hergestellt werden nach einem verfahren, umfassend das Züchten eines Gemisches von Bacterium Stamm T und Bacillus sp. Stamm S, wobei das Gemisch hinterlegt ist als FERM BP-810, in einem Tryptophan enthaltenden Kulturmedium, und Gewinnung der erhaltenen thermisch stabilen Tryptophanase aus der Kulturbrühe.
Bacterium Stamm T ist ein neues Tryptophanase bildendes Bakterium, das einzigartige Wachstumscharakteristika besitzt und aus einer Bodenprobe isoliert wurde. Dieses Tryptophanase bildendes Bakterium wächst nicht allein in einem natürlichen Medium oder einem tryptophanhaltigen synthetischen Medium, sondern wächst dort in Gegenwart von Bacillus sp. Stamm S. Es wächst so nur aktiv und vermehrt sich nur, wenn der Bacillus Stamm S vorhanden ist und gleichzeitig wächst, z. B. in einem synthetischen flüssigen Medium enthaltend Tryptophan, dessen pH-Wert mit Phosphat eingestellt ist, bei einer Temperatur von etwa 58 bis 63ºC unter leichtem Bewegen oder Stehen unter Bildung eines gemischten Kulturproduktes mit starker enzymatischer Aktivität.
Der Bacillus sp. Stamm S ist ebenfalls ein neuer Stamm. Er gehört zu der Gattung Bacillus, die Sporen bildet und er kann in allgemeinen Medien für Bakterien rein gezüchtet werden. Er zeigt physiologische Eigenschaften, die angegeben sind durch (i)' negative Indolbildung und (ii)' negative Nitratreduktion, und er zeigt nicht die Fähigkeit, Tryptophanase zu bilden, weder allein noch in Gegenwart des thermisch stabilen Tryptophanase bildenden Bakteriums, in einem tryptophanhaltigen synthetischen Medium.
Bacterium Stamm T, das nicht allein in einem tryptophanhaltigen synthetischen Medium wächst, sondern dort in Gegenwart von Bacillus sp. Stamm S wächst, unter Bildung und Ansammlung der thermisch stabilen Tryptophanase innerhalb der Zellen, wird aus einer Bodenprobe isoliert, aus einer Umgebung mit hoher Temperatur, wie heißen Quellen und Komposthaufen.
Das Isolationsverfahren wird unten beschrieben.
Eine Bodenprobe aus einer Umgebung hoher Temperatur, wie heißen Quellen und Komposthaufen, wird in ein flüssiges Trp-PEP-Medium, das noch beschrieben wird, gegeben, das ein Tryptophanase induzierendes Medium ist, dessen pH-Wert mit einem Phosphat eingestellt ist. Sie wird einer Schüttelkultur bei etwa 60 bis 70ºC in einem L-förmigen Teströhrchen unterworfen und die Züchtung, die zur Indolbildung führt, wie durch Kovac's Reagenz nachgewiesen wird angewandt, um den Tryptophanase bildenden Stamm abzutrennen. Der bei etwa 60ºC wachsende Tryptophanase bildende Stamm wird aus der Kultur gereinigt durch ein Verdünnungsverfahren und ferner durch Ausnutzung der Resistenz gegenüber Bacitracin, unter Bildung eines gereinigten Tryptophanase bildenden Stammes.
Die den Tryptophanase bildenden Stamm enthaltende Kultur wird einer festen Agar-Kultur auf übliche Weise unterworfen und es wird eine Trennung von Kolonien versucht. Es wird jedoch bei allen untersuchten festen Agar-Medien keine Bildung von Kolonien beobachtet. Die von der Kultur gewonnene Zellsuspension wird auf ein Trp-PEP-Agar-Medium aufgebracht, dessen Oberfläche mit einem Membranfilter bedeckt ist (100 bis 200 Zellen pro Platte) und unter Bildung von Kolonien bei etwa 60ºC gezüchtet. In bezug auf die entstandenen Kolonien wurde mit Kovac's Reagenz Indolbildung nachgewiesen und die Kolonien können in Indol bildende Kolonien und kein Indol bildende Kolonien getrennt werden.
Die Indol bildenden Kolonien werden erhalten als gemischte Kolonien aus zwei Arten von Bacilli mit verschiedenen Zellgrößen und die kein Indol bildenden Kolonien können erhalten werden als Kolonien, bestehend aus einer der zwei Arten von Bacilli.
Der Stamm, der entweder allein oder als Gemisch in dem oben angegebenen tryptophanhaltigen synthetischen Medium wächst, aber nicht die Fähigkeit zeigt, selbst Tryptophanase zu bilden (kein Indol bildender Stamm) wurde gemäß der Erfindung Bacillus sp. Stamm S benannt. Das thermisch stabile Tryptophanase bildende Bakterium, das als Gemisch mit Bacillus sp. Stamm S isoliert werden kann und nicht allein in einem tryptophanhaltigen synthetischen Medium wächst, aber dort in Gegenwart des Bacillus sp. Stammes S unter Bildung und Ansammlung einer thermisch stabilen Tryptophanase innerhalb der Zellen, wurde im Rahmen der Erfindung als Bakterium Stamm T benannt.
Das thermisch stabile Tryptophanase bildende Bakterium nach der Erfindung, das als Gemisch mit dem Bacillus sp. Stamm S aus einer Bodenprobe aus einer Hochtemperaturumgebung, wie oben angegeben, isoliert werden kann, kann kontinuierlich gezüchtet werden und als das oben erwähnte Gemisch in einem synthetischen flüssigen Medium (Trp-PEP flüssiges Medium) mit der folgenden Zusammensetzung, enthaltend Tryptophan, bei dem mit einem Phosphat eingestellten pH-Wert aufbewahrt werden oder es kann als trockene L-Zellen (Gemisch) gelagert werden.

Flüssiges Trp-PEP-Medium:

Zusammensetzung auf 100 ml
L-Tryptophan 0,2 g
Polypepton 0,5 g
Hefeextrakt 0,1 g
K&sub2;HPO&sub4; 0,3 g
KH&sub2;PO&sub4; 0,1 g
MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,05 g
Pyridoxal-5'-Phosphat 0,05 g
Der pH-Wert des Mediums beträgt 6,8 bis 7,0.
Das thermisch stabile Tryptophanase bildende Bakterium, Bakterium Stamm T, das als Gemisch mit Bacillus sp. Stamm S aus einer Bodenprobe aus einer Hochtemperaturumgebung isoliert werden kann, wie oben angegeben und als solches gezüchtet und aufbewahrt werden kann oder als trockene L-Zellen gelagert werden kann, kann von dem mitwachsenden Bacillus sp. Stamm S z. B. nach dem folgenden Verfahren abgetrennt werden.
(a) Bakterium Stamm T und Bacillus sp. Stamm S können voneinander getrennt werden nach einem Verfahren des fraktionierten Zentrifugierens unter Ausnutzung der Unterschiede in der Zellgröße.
(b) Bakterium Stamm T und Bacillus sp. Stamm S unterscheiden sich in ihrer Empfindlichkeit gegenüber Lysozym, und Bacillus sp. Stamm S ist empfindlicher dagegen. Unter Ausnutzung dieses Unterschiedes kann Bacillus sp. Stamm S selektiv lysiert werden. Als Ergebnis kann Bakterium Stamm T aus dem Gemisch abgetrennt werden.
Entsprechend den im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Versuchen hat es sich gezeigt, daß das thermisch stabile Tryptophanase bildende Bakterium nach der Erfindung nicht allein in irgendeinem natürlichen oder synthetischen Medium für Mikroorganismen wächst. Daher können mit Ausnahme seiner morphologischen Charakteristika und physiologischen Charakteristika in bezug auf Katalase, seine mikrobiologischen Charakteristika nicht bestimmt werden.

Bakterium Stamm T

a) Morphologische Charakteristika

(1) Größe und Form der Zellen: stäbchenförmig (Durchmesser 0,25 bis 0,35 um, Länge 1,5 bis 7 um), üblicherweise einzeln auftretend.
(2) Pleomorphismus der Zellen: keiner
(3) Mobilität: keine
(4) Sporen: keine
(5) Gramfärbung: negativ, unveränderlich

b) Kulturcharakteristika auf verschiedenen Medien

(1) Nähr-Agar-Kultur: kein Wachstum
(2) Nähr-Agar-Schrägenkultur: kein Wachstum
(3) Kultur in flüssigem Nährmedium: kein Wachstum
(4) Nährgelatine Schrägenkultur: kein Wachstum
(5) Lakmusmilch: kein Wachstum
(6) Tryptophan enthaltendes synthetisches Medium (flüssiges Trp-PEP-Medium): kein Wachstum, wenn es allein kultiviert wird. Es wächst aber in Gegenwart von Bacillus sp. Stamm S (FERM BP-809).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck, daß der "Mikroorganismus nicht allein in einem Tryptophan enthaltenden synthetischen Medium wächst, aber dort in Gegenwart von Bacillus sp. Stamm S unter Bildung und Ansammlung einer thermisch stabilen Tryptophanase innerhalb der Zellen", das er nicht allein in dem oben genannten Trp-PEP-Medium wächst, aber daß er dort in Gegenwart von Bacillus sp. Stamm S wächst, unter Bildung und Ansammlung der thermisch stabilen Tryptophanase innerhalb der Zellen.

c) Physiologische Charakteristika (+: positiv; -: negativ)

(1) Reduktion von Nitrat: Test in der reinen Kultur unmöglich. Aber (+) in Gegenwart von Bacillus sp. Stamm S.
(2) Denitrifikation: Test unmöglich.
(3) MR-Test: Test unmöglich.
(4) VP-Test: Test unmöglich.
(5) Indolbildung: Test unmöglich in der reinen Kultur, aber (+) in Gegenwart von Bacillus sp. Stamm S.
(6) Bildung von Schwefelwasserstoff: Test unmöglich.
(7) Hydrolyse von Stärke: Test unmöglich.
(8) Verwertung von Citronensäure: Test unmöglich.
(9) Verwertung von anorganischen Stickstoffquellen: Test unmöglich.
(10) Bildung von Pigmenten: Test unmöglich.
(11) Urease: Test unmöglich.
(12) Oxidase: Test unmöglich.
(13) Katalase: (+)
(14) Wachstumsbereich (pH, Temperatur etc.): Test unmöglich.
(15) Aerobiose: Test unmöglich.
(16) O-F-Test: Test unmöglich.
(17) Bildung von Säuren und Gasen aus Zuckern: Test unmöglich.

d) Andere Charakteristika

(1) DNA hat einen Guanin-Cytocin (GC)-Gehalt bestimmt nach dem Tm-Verfahren von etwa 65 Mol%.
(2) Es wächst in dem tryptophanhaltigen synthetischen Medium, wie unter b), (6) oben angegeben in Gegenwart von Bacillus sp. Stamm S bei einer Temperatur von etwa 58 bis 63ºC unter leichtem Bewegen oder beim Stehen.
Das Bakterium mit den oben angegebenen Charakteristika ist nirgends in der bekannten Literatur beschrieben (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Aufl.) und wurde im Rahmen der Erfindung als Bakterium Stamm T benannt. Das oben angegebene erstmals erfindungsgemäß isolierte Bakterium ist hinterlegt als Gemisch mit Bacillus sp. Stamm S beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-810, gemäß dem Budapester Übereinkommen bezüglich der internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für Patentverfahren.
Bacillus sp. Stamm S, in dessen Gegenwart das thermisch stabile Tryptophanase bildende Bakterium nach der Erfindung in einem tryptophanhaltigen synthetischen Medium wachsen kann, ist ein neuer Stamm der Art Bacillus, der Sporen bildet und rein in allgemeinen Medien für Bakterien gezüchtet werden kann. Seine mikrobiologischen Charakteristika sind unten beschrieben.

Bacillus sp. Stamm S

a) Morphologische Charakteristika

(1) Größe und Form der Zellen: stäbchenförmig (Durchmesser 0,6 bis 0,9 um, Länge 2,5 bis 6,0 um) üblicherweise einzeln auftretend.
(2) Pleomorphismus der Zellen: keiner
(3) Mobilität: +, periphere Flagella.
(4) Sporen: ellyptisch 1,1 · 2,0 um, gebildet innerhalb und an einem Ende der Zellen.
(5) Gramfärbung: positiv

b) Kulturcharakteristika auf verschiedenen Medien

1. Nähr-Agar-Medium Glatt, farblos oder halbtransparent, glänzend.
2. Flüssiges Nähr-Medium Oberflächenwachstum, das eine weiße Membran bildet.

c) Physiologische Charakteristika (+: positiv; -: negativ)

(1) Reduktion von Nitrat: +
(2) MR-Test: +
(3) VP-Test: -
(4) Indolbildung: -
(5) Beständigkeit gegenüber 0,02% NaN&sub3;: +
(6) Katalase: +
(7) Wachstum in Gegenwart von 5% Salz: -
(8) Wachstumsbereich: Wachstum bei pH 5,7 (+); Wachstumstemperatur 66ºC (Obergrenze), 40ºC (Untergrenze)
(9) Aerobiose: Anaerob
(10) Fermentation von Stärke: +
(11) Fermentation von Arabinose und Xylose: -
(12) Fermentation von Mannit: -
(13) Fermentation von Glukose: +, Gasbildung: (-).
Da er bei 65ºC wächst, ist er Bacillus stearothermophilus ähnlich. Die Testergebnisse bezüglich (9) anaerobes Wachstum, (5) Beständigkeit gegenüber 0,02% NaN&sub3; und (8) Wachstum bei pH 5,7 stimmen jedoch nicht miteinander überein und daher existiert kein entsprechender Stamm in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Aufl . . Folglich wurde er als neuer Stamm identifiziert und nach der Erfindung Bacillus sp. Stamm S benannt. Dieser erstmals im Rahmen der Erfindung isolierte Stamm ist hinterlegt beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology' Japan, unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-809, gemäß dem Budapester Übereinkommen über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für Patentzwecke.
Die Züchtung kann erfindungsgemäß durchgeführt werden durch Beimpfen eines Kulturmediums, enthaltend geeignete Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und Mineralien mit dem thermisch stabile Tryptophanase bildenden Bakterium in Gegenwart von Bacillus sp. Stamm S. Beispiele für die Kohlenstoffquelle sind Glukose, Stärke, Maltose, Natriumsuccinat und Natriumacetat. Beispiele für die Stickstoffquelle sind organische und anorganische Stickstoffquellen wie NH&sub4;Cl, (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, Casaminosäure, Pepton und Hefeextrakt. Beispiele für die Mineralien sind K&sub2;HPO&sub4;, KH&sub2;PO&sub4;, MgSO&sub4;·7H&sub2;O, FeCl&sub3; und Vitamine.
Die Züchtung kann aerob in einem flüssigen Medium, enthaltend L-Tryptophan neben den oben erwähnten Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, Mineralien und Vitaminen, durchgeführt werden. Das Züchtungsverfahren kann entsprechend gewählt werden und kann z. B. eine stationäre Kultur, Schüttelkultur und aerobe Rührkultur sein. Die Züchtung wird bei einem pH-Wert von etwa 6 bis 8 und einer Temperatur von etwa 55 bis 65ºC während etwa 1 bis 3 Tagen durchgeführt.
Nach der Züchtung werden die Zellen gesammelt durch Zentrifugentrennung, Filtration usw. Z. B. kann die erwünschte thermisch stabile Tryptophanase extrahiert werden durch Aufbrechen der Zellen durch beispielsweise Vermahlen von Tonerde und Gewinnung der die thermisch stabile Tryptophanase enthaltenden Fraktion von dem erhaltenen Zellextrakt durch beispielsweise Ammoniumsulfatfraktionierung. Das Enzym kann gereinigt werden durch ein geeignetes Reinigungsverfahren wie Ionenaustausch, Gelfiltration und Säulenchromatographie.
Die thermisch stabile Tryptophanase nach der Erfindung, die wie oben hergestellt werden kann, ist ein neues Enzym, das deutlich unterschieden werden kann von den üblichen Tryptophanasen, indem es eine optimale Temperatur für die Aktivität bei pH 8,0 von etwa 70ºC besitzt und derartige thermische Stabilitätseigenschaft, daß sie nicht thermisch inaktiviert wird, wenn sie bei einer Temperatur von bis zu etwa 65ºC bei pH 8,0 40 min gehalten wird.
Die Eigenschaften der thermisch stabilen Tryptophanasen nach der Erfindung sind unten angegeben.

1. Aktivität

Sie bildet Brenztraubensäure, Indol und Ammoniak aus L-Tryptophan in Gegenwart von Pyridoxalphosphat.

2. Substratspezifität

Sie baut L-Tryptophan, S-Methyl-L-cystein, L-Cystein und 5-Methyl-L-tryptophan ab.

3. Optimaler pH-Wert und stabiler pH-Wert

Optimum pH = 7,0 - 7,5 (65ºC) (s. Fig. 1)
Stabil bei pH 6 - 10 (25ºC, 2 Tage) (s. Fig. 2).
Fig. 1 der beiliegenden Zeichnungen zeigt die Tryptophanaseaktivität des erfindungsgemäßen Enzyms, die bei verschiedenen pH-Werten (bei 65ºC) gemessen wurde unter Verwendung von (1) 50 mM Kaliumphosphatpuffer (- - -), (2) 50 mM Glycin-NaOH-Puffer, enthaltend 10 mK KCl (- - -), (3) 50 mM Glycin/NaOH-Puffer, enthaltend 5 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; ( ) und (4) 50 mM Glycin/ NaOH-Puffer ( ). Aus den Ergebnissen von (1), (2) und (3) wurde der optimale pH-Wert zu 7,0 bis 7,5 (65ºC) bestimmt.
Fig. 2 der beiliegenden Zeichnungen zeigt die Ergebnisse der Messung der restlichen Tryptophanaseaktivität des erfindungsgemäßen. Enzyms nach es dem zwei Tage bei 25ºC bei verschiedenen pH-Werten (bei 25ºC) behandelt worden ist unter Verwendung unterschiedlicher 50 mM Puffer enthaltend 10 mK KCl und 10 uM Pyridoxal-5'-phosphat (Citrat/Na&sub2;HPO&sub4;-Puffer - - -; K&sub2;HPO&sub4;/ KH&sub2;PO&sub4;-Puffer ; Tris-HCl-Puffer - - - Glycin/NaOH-Puffer ; NaHCO&sub3;/NaOH-Puffer - - -.). Aus den in Fig. 2 angegebenen Ergebnissen wurde der stabile pH-Wert des erfindungsgemäßen Enzyms zu 6 bis 10 (25ºC, 2 Tage) zu 6 bis 10 bestimmt.

4. Verfahren zur Messung der Aktivität

Die Aktivität wurde gemäß dem Verfahren von Yamada et al. wie folgt gemessen. In 4,0 ml eines Reaktionsgemisches, enthaltend 10 uM L-Tryptophan, 0,4 uM Pyridoxalphosphat (PLP), 200 uM K&sub2;HPO&sub4;/KH&sub2;PO&sub4; (pH 8,0) wurde das Enzym 10 min bei 65ºC inkubiert. Dann wurden 10 ml einer 30%igen wäßrigen Lösung von Trichloressigsäure (TCA) zugegeben, um die Reaktion abzubrechen. Das in dem Reaktionssystem entstandene Indol wurde quantitativ bestimmt nach dem Verfahren von E. McEvoy-Bowe [The Analyst, Bd. 88, S. 893 - 894 (1963)]. Die Aktivität wird angegeben in Einheiten (U), wobei 1 U die Menge in um Indol ist, die während einer Minute gebildet wird.

5. Optimale Temperatur

Die optimale Temperatur für die Tryptophanabbauaktivität beträgt etwa 70ºC (pH = 8,0) (s. Fig. 3).
Fig. 3 der beiliegenden Zeichnungen zeigt die Tryptophanaseaktivität des Enzyms, bestimmt bei unterschiedlichen Temperaturen während 10 min in 50 mM K&sub2;HPO&sub4;-KH&sub2;PO&sub4;-Puffer (pH 8,0). Aus den Ergebnissen wurde die optimale Temperatur für die Aktivität bei pH 8,0 zu etwa 70ºC bestimmt.

6. Bedingungen für die Inaktivierung durch Temperatur

Fig. 4 der beiliegenden Zeichnungen zeigt den Zusammenhang zwischen der Resttrypophanaseaktivität und der Inkubationszeit (min) bei Temperaturen von 50ºC (Fig. 4-1), 55ºC (Fig. 4-2), 60ºC (Fig. 4-3), 65ºC (Fig. 4-4) und 70ºC (Fig. 4-5), um die thermischen Inaktivierungs-Charakteristika der thermisch stabilen Tryptophanasen nach der Erfindung zu zeigen.
Sie wird nicht inaktiviert beim Temperaturen bis zu etwa 65ºC (pH-8,0, Inkubationszeit 40 Min) (s. Fig. 4-1 bis 4-4).
Bei etwa 70ºC (pH 8,0, Inkubationszeit 10 min) zeigt das Enzym eine Restaktivität von etwa 20% (s. Fig. 4-5).

7. Hemmung, Aktivierung und Stabilisierung

Eine Aktivierung des Enzyms mit K&spplus; und NH&sub4;&spplus; wurde beobachtet. Wenn z. B. diese Ionen zu einem Glycin/NaOH-Puffer zugegeben werden, wird das Enzym in dem Puffer aktiviert (s. Fig. 1).

8. Verfahren zur Reinigung

Die durch Züchtung in einem Tryptophanase induzierten Kulturmedium erhaltenen Zellen werden durch Vermahlen mit Tonerde aufgebrochen und mit einer 50%igen gesättigten Ammoniumsulfatlösung unter Verwendung von 50 mM K&sub2;H PO&sub4;/KH&sub2;PO&sub4;-Puffer (pH 8,0), enthaltend 10 uM PLP und 1 mM Mercaptoethanol, fraktioniert. Der Niederschlag wird suspendiert, dialysiert und gereinigt unter Verwendung von DEAE-Toyoparl, Gelfiltration mit Ultrogel AcA34 und Hydroxylapatit HT.

9. Molekulargewicht

Das Molekulargewicht wurde zu etwa 44.000 bis 46.000 bestimmt durch SDS-Gel-Elektrophorese.
Da die thermisch stabile Tryptophanase nach der Erfindung ausgezeichnete thermische Stabilitätseigenschaften besitzt, im Gegensatz zu den üblichen Tryptophanasen, kann sie die technischen Schwierigkeiten üblicher Tryptophanasen in bezug auf Reaktionstemperaturen oder thermische Stabilität überwinden und kann vorteilhaft industriell angewandt werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung spezieller.

Beispiel 1

Isolierung von Bacterium T-Stamm als thermisch stabile Tryptophanase bildendes Bakterium.
(1) Ein Gramm einer Kompostprobe wurde zu 10 ml eines flüssigen Trp-PEP-Mediums zugegeben und einen Tag bei 60ºC in einem L-förmigen Testrohr unter Schütteln gezüchtet. Die Indolbildung wurde bestätigt durch Kovac's Reagenz und dann wurde ein Teil (0,1 ml) der Kultur in 10 ml eines frischen flüssigen Trp-PEP-Mediums überimpft und wiederholt gezüchtet unter Bildung einer Kultur mit gut wachsenden Indol bildenden Zellen. Die Kultur (0,1 ml) wurde in 10 ml flüssiges Trp-PEP-Medium, enthaltend 1 mg/l Bacitracin, überimpft und auf die gleiche Weise wie oben gezüchtet.
Die erhaltene Kulturbrühe wurde auf das etwa 100.000fache verdünnt mit einer sterilisierten physiologischen Salzlösung und 0,1 ml der Verdünnung wurden auf ein Trp-PEP-Agar-Medium (enthaltend 1,5% Agar) aufgestrichen, dessen Oberfläche mit einem Membranfilter (Toyo TM-2) bedeckt war. So wurden Kolonien, bei denen Bacterium Stamm T (manchmal abgekürzt als Stamm T) und Bacillus sp. Stamm S (manchmal abgekürzt als Stamm S) in gemischter Form zusammenwuchsen und Kolonien, bestehend aus Stamm S allein, getrennt gesammelt.
(2) Ein Milliliter der gemischten Kolonien von Stamm T und Stamm S, die entsprechend (1) oben erhalten worden waren, wurde in 200 ml eines tryptophanhaltigen synthetischen Mediums (flüssiges Trp-PEP-Medium) überimpft und etwa 30 Stunden bei 60ºC gezüchtet. Etwa 4 Stunden später trat aktives Wachstum von Stamm S ein und anschließend nahezu gleichzeitig mit dem Ende des Wachstums von Stamm S begann Wachstum von Stamm T. Gleichzeitig starb Stamm S schnell ab. Schließlich konnte eine Kultur, in der mindestens 99% der Zellen Stamm T waren, erhalten werden. Um den Anteil an Stamm S Zellen weiter herabzusetzen und eine reine Kultur, die im wesentlichen nur aus Stamm T Zellen bestand, zu erhalten, konnten die Stamm T Zellen in einer beliebigen Stufe der Züchtung abgetrennt werden unter Anwendung eines Verfahrens, das auf dem Unterschied von Stamm T und Stamm S in der Resistenz gegenüber einem Zellwand abbauenden Enzym (Lysozym) bestand oder mit Hilfe eines fraktionierten Zentrifugenverfahrens wie unten beschrieben.

(1) Verfahren unter Verwendung von Lysozym:

Stamm T und Stamm S wurden in gemischter Form 18 Stunden gezüchtet. Die Wirkung von Lysozym unter den folgenden Bedingungen führte zu einer selektiven Lyse der Stamm S Zellen. Stamm S Zellen, die zu irgendeinem Zeitpunkt in einem Anteil von etwa 25% der Gesamtzellzahl vorhanden waren, nahmen auf weniger als 1.000stel der gesamten Zellen durch diese Behandlung ab. So konnte eine reine Kultur von Stamm T erhalten werden.

Bedingungen:

Die Zellen wurden in einem Reaktionsgemisch, bestehend aus 300 ug/ml Eiweißlysozym 200 ug/ml EDTA und 30 mg/ml Natriumcitrat in 100 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) bei 35ºC 15 min inkubiert.

(2) Fraktioniertes Zentrifugenverfahren

Eine Kultur, die erhalten worden war durch Züchten von Stamm T und Stamm S in gemischter Form während 20 Stunden wurde mit 1.000 G 15 min zentrifugiert, um die Stamm S Zellen selektiv auszufällen. Dann wurde 20 min mit 40.000 G zentrifugiert, um die Stamm T Zellen allein auszufällen und abzutrennen.

Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigt, daß Stamm T nicht allein gezüchtet werden kann.
(1) Stamm T Zellen, die von der gemischten Kultur von Stamm T und Stamm S nach dem in Beispiel l, (2) angegebenen Verfahren abgetrennt worden waren, wurden auf jedes der folgenden flüssigen Medien bei 60ºC überimpft. Aber in allen diesen Medien wurde kein Wachstum von Stamm T beobachtet.
1. Flüssiges Trp-PEP-Medium
2. Übliches Nähr-Medium
3. Herzinfusions-Nähr-Medium
4. Rinderserum + Herzinfusions-Nähr-Medium
5. Hefeextrakt + Herzinfusions-Nähr-Medium
6. Nährmedium 1 bis 5 + 0,5% Agar.
(2) Um die Fähigkeit von Zellprodukten oder Zellbestandteilen von Stamm T zu zeigen, das Wachstum von Stamm T zu fördern, wurde Stamm S allein in das flüssige Trp-PEP-Medium überimpft und etwa 12 Stunden bei 60ºC gezüchtet. Eine überstehende Flüssigkeit der Kultur und ein zellfreier Extrakt, der erhalten worden war durch ultraschall-Behandlung, wurden aseptisch filtriert und zu einem flüssigen Trp-PEP-Medium gegeben. Reine abgetrennte Stamm T Zellen wurden in das Medium überimpft, aber es wurde keine Vermehrung von Stamm T beobachtet. Getrennt wurde eine Kultur von Stamm T in Gegenwart von Stamm S Zellen durchgeführt, deren Zellteilung durch Streptomycin gestoppt war. Es wurde kein Wachstum von Stamm T beobachtet.

Beispiel 3

Enzymbildung:

Eineinhalb Liter eines tryptophanhaltigen synthetischen Mediums (flüssiges Trp-PEP-Medium) in einem 5-Liter-Erlenmeyer-Kolben wurde mit 5 ml einer gemischten Kultur von Stamm T und Stamm S beimpft und in stationärem Zustand 30 Stunden bei 60ºC kultiviert. Die Kulturbrühe wurde wie in Beispiel 1 behandelt, um 120 g nasse Zellen von Stamm T aus 77,6 Liter der Kulturbrühe zu erhalten. Die Zellen wurden durch Vermahlen mit Tonerde aufgebrochen und 166 ml 50 mM K&sub2;HPO&sub4;/KH&sub2;PO&sub4;-Puffer (pH 6,5, enthaltend 10 uM Pyrioxal-5'-phosphat (PLP), 1 mM 2-Mercaptoethanol und 250 uM Phenylmethylsulfonylfluorid (Serinproteasehemmer) zugegeben, unter Bildung einer rohen Enzymlösung. Das Enzym wurde mit 0 bis 50%igen gesättigten Ammoniumsulfatfraktionen ausgefällt. Das erhaltene rohe Enzympräparat wurde mit Streptomycin behandelt, um Nucleinsäure zu entfernen, und dialysiert und absorbiert auf einer DEAE-Toyopal (Toyo Soda Industry Co., Ltd.) Säule (2,6 cm Durchmesser mal 12 cm). Die Säule wurde mit einem Konzentrationsgradienten von 0 → 400 mK KCl (400 ml) eluiert. Nachdem Fraktionen gesammelt und durch Gelfiltration über eine Säule (2,1 cm Durchmesser mal 85 cm) von Ultrogel AcA34 (LKB Company) gereinigt worden waren, wurden die gereinigten Fraktionen weiter auf einer Säule (2,6 cm mal 8 cm) von Hydroxylapatit-Gel HT (Biorad Company) adsorbiert. Die Säule wurde eluiert mit einem Konzentrationsgradienten von 0 → 300 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; (300 ml), und etwa 100 mg Tryptophanase wurden aus den aktiven Fraktionen erhalten.
Das erhaltene Enzym besaß eine optimale Temperatur für die Aktivität bei pH 8,0 von etwa 70ºC und wurde thermisch nicht inaktiviert, wenn es 40 min bei Temperaturen von etwa 65ºC und einem pH-Wert von 8,0 gehalten wurde. Die spezifische Aktivität dieses Enzyms zum Tryptophanabbau war mindestens 8 mal so hoch wie diejenige eines handelsüblichen Enzyms (37ºC) und die Aktivität zur Synthese von Tryptophan aus Indol, Brenztraubensäure und Ammoniak durch eine umgekehrte Reaktion wurde ebenfalls nachgewiesen.

Claims

1. Thermisch stabile Tryptophanase, die

(1) eine optimale Temperatur für die Aktivität bei pH 8,0 von etwa 70ºC aufweist;

(2) dicht thermisch desaktiviert wird, wenn sie 40 min bei Temperaturen bis zu etwa 65ºC und einem pH-Wert von 8,0 gehalten wird und

(3) aus L-Tryptophan, in Gegenwart von Pyridoxalphosphorsäure, Brenztraubensäure, Indol und Ammoniak bildet.

2. Tryptophanase nach Anspruch 1, die

(4) Tryptophan, S-Methyl-L-cystein, L-Cystein und 5-Methyl-L- tryptophan abbaut und

(5) einen optimalen pH-Bereich von 7,0 bis 7,5 bei 65ºC und einen stabilen pH-Bereich von 6 bis 10 bei 25ºC besitzt.

3. Verfahren zur Herstellung einer thermisch stabilen Tryptophanase nach Anspruch 1 oder 2, umfassend das Züchten eines Gemisches von Bacterium Stamm T und Bacillus sp. Stamm S, wobei das Gemisch hinterlegt ist als FERM BP-810, in einem Tryptophan enthaltenden Kulturmedium, und Gewinnung der erhaltenen thermisch stabilen Tryptophanase aus der Kulturbrühe.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Züchtung bei einer Temperatur von 55 bis 65ºC und einem pH-Wert von 6 bis 8 durchgeführt wird.

5. Gemisch von Bacterium Stamm T mit Bacillus sp. Stamm S (FERM BP-810).

6. Bacillus sp. Stamm S, der der Stamm FERM BP-809 ist.