DE2834307A1

DE2834307A1 - Verfahren zur herstellung von liposomen in waessriger loesung

Info

Publication number: DE2834307A1
Application number: DE19782834307
Authority: DE
Inventors: Michel Schneider
Original assignee: Battelle Memorial Institute Inc
Current assignee: Battelle Memorial Institute Inc
Priority date: 1977-08-05
Filing date: 1978-08-03
Publication date: 1979-02-15
Also published as: CA1098410A; IT1097928B; IL55154A; GB2001929B; ES472326A1; US4224179A; DK155036C; SE433169B; SU1158031A3; DK155036B; FR2399242B1; SE7808356L; JPS6355978B2; CH624011A5; DK344478A; HU179672B; GB2001929A; BE869490A; IL55154A0; JPS5441279A

Description

PATENTANWÄLTE

D-1 BERLIN-DAHLEM 33 - PODB1ELSKIALLEE βθ D-8 MÜNCHEN 22 ■ WIDENMAYERSTRASSE 49

DATTELLE MEMORIAL INSTITUTE

BERLIN: DIPI ING. R. MÜLLER-BÖHNER

MÜNCHEN: DIPL.-INS. HANS-HEINRICH WEY DIPL.-INS. EKKEHARD KÖRNER

Berlin, den '}. August 1978

Verfahren zur Herstellung von Liposomen in wäßriger Lösung

(entsprechend Schweiz Nr. 9616/77 v. 5.8.77)

23 Seiten Beschreibung mit 11 Patentansprüchen

Ohr - 27 391

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BERLIN: TELEFON (O3O) 8312Ο88 KABEL: PROPINDUS ■ TELEX 01 84Ο57 MÜNCHEN: TELEFON (O8S) 2S558B
KABEL: PROPINDUS · TELEX O5 24244

Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Liposomen in wäßriger Lösung oder Suspension.

Liposome sind mikroskopische Bläschen von im allgemeinen shärischer Form, die aus mehreren konzentrischen Schichten (Lamellen) von lipiden Molekülen bestehen, d.h. sie weisen einen hydrophilen lipophoben und einen lipophilen und hydrophoben Teil auf. Die Lamellen eines in Wasser löslichen Liposoms bestehen aus mindestens einer bimolekularen Lipidschicht (im folgenden bezeichnet mit der Formel XY, wobei X der hydrophile und Y der hydrophobe Teil sind). Die Moleküle der letzteren sind so orientiert, daß ihre hydrophilen Funktionen in Kontakt mit der wäßrigen Phase sind. Die Lamellen der Liposomen sind voneinander durch eine Wasserschicht getrennt, die im Schnitt schematisch durch eine Folge von molekularen Verbindungen XY-YX dargestellt werden können, die in der Papierebene nebeneinander angeordnet sind. Die Größe der Liposomen ist sehr unterschiedlich und hängt, wie weiter unten beschrieben wird, von der Herstellungsart ab. Im allgemeinen beträgt der Durchmesser zwischen 25 und 30 000 nm, wobei die Dicke des Lipidfilms der Lamellen in der Größenordnung zwischen 3 und 10 nm liegt. Die Liposome, deren Größe im unteren Bereich liegt, bilden im allgemeinen eine monolamellare

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Schicht, d.h. eine einzelne Schicht molekularer Verbindungen XY-YX.

Die wäßrige Phase, in der die Liposome eine Lösung oder Suspension bilden, unterscheidet sich im allgemeinen von der wäßrigen Phase in ihrem Inneren. Die Herstellung von Liposomen bildet ein sehr brauchbares Einkapselungsverfahren zum Einschließen einer wäßrigen Lösung und derartige Bläschen sind besonders nützlich zum Einführen von biologisch aktive Substanzen in lebende Organismen, das sind Drogen oder Medikamente, wobei ein vorzeitiger Abbau (beispielsweise durch Magensaft oder Darmflüssigkeit) bevor die Substanzen die Möglichkeit haben das betreffende zu behandelnde Organ zu erreichen, verhindert wird. Durch eine geeignete Auswahl der Verbindung XY allein oder mit einem anderen Surfaktans ZW, wobei Z X entspricht und WY entspricht, zur Bildung liposomer Wände, ist es möglich, Liposome mit Wänden zu bilden, die der Wirkung der jeweiligen Kategorien von organischen Flüssigkeiten widerstehen und nur in dem Medium gelöst werden, das in dem Organ besteht, in dem die biologisch aktive Substanz freigesetzt werden soll. Infolgedessen enthalten die Liposome in ihrem Innern im aligemeinen eine wäßrige Lösung des eingekapselten Produkts und zur Erzeugung der Liposomenlösung selbst werden sie in Wasser oder in einer beliebigen wäßrigen Phase, wie beispielsweise wäßrigen NaCl von isotoner Konzentration gelöst oder dispergiert.

Es wird darauf hingewiesen, daß der Inhalt der Liposome nach der Erfindung nicht auf die medizinische Anwendung oder auf biologisch aktive Komponenten beschränkt ist, sondern auch andere wasserlösliche Materialien umfaßt. Als derartige andere Materialien sollen genannt werden: Par-

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ben, Parfüme, Geschmacksstoffe oder, allgemein gesagt, Stoffe, welche in einem bestimmten industriellen Verfahren benutzt werden oder Materialzusammensetzungen, welche mit einer gewissen Verzögerung in Bezug auf ihr Hinzufügen freigesetzt werden sollen oder aber im Verlauf der Zeit nach und nach verbraucht werden sollen- Liposome sind daher nicht nur für pharmazeutische Produkte geeignet, obwohl sie, wie oben erwähnt, den Träger für Medikamente bilden können.

Es soll ebenfalls darauf hingewiesen werden, daß der Begriff "Lipid" hier in seinem weitesten Sinn gebraucht wird, d.h. er umfaßt die meisten Verbindungen, welche der Definition XY oder ZW, wie oben erwähnt, genügen, wobei sie entweder natürlich oder synthetisch sein können, wie beispielsweise viele Arten von Surfaktantien, welche in der pharmazeutischen, kosmetischen, Textil-, Detergenzien-, Nahrungsmittel- usw. Industrie verwendet werden.

Es ist bereits eine Anzahl von Verfahren zur Herstellung von Liposomenlosungen im obengenannten Sinn bekannt, wobei die Verfahren beschrieben sind in "New Aspects of Liposomes" von D. A. Tyrell, T. D₀ Heath, CM. Colley & B.E. Ryman, Biochimica & Biophysica Acta, 457 (1976), 259-302.

Eines dieser Verfahren umfaßt das Aufheizen einer heterogenen Mischung eines Lipids und des einzukapselnden wäßrigen Lipids auf eine Temperatur oberhalb der Raumtemperatur und das anschließende Aussetzen der Mischung einer heftigen Beschallung, d.h. Frequenzen im Schall- oder Ultraschallbereich. Ein weiteres Verfahren umfaßt das Lösen einer Verbindung der Formel XY (X und Y mit der oben definierten Bedeutung), z.B. ein Lipid in einem flüchtigen Lösungsmittel, Verdampfen der in einem Gefäß enthaltenen

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Lösung, wodurch sich ein Film des Lipids an den Wänden des Gefäßes niederschlägt. Eingeben der einzukapselnden Flüssigkeit in das Gefäß und schließlich das Aussetzen der Einwirkung von Schall- oder Ultraschall-Frequenzen, wobei die Flüssigkeit in Tröpfchen geteilt wird, die von lipiden Umhüllungen umgeben sind. Je langer die Behandlung andauert, desto mehr Liposome erhalten eine monolamellare Umhüllung.

Es ist ersichtlich, daß die beiden obengenannten Methoden zu einer Lösung von Liposomen führen, die in der einzukapselnden Flüssigkeit verteilt sind, was im allgemeinen jedoch nicht beabsichtigt ist. Daher ist es notwendig, später die liposomen Bläschen von der Trägerflüssigkeit zu trennen und anschließend in einer anderen wäßrigen Phase zu verteilen. Eine derartige Trennung der Liposomen aus ihrem ersten flüssigen Träger kann beispielsweise durch Chromatographie oder Molekularsiebe auf Silicagelen oder Sephadex (granulierte Polymere) bzw. wiederholtes Zentrifugieren bewirkt werden. Alle derartigen Methoden sind aber langwierig und kostspielig.

Es ist nach einem anderen Verfahren zur Herstellung von Liposomenlösungen auch möglich, eine Äthanol-Lipid-Lösung in eine einzukapselnde Lösung zu injizieren, was zur 5 Bildung von Liposomenbläschen von ungefähr 2 5 nm führt. Ein derartiges Verfahren ist nur anwendbar, wenn das zu umkapselnde Produkt sich in Gegenwart von Alkohol nicht verändert. Die Trennung der erhaltenen Bläschen aus der im Überschuß vorhandenen nicht eingekapselten Flüssigkeit und die anschließende Redispersion in einen anderen wäßrigen Träger ist langwierig und mit einigen der zuvor genannten Nachteile behaftet.

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Es ist auch ein Verfahren benutzt worden, das darin besteht, ein Lipid und ein Detergenz mit der einzukapselnden Flüssigkeit zu mischen und die Mixtur zu emulgieren. Anschließend wird das Detergenz durch Dialyse beseitigt. Dabei werden wiederum die Liposome in dem Überschuß der einzukapselnden Flüssigkeit erhalten, aus der sie getrennt und gereinigt werden müssen.

Es soll erwähnt werden, daß die bisher beschriebenen Verfahren alle voraussetzen, daß eine Anfangsflussigkeitsmenge vorhanden sein muß, die viel größer ist als diejenige, welche schließlich in den Liposomen eingekapselt ist. Bei diesen Verfahren werden die Liposome - wie erwähnt schließlich in hohlen Perlen in Lösung oder kolloidaler Suspension in einem flüssigen Träger erzeugt, welche einen Teil der einzukapselnden Originalflüssigkeit bildet, die nicht in den Perlen festgehalten wird. Das Verhältnis der in den Liposomen eingekapselten Flüssigkeit zum gesamten Flüssigkeitsvolumen liegt nur in der Größenordnung von 1 bis 10%. Es ist daher kostspielig Flüssigkeiten einzukapseln und es ist nötig - insbesondere im Falle der biologisch aktiven Lösungen - den nicht eingekapselten Teil der Flüssigkeit wiederzugewinnen. Diese Wiedergewinnung entspricht der Trennung der Liposome aus der Flüssigkeit. Nach der Trennung muß die Flüssigkeit von Verunreinigungen befreit und die Konzentration der aktiven Substanzen wiederhergestellt werden, da die Trennungs- und Reinigungsvorgänge große Volumina von Lösungsmitteln erfordern können, welche zu einer unannehmbaren Verdünnung der aktiven Substanzen führen. Es ist daher schwierig und teuer die obengenannten Verfahren für die Herstellung von Liposomenlösungen in industriellem Maßstab zu benutzen, da sehr große Flüssigkeitsvolumina, bezogen auf das Ergebnis, benutzt werden müssen.

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Aus der DE-OS 25 32 317 ist ein Verfahren zur Herstellung von Liposomen in wäßriger Lösung bekannt, welche die vorgenannten Nachteile zum großen Teil beseitigt. Nach dieser Methode wird die einzukapselnde Lösung einfach zu der Lösung des Surfaktans in einem organischen, in Wasser unlöslichen Lösungsmittel hinzugefügt, mit einer Dichte unter 1 wobei die Mischung ebenfalls beschallt wird. Nach diesem Schritt liegt eine organische Flüssigkeit mit einer Suspension von mikroskopischen wäßrigen Bläschen vor, welehe von jetzt ab "Precursor von Liposomen" genannt werden sollen. Sie sind ein Ergebnis einer Dispersion der in das organische Lösungsmittel einzukapselnden Lösung, deren Bläschen von einer Einfachschicht von Lipid-Molekülen umgeben sind, von denen jedes wie folgt orientiert ist: Die X-Funktion kontaktiert die wäßrige Phase und ist deshalb zum Inneren jedes Tropfens gerichtet, während die Y-Funktion entgegengesetzt ist, d.h. es ist von dem organischen Milieu umgeben, welches in gelöstem Zustand einen Oberschuß von Lipid enthält.

Anschließend wird die Suspension in Anwesenheit des wäßrigen Mediums zentrifugiert, in dem die Liposomenlösung erzeugt werden soll. Während des Zentrifugierens gehen die "Precursor von Liposomen" von der oberen organischen Phase unter dem Einfluß der Zentrifugalkraft in die wäßrige Phase über. Dabei passieren sie eine Zwischenphase, die eine lipide Membran umfaßt, welche aus dem Oberschuß des in dem organischen Lösungsmittel gelösten Surfaktans resultiert. Die Moleküle des Lipids in dieser Zwischenphase orientieren sich entsprechend den relativen Positionen der beiden Phasen. Bei diesem Obergang bilden die "Precursor von Liposomen" eine zweite Oberflächenschicht, deren Moleküle entgegengesetzt sind. Die beiden Schichten bilden

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eine liposome XY-YX Haut. Es ergibt sich damit direkt die gewünschte Lösung von Liposomen in wäßrigem Milieu.

Damit umfaßt dieses Verfahren zwei Phasen: In der ersten Phase wird unter dem Einfluß von Schall eine Dispersion von Bläschen oder Kugeln der zu umkapselnden Flüssigkeit in einer Flüssigkeit erzeugt, die in Wasser nicht oder kaum löslich ist. Die Kugeln haben kolloidale Dimensionen, d.h. einen Durchmesser von 20 bis 100 nm. Diese Kugeln werden durch eine monomolekulare Schicht der Zusammensetzung X-Y begrenzt, deren hydrophile Gruppen auf das Innere der Kugeln zu gerichtet sind, welche von der zu umkapselnden Flüssigkeit eingenommen ist. Die hydrophoben Gruppen Y sind dagegen zum Äußeren der Kugeln gerichtet, die sich in der wäßrigen Phase befinden. Diese Kugeln sind zwar keine echten Liposome, da sie nicht durch eine doppelte Molekülschicht der XY-Verbindung begrenzt sind, sie können aber als Liposomskelett betrachtet werden, da jede von ihnen die selbe Menge Flüssigkeit enthält, die in den späteren Liposomen enthalten sein wird. Es ist deshalb gerechtfertigt, diese Kugeln als "Precursor von Liposomen™ anzusprechen.

Durch entsprechende Einstellung der verschiedenen Anteile der einzukapselnden wäßrigen Flüssigkeit, des organischen Lösungsmittels und der Verbindung der Formel X-Y im Verlauf des ersten Teils des Verfahrens ist es möglich, eine nahezu vollständige Einkapselung der zu ummantelnden Flüssigkeit in die Precursor der Liposomen zu erreichen» 30

Die Ausbeute der Einkapselung ist dabei in der Nähe der theoretischen Grenze, beispielsweise rund 80%„ was einen beträchtlichen Fortschritt im Vergleich zu den bisherigen Ausbeuten in der Größenordnung von 20% bedeutet.

Die zweite Phase des Verfahrens besteht in dem Erzeugen der Liposome selbst. Es kann angenommen werden, daß dieser Vorgang mit einem Durchlaufen der Precusor der monomolekularen Schicht der Verbindung X-Y in der Interphase zwischen der nichtwäßrigen oberen Schicht und der wäßrigen unteren Schicht verbunden ist. Die Bildung einer derartigen monomolekülaren Schicht resultiert in bekannter Weise aus den Eigenschaften seiner Zusammensetzung: Die hydrophilen Gruppen X werden von der flüssigen wäßrigen Schicht angezogen,.während die hydrophoben Gruppen in Kontakt mit der nichtwäßrigen Schicht bleiben). Jeder "Precursor von Liposomen" erzeugt einen Teil dieser Schicht, welcher sich mit der monomolekularen Schicht der Verbindung X-Y verbindet, die sie umgibt, und bildet damit die für die Liposome charakteristische bimolekulare Schicht.

Dieses Verfahren gestattet es damit, die Verfahrens schritte der Wiedergewinnung, Reinigung und Wiedereinstellung der Konzentration der einzukapselnden Schicht zu vermeiden, die - wie oben erwähnt - bei den bekannten Fabrikationsverfahren für Liposome notwendig sind.

Es ist ebenfalls ersichtlich, daß es das Verfahren durch die Bildung von Liposomen ermöglicht, Flüssigkeiten einzukapseln, die nur in geringen Mengen, wie beispielsweise in der Größenordnung von 0,05 bis 0,1 ml vorhanden sind, einzukapseln, wobei diese Mengen für die bisherigen Verfahren nicht ausgereicht hätten.

Damit hat dieses Verfahren, das die direkte Herstellung von Liposomlösungen ohne die Notwendigkeit, die Liposomen von den Resten einer wäßrigen Anfangslösung zu befreien und damit die Liposome in einem weiteren gewünschten wäß-

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rigen Medium zu dispergieren, ermöglicht den Vorteil, daß es für viele Anwendungen benutzt werden kann, in denen die bisherigen Verfahren nicht verwendbar wären, wie beispielsweise biologische und medizinische Anwendungen und Analysen.

Es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß trotz dieser Vorteile das genannte Verfahren zwei Nachteile aufweist: Erstens muß das organische wasserunlösliche Lösungsmittel notwendigerweise leichter als Wasser sein, um sicherzustellen, daß die Phase der "Precursor von Liposomen" die obere Schicht beim Zentrifugieren bildet. Damit ergeben sich bestimmte Einschränkungen bei der Wahl des Lösungsmittels. Darüber hinaus ist das Zentrifugieren selbst ein unerwünschter Vorgang, da es normale Hochgeschwindigkeitszentrifugen nicht gestatten, größere Flüssigkeitsmengen auf einmal zu behandeln. Weiterhin ertragen einige empfindliche biologische Substanzen nicht die höhen Beschleunigungen (103 bis 105 g), die mit der Ultrazentrifugierung verbunden sind.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde bei einem Verfahren zur Herstellung von Liposomen in wäßriger Lösung oder Suspension, bei dem "Precursor von Liposomen" mit einem wäßrigen Medium in der Weise in Kontakt gebracht werden, daß die wäßrige Lösung oder Suspension von Liposomen entsteht, wobei die "Precursor von Liposomen" aus mikroskopischen Bläschen einer ersten wäßrigen Lösung bestehen, die von einer Umhüllung eines Lipids oder Surfaktans der Formel XY umgeben sind, wobei X eine hydrophile lipophobe Gruppe darstellt und Y eine lipophile hydrophobe Gruppe und die "Precursor von Liposomen" durch Dispergieren der ersten wäßrigen Phase in einem in Wasser

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unlöslichen oder kaum löslichen Lösungsmittel in Gegenwart einer Menge einer Verbindung XY dispergiert werden, diese Nachteile zu vermeiden.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die "Precursor von Liposomen" in dem wäßrigen Medium unter Anwesenheit der Verbindung XY im Überschuß oder eines anderen Lipids oder Surfaktans ZW, wobei Z eine hydrophile Gruppe und W eine hydrophobe Gruppe darstellt, emulgiert werden, wobei das unlösliche oder kaum lösliche Lösungsmittel vor oder nach dem Emulgieren beseitigt wird.

Um die erste wäßrige Phase im nicht oder wenig in Wasser löslichen Lösungsmittel zu dispergieren, können die klassischen Methoden wie Beschallung, heftiges Rühren, Homogenisierung, Dispersion durch Einblasen eines Gases, Pulverisierung etc. verwendet werden. Das Verfahren der Beschallung wird aus Gründen der Einfachheit bevorzugt. Um das unlösliche Lösungsmittel vor der Emulgierung zu trennen, können die klassischen Verfahren wie Destillation, Verdampfung oder Zentrifugieren angewendet werden. Eine derartige Beseitigung vor der Emulgierung kann jedoch zur teilweisen Agglomeration der "Precursor von Liposomen™ führen, mit der Konsequenz, daß das Entfernen des Lösungsmittels nach der Emulgierung der das Lösungsmittel enthaltenden Precursor im wäßrigen Medium vorgenommen wird. Dieses Entfernen kann beispielsweise durch selektive Destillation oder Verdampfung erfolgen. Nach einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung werden die beiden Phasen zusammen emulgiert und die Emulsion einer Verdampfung zum Verflüchtigen des Lösungsmittels unterzogen, so daß sie eine Lösung von Liposomen in der wäßrigen Phase bilden»

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In der Praxis kann dazu ein nicht wasserlösliches organisches Lösungsmittel in einen Reaktor gegeben werden und ein Lipid oder eine Mischung von die lipide Fraktion bildenden Produkten hinzugegeben werden. Anschließend wird die zu umkapselnde wäßrige Lösung hinzugefügt, die Mischung durch Schall- oder ultraschallwellen homogenisiert, um darin die Bläschen oder Perlen der eingeschlossenen wäßrigen Flüssigkeit in der Form von "Precursor von Liposomen" zu bilden. Anschließend wird die gewünschte Menge des wäßrigen Mediums, beispielsweise einer Lösung einer Anzahl von Salzen in Wasser oder reines Wasser bzw. ein weiterer Teil der Verbindung XY oder der anderen Mischung ZW, wie sie oben definiert wurde, hinzugefügt und der Einwirkung einer Emulgiervorrichtung ausgesetzt bis sich die endgültige Emulsion einstellt. Diese Emulsion besteht aus einer Suspension von Mikrotröpfchen des Lösungsmittels in der wäßrigen Phase. Diese Mikrotropfen enthalten in Lösung eine unterschiedliche Anzahl der "Precursor von Liposomen" und ein Überschuß der lipiden Fraktion. Anschließend wird die Emulsion durch Rühren aufrechterhalten (bzw. das Rühren eingestellt, wenn die Emulsion in sich stabil ist) und der Inhalt des Reaktors einer Verdampfung ausgesetzt. Bei gewöhnlichem Druck wird beispielsweise Luft oder ein anderes Gas auf die Oberfläehe der Flüssigkeit bzw. parallel dazu eingeblasen und die mit dem Dampf des Lösungsmittels beladene Luft in einem auf niedrige Temperatur abgekühlten Kondensator kondensiert. Während der Verdampfung und wegen des heftigen Rührens werden die "Precursor von Liposomen" zunehmend durch die Zwischenphase Lösungsmittel-Wasser dispergiert und treten infolgedessen durch die Lipidmembran hindurch, welche die beiden Phasen trennt, so daß sie die zweite Lipidschicht erreichen, in der sie vom Zustand der Precur-

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sor in den der endgültigen in wäßrigem Medium gelösten oder dispergierten Liposomen umgeformt werden.

Bei dem letzten Schritt dieser Ausführungsform kann es vorteilhaft sein, ein Lipid oder Surfaktans ZW zu benutzen, welches sich von der Verbindung XY unterscheidet, insbesondere in dem Fall, wenn die gegenseitige Affinität der hydrophoben-lipophilen Y- und Z- größer ist als die gegenseitige Affinität zwischen den beiden Y oder den beiden W-Gruppen. In diesem Fall (beispielsweise, wenn Y ein gutes lipophiles dispergierendes Agens ist und ZW ein gutes dispergierendes hydrophiles Agens ist) erhält man Liposomen., deren Umhüllung die nachfolgende Struktur aufweist
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— XX —
Y Y

I I

W W — ZZ —

und relativ stabil ist.

Dieses Verfahren, bei dem die Ausbeute sehr groß ist (ungefahr 50 bis 80%), ist im Vergleich mit dem bekannten Verfahren sehr einfach auszuführen. Große Materialmengen können gleichzeitig verarbeitet werden und es können, wenn gewünscht, auch Lösungsmittel verwendet werden, die schwerer als Wasser sind. Die Auswahlmöglichkeit des Lösungsmittels ist in diesem Fall größer als bei dem in der DE-OS 25 32 317 beschriebenen Verfahren, so daß es damit möglich ist, sehr unterschiedliche Surfaktante zu benutzen, wie beispielsweise Lipide, die bei Raumtemperatur fest sind

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und nach den bekannten Verfahren hätten aufgeheizt und geschmolzen werden müssen, wobei die dabei zu erreichenden Temperaturen vielfach schädlich für die einzukapselnden Produkte sind.
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Weiterhin erleichtert die größere Auswahlmöglichkeit von Lösungsmitteln die Wahl, wenn Lösungsmittel benutzt werden müssen, welche gegen aktive einzukapselnde Inhaltsstoffe inert sein müssen.

Es wird darauf hingewiesen, daß andere als die genannten Mittel benutzt werden können, um die Emulsion herzustellen und anschließend das Lösungsmittel zu verdampfen. Das Emulgieren kann beispielsweise durch Schütteln und das Evaporieren bei reduziertem Druck erfolgen. Es ist jedoch notwendig, daß der Partialdampfdruck des Lösungsmittels beträchtlich größer ist als derjenige von Wasser, da sonst durch das Abziehen von Wasser während des Verdampfens Wasser wiederholt zugesetzt werden muß.

Als Lösungsmittel kommen in Betracht:

Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Toluol, Cyclohexan, Petroläther, Octan, etc.,
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Äther, wie Diäthyläther, Diisopropyläther, Dibutyläther, etc. ,

Ester, wie Äthylacetat, Propylacetat, Butylacetat, Äthylcarbonat, etc.,

halogenierte Lösungsmittel, wie Chloroform, CCl_-J, CH₂Cl₂, etc.;

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als Surfaktans der Formel XY oder ZW können beispielsweise benutzt werden: tertiäre oder komplexe Lipide, GIyceride, Geride, Ätholide und Steride, insbesondere eine oder mehrere Verbindungen, in denen die hydrophile X- bzw. Z-Gruppe eine der folgenden ist: Phosphat, Carboxyl, Sulfat, Amino, Hydroxyl und Cholin und die hydrophobe Y- bzw. W-Gruppe eine der folgenden ist: gesättigte oder ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffe (beispielsweise Alkyl, Alkylen), Polyoxyalkylen, und aliphatische Kohlenwasserstoffe, bei denen mindestens ein aromatischer oder cykloaliphatischer Rest substituiert ist.

Es ist von Bedeutung, daß, wenn XY oder ZW Verbindungen mit acidischen hydrophilen Gruppen (Phosphate, Sulfate, etc«) verwendet werden, die erhaltenen Liposome anionisch sind (genannt (-)-Liposome). Bei basischen Gruppen wie Amine ergeben sich kationische (+)-Liposome. Bei Polyäthylenoxy- oder Polyglykol-Gruppen ergeben sich neutrale Liposome. Viele für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Verbindüngen finden sich in: McCutcheon's Detergents & Emulsifiers sowie McCuteheon's 1976 Functional Material, Allured Pub.l. Company, Ridgwood, N.J. USA.

Als Verbindungen XY oder ZW werden vorzugsweise mit Phospholipiden verwandte Verbindungen benutzt, wie beispielsweise die folgenden: Lecithin, Phosphatidyl-äthanolamin, Lysolecithin, Lysophosphatidyl-äthanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidyl-inosit, Sphingomyelin, Cardio-lipin, Phosphatidinsäure und Cerebroside, Dicety!phosphat, Phosphatidyl-cholin, Dipalmitinoyl-phosphatidylcholin. Als nicht phosphorhalt ige Lipide können beispielsweise verwendet werden: Stearylamin, Dodecylamin, Hexadecylamin, (Kodak Ltd) Cetylpalmitat, Ricinolsäureglycerid^ Hexade-

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cylstearat, Isopropylmyristinat, amphotere Acrylpolymere, Laurylsulfat, Triäthanolaminsulfat, Alkoylarylsulfonat, Amide von äthoxylierten Fettsäuren, etc.

Die lipiden Fraktionen können weiterhin gelöst Substanzen entshalten, welche die Stabilität und Dauerhaftigkeit der Liposomenmembran steuern. Dazu lassen sich als Beispiele nennen:

Sterole, z.B. Cholesterin, Tocopherole Phytosterin und Lanolinextrakte.

In dem beschriebenen Verfahren lassen sich praktisch alle wasserlöslichen Substanzen einkapseln, welche keine zu große Affinität zu den Verbindungen der Liposomhüllen haben bzw. nicht diese Hüllen durchdringen wurden. In dieser Beziehung sollen neben den vorgenannten Produkten erwähnt werden: wäßrige Lösungen von biologisch aktiven Substanzen, z.B. Schwermetallchelate, Enzyme, Medikamente, Antibiotica etc. Beispiele von geeigneten Substanzen sind aufgeführt in "Targeting of Drugs", G. Gregoriadis, Nature 265, [2] (1967), 407.

Als wäßriges dispergierendes Medium, in dem sich die Liposome bilden, kann reines Wasser oder jede andere geeignete wäßrige Flüssigkeit verwendet werden. Vorzugsweise wird eine Flüssigkeit verwendet, welche als endgültiges Dispersionsmilieu für die Liposome bei ihrer Benutzung dient, wie beispielsweise eine wäßrige Lösung von NaCl. Insbesondere kann eine physiologische Kochsalzlösung mit einer Konzentration von 0,15 NaCl /1 (0,9 Gew.%) verwendet werden, um im zweiten Teil des Verfahrens eine liposome Dispersion in einem direkt in den menschlichen Organismus

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injizierbaren Milieu zu erhalten. Dabei wird einer der HauptVorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sichtbar: die Möglichkeit, eine liposome Suspension direkt in einem Medium zu erhalten, das der endgültigen Bestimmung dieser Liposome entspricht.

Dabei ist es selbstverständlich gleichfalls möglich, die nach dem dargestellten Verfahren hergestellten Liposomen von ihrem wäßrigen Dispersionsmedium zu trennen, wenn es beispielsweise gewünscht ist, alle Spuren von nicht eingekapselten aktiven Verbindungen bei der endgültigen Anwendung zu vermeiden. Diese Trennung kann in einfacher Weise durch die geeigneten bekannten Methoden, wie beispielsweise Gelchromatographie, erreicht werden.

In dem nachfolgenden Beispielen soll die Erfindung in detaillierter Weise beschrieben werden.

Beispiel 1

In einen 10 ml-Pyrex-Kolben wurden 2 ml Dibutyläther und 1 ml Cyclohexan eingegeben. Anschließend wurden 0,2 ml einer 10 mg/1 enthaltenden Insulinlösung in wäßriger 9/oo NaCl-Lösung zugefügt und auf pH 3 eingestellt (HCl N/10). Weiterhin wurden 150 mg Dipalmitinoyl-phosphatidyl-cholin (hydrophile-lipophile Verbindung) zugefügt und die hetero gene Mischung bei Raumtemperatur für eine Minute mittels eines Generators vom Typ "BRANSON"-Mode11 B-I2 (2o KHz, 150 W) Ultraschall ausgesetzt. Es wurde eine klare Lösung mit "Precursor von Liposomen" in Form von Mikrobläschen der Insulinlösung erhalten, bei der die Wände aus einer Surfaktansschicht bestanden und die Moleküle derart gerichtet waren, daß ihre hydrophile Funktion (phosphatidyl-cholin) nach innen und die hydrophoben Gruppen

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(Kohlenwasserstoff-Kette) nach außen wiesen. Diese Mikrokügelchen befanden sich in kolloidaler Suspension in der organischen Lösung und enthielten gelöst den Überschuß an Surfaktans, der beim Umhüllen der Mikrokugeln nicht verbraucht worden war.

Anschließend wurde eine organische Lösung in den Behälter gegeben, die 30 ml eine 0,9%igen wäßrigen NaCl-Lösung enthielt und die organische Suspension wurde bei 30⁰C mit einem Rühr-Emalgator in die wäßrige Lösung emulgiert.

Nach dieser Behandlung bestand die Mischung aus einer Dispersion von feinen Tropfen des organischen Lösungsmittels in der wäßrigen Phase. Jeder Tropfen enthielt in Suspension die beschriebenen "Precursor von Liposomen" und einen Überschuß von gelöstem Surfaktans.

Mittels einer geeigneten Röhre wurde ein Luftstrom in das Gefäß eingeblasen und in der Nähe der Luft-Flüssigkeit-Grenzschicht entlanggeführt, während bei 30⁰C gerührt wurde. Der Luftstrom kontaktierte die Teilchen der Emulsion und belud sich mit dem organischen Lösungsmittel. Die Mischung von Luft und Dampf wurde in einen Kondensator geleitet (abgekühlt auf 10⁰C, wo der mitgeführte Dampf zu Flüssigkeit kondensierte. Dieser Vorgang wurde solange fortgeführt, bis die Kondensation aufhörte (nach ungefähr 20 bis 30 Minuten). Nach dieser Behandlung verblieben in dem Gefäß ungefär 20 ml einer klaren Lösung (9°/oo NaCl), in der die eingekapselten Liposome in Form von Bläschen verteilt waren, deren Hülle aus einer doppeltmolekularen Schicht des Surfaktans bestand, wobei die hydrophilen Funktionen (Kopf an Kopf) sowohl nach innen als nach außen gerichtet waren, während die äußere Schicht der Hülle von

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dem überschüssigen, in dem organischen Lösungsmittel gelösten organischen Lösungsmittel eingenommen war, das beim Evaporieren freigesetzt wurde. 2 ml der Liposomenlösung wurden chromatographiert in einer Säule mit 2,5 g Sephadex G-5"Q (Eluens: 0,5 molare wäßrige NaCl-Lösung + 0,05 molarer Phosphatpuffer, pH 7,5). Durch spektroskopische Analyse des Eluats wurde festgestellt, daß nur 20 bis 25% der ursprünglichen Insulinlösung der Einkapselung entging. Die so erhaltene Liposomlösung kann therapeutisch gebraucht werden und ohne weitere Reinigung weiterverarbeitet werden.

Beispiel 2

Eine wäßrige lOg/1 enthaltene Aminoglucosidase-Lösung wurde in einer wäßrigen Lösung von NaCl mit 0,15 Mol/l auf die folgende Art und Weise eingekapselt: eine Mischung von Lecithin (74 mg), 0,1 ml der Aminoglucosidase-Lösung und Diisopropyläther (3 ml) wurden 2 min lang beschallt (20 kHz, 150 W), während eine Abkühlung unter 30⁰C mit einem Kühlbad erfolgte. Es wurde eine transparente Flüssigkeit homogener Erscheinung erhalten, die bläulich reflektierte. Zu dieser Flüssigkeit wurden 15 ml der wäßrigen 0,15 molaren Kochsalzlösung hinzugefügt und - wie bei Beispiel 1 beschrieben - die organische Lösung in eine wäßrige Phase emulgiert. Anschließend wurde die feine Emulsion unter Rühren mit einem Strom von Stickstoff beaufschlagt, der sich mit dem Diisopropyläther in Dampfform belud. Dieses Verdampfen wurde solange fortgesetzt, bis das organische Lösungsmittel vollständig beseitigt war und eine klare Lösung vorlag.

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Diese klare Flüssigkeit besteht aus einer Suspension von Liposomen von kolloidalen Dimensionen, in dem die Aminoglucosidase-Lösung eingeschlossen ist in einer wäßrigen 0,15 molaren NaCl-Lösung, die eine geringe Menge (in der Größenordnung von 5%) von Aminoglucosidase in nicht eingekapselter Form enthält. Je nach der beabsichtigten Benutzung kann die Lösung direkt benutzt werden, oder aber nach dem die nicht eingekapselte Aminoglucosidase beseitigt wurde (beispielsweise durch Gelchromatographie auf "Sepharose").

Beispiel 3

Bei einem Verfahren entsprechend dem in Beipiel 1 wurde als einzukapselnde Lösung eine 0,05 molare wäßrige gepufferte Lösung (Phosphatpuffer 10 mmol, pH 7,2) verwendet, enthaltend 0,5 mg/ml Arabinosecytosin, gelöst in einer 0,15 molaren wäßrigen NaCl-Lösung. Um die organische Phase unter Ultraschallbehandlung zu erzeugen, werden 47,7 mg Cardio-lipin und eine Mischung aus 2,4 ml Dibutyläther und 0,6 ml Chloroform benutzt.

Beispiel 4

Bei einem Verfahren entsprechend demjenigen in Beispiel 1 wurde als einzukapselnde Lösung 0,1 ml einer Penicillamin-Lösung von 100 mg/ml in einer wäßrigen 0,15 molaren NaCl-Lösung benutzt, wobei zum bilden der organischen Phase unter Ultraschallbehandlung eine Mischung von 105 mg Lecithin und 35 mg Cholesterin sowie 3 ml Butylacetat verwendet wird.

Beispiel 5

Bei einem Verfahren nach Beispiel 1 wurden als einzukapselnde Lösung 0,05 ml einer Lösung von Dinatriumphosphat

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von Betamethason mit 150 mg/1 in einer 0,15 molaren NaCl-Lösung verwendet unter Benutzung zur Bildung der organischen Phase bei ultraschallbehandlung einer Mischung von 85 mg Lecithin und 45 mg von Phosphatidyl-äthanolamin und 3 ml 3-Heptanon.

Beispiel 6

Ein Verfahren wie in Beispiel 1 unter Benutzung einer einzukapselnden Lösung von 0,1 ml einer Lösung eines Komplexes Polyinosinsäure - Polycytidilinsäure (Poly (I) · Poly (C) bei 1 mg/ml, in einer 0,15 molaren NaCl-Lösung, wobei unter Ultraschallbehandlung zur Herstellung der organischen Phase eine Mischung von 60 mg Lecithin, 20 mg Stearylamin und 15 mg Cholesterin/ sowie 3 mg einer Diisopropyläther-Butylacetat im Verhältnis 1:1 diente.

Beispiel 7

Zu 20 ml Diisopropyläther wurden 1,5 g Lecithin zugefügt, 0,4 g Phosphatidyl-serin und 0,5 g Cholesterin, sowie eine Lösung von 1,8 Actinomycin D in 3 ml eines Phosphatpuffers (0,1 M, pH 7). Die Lösung wurde 5 min einer Schallbehandlung unterzogen, wie in Beispiel 1 beschrieben. Anschließend wurden 100 ml eines wäßrigen Phosphatpuffers 0,1 M, pH 7, hinzugefügt und die Emulgierung wie in Beispiel 1 ausgeführt. Ohne Unterbrechung des Rührens beim Emulgieren wurde das Gefäß mit einem Vakuumanschluß verbunden und der Druck kontinuierlich auf 10 Torr reduziert, wobei eine Temperatur von 20 bis 22°C eingehalten wurde. Nach ungefähr 45 min war der Diisopropyläther vollständig entfernt, und die restliche Mischung lag in der Form einer klaren Liposomenlösung vor. Durch Analyse einer Probe (Chromatographie auf Sephadex G-50) wurde eine Ausbeute von 85% bei der Verkapselung ermittelt.

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Beispiel 9

Bei diesem Beispiel wird die Bildung von Liposomen mit einer asymmetrischen Umhüllung beschrieben. Diese Umhüllung weist auf ihrer Innenseite eine phospholipide Schicht auf, bestehend aus Dipalmitinoyl-phosphatidylcholin und an der Außenseite aus einer Mischung von Ei-Lecithin und Phosphatidyl-serin. Es wurde das folgende Verfahren angewandt: zu 3 ml Dibutyläther wurden hinzugefügt: 0,1 mi einer wäßrigen 0,01 molaren Lösung von 3,Q-Bisdimethylaminophenazothioniumchlorid und 0,015 Mol NaCl sowie 55 mg Dipalmitinoyl-phosphatidyl-cholin. Diese Mischung wurde beschallt, wie in Beispiel 1 beschrieben, und es entstand eine durchsichtige organische Lösung, enthaltend Mikrobläschen ("Precursor von Liposomen") der obengenannten wäßrigen Lösung, die von einer Dipalmitinoyl-phosphatidyl-cholin-Lösung umgeben war. Diese organische Lösung wurde anschließend 20 min lang mit 8000 g zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren lag eine klare überlagerte Phase und eine durchsichtige blaue Phase am Boden vor, welche die Mikrobläschen in durch die Zentrifugalkraft agglomerierter Form enthielt. Diese Phase bildete ein ziemlich festes Gel und wurde in einen 10 ml-Behälter umgefüllt. Darin wurde es mittels eines Spatels mit 0,3 ml einer 200 mg/ml Lösung einer 20:1 (Molverhältnis) Mischung von Ei-Lecithin und Phosphatidyl-serin in Dibutyläther vermengt. Schließlich wurden zu dieser gummiartigen Masse 5 ml einer 0,15-molaren wäßrigen NaCl-Lösung hinzugefügt, und die Mischung mit einem magnetischen Rührer heftig gerührt. Die Masse dispergierte zunehmend und nach 10 bis 15 Minuten lag eine homogene transparente Lösung vor, welche in Lösung die Liposomen mit einem gemischten überzug enthielt. Die Außenseite der Umhüllung bestand aus einer Mischung von Ei-Lecithin und Phosphatidyl-serin und

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die Innenschicht bestand aus Dipalmitinoyl-phosphatidylcholin.

Beispiel 10

Insulin enthaltende "Precursor von Liposomen" wurden wie in Beispiel 1 hergestellt. Anschließend wurde anstatt wie in Beispiel 1 die organische, die Mikrobläschen enthaltene Lösung direkt in einer wäßrigen 0,9%igen NaCl-Lösung zu emulgieren,- die organische Lösung durch Aussetzen einem verminderten Druck (20 Torr) bei Raumtemperatur zunächst konzentriert. Nach Verdampfen der organischen Lösungsmittel entstand auf dem Boden des Behälters eine ölige, durchsichtige Schicht, die ein Agglomerat von Mikrobläschen enthielt. In den Kolben wurden 7 ml einer wäßrigen 0,9%igen NaCl-Lösung hinzugefügt und mittels eines magnetischen Rührers die ölige Phase in ein wäßriges Medium dispergiert. Die ölige Phase verschwand allmählich und nach 10 bis 15 min entstand eine transparente homogene Lösung, welche in Suspension die gewünschten Liposome enthielt. Nach Chromatographie dieser Lösung auf "Sephadex 4B" (Pharmacia, Schweden) zeigte eine Analyse der nicht eingekapselten Phasen, daß effektiv 52% des anfänglich vorhandenen Insulins als Liposome verkapselt wurde.

Beispiel 11

Mit Hilfe eines Homogenisators vom Typ MINISONIC (Ultrasonics Ltd., Großbritannien) wurde in 20 min eine Mischung, bestehend aus 40 g Lecithin, 600 ml Dibutyläther und 400 ml einer wäßrigen Insulinlösung von 10 mg/ml in einer 9 °/oo NaCl-Lösung homogenisiert. Es wurde eine stabile milchige Emulsion erhalten, die in einen 4 1-Kolben eingegeben wurde, der 2 1 einer wäßrigen 0,9%igen NaCl-Lösung enthielt. Die organische Suspension und das wäßri-

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ge Medium wurden anschließend mittels eines Emulgierrührers bei Raumtemperatur emulgiert. Anschließend wurde das organische Lösungsmittel durch einen Gegenstrom von Luft (air stripping) beseitigt, d.h. die Mischung zirkulierte abwärts in einer Säule, welche von aufsteigender Luft passiert wurde. Die mit dem Dampf beladene Luft wurde oben an der Säule aufgefangen. Es entstand eine homogene durchsichtige Lösung von Insulin enthaltenden Liposomen.

Beispiel 12

In einem Pyrex-Kolben von 10 ml Inhalt wurden 3 ml Dibutyläther, eine wäßrige 9 °/oo NaCl-Lösung, enthaltend 10 mg/ml Insulin (1 ml) und Lecithin (125 mg) zusammen mit g Glaskugeln von 1 mm Durchmesser. Der Kolben wurde verschlossen und auf einem Schüttler 30 min lang mit 100 Schwingungen pro Minute geschüttelt. Es entstand eine relativ homogene milchig aussehende Lösung, welche in einen 100 ml Behälter umgefüllt wurde, der eine wäßrige 9 °/oo NaCl-Lösung (30 ml) enthielt. Anschließend wurde das organische Lösungsmittel unter Benutzung von Stickstoff, wie in Beispiel 2 beschrieben, evaporiert. Nach einem 20 bis 30 minütigen Schwenken entstand eine klare Lösung von Liposomen, welche Insulin in gekapselter Form enthielt.

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Claims

Patentansp r ü c h e

1. Verfahren zur Herstellung von Liposomen in wäßriger

Lösung oder Suspension, bei dem "Precursor von Liposomen" mit einem wäßrigen Medium in der Weise in Kontakt gebracht werden, daß die wäßrige Lösung oder Suspension von Liposomen entsteht, wobei die "Precursor von Liposomen" aus mikroskopischen Bläschen einer ersten wäßrigen Lösung bestehen, die von einer Umhüllung eines Lipids oder Surfakt ans der Formel XY umgeben sind, wobei X eine hydrophile lipophobe Gruppe darstellt und Y eine lipophile hydrophobe Gruppe und die "Precursor von Liposomen" durch Dispergieren der ersten wäßrigen Phase in einem in Wasser unlöslichen oder kaum löslichen Lösungsmittel in Gegenwart einer Menge einer Verbindung XY dispergiert werden, da durch gekennzeichnet, daß die "Precursor von Liposomen" in dem wäßrigen Medium unter Anwesenheit der Verbindung XY im Oberschuß oder eines anderen Lipids oder Surfaktans ZW, wobei Z eine hydrophile Gruppe und W eine hydrophobe Gruppe darstellt, emulgiert werden, wobei das unlösliche oder kaum lösliche Lösungsmittel vor oder nach dem Emulgieren beseitigt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet, daß das Beseitigen des unlös-

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lichen Lösungsmittels vor dem Emulgieren der "Precursor von Liposomen" in dem wäßrigen Medium bewirkt wird, wobei die Beseitigung dadurch erfolgt, daß die resultierende Emulsion Bedingungen ausgesetzt wird, die ein Verdampfen des Lösungsmittels bewirken.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die erste wäßrige Phase in dem in Wasser nicht oder kaum löslichen Lösungsmittel durch Anwendung von Schall- oder Ultraschallwellen dispergiert wird.

4. Verfahren zur Herstellung einer wäßrigen Lösung von

Liposomen, bei dem eine wäßrige Lösung eines einzukapselnden Produkts in einem in Wasser nicht oder kaum löslichen Lösungsmittel unter Anwendung von Schall- oder Ultraschallwellen dispergiert wird, das in Lösung einen Überschuß eines Lipids oder Surfaktans der Formel XY enthält, wobei X eine hydrophile lipophobe Funktion darstellt und Y eine lipophile hydrophobe Funktion zum Bilden einer Lösung oder Suspension in dem Lösungsmittel von Bläschen oder Perlen der zu umkapselnden Flüssigkeit, die "Precursor von Liposomen" genannt werden, und deren Wände aus einem Film von Lipid oder Surfaktans bestehen, deren X- und Y-Funktionen nach außen bzw. nach innen gerichtet sind, woraufhin diese Lösung von "Precursor von Liposomen" mit einem Überschuß von Lipid mit einem wäßrigen Medium derart kontaktiert wird, daß die liposome Lösung oder Suspension in dem wäßrigen Medium gebildet wird, dadurch gekennzeichnet, daß sowohl die Lösung und das wäßrige Medium miteinander emulgiert wer-

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den, und daß die resultierende Emulsion Verdampfungsbedingungen ausgesetzt wird, bis alle flüchtigen Lösungsmittel verdampft sind, so daß eine lösungsmittelfreie Lösung oder Suspension von Liposomen in dem wäßrigen Medium vorliegt.

5. Verfahren nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet, daß das Lipid eines der folgenden Verbindungen darstellt: Lecithin, Phosphatidyl-äthanolamin, Lysolecithin, Lysophosphatidyl-äthanolamin, Phosphatidyl-serin, Phosphatidyl-inosit, Sphingomyelin, Cardiolipin, Phosphatidsäure, Cerebroside, Stearylamine, Dipalmitinylphosphatidyl-cholin.

6. Verfahren nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet, daß als Verbindungen der Formel XY und/oder ZW eine Mischung von mindestens einem Phospholipid und mindestens einer anderen lipoiden Verbindung verwendet wird, die zu einer anderen Kategorie als das Phospholipid gehört und vorzugsweise Cholesterin oder Tocopherol ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet, daß das wasserunlösliche Solvens aus Benzol, alkyliertem oder halogenalkyliertem Benzol, aliphatischen Äthern, Aldehyden, Estern und Ketonen und frei und halogenierten aliphatischen und cycloaliphatischen Kohlenwasserstoffen besteht.

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8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das zu umkapselnde Produkt ausgewählt ist aus Farbstoffen, Geschmacksstoffen, Geruchsstoffen, Enzymen, Polypeptiden, Chelatbildnern oder anderen industriellen Produkten, deren Wirksamwerden nach dem Zufügen mit Verzögerung eintreten soll, bzw. die im Zeitverlauf nacheinander freigegeben werden sollen.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite wäßrige Phase aus reinem Wasser oder einer wäßrigen Lösung von löslichen Salzen, vorzugsweise einer 0,15 molaren NaCl-Lösung besteht.

10. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Verdampfen durch einen über die Flüssigkeit geleiteten Gasstrom oder durch die Anwendung von Unterdruck erfolgt.

11. Lösung von Liposomen, die durch eines der vorgenannten Verfahren hergestellt wird. 25

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