SE432265B - Sett att framstella sarkosinoxidas genom odling av bacillus sp. nrrl b-11380 - Google Patents

Description

73105 55-3 (h) (s) 2 Lackmusmjölk: alkalisation efter ungefär 1-2 veckor.

Buljong/gelatinskiva: Tillväxt: tillväxt på ytan, kvefaktion. svag men trattliknande li- Mikrokopisk observation: (1) (2) (3) (h) (s) (6) Cellernas form och storlek: stora och raka stavar, 1,0 - 1,5 x 2,0 - 5/um, avrundad kant, enkel eller dubbel -länk, ibland, kort länk.

Polymorfism: ingen.

Rörlighet: peritrik rörelse (observerad på snedagarbul- jong vid 26°C, 18 timmars kultur).

Sporer: cylindriska eller oosfäriska (ell/iptiska, i mitten eller nära cellkanten. Ingen av sporbildning or- sakad svällning. 0,8- 1,0 x 1,2 - 1,6/um.

Gramfärgning: positiv.

Syrafast färgning: negativ.

Fysiologiska egenskaper: Nitratreduktion: negativ.

Denitrifikationsreaktiong-negativ.

MR-test: negativ.

VPftest: negativ.

Indolbildning: negativ." Vätesulfatbildning: positiv.

Stärkelsehydrolys: negativ.

Gelatinhydrolys: positiv.

Kaseinhydrolys: negativ.

Eskulinhydrolys: negativ.

Cellulosahydrolys: negativ.

Citratutnyttjande, Simons medium: negativt.

Christensens medium: positivt.

Nitratutnyttjande: positivt.

Ammoniumutnyttjande: negativt.

Bildning av ammonium ur nitrat: positiv.

Tillväxt-pH: 6,4 - 9,6.

Tillväxttemperatur: 10 - ÄZOC Halogentolerans: NaCl 6,0 %.

Beteende i syre: aerobt. o-F-test (Hugh Leifsøn medium). NT.

O-F-test*: *o-F-testmed1um= modifierat medium.

O (oxidativ nedbrytning).

På grund av ingen syra-bildning ur glykos och ingen el- ler ringa syrabildningur annan sackarid användes glycerol 3 7810355-3 som socker. NHuH2P0h 1,0 g, KCL 0,2 g, MgSOh'7H20 0,2 g, jästextraktpulver 1,0 g, agarpulver 3,0 g, bromtymolblått (10$-g vattenlösning)<10 ml, destillerat vatten 1000 ml, pH 7,2 - 7,ü.

Syra- och gasbildning ur socker:*' (Ingen gasbildning observerad). dulcitol: - L-arabinos: - cellobios: - erytriolz. - fruktos: +(syra) galaktos: -_ glukos: - glycerol: +(syra) inositol: - laktos: - maltos: - mannitol: +(syra) mannos: - melezitos: - melibios: - raffinos: - L-ramnos: - salicin: - L-sorbos: - sorbitol: - stärkelse: - sackaros: - trehalos: - xylos: - flgasmedium: nnuflzPoh 1,0 g, KcL 0,2 g, Mgsoh-wizo 0,2 g, jäst-ex- traktpulver 1,0 g, agarpulver 3,0 g, bromtymolblått (10%-igvat- tenlösning) 10 ml, destíllerat vatten 1000 ml, pH7,2 - 7,4.

Till detta sattes 10 g socker.

Enligt-Bergey's Manuel of Determinative Bacteriology, 8th Ed. 197ü, tillhör stammen B-0618 med de i det ovanstående angivna taxonometriska egenskaperna, i synnerhet de grampositiva, sporbil- dande stora bacillerna, de peritrikt rörliga aeroba bakterierna och de 'ur glukos syra bildande bakterierna släktet Bacillus.

En jämförelse av stammen B-0618 med de andra liknande bakte- rierna, nämligen Bacillus badius, Bacillus freudenreíchii och Bacil- lus macroides genomfördes på följande sätt.

Bacillus badius ATCC-1ü57h (typkultur).

Bacillus freudenreichii ATCC-7053 (icke-typkultur, icke ori- gínalstam).

Bacillus macroides ATcc-129o5 (typkultur). m | 9 I o -H. D h u-r m 0 v\ w ml\ H M N O' P nfln M-flr\ E m w J -HO 'N O mr n§r\ m ~- : 5 | S 0 I D | m F40 H-HO' H 0 v40 H wo H U E -HB M hä fl me m 0< 0 nd 0 04 v m om mn m m m'U m~fl Hugh Leifson OF-test ingen syrabildning medium OF-test OF-test 0 O ingen syrabildning ovannämnda medium 7ë1nzss-s Fortsättning: katalas oxidas lllreaß' gelatin- 1ikváäçnn - (+) stärkelse hydrolys eskulin hydrolys (+) indolbild- ning Hzsfbila- '«ning aceton- bildning MR-test nitrat- reduktion citrat- utnyttjande Syrabíldníng EV socker arabinos fruktos galaktos ; 7310355-s Fortsättning: glukos - - - - glycerol + +* - - *senare alkali- nisering inositol - - - - laktos - -, - - - maltos O - - - - mannitol + - - - 111311005 - _ - - sorbitol - - - - sackaros - - - - - trehalos - - - - - xylos - - - - Följande karakteristika erhålles på buljongmedium.

Stammen B-0618: svag tillväxt, ulliknande sediment.

ATCC-1ä57Ä: likformigt grumlig, partiellt sediment. ÅTcc-7o53= svag tillväxt, uuilknanae sediment.

ATCC-12905: svag tillväxt, likformigt grumlig, partiellt sedi- ment.

Resultatet var att stammens B-0618 taxonometriska egenskaper skilde sig i flera avseenden från de därmed jämförda stammarnas ta- xonometriska egenskaper enligt följande: Bacillus badius ATCC-1457ü: bildning av ureas, syrabildning ur glycerol (syrabildning och senare alkalinisering) och mannitol.

Bacillus freudenreichii ATCC-7053: tillväxt på vätskeformigt odlingdmedium och ureasbildning (något liknande), eskulinhydrolys, syrabildning ur fruktos, glycerol och mannos. ATCC-7053-stammen är varken typkultur eller originalstam och följaktligen kan den icke identifieras med stammen B-0618. Följaktligen kan stammen icke till- höra nya arter.

Följaktligen hänföras satmmen B-0618 till Baeillus sp. och be- tecknas som Bacillus sp. B-0618. Denna stam har deponerats för per- manent kollektion i Institute for Microbial Industry and Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, under deposi- ïsflazss-s 6 tion nr FERM-P UOHQ. Stammen har också deponerats i ARS, USA som NFRI nr B-11380.

Ett ändamål med föreliggande uppfinning är ett förfarande för framställning av enzymet sarkosinoxidas genom odling av sarkosinoxi- das producerade mikroorganísm tillhörande släktet Bacillus i nä- rings-odlingsmedium och isolering av sarkosinoxidas från odlings- mediet. _ Ett annat ändamål med uppfinningen är att tillhandahålla en stam av mirkoorganismer som producerar sarkosinoxidas och som beteck- nas som Bacillus sp. B-0618 FERM-P nr HOHQ, NRRL B-11380.

Andra ändamål, kännetecken och fördelar med föreliggande uppfinning framgår av följande beskrivning i kombination med de bifo- gade ritningarna§ på vilka visas kurvor eller diagram som belyser föreliggande uppfinning. Pig. 1 visar sarkosinoxidasets optimala pH- värden. Pig. 2 visar sarkosinoxidasets optimala temperatur. Pig. 3 visar sarkosinoxidasets pH-stabilitet. Pig. 4 visar sarkosinoxidasets värmestabilitet. Pig. 5 visar resultatet av en kvantitativ analys av sarkosin genom bestämning av formaldehyd. Pig. 6 visar resul- tatet av en kvantitativ analys av sarkosin genom bestämning av väte- peroxid. I Enligt en utföringsform av föreliggande uppfinning odlas Bacillus sp. B-0618 EERM-P HUNQ i ett konventionellt odlingsmedium för anti- biotika- eller enzymproduktion. Odling med undervattensluftning före- dras för industriell produktion.

Ett konventionellt medium för mikroorganismer kan företrädes- vis användas. Som kvävekällor kan man använda källor för assimiler- bart kväve såsom majsstöpvätskor, sojabönpulver, pepton, kött- extrakt, jästextrakt, ammoniumsulfat, ammoniumklorid, eller liknande.

Assimilerbara kolkällor, såsom glukos, melass, stärkelsehydrat eller liknande kan lämpligen användas. Olika oorganiska salter såsom I natriumklorid, kaliumklorid, magnesiumsulfat, kaliumvätefosfat eller kaliumdivätefosfat kan eventuellt användas. Genom tillsats av kreatin till mediet, lämpligen i en mängd av 0,5 - l %, stimuleras sarkosin- oxídasbildningen.

Odlingstemperaturen kan varieras inom intervallet för växten av mikrobceller och eniymbildning och ligger företrädesvis mellan 26 och 33°C. Odlingstiden kan varieras beroende på betingelserna och ligger vanligtvis mellan 15 och 25 h. Odlingen bör givetvis avslutas när sarkosinoxidasbildningen i det väsentliga är slutförd. ' Sarkosinoxidas förekommer i mikroorganismernas celler.

Följande utföringsformer vid extraktion av sarkosinoxidas ur -, 7810355-3 odlingsmedier kan tillämpas. Odlingsmediet centrifugeras och de vå- ta cellerna suspenderas i en buffert, exempelvis i tris-HCl-buffert, och spränges genom behandling lysozym, ljudvågor eller en press en- ligt French. Det sålunda erhållna sarkosinoxidaset i rått tillstånd renas genom konventionell isolering och rening för protein och en- zym.V Som exempel kan nämnas, om så erfordras efter avlägsnande av nukleinsyra, genom tillsats av protaminsulfat, fraktionerad utfäll- ning med aceton, metanol, etanol, eller isopropanol och utsaltning med ammoniumsulfat. Ytterligare rening kan åstadkommas exempelvis medelst kromatografering, varvid det råa sarkosinoxidaset löses i tris-H01-buffert och kromatograferas med anjonbytare, såsom dietyl- aminbety1-cellulosa- eller -dextrangel, och gelfiltreringsmedel så- som dextrangel eller polyakrylamidgel. Renat sarkosinoxidas kan la- gras i form av lyofiliserat pulver.

Sarkosinoxidas enligt föreliggande uppfinning har följande fy- sikaliskt-kemiska egenskaper: (1) Enzymverkan: En mol sarkosin förbrukar en mol H20 och en mol syre och gene- rerar en mol glycin, en molfbrmaldehyd och en mol väteperoxid. En- zymet kataliserar oxidation av sarkosin till glycin och formaldehyd.

CHBNHCH + 02 + H20 -+-HZNCHZCOOH + HCHO + H2O2 Enzymprövning genomföras på följande sätt.

Till en reaktionsblandning (0,5 ml), bestående av 0,2 mol tris- Hcl-buffert (ps 8,0, 0,05 m1), h-aminoantipyrin (3 mg/m1, 0,05 m1), 0,2 % fenol (0,05 ml), peroxidas (0,5 mg/ml), 1 mol sarkosin (0,1ml), och destillerat vatten (0,2 ml) tillsättes till enzymlösningen (10 /ul) och inkuberas vid 3700 under 5 min. Etanol (2,5 ml) tillsättes för att avbryta reaktionen. Väteperoxidbildningen bestämdes kolori- metriskt (absorption vid H80 nm).

En enhet (1 unit, 1 u.) enzymaktivitet definieras som den mängd enzym som genererar 1/umol väteperoxid/min. (2) Substratspecifitet: Till en reaktionsblandning (0,5 ml) bestående av 0,2 mol tris- Hcl-bufferc (pH 8,0, 0,05 m1), h-aminoantipyrin (3 mg/ml, 0,05 m1), 0,2 $ fenol (0,05 mi), peroxidas (0,5 mg/mi, 0,05 m1), destillera: vatten (0,2 m1) och följande substrat (0,5 mol, 0,20 ml) sattes sar- kosinoxidas (0,5 enheter) och inkuberades vid'37°C i 5 min. Etanol (2,5 ml) tillsattes för att avbryta reaktionen, och bestämningen ge- nomfördes kolorimetriskt vid #80 nm.

Den relativa aktiviteten på olika substrat var följande: Substrat Relativ aktivitet Sarkosin 100,0 7810355-3 8 Kolin 0 Betain 0,03 Dimetylglycin 0,01 Glycin 0,06 Treonin 0 Alanin 0 Valin - 0 Lysin 0,09 . N-metyletanolamin 0 N-dimetyletanolamin 0 (3) optimalt pH: För att undvika en inverkan av Å-aminoantipyrin-fenol-peroxi- das på kromogen, bestämdes aldehydbildningen medelst acetylaceton- metoden. 'Resultaten visas i fig. 1, varav det framgår att optimalt pH är 8,0 - 9,5.

De använda buffertlösningarna var följande: pH Ä - 7: dimetyl- glutaratbuffert, pH 6-Ä 8: fosfatbuffert, pH 7,5 - 9: tris-HCl-buff- ert, pH 9 - 10: glycin - Na0H-buffert och pH 10 - 11: natriumkarbo- nat-boratbuffert. (4) Optimal temperatur: ' Ungefär 50°C såsom framgår av fig. 2. Substrat: sarkosin. (5) pH-stabilitet: _Man använder dimetylglutarat-buffert för pH 5 - 7, fosfat-buf- fert för pH 6 - 8,-tris-HCl-buffert för pH 7,5 - 9, glyçin-Na0H-buf- fert för pH 9 - 10 och natriumkarbonat-borat-buffert för pH 10 - 11.

Till 0,1 ml av var och en av bufferterna sattes 100 uLIenzymlösning (protein 1oo/ug/m1) och det hela fick stå 1 60 min vid 37°c. Efter injustering av pH genom att tillsätta 1,0 mol tris-HCl-buffert (pH 8,0, 0,3 ml) oeh uttagning av ett prov om 20/ul, bestämdes enzymaktií viteten. Sarkosin användes som substrat och såsom framgår av fig. 3: ligger stabilt pH mellan ungefär 6,0 och 10,0. (6) värmestabilitet: 1 Enzymets värmestabilitet bestämdes genom inkubering av 10 mmol tris-HCI-buffert (0,5 ml, pH 8,0) innehållande enzym (protein 20/ug/ ml) vid olika temperaturer i 10 min med användning av sarkosin som substrat. 'Såsom framgår av fig. 4 är enzymet stabilt vid temperatu- rer under ungefär 4000. (7) M01eky1vikt= ÄOOOO (bestämd medelst gelfiltreringsmetoden). (8) Isoelektrisk punkt: ü,7 (elektrofores med användning av anfolyt av bärartyp). (9) Identifiering och bestämning av reaktionsprodukternaí 9 7810355-5 i) Identifiering av glycin: Reaktionsblandning: 0,2 m°1 tris-Hc1~buffert (pH 8,0) 1,0 m1 1 mmol sarkosin 1,0 ml Katalas 200 enheter Sarkosinoxídas 5 enheter Destillerat vatten . 8,0 ml totalt 10,0 ml .Ovanstående reaktionsblandning (10 ml) inkuberades vid 3700 i 60 min, varpå reaktionen avbröts genom upphettning vid 100°C i 5 min.

Bildade fällningar avcentrifugerades och det övre vätskeskiktet upp- koncentrerades 10 gånger och droppar och droppar därav avsattes på ett filtrerpapper. Ett kromatogram framkallades över natten med vatten, mättat med fenol och färgades genom upphettning efter besprut- ning med ninhydrinlösning. Observerat Rf-värde 0,26. Autentiska prov av sarkosin och glycin uppvisade Rf-värden av 0,66 resp 0,26 och härigenom identifierades en fläck med det ovan angivna Rf-värdet som glycin. ii) Bestämning av formaldehydz Reaktionsblandningen: 0,2 m1 tris-Hcnbufferc (pH 8,0) 0,05 m1 Sarkosin med alikvot koncentration 0,10 ml Katalas _ 200 enheter Sarkosinoxidas - 3,0 " Destillerat vatten _ 0,35 ml totalt 0,50 ml Reaktionsblandningen inkuberades vid 37°C i 20 min. Reaktionen avbröts genom upphettning i 5 min, och efter avkylning tillsattes acetatbuffert (pH 5,5, 1,5 ml) och därefter den härnedan angivna kro- mogenlösningen (20 ml), Efter inkubation i 50 min vid 3700 genomför- des kolorimetrisk bestämning vid 412 nm. Resultatet framgår av fig. 5, i vilket diagram formaldehydbíldningen angives som funktion av sarkosinkoncentrationen.

Kromogen: Ammonium acetat 15 g Ättihsyra 0,3 ml Acetylaceton 0,2 ml Vatten q.s. 100 ml iii) Bestämning av väteperoxid: Väteperoxid bestämdes kvantitativt genom kombination av R- aminoantipyrin-fenol-peroxidas.

Reaktionsblandníng: 7810355-3 10 0,2 mn1 :rie-H01-bufferclöening (pa 8,0) 0,05 m1 3 mg/ml R-aminoantipyrin 0,05 ml 0, 2 % fenel 0,05 m1 0,5 mg/ml peroxidas 0,05 ml Sarkosin med alikvot koncentration 0,10 ml Sarkosinoxidas 3,0 enheter Destillerat vatten 0,2 ml totalt 0,5 ml Reaktionsblandningen inkuberades vid 3700 i 20 min. Efter tillsättning av etanol (2,5 ml) genomfördes kolorimetrisk bestämning av blandningen vid h80 nm. Såsom framgår av fig. 6 svarar väteper- oxidbildningen mot sarkosinkoncentrationen. » Såsom ovan förklarats katalyserar enzymet sarkosinoxidas en- ligt föreliggande uppfinningoxidationsreaktionen, varvid sarkosin omsättes med syre (där en mol vattenförbrukas per en mol sarkosin), och glycin, formaldehyd och väteperoxid bildas. Följaktligen bekräí tas att enzymet är EC 1.5.3.1-sarkosin: oxygenoxidoreduktas (demetyl erande).

Sarkosinoxidas kan användas som enzymatiskt diagnostiserings- reagens exempelvis för bestämning av kxeatinin i blod eller urin med kombination av kreatinas och kreatininas. Vidare kan sarkosinoxidas användas för bestämning av kreatíninasaktivitet.

I följande exempel förklaras uppfinningen som utföringsform men denna är givetvis icke begränsande för uppfinningen.

Exemgel: Ett medium (100 m1) innehållande kreatin (0,5 %), fiexexurekt (o,5_%),-jäetextrekc (0,2 %), Kcl (0,3 %), KZHPOÄ (0,1 %), een Mgs0¿ -7H20 (0,o5 $) 1 en 500 m1 erlenmeyerkelv eeerilieeredee vid 12o°c : 20 min. Bacillus sp. B-0618 FERM-P üOü9 inympades och det hela od-0 lades vid 3000 under en dag som en frökultur, som överfördes till : samma steriliserade medium (20 1) i ett jäskar för 30 l och odlades vid 3000 i 20 timmar och under rotation 200 v/min och luftning med 20 l/min. Bakteriecellerna avcentrifugerades (12 g), tvättades med 10 mmol fosfat-buffert (pH 7,0), suspenserades i samma buffertlösniz och lysozym (slutlig koncentration 0,2 mg/ml) tillsattes och det hefi omrördes vid 3700 i 30 min. Genom centrifugering med 5000 v/min i 15 min erhölls ett övre vätskeskikt som uppsamlades (sarkosinoxidas aktivitet 1ü0O enheter). Till det sålunda erhållna övre vätskeskikf tet sattes 2 % protaminsulfatlösning (2,5 ml) och nukleinsyrafällnil gen avskildes. Till vätskefasen sattes mättat ammoniumsulfat och fällningen åstadkommen med fraktioner av 50 - 70 % ammoniumkoncentr tion uppsamlades. Fâllningen löstes i 10 nmol tris-HCl-buffert (pH H 78310355-3 8,0, 20 ml) och avsaltades genom en kolonn av SEPHADEf® G-25 (3,5 x 30 cm). Den avsaltade lösningen passerade en DEAE-cellulosakolonn (2,0 x 18 cm, buffrad med 10 nm°1 yris-Hcl-buffert, pH 7,0) för att absorbera enzymet, tvättades med samma buffertlösning, innehållande Q 0,1 mol KCl, och eluerades med en gradient av 0,1 mol - 0,5 mol KC1- lösning.

Den aktiva fraktionen som eluerades med 0,36 mol KC1 qppsamla- des och dialyserades i 10 timmar mot en lösning av 10 nmol tris-HC1- buffeft (pH 8,0) och frystorkades, varigenom man erhöll ett pulver av sarkosinoxidas.

Totalaktivitet: 540 enheter, protein H3 mg, specifik aktivitet 12,7 enheter/mg, utbyte 38,6 $.

Claims (2)

vëfoass-s \í P A T E N T K R A V

1. Sätt att framställa sarkosinoxidas, k ä n n e - t e c k n a t av att man odlar en sarkosinoxidas producerande mikroorganism Bacillus sp. NRRL B-11380 i ett närings-odlings- medium och isolerar det så bildade sarkosinoxidaset ur ødlings- mediet.

2. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att odlingsmediet innehåller kreatin.