SE432265B - Sett att framstella sarkosinoxidas genom odling av bacillus sp. nrrl b-11380 - Google Patents
Sett att framstella sarkosinoxidas genom odling av bacillus sp. nrrl b-11380Info
- Publication number
- SE432265B SE432265B SE7810355A SE7810355A SE432265B SE 432265 B SE432265 B SE 432265B SE 7810355 A SE7810355 A SE 7810355A SE 7810355 A SE7810355 A SE 7810355A SE 432265 B SE432265 B SE 432265B
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- sarcosine
- bacillus
- formation
- sarcosine oxidase
- buffer
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
- C12N9/0032—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with oxygen as acceptor (1.5.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
73105 55-3 (h) (s) 2 Lackmusmjölk: alkalisation efter ungefär 1-2 veckor.
Buljong/gelatinskiva: Tillväxt: tillväxt på ytan, kvefaktion. svag men trattliknande li- Mikrokopisk observation: (1) (2) (3) (h) (s) (6) Cellernas form och storlek: stora och raka stavar, 1,0 - 1,5 x 2,0 - 5/um, avrundad kant, enkel eller dubbel -länk, ibland, kort länk.
Polymorfism: ingen.
Rörlighet: peritrik rörelse (observerad på snedagarbul- jong vid 26°C, 18 timmars kultur).
Sporer: cylindriska eller oosfäriska (ell/iptiska, i mitten eller nära cellkanten. Ingen av sporbildning or- sakad svällning. 0,8- 1,0 x 1,2 - 1,6/um.
Gramfärgning: positiv.
Syrafast färgning: negativ.
Fysiologiska egenskaper: Nitratreduktion: negativ.
Denitrifikationsreaktiong-negativ.
MR-test: negativ.
VPftest: negativ.
Indolbildning: negativ." Vätesulfatbildning: positiv.
Stärkelsehydrolys: negativ.
Gelatinhydrolys: positiv.
Kaseinhydrolys: negativ.
Eskulinhydrolys: negativ.
Cellulosahydrolys: negativ.
Citratutnyttjande, Simons medium: negativt.
Christensens medium: positivt.
Nitratutnyttjande: positivt.
Ammoniumutnyttjande: negativt.
Bildning av ammonium ur nitrat: positiv.
Tillväxt-pH: 6,4 - 9,6.
Tillväxttemperatur: 10 - ÄZOC Halogentolerans: NaCl 6,0 %.
Beteende i syre: aerobt. o-F-test (Hugh Leifsøn medium). NT.
O-F-test*: *o-F-testmed1um= modifierat medium.
O (oxidativ nedbrytning).
På grund av ingen syra-bildning ur glykos och ingen el- ler ringa syrabildningur annan sackarid användes glycerol 3 7810355-3 som socker. NHuH2P0h 1,0 g, KCL 0,2 g, MgSOh'7H20 0,2 g, jästextraktpulver 1,0 g, agarpulver 3,0 g, bromtymolblått (10$-g vattenlösning)<10 ml, destillerat vatten 1000 ml, pH 7,2 - 7,ü.
Syra- och gasbildning ur socker:*' (Ingen gasbildning observerad). dulcitol: - L-arabinos: - cellobios: - erytriolz. - fruktos: +(syra) galaktos: -_ glukos: - glycerol: +(syra) inositol: - laktos: - maltos: - mannitol: +(syra) mannos: - melezitos: - melibios: - raffinos: - L-ramnos: - salicin: - L-sorbos: - sorbitol: - stärkelse: - sackaros: - trehalos: - xylos: - flgasmedium: nnuflzPoh 1,0 g, KcL 0,2 g, Mgsoh-wizo 0,2 g, jäst-ex- traktpulver 1,0 g, agarpulver 3,0 g, bromtymolblått (10%-igvat- tenlösning) 10 ml, destíllerat vatten 1000 ml, pH7,2 - 7,4.
Till detta sattes 10 g socker.
Enligt-Bergey's Manuel of Determinative Bacteriology, 8th Ed. 197ü, tillhör stammen B-0618 med de i det ovanstående angivna taxonometriska egenskaperna, i synnerhet de grampositiva, sporbil- dande stora bacillerna, de peritrikt rörliga aeroba bakterierna och de 'ur glukos syra bildande bakterierna släktet Bacillus.
En jämförelse av stammen B-0618 med de andra liknande bakte- rierna, nämligen Bacillus badius, Bacillus freudenreíchii och Bacil- lus macroides genomfördes på följande sätt.
Bacillus badius ATCC-1ü57h (typkultur).
Bacillus freudenreichii ATCC-7053 (icke-typkultur, icke ori- gínalstam).
Bacillus macroides ATcc-129o5 (typkultur). m | 9 I o -H. D h u-r m 0 v\ w ml\ H M N O' P nfln M-flr\ E m w J -HO 'N O mr n§r\ m ~- : 5 | S 0 I D | m F40 H-HO' H 0 v40 H wo H U E -HB M hä fl me m 0< 0 nd 0 04 v m om mn m m m'U m~fl Hugh Leifson OF-test ingen syrabildning medium OF-test OF-test 0 O ingen syrabildning ovannämnda medium 7ë1nzss-s Fortsättning: katalas oxidas lllreaß' gelatin- 1ikváäçnn - (+) stärkelse hydrolys eskulin hydrolys (+) indolbild- ning Hzsfbila- '«ning aceton- bildning MR-test nitrat- reduktion citrat- utnyttjande Syrabíldníng EV socker arabinos fruktos galaktos ; 7310355-s Fortsättning: glukos - - - - glycerol + +* - - *senare alkali- nisering inositol - - - - laktos - -, - - - maltos O - - - - mannitol + - - - 111311005 - _ - - sorbitol - - - - sackaros - - - - - trehalos - - - - - xylos - - - - Följande karakteristika erhålles på buljongmedium.
Stammen B-0618: svag tillväxt, ulliknande sediment.
ATCC-1ä57Ä: likformigt grumlig, partiellt sediment. ÅTcc-7o53= svag tillväxt, uuilknanae sediment.
ATCC-12905: svag tillväxt, likformigt grumlig, partiellt sedi- ment.
Resultatet var att stammens B-0618 taxonometriska egenskaper skilde sig i flera avseenden från de därmed jämförda stammarnas ta- xonometriska egenskaper enligt följande: Bacillus badius ATCC-1457ü: bildning av ureas, syrabildning ur glycerol (syrabildning och senare alkalinisering) och mannitol.
Bacillus freudenreichii ATCC-7053: tillväxt på vätskeformigt odlingdmedium och ureasbildning (något liknande), eskulinhydrolys, syrabildning ur fruktos, glycerol och mannos. ATCC-7053-stammen är varken typkultur eller originalstam och följaktligen kan den icke identifieras med stammen B-0618. Följaktligen kan stammen icke till- höra nya arter.
Följaktligen hänföras satmmen B-0618 till Baeillus sp. och be- tecknas som Bacillus sp. B-0618. Denna stam har deponerats för per- manent kollektion i Institute for Microbial Industry and Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, under deposi- ïsflazss-s 6 tion nr FERM-P UOHQ. Stammen har också deponerats i ARS, USA som NFRI nr B-11380.
Ett ändamål med föreliggande uppfinning är ett förfarande för framställning av enzymet sarkosinoxidas genom odling av sarkosinoxi- das producerade mikroorganísm tillhörande släktet Bacillus i nä- rings-odlingsmedium och isolering av sarkosinoxidas från odlings- mediet. _ Ett annat ändamål med uppfinningen är att tillhandahålla en stam av mirkoorganismer som producerar sarkosinoxidas och som beteck- nas som Bacillus sp. B-0618 FERM-P nr HOHQ, NRRL B-11380.
Andra ändamål, kännetecken och fördelar med föreliggande uppfinning framgår av följande beskrivning i kombination med de bifo- gade ritningarna§ på vilka visas kurvor eller diagram som belyser föreliggande uppfinning. Pig. 1 visar sarkosinoxidasets optimala pH- värden. Pig. 2 visar sarkosinoxidasets optimala temperatur. Pig. 3 visar sarkosinoxidasets pH-stabilitet. Pig. 4 visar sarkosinoxidasets värmestabilitet. Pig. 5 visar resultatet av en kvantitativ analys av sarkosin genom bestämning av formaldehyd. Pig. 6 visar resul- tatet av en kvantitativ analys av sarkosin genom bestämning av väte- peroxid. I Enligt en utföringsform av föreliggande uppfinning odlas Bacillus sp. B-0618 EERM-P HUNQ i ett konventionellt odlingsmedium för anti- biotika- eller enzymproduktion. Odling med undervattensluftning före- dras för industriell produktion.
Ett konventionellt medium för mikroorganismer kan företrädes- vis användas. Som kvävekällor kan man använda källor för assimiler- bart kväve såsom majsstöpvätskor, sojabönpulver, pepton, kött- extrakt, jästextrakt, ammoniumsulfat, ammoniumklorid, eller liknande.
Assimilerbara kolkällor, såsom glukos, melass, stärkelsehydrat eller liknande kan lämpligen användas. Olika oorganiska salter såsom I natriumklorid, kaliumklorid, magnesiumsulfat, kaliumvätefosfat eller kaliumdivätefosfat kan eventuellt användas. Genom tillsats av kreatin till mediet, lämpligen i en mängd av 0,5 - l %, stimuleras sarkosin- oxídasbildningen.
Odlingstemperaturen kan varieras inom intervallet för växten av mikrobceller och eniymbildning och ligger företrädesvis mellan 26 och 33°C. Odlingstiden kan varieras beroende på betingelserna och ligger vanligtvis mellan 15 och 25 h. Odlingen bör givetvis avslutas när sarkosinoxidasbildningen i det väsentliga är slutförd. ' Sarkosinoxidas förekommer i mikroorganismernas celler.
Följande utföringsformer vid extraktion av sarkosinoxidas ur -, 7810355-3 odlingsmedier kan tillämpas. Odlingsmediet centrifugeras och de vå- ta cellerna suspenderas i en buffert, exempelvis i tris-HCl-buffert, och spränges genom behandling lysozym, ljudvågor eller en press en- ligt French. Det sålunda erhållna sarkosinoxidaset i rått tillstånd renas genom konventionell isolering och rening för protein och en- zym.V Som exempel kan nämnas, om så erfordras efter avlägsnande av nukleinsyra, genom tillsats av protaminsulfat, fraktionerad utfäll- ning med aceton, metanol, etanol, eller isopropanol och utsaltning med ammoniumsulfat. Ytterligare rening kan åstadkommas exempelvis medelst kromatografering, varvid det råa sarkosinoxidaset löses i tris-H01-buffert och kromatograferas med anjonbytare, såsom dietyl- aminbety1-cellulosa- eller -dextrangel, och gelfiltreringsmedel så- som dextrangel eller polyakrylamidgel. Renat sarkosinoxidas kan la- gras i form av lyofiliserat pulver.
Sarkosinoxidas enligt föreliggande uppfinning har följande fy- sikaliskt-kemiska egenskaper: (1) Enzymverkan: En mol sarkosin förbrukar en mol H20 och en mol syre och gene- rerar en mol glycin, en molfbrmaldehyd och en mol väteperoxid. En- zymet kataliserar oxidation av sarkosin till glycin och formaldehyd.
CHBNHCH + 02 + H20 -+-HZNCHZCOOH + HCHO + H2O2 Enzymprövning genomföras på följande sätt.
Till en reaktionsblandning (0,5 ml), bestående av 0,2 mol tris- Hcl-buffert (ps 8,0, 0,05 m1), h-aminoantipyrin (3 mg/m1, 0,05 m1), 0,2 % fenol (0,05 ml), peroxidas (0,5 mg/ml), 1 mol sarkosin (0,1ml), och destillerat vatten (0,2 ml) tillsättes till enzymlösningen (10 /ul) och inkuberas vid 3700 under 5 min. Etanol (2,5 ml) tillsättes för att avbryta reaktionen. Väteperoxidbildningen bestämdes kolori- metriskt (absorption vid H80 nm).
En enhet (1 unit, 1 u.) enzymaktivitet definieras som den mängd enzym som genererar 1/umol väteperoxid/min. (2) Substratspecifitet: Till en reaktionsblandning (0,5 ml) bestående av 0,2 mol tris- Hcl-bufferc (pH 8,0, 0,05 m1), h-aminoantipyrin (3 mg/ml, 0,05 m1), 0,2 $ fenol (0,05 mi), peroxidas (0,5 mg/mi, 0,05 m1), destillera: vatten (0,2 m1) och följande substrat (0,5 mol, 0,20 ml) sattes sar- kosinoxidas (0,5 enheter) och inkuberades vid'37°C i 5 min. Etanol (2,5 ml) tillsattes för att avbryta reaktionen, och bestämningen ge- nomfördes kolorimetriskt vid #80 nm.
Den relativa aktiviteten på olika substrat var följande: Substrat Relativ aktivitet Sarkosin 100,0 7810355-3 8 Kolin 0 Betain 0,03 Dimetylglycin 0,01 Glycin 0,06 Treonin 0 Alanin 0 Valin - 0 Lysin 0,09 . N-metyletanolamin 0 N-dimetyletanolamin 0 (3) optimalt pH: För att undvika en inverkan av Å-aminoantipyrin-fenol-peroxi- das på kromogen, bestämdes aldehydbildningen medelst acetylaceton- metoden. 'Resultaten visas i fig. 1, varav det framgår att optimalt pH är 8,0 - 9,5.
De använda buffertlösningarna var följande: pH Ä - 7: dimetyl- glutaratbuffert, pH 6-Ä 8: fosfatbuffert, pH 7,5 - 9: tris-HCl-buff- ert, pH 9 - 10: glycin - Na0H-buffert och pH 10 - 11: natriumkarbo- nat-boratbuffert. (4) Optimal temperatur: ' Ungefär 50°C såsom framgår av fig. 2. Substrat: sarkosin. (5) pH-stabilitet: _Man använder dimetylglutarat-buffert för pH 5 - 7, fosfat-buf- fert för pH 6 - 8,-tris-HCl-buffert för pH 7,5 - 9, glyçin-Na0H-buf- fert för pH 9 - 10 och natriumkarbonat-borat-buffert för pH 10 - 11.
Till 0,1 ml av var och en av bufferterna sattes 100 uLIenzymlösning (protein 1oo/ug/m1) och det hela fick stå 1 60 min vid 37°c. Efter injustering av pH genom att tillsätta 1,0 mol tris-HCl-buffert (pH 8,0, 0,3 ml) oeh uttagning av ett prov om 20/ul, bestämdes enzymaktií viteten. Sarkosin användes som substrat och såsom framgår av fig. 3: ligger stabilt pH mellan ungefär 6,0 och 10,0. (6) värmestabilitet: 1 Enzymets värmestabilitet bestämdes genom inkubering av 10 mmol tris-HCI-buffert (0,5 ml, pH 8,0) innehållande enzym (protein 20/ug/ ml) vid olika temperaturer i 10 min med användning av sarkosin som substrat. 'Såsom framgår av fig. 4 är enzymet stabilt vid temperatu- rer under ungefär 4000. (7) M01eky1vikt= ÄOOOO (bestämd medelst gelfiltreringsmetoden). (8) Isoelektrisk punkt: ü,7 (elektrofores med användning av anfolyt av bärartyp). (9) Identifiering och bestämning av reaktionsprodukternaí 9 7810355-5 i) Identifiering av glycin: Reaktionsblandning: 0,2 m°1 tris-Hc1~buffert (pH 8,0) 1,0 m1 1 mmol sarkosin 1,0 ml Katalas 200 enheter Sarkosinoxídas 5 enheter Destillerat vatten . 8,0 ml totalt 10,0 ml .Ovanstående reaktionsblandning (10 ml) inkuberades vid 3700 i 60 min, varpå reaktionen avbröts genom upphettning vid 100°C i 5 min.
Bildade fällningar avcentrifugerades och det övre vätskeskiktet upp- koncentrerades 10 gånger och droppar och droppar därav avsattes på ett filtrerpapper. Ett kromatogram framkallades över natten med vatten, mättat med fenol och färgades genom upphettning efter besprut- ning med ninhydrinlösning. Observerat Rf-värde 0,26. Autentiska prov av sarkosin och glycin uppvisade Rf-värden av 0,66 resp 0,26 och härigenom identifierades en fläck med det ovan angivna Rf-värdet som glycin. ii) Bestämning av formaldehydz Reaktionsblandningen: 0,2 m1 tris-Hcnbufferc (pH 8,0) 0,05 m1 Sarkosin med alikvot koncentration 0,10 ml Katalas _ 200 enheter Sarkosinoxidas - 3,0 " Destillerat vatten _ 0,35 ml totalt 0,50 ml Reaktionsblandningen inkuberades vid 37°C i 20 min. Reaktionen avbröts genom upphettning i 5 min, och efter avkylning tillsattes acetatbuffert (pH 5,5, 1,5 ml) och därefter den härnedan angivna kro- mogenlösningen (20 ml), Efter inkubation i 50 min vid 3700 genomför- des kolorimetrisk bestämning vid 412 nm. Resultatet framgår av fig. 5, i vilket diagram formaldehydbíldningen angives som funktion av sarkosinkoncentrationen.
Kromogen: Ammonium acetat 15 g Ättihsyra 0,3 ml Acetylaceton 0,2 ml Vatten q.s. 100 ml iii) Bestämning av väteperoxid: Väteperoxid bestämdes kvantitativt genom kombination av R- aminoantipyrin-fenol-peroxidas.
Reaktionsblandníng: 7810355-3 10 0,2 mn1 :rie-H01-bufferclöening (pa 8,0) 0,05 m1 3 mg/ml R-aminoantipyrin 0,05 ml 0, 2 % fenel 0,05 m1 0,5 mg/ml peroxidas 0,05 ml Sarkosin med alikvot koncentration 0,10 ml Sarkosinoxidas 3,0 enheter Destillerat vatten 0,2 ml totalt 0,5 ml Reaktionsblandningen inkuberades vid 3700 i 20 min. Efter tillsättning av etanol (2,5 ml) genomfördes kolorimetrisk bestämning av blandningen vid h80 nm. Såsom framgår av fig. 6 svarar väteper- oxidbildningen mot sarkosinkoncentrationen. » Såsom ovan förklarats katalyserar enzymet sarkosinoxidas en- ligt föreliggande uppfinningoxidationsreaktionen, varvid sarkosin omsättes med syre (där en mol vattenförbrukas per en mol sarkosin), och glycin, formaldehyd och väteperoxid bildas. Följaktligen bekräí tas att enzymet är EC 1.5.3.1-sarkosin: oxygenoxidoreduktas (demetyl erande).
Sarkosinoxidas kan användas som enzymatiskt diagnostiserings- reagens exempelvis för bestämning av kxeatinin i blod eller urin med kombination av kreatinas och kreatininas. Vidare kan sarkosinoxidas användas för bestämning av kreatíninasaktivitet.
I följande exempel förklaras uppfinningen som utföringsform men denna är givetvis icke begränsande för uppfinningen.
Exemgel: Ett medium (100 m1) innehållande kreatin (0,5 %), fiexexurekt (o,5_%),-jäetextrekc (0,2 %), Kcl (0,3 %), KZHPOÄ (0,1 %), een Mgs0¿ -7H20 (0,o5 $) 1 en 500 m1 erlenmeyerkelv eeerilieeredee vid 12o°c : 20 min. Bacillus sp. B-0618 FERM-P üOü9 inympades och det hela od-0 lades vid 3000 under en dag som en frökultur, som överfördes till : samma steriliserade medium (20 1) i ett jäskar för 30 l och odlades vid 3000 i 20 timmar och under rotation 200 v/min och luftning med 20 l/min. Bakteriecellerna avcentrifugerades (12 g), tvättades med 10 mmol fosfat-buffert (pH 7,0), suspenserades i samma buffertlösniz och lysozym (slutlig koncentration 0,2 mg/ml) tillsattes och det hefi omrördes vid 3700 i 30 min. Genom centrifugering med 5000 v/min i 15 min erhölls ett övre vätskeskikt som uppsamlades (sarkosinoxidas aktivitet 1ü0O enheter). Till det sålunda erhållna övre vätskeskikf tet sattes 2 % protaminsulfatlösning (2,5 ml) och nukleinsyrafällnil gen avskildes. Till vätskefasen sattes mättat ammoniumsulfat och fällningen åstadkommen med fraktioner av 50 - 70 % ammoniumkoncentr tion uppsamlades. Fâllningen löstes i 10 nmol tris-HCl-buffert (pH H 78310355-3 8,0, 20 ml) och avsaltades genom en kolonn av SEPHADEf® G-25 (3,5 x 30 cm). Den avsaltade lösningen passerade en DEAE-cellulosakolonn (2,0 x 18 cm, buffrad med 10 nm°1 yris-Hcl-buffert, pH 7,0) för att absorbera enzymet, tvättades med samma buffertlösning, innehållande Q 0,1 mol KCl, och eluerades med en gradient av 0,1 mol - 0,5 mol KC1- lösning.
Den aktiva fraktionen som eluerades med 0,36 mol KC1 qppsamla- des och dialyserades i 10 timmar mot en lösning av 10 nmol tris-HC1- buffeft (pH 8,0) och frystorkades, varigenom man erhöll ett pulver av sarkosinoxidas.
Totalaktivitet: 540 enheter, protein H3 mg, specifik aktivitet 12,7 enheter/mg, utbyte 38,6 $.
Claims (2)
1. Sätt att framställa sarkosinoxidas, k ä n n e - t e c k n a t av att man odlar en sarkosinoxidas producerande mikroorganism Bacillus sp. NRRL B-11380 i ett närings-odlings- medium och isolerar det så bildade sarkosinoxidaset ur ødlings- mediet.
2. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att odlingsmediet innehåller kreatin.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP52119776A JPS6029473B2 (ja) | 1977-10-04 | 1977-10-04 | ザルコシン・オキシダ−ゼの製法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SE7810355L SE7810355L (sv) | 1979-04-05 |
SE432265B true SE432265B (sv) | 1984-03-26 |
Family
ID=14769924
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SE7810355A SE432265B (sv) | 1977-10-04 | 1978-10-03 | Sett att framstella sarkosinoxidas genom odling av bacillus sp. nrrl b-11380 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4216292A (sv) |
JP (1) | JPS6029473B2 (sv) |
AT (1) | AT364878B (sv) |
CA (1) | CA1112192A (sv) |
CH (1) | CH645668A5 (sv) |
DE (1) | DE2842940C2 (sv) |
DK (1) | DK146224C (sv) |
FR (1) | FR2405299A1 (sv) |
GB (1) | GB2005689B (sv) |
HU (1) | HU180306B (sv) |
NL (1) | NL7809943A (sv) |
SE (1) | SE432265B (sv) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS568687A (en) * | 1979-07-04 | 1981-01-29 | Toyo Jozo Co Ltd | Preparation of creatinase |
DE3326888A1 (de) * | 1983-07-26 | 1985-02-14 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Sarcosin-oxidase |
JPS61162174A (ja) * | 1985-01-11 | 1986-07-22 | Noda Sangyo Kagaku Kenkyusho | 耐熱性ザルコシン・オキシダ−ゼn及びその製造法 |
DE3519218A1 (de) * | 1985-05-29 | 1986-12-04 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | H(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)o(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)-bildende sarcosinoxidase, ihre herstellung und verwendung |
JP2593481B2 (ja) * | 1987-08-10 | 1997-03-26 | 旭化成工業株式会社 | サルコシンオキシダーゼの遺伝情報を有するdnaおよびその用途 |
US5188941A (en) * | 1988-02-12 | 1993-02-23 | Gds Technology, Inc. | Enzymatic determination of theophylline |
AU3063689A (en) * | 1988-02-12 | 1989-09-06 | Gds Technology, Inc. | Enzymatic determination of theophylline |
AU2003284548A1 (en) | 2002-11-13 | 2004-06-03 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Modified sarcosine oxidase, process for producing the same and reagent composition using the same |
JP4405324B2 (ja) | 2003-11-18 | 2010-01-27 | キッコーマン株式会社 | 改変型ザルコシンオキシダーゼ、改変型ザルコシンオキシダーゼ遺伝子及び改変型ザルコシンオキシダーゼの製造法 |
WO2018052005A1 (ja) | 2016-09-15 | 2018-03-22 | キッコーマン株式会社 | 改変型ザルコシンオキシダーゼ並びにその遺伝子及び製造法 |
-
1977
- 1977-10-04 JP JP52119776A patent/JPS6029473B2/ja not_active Expired
-
1978
- 1978-09-27 US US05/946,402 patent/US4216292A/en not_active Expired - Lifetime
- 1978-10-02 NL NL7809943A patent/NL7809943A/xx not_active Application Discontinuation
- 1978-10-02 FR FR7828107A patent/FR2405299A1/fr active Granted
- 1978-10-02 DE DE2842940A patent/DE2842940C2/de not_active Expired
- 1978-10-03 GB GB7839155A patent/GB2005689B/en not_active Expired
- 1978-10-03 AT AT0712778A patent/AT364878B/de active
- 1978-10-03 SE SE7810355A patent/SE432265B/sv unknown
- 1978-10-03 HU HU78TO1087A patent/HU180306B/hu unknown
- 1978-10-03 CA CA312,555A patent/CA1112192A/en not_active Expired
- 1978-10-03 DK DK436978A patent/DK146224C/da not_active IP Right Cessation
- 1978-10-04 CH CH1031278A patent/CH645668A5/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK146224B (da) | 1983-08-01 |
JPS5452789A (en) | 1979-04-25 |
FR2405299B1 (sv) | 1984-06-22 |
SE7810355L (sv) | 1979-04-05 |
JPS6029473B2 (ja) | 1985-07-10 |
FR2405299A1 (fr) | 1979-05-04 |
GB2005689A (en) | 1979-04-25 |
DE2842940C2 (de) | 1986-09-04 |
US4216292A (en) | 1980-08-05 |
DE2842940A1 (de) | 1979-04-12 |
ATA712778A (de) | 1981-04-15 |
DK436978A (da) | 1979-04-05 |
AT364878B (de) | 1981-04-15 |
CH645668A5 (de) | 1984-10-15 |
GB2005689B (en) | 1982-02-10 |
DK146224C (da) | 1984-01-16 |
HU180306B (en) | 1983-02-28 |
CA1112192A (en) | 1981-11-10 |
NL7809943A (nl) | 1979-04-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4135980A (en) | Choline oxidase | |
SE432265B (sv) | Sett att framstella sarkosinoxidas genom odling av bacillus sp. nrrl b-11380 | |
US4387163A (en) | Process for producing the enzyme cholesterol esterase and for hydrolyzing cholesterol esters of fatty acids by using the enzyme itself | |
US4740465A (en) | Heat-resistant sarcosine oxidase N and process for producing the same | |
CA1130739A (en) | Lactate oxidase, process for manufacture thereof and analytical method and kit for the use of the same | |
US5451520A (en) | Creatine amidinohydrolase from alkaligenes sp. ks-85 ferm bp-4487 | |
EP0091810B1 (en) | Aldehyde oxidase, process for its production and microorganism therefor | |
US4397952A (en) | Process for obtaining glucose dehydrogenase and micro-organism therefor | |
EP0257986B1 (en) | Pyruvate oxidase having high thermal stability, analytical methods using it and analytical reagents containing it | |
US4788147A (en) | Method for producing ethanolamine oxidase | |
US4496655A (en) | Process for the production of tyramine oxidase | |
US4335213A (en) | Process for the preparation of galactose oxidase | |
JPS5889200A (ja) | Nad依存性コレステロール脱水素酵素を使用するコレステロールの定量法およびその定量用試薬 | |
GB2030149A (en) | Process for l- -glycerophosphate oxidase | |
KR101095468B1 (ko) | 체지방 분해에 관여하는 콜레스테롤 산화효소를 생산하는 신규한 노카디아 속 nes115 균주와 이를 이용한 콜레스테롤 산화효소의 생산방법 | |
JPH0544273B2 (sv) | ||
JPS5889183A (ja) | Nad(p)依存性コレステロ−ル脱水素酵素の製造法 | |
JPH0147150B2 (sv) | ||
JPH0616704B2 (ja) | フッ化物イオンに耐性な細菌カタラーゼ及びそれを生産するミクロコッカスsp.kwi‐5菌株 | |
AU706847B2 (en) | Novel bile acid-converting microorganism | |
JP2520073B2 (ja) | 1,5−アンヒドログルシト―ル誘導体 | |
JPS5828283A (ja) | コリンオキシダ−ゼの改良製造法 | |
JPS5820272B2 (ja) | クレアチニンの定量方法及びそのキツト | |
JP2003061651A (ja) | 耐熱性トレハラーゼと、その製造法 | |
JPH03247278A (ja) | 新規なヌクレオシド・オキシダーゼおよびその製法 |