KR101465365B1

KR101465365B1 - 리포좀 내 고분자 충진된 다중 기능 복합 입자체 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101465365B1
Application number: KR1020130122934A
Authority: KR
Inventors: 엄숭호; 신승원
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2013-10-15
Filing date: 2013-10-15
Publication date: 2014-11-25
Also published as: US20150104501A1

Abstract

본 발명은 변용이 가능한 리포좀 내부에 수용성 또는 지용성 고분자를 충진시켜 제조되는 기능성 복합 입자체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 상기 수용성 또는 지용성 고분자로, 지질막과 융화시킬 수 있는 그룹들을 선별하여 복합체를 제작하여, 생물리화학적 전문 특성을 평가하는 것에 관한 것이다. 본 발명에서 제시되는 프로토콜을 사용하면 고분자 혹은 지질막 만의 입자체를 제작하기 위한 기존 물/기름 기반 단일 에멀젼(emulsion) 프로토콜의 문제점을 극복하고 다양한 고분자군들과 리보좀 융합이 가능하다.

Description

리포좀 내 고분자 충진된 다중 기능 복합 입자체 및 이의 제조방법 {Lipid-supported polymeric functional particles and method thereof}

본 발명은 리포좀 내부에 수용성 고분자 또는 지용성 고분자가 융합된 기능성 입자체와 상기 입자체의 제조방법에 관한 것이다.

리포좀은 인지질 이중막이 수상을 둘러싸고 있는 구형의 소포(vesicle)이다. 지질막의 구성 성분은 두개의 소수성 지방산 그룹과 친수성의 인산기 그룹으로 이루어진 양친매성 인지질이며, 수용액에서 이중막을 형성하고 이것은 인공적인 세포처럼 닫힌 구조의 소포를 형성하기도 한다. 이중막 구조에서 비극성인 지방산 꼬리부분은 막의 안쪽을 향하고 극성인 머리부분은 바깥쪽을 향하게 된다. 이러한 리포좀에 약물을 넣는 것은 약물의 독성을 감소시키고 이의 효과를 증가시킴으로써 치료요법을 강화시킬 수 있으므로, 고분자, 약물, 항원과 조립되어 제조되는 입자체의 구조로서 주목받고 있다.

그러나, 종래 기술에서 전달체로 이용하기 위한 기존의 단일 고분자 혹은 단일 지질 입자체 제작에서, 가장 많이 사용되는 물/기름 이중막을 사용하는 단일 에멀젼 프로토콜은 많은 문제점을 드러냈다. 특히 이 방법을 사용하면 오로지 지용성 고분자의 사용만이 가능한데, 지용성 고분자의 경우 실질적인 치료 목적에서 사용시 가용 고분자의 범위가 매우 좁다는 문제점이 있다. 또한, 단일 지질막 입자체의 빠른 분해결과등의 제약은 임상적용에서 한계를 드러냈다.

특히, 세포 및 조직에서 고분자가 노출되거나 분해될 때 생성되는 물질들은 주변 정상 세포들에게 손상을 입히거나 염증 반응과 같은 부작용을 불러오는 경우가 흔하게 일어난다. 이와 비교하여, 수용성 고분자의 경우 자연적으로 존재하는 경우가 많아 역효과를 최소화 할 수 있다는 것이 장점 중 하나이다. Polysaccharide, Polydeoxyribonucleic acid, Collagen, Cellulose와 같은 수용성 고분자는 모두 자연적으로 존재하는 것이며, 분해 시 세포 대사의 물질들로 편입될 수 있기에 부작용을 최소화 할 수 있다.

그러나, 수용성 단백질을 입자체에 포획시키려고 할 때 기름 상에서 대부분의 단백질들이 뭉치는 등 제작 및 응용에서 심각한 부작용이 발생한다. 따라서 일정 양의 포획 단백질 농도에서만의 입자체 제작이 가능하다. 사용 가능한 고분자 군의 제약과 단백질을 다루는데 있어서 어려움으로 단백질 항원 혹은 항체 기반의 면역 백신 제작 등 생체 내 응용 면에서 상당한 어려움이 지적되고 있는 실정이다.

따라서 목표로 하는 질병의 종류와 특성에 따라 이러한 지용성 및 수용성 고분자를 자유자재로 사용할 수 있도록 하는 것과 내부에 원하는 약물을 쉽게 이입하는 것이 중요하다. 이를 모두 만족시키기 위한 노력으로 이번 발명에서는 고분자 충진물을 포획한 지질막 복합체를 제작하고 기능성 약물 전달체로 활용하는 획기적인 방법을 제안한다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 수용성 및 지용성 고분자를 리포좀 내로 충진하여 입자체를 제조하고, 상기 입자체 내의 비제한적인 약물의 충진을 가능하게 하는 것을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고하 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 지질로 형성되는 리포좀 내부에, 고분자(polymer) 및 약물이 융합된 입자체를 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 고분자는 수용성 고분자 또는 지용성 고분자인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 고분자가 수용성 고분자일 경우, 지질의 농도는 1mM 내지 10mM인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 구현예로, 상기 고분자가 지용성 고분자일 경우, 지질의 농도는 3M 내지 5M인 것을 특징으로 한다,

본 발명의 또다른 구현예로, 상기 수용성 고분자는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드산(polydeoxyribonucleic acid), 아가로스(agarose), 알지네이트(alginate), 카라기닌(carrageenan), 히알루론산(hyaluronic acid), 덱스트란(dextran), 키토산(chitosan), 및 사이클로덱스트린(cyclodextrin)으로 이루어지는 군으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 구현예로, 상기 지용성 고분자는 폴리락타이드(Poly lactide), 폴리글라이콜라이드(poly glycolide), 폴리감마글루탄산(BLS-PGA), 폴리카프로락톤(Polycaprolactone), 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol), 폴리하이드록시부틸산(poly(hydroxy butyrate)), 폴리입실론카프로락톤(poly(ε-caprolactone)), 폴리베타말릭산(poly(β-malic acid)), 폴리락트산-글라이콜산(poly(lactic acid-co-glycolic acid)) 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 구현예로, 상기 지용성 고분자는 폴리락타이드(Poly lactide), 폴리글라이콜라이드(poly glycolide) 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 구현예로, 상기 혼합물에서 폴리락타드와 폴리글라이콜라이드의 몰비가 25~75:75~25인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 구현예로, 상기 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC) , 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) 소듐 염(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) sodium salt, DOPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[4-(p-말레이미도페닐)부틸아민] (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide], MPB-PE), 1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 트리에틸암모늄 염 (1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt, Texas Red DHPE), 콜레스테롤(Cholesterol), 레시틴(lecithin), 및 이들의 혼합물으로 이루어지는 군으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 구현예로, 상기 약물은 오발부민 또는 CpG 올리고디옥시뉴클레오티드인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 구현예로, 상기 입자체의 지름은 200nm 내지 1500nm인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 상기 수용성 고분자가 융합된 입자체의 제조방법을 제공한다:

a) 수용성 고분자 및 지질을 혼합하는 단계;

b) 상기 혼합된 용액에 교반 또는 초음파처리하여 에멀젼을 제조하는 단계;

c) 상기 에멀젼을 원심분리하여 상층의 유기용매를 제거하는 단계.

본 발명의 일실시예로, 상기 수용성 고분자는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드산(polydeoxyribonucleic acid), 아가로스(agarose), 알지네이트(alginate), 카라기닌(carrageenan), 히알루론산(hyaluronic acid), 덱스트란(dextran), 키토산(chitosan), 및 사이클로덱스트린(cyclodextrin)으로 이루어지는 군으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 실시예로, 상기 a) 단계에서 약물이 추가로 혼합되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 상기 지용성 고분자가 융합된 입자체의 제조방법을 제공할 수 있다:

a) 지용성 고분자 및 지질을 혼합하는 단계;

b) 상기 혼합된 용액에 초음파처리하여 단일 에멀젼을 제조하는 단계;

c) 상기 단일 에멀젼에 약물을 포함한 수용액을 첨가하여 초음파처리하여 다중 에멀젼을 제조하는 단계;

d) 상기 다중 에멀젼을 교반하여 유기용매를 제거하는 단계; 및

e) 상기 d) 단계에서 유기용매가 제거된 에멀젼을 원심분리하는 단계.

본 발명의 또다른 구현예로, 상기 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) 소듐 염(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) sodium salt, DOPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[4-(p-말레이미도페닐)부틸아민] (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide], MPB-PE), 1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 트리에틸암모늄 염 (1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt, Texas Red DHPE), 콜레스테롤(Cholesterol), 레시틴(lecithin), 및 이들의 혼합물으로 이루어지는 군으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 입자체의 제조방법을 통해, 단일 에멀젼 방법을 개선한 새로운 이중 에멀젼 방법과 고분자 충진 지질 단일막 형성법을 통한 지질막 표면의 고분자-항원 융합 충진의 기능성 복합 구조체를 디자인하고 제작할 수 있다. 단일 에멀젼 방법에서 지용성 고분자만 가능했던 제한에서 과감히 탈피하여 수용성 고분자도 쉽게 제작 가능하다. 따라서 사용가능한 고분자 군의 종류도 지용성 고분자 (예, PLGA)부터 수용성 고분자(예, 핵산)로 다양해질 수 있다. 아울러, 포획가능한 항원의 종류 및 내부 함유량도 다양해질 수 있다. 또한 리피드 조성에 대한 무제한적인 변용이 가능함으로써 입자체 표면 성질에 대한 수정이 가능하다. 이를 통하여 다기능성 입자의 표면 도포 및 이미징에 응용이 가능하다.

도 1은 본 발명에서 제조한 지용성 고분자 충진 융합 입자체의 구조를 나타낸 도면이다.
도 2는 입자체의 형성을 확인할 수 있는 투과전자현미경과 공초점현미경을 사용해 얻은 이미지이다.
도 3은 형성된 입자체의 크기 및 표면 전하를 확인할 수 있는 도표이다. (a)의 경우 지용성 고분자군이 이입된 입자체의 물리적 성질에 대한 것이고, (b)의 경우 다양한 농도의 수용성 고분자(핵산)이 이입된 입자체의 물리적 성질을 보여준다.
도 4는 입자체 내부에 포획된 약물의 양을 나타내는 도표이다. (a)는 지용성 고분자군에 대한 핵산과 오발부민의 이입 정도를 나타내고, (b)의 경우 수용성 고분자의 이입 정도를 나타내는 도표이다.
도 5는 기존 방식으로 제작된 입자체와 본 발명에서 제시되는 방식으로 제작된 입자체를 다양한 오발부민 농도를 적용하여 고른 크기의 입자체가 형성되는지 비교한 도표이다. (a)는 기존 방식으로 제작된 입자체의 크기를 나타내며, (b)는 본 발명에서 제시된 방식으로 제작된 입자체의 크기를 보여준다.
도 6은 지용성 고분자의 대표군으로써 사용된 PLGA 50:50(lactide:glycolide)과 PLGA 75:25(lactide:glycolide), PLA(lactide only)로 충진된 입자체의 분해속도 차이를 확인한 도표이다.
도 7은 수용성 고분자의 대표군으로 사용된 핵산이 입자체 내에서 리가아제에 의해 하나의 구조체를 이루는 것을 확인한 전기영동 이미지이다.
도 8은 수용성 고분자인 핵산젤이 입자체 내부에 위치한 것을 보여주는 공초점 현미경 이미지이다.

본 발명자들은 변용이 가능한 리포좀 내부에 다양한 성질을 가지는 고분자들이 융합되어 만들어지는 다기능성 입자체에 대하여 연구한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 리포좀 내부에 고분자(polymer)가 융합된 입자체로서, 상기 리포좀은 약물을 포함하는 것을 특징으로 하는 입자체를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

즉, 본 발명은 변용이 가능한 리포좀 내부에 수용성 고분자 또는 지용성 고분자를 충진시키고, 내부에 원하는 약물을 이입함으로써 다기능성 입자체를 제공할 수 있다.

본 발명의 다른 일시예에서, 상기 본 발명의 입자체의 리포좀 내부에 융합되는 고분자는 수용성 고분자 또는 지용성 고분자일 수 있다.

본 발명자들은 리포좀의 형성이 가능하게 하기 위하여, 다양한 조성과 양의 지질이 사용된 리포좀을 제조하여 실험한 결과, 지용성 고분자의 경우 총 3M 내지 5M의 지질, 수용성 고분자의 경우 총 1 mM 내지 10 mM의 지질을 이용하는 것이 바람직하다는 것을 발견하였다. 더욱 바람직하게는, 지용성 고분자의 경우 총 4.2 M의 지질, 수용성 고분자의 경우 총 5.54 mM의 지질이 입자체 형성에 필요한 것을 확인하였다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 지질(lipid)은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) 소듐 염(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) sodium salt, DOPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[4-(p-말레이미도페닐)부틸아민] (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide], MPB-PE), 1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 트리에틸암모늄 염 (1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt, Texas Red DHPE), 콜레스테롤(Cholesterol), 레시틴(lecithin), 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니며, 그 조성과 양이 필요에 따라 세분화될 수 있다.

상기 지질 중 형광물질을 포함하는 Texas Red DHPE나 사이올기(-SH)와 특이적으로 결합하는 MPB-PE의 경우 입자체의 다기능성 부여에 매우 바람직하다. Texas red DHPE는 상업적으로 제작되어 판매되는 리피드로써 595 nm의 빛에 반응하여, 615 nm의 빛을 방출하는 것으로 알려져 있다. 기존 리피드 조성에 0.02~0.03 mg의 Texas Red DHPE를 첨가함으로써 입자체의 형광이미지를 얻을 수 있는 것을 확인하였다.

지질의 조성은 입자체의 형성에는 크게 관여하지 않으며, 단순 표면 성질의 변화를 일으키는 것으로 확인되었다. 입자체의 다기능성에 기여하기 위해 표면 지질 조성을 다변화하여 실험한 결과, 상기 지질 중 DOPG의 경우 각 분자마다 -1로 총 전하가 형성이 되어있기 때문에, DOPG의 분율을 크게 함으로써 표면 전하가 점차 음전하로 더욱 바뀌어 가는 것을 확인하였다. 세포 표면의 전하가 음전하이기 때문에 입자체의 표면 전하가 음전하로 대전되는 것은 실제적인 세포 및 조직에서의 실험에서 매우 중요한 요소이다. 따라서, 본 발명의 입자체의 형성에 있어, 지질의 조성 변화에 의해 다양한 표면 성질의 조절이 가능하다는 것을 알 수 있다.

본 발명의 또다른 실시예에서, 상기 수용성 고분자는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드산(polydeoxyribonucleic acid), 아가로스(agarose), 알지네이트(alginate), 카라기닌(carrageenan), 히알루론산(hyaluronic acid), 덱스트란(dextran), 키토산(chitosan), 및 사이클로덱스트린(cyclodextrin)일 수 있고, 가장 바람직하게는 Polydeoxyribonucleic acid가 이용될 수 있다.

상기 Polydeoxyribonucleic acid은 세포 내 유전자를 이루는 핵산과 기본적으로 동일하고, 본 발명에서 사용된 Polydeoxyribonucleic acid의 경우 하나의 구성 단위가 4개의 말단을 가지는 X 형태로 제작되었으며, 각 Polydeoxyribonucleic acid의 결합은 상보적인 4개의 말단기(overhang)의 일시적 상호결합과 이 결합을 공유결합으로 대체하는 리가아제에 의해 형성된다. 이를 통하여 리포좀이 분해된 이후에도 구조물의 형태를 유지할 수 있는 수용성 고분자 입자체의 형성이 가능하다.

상기 지용성 고분자는 폴리락타이드(Poly lactide), 폴리글라이콜라이드(poly glycolide), 폴리감마글루탄산(BLS-PGA), 폴리카프로락톤(Polycaprolactone), 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol), 폴리하이드록시부틸산(poly(hydroxy butyrate)), 폴리입실론카프로락톤(poly(ε-caprolactone)), 폴리베타말릭산(poly(β-malic acid)), 및 폴리락트산-글라이콜산(poly(lactic acid-co-glycolic acid)) 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 실시예와 같이 락타이드와 글라이콜라이드를 혼합한 d,l-lactide/glycolide를 이용하는데, 상기 lactide과 glycolide의 조성 비율에 따라, 입자체의 체내 분해 속도를 다변화시킬 수 있다.

본 발명에서는 lactide와 glycolide의 조성이 각각 50 : 50, 75 : 25, 100 : 0에 해당하는 PLGA 50:50, PLGA 75:25, PLA가 사용되었다. 이 고분자들은 모두 동일한 제조 방식을 따라서 입자체에 이입되었으며, 실험 결과 분해 속도에 따른 내부 약물의 방출 시점이 달라지는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명의 리포좀 내부에 지용성 고분자가 융합된 입자체의 이러한 성질은 현재 백신 접종시 확고한 면역체계의 정립을 위해 사용되는 다중 접종의 대체 방식으로 한번의 접종으로도 다중 접종과 동일한 효과를 내는 것에 응용될 수 있다는 것을 확인하였다.

본 발명의 또다른 실시예에서, 입자체에는 다양한 약물이 포함될 수 있다. 상기 약물은 지용성 약물, 수용성 약물이 모두 포함될 수 있으며, 본 발명의 실시예에서는 입자체의 다기능성 백신 플랫폼으로써 응용을 위해 면역원성의 유도 모델에 사용되는 항원이나 핵산을 상기 약물로써 사용하였다. 상기 항원으로는 달걀에서 얻어지는 오발부민이 사용되었고, 상기 핵산으로는 TLR 9을 자극시키는 것으로 알려진 CpG 올리고디옥시뉴클레오티드(CpG ODN)이 사용되었다. 지용성 고분자 충진 입자체의 경우 다양한 농도의 오발부민 이입 실험에서 정상적인 입자체의 제조가 가능한 것으로 확인하였다.

본 발명자들은 다양한 크기의 입자체를 형성하기 위해, 지질, 고분자 약물이 포함된 용액의 물/기름 에멀젼 형성 단계에서, 다양한 크기의 에너지를 초음파 혹은 교반으로 용액에 가함으로써, 약 200 nm 내지 1500 nm의 지름을 가지는 입자체를 제조하였다. 지름이 200 nm 내지 800 nm에 해당하는 입자체의 경우 세포내 이입이 용이하고, 지름이 1000 nm 내지 1500 nm 이상의 입자체의 경우 입자의 형태학적 혹은 그 이외의 이미징에 최적화된 특성을 지닌다는 것을 확인하였다.

본 발명의 리포좀 내부 충진 고분자의 경우, 일반적으로 사용되는 Chloroform이나 Dichloromethane에 녹는 지용성 고분자와 물층에 녹을 수 있는 수용성 고분자가 모두 사용 가능하다. 가용 고분자의 예로 Polysaccharides 에 해당하는 agarose, alginate, carrageenan, hyaluronic acid, dextran, chitosan, cyclodextins, 그리고 polyesters에 해당하는 poly(lactic acid), poly(glycolic acid), poly(hydroxy butyrate), poly(ε-caprolactone), poly(β-malic acid), poly(lactic acid-co-glycolic acid) 등이 있으며, 이에 한정되지는 않는다.

즉, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 리포좀 내부에 수용성 고분자가 융합된 입자체의 제조방법을 제공할 수 있다:

a) 수용성 고분자 및 지질을 혼합하는 단계;

b) 상기 혼합된 용액에 교반 또는 초음파처리하여 에멀젼을 제조하는 단계; 및

상기 a) 단계에서 약물이 추가로 혼합될 수 있다.

아울러, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 리포좀 내부에 지용성 고분자가 융합된 입자체의 제조방법을 제공할 수 있다:

a) 지용성 고분자 및 지질을 혼합하는 단계;

본 발명에서, 상기 지용성 고분자를 녹이기 위해 일반적으로 사용되는 Chloroform이나 Dichloromethane과 같은 유기용매를 사용할 수 있다. 상기 유기 용매를 사용하면, 대다수의 지용성 고분자를 녹일 수 있기 때문에, 상용되는 대다수의 지용성 고분자를 본 제조 방식에 적용할 수 있다. 따라서 본 발명에서 사용되는 지용성 고분자는 Poly(d,l-lactide/glycolide)가 대표적이나, Chloroform이나 Dichloromethane에 녹는 고분자라면 모두 적용이 가능하다.

상기 결과로부터, 본 발명의 지질막 내 고분자 융합 조립체 제조 방식은 다기능성 입자체를 제조 할 수 있으며, 뛰어난 응용 가능성을 가지고 있기 때문에 다양한 질병 치료 목적에 적용될 수 있을 것으로 기대된다.

이하 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 지질막 내 고분자 융합 조립체 제작을 위한 새로운 다중 에멀젼( emulsion ) 프로토콜 정립과 이의 생산방법

1.1 지용성 고분자 충진 융합 입자체의 제조

지질막내 고분자 융합 조립체를 제작하기 위하여, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)와 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (DOPG), cholesterol, 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt (Texas Red DHPE)가 사용되었다. DOPC, DOPG, Cholesterol의 경우 Avanti Polar Lipids, Inc.에서 구매하였고, Texas Red DHPE의 경우 life technologies에서 구매하였다.

지용성 고분자 충진 융합 입자체 제작(도 1 참조)을 위해서 다중 에멀젼 용매 증착방법을 사용한 것으로, 간략히 디클로로메탄(dichloromethane, DCM) 1 ml에 고분자 0.03 mg 및 지질 1.6 mg을 녹이고, 상기 수용액을 초음파 분산시켜 일차 단일 에멀젼을 형성시켰고, 이들 단일 에멀젼과 다양한 항원들을 포함한 과량의 수용액(6 ml)을 일정한 간격의 초음파 상에서 섞어 다중 에멀젼을 형성시켜 주었다. 상기 다중 에멀젼이 형성되면 준비된 에멀젼 용액은 상온에서 천천히 교반하며 DCM 용매를 증발시켜 모두 제거하였다. 그리고, 원심분리를 통해 용매가 증발되고 남은 용액으로부터 녹아있는 고분자 융합체를 분리하여 모아지고, 물상에서 씻어내어 지용성 고분자 융합 입자체를 제조하였다. 입자체의 크기 및 표면전하 등의 물리화학적 특성들은 다양한 장비들을 통해서 측정하였다.

1.2 수용성 고분자 충진 융합 입자체의 제조

수용성 고분자 (예, 핵산고분자) 충진 융합 입자체 제작을 위해서 거대 단일층 소포체 형성법을 기반으로 수정하여 사용되었다. 간략히 지질이 녹아있는 liquid paraffin 혹은 ethyl acetate 유기 상에 block unit으로 사용되는 수용성 고분자로 X-모양 DNA와 ligation component (T4 ligase 및 ligase buffer)를 포함하는 수용액 상을 교반시키거나 음파처리하여 에멀젼을 형성시켰고, 형성된 에멀젼 포함 유기용액을 수용액] 위에 적층시킨 뒤 원심분리하여 분리해주었다. 원심분리 처리 이전에, 삼투압을 최소화하기 위하여 지질막 내부 수용액에 자당과 포도당을 포함시켰다. 이와 함께 내부 수용액의 자당과 포도당으로 인한 삼투압을 최소화하기 위해, 외부 수용액에 포도당을 내부 수용액의 자당과 포도당의 몰농도와 동일한 양을 포함시킨 뒤, 상층의 유기용매를 제거하여 수용성 고분자 융합 입자체를 제조하였다. 상기 입자체의 크기 및 표면전하 등의 물리화학적 특성들은 다양한 장비들을 통해서 측정하였다.

1.3 입자체의 형성 확인

리포좀에 의한 에멀젼의 안정화와 입자체의 형성은 입자체 제조 후 투과전자현미경(LIBRA 120)과 공초점현미경 (LSM 510)을 이용한 형광이미징을 이용하여 확인되었다. 그 결과는 도 2에 나타내었다. 도 2에서 위쪽의 도면이 투과전자현미경을 이용하여 확인한 이미지이고, 아래쪽의 도면이 형광이미징을 통해 확인한 이미지이다.

도 2에 나타낸 것과 같이, 투과전자현미경 이미지의 경우 200 nm 정도의 입자체의 형성이 원활하게 이루어 졌다는 것을 보여주고 있고(도 2 위), 공초점현미경 이미지의 경우 분해능의 한계에 의해 그보다 큰 1000 nm 이상의 입자체가 표면 지질막에 의해 둘러싸여 있다는 것을 보여주고 있다(도 2 아래).

이 결과를 조합하면, 본 발명의 제조방법을 사용하여 지질막 내 고분자 융합 조립체가 효과적으로 잘 형성되었다는 것을 확인할 수 있다.

1.4 형성된 입자체의 크기 및 표면 전하 확인

형성된 입자체의 전체적인 크기 및 표면 전하를 확인하기 위해서 Dynamic light scattering (DLS)가 사용되었다. Otsuka Electronics사의 ELS-Z모델의 Dynamic light scattering (DLS) 장비를 사용하여 653 nm 파장의 레이져로 입자체 크기 분포 및 표면전하가 측정되었다. 입자체 크기는 DLS 장비 소프트웨어인 cumulant method로 정밀화되었다. 여기서, cumulate 횟수는 100이상으로 제한하여 사용하였다.

지용성 고분자 충진 입자체의 경우 모두 200 nm 이하의 평균 입자체 지름이 확인되었고, 그 결과는 도 3(a)에 나타낸 것과 같다.

또한 수용성 고분자 충진 입자체의 경우에도 DLS 측정을 하였으며, 내부에 충진하는 핵산의 양에 따라 300 nm에서 7800nm에 이르는 정도의 평균 입자체 지름이 확인되었다. 그 결과는 도 3(b)에 나타낸 것과 같다.

1.5 형성된 입자체의 약물 포획 능력 확인

본 발명자들은 입자체의 약물 포획능력을 실험을 통해 확인하였다. 입자체 형성 이후에 용액 내에 잔류하는 약물의 농도를 측정함으로써 이입된 약물의 양을 계산하였다. 이에 사용된 약물의 경우 크게 핵산(DNA)과 오발부민(OVA)으로 나누어진다.

잔여 핵산의 경우 Quant-iT™ PicoGreen ® dsDNA Reagent and Kits를 이용하여 그 농도가 측정되었고, 오발부민은 공유결합적으로 Alexa 594 형광물질이 부착된 것을 이용하여 형광을 측정, 농도가 정량화되었다. 도 4(a)에 나타낸 것과 같이, 지용성 고분자 충진 입자체의 경우 처리된 약 73%의 핵산과 약 22%의 오발부민이 이입되는 것을 확인할 수 있었다.

또한 수용성 고분자 충진 입자체의 경우에 처리된 X 형태의 핵산 중 약 68%가 이입되는 것을 확인하였다. 이 결과는 도 4(b)에 나타낸 것과 같다.

1.6 형성된 입자체의 크기 비교

즉, 본 상기 실시예들에서 확인한 것과 같이, 본 발명의 제조 방법은 기존의 단일 고분자 혹은 지질입자체 제조 방법보다, 다양한 농도의 수용성 단백질에 대한 입자체 형성이 용이한 장점이 있다. 이를 확인하기 위해서, 기존 방식과 본 발명에서 제시되는 지용성 고분자 충진 입자체 제조 방식으로 다양한 단백질 농도에서 입자체를 형성함으로써, 입자의 크기를 분석하여 비교하였다.

도 5(a)에 나타낸 것과 같이, 기존 방식의 경우 0.125 μg/ml의 단백질 농도에서만 약 200 nm 정도의 입자체가 형성되는 것을 확인하였다.

그러나, 도 5(b)에 나타낸 것과 같이, 본 발명에서 사용되는 제조 방식의 경우 사용된 모든 농도에서 일정한 크기(200nm 내외)의 입자가 형성되는 것을 확인하였다.

실시예 2. 고분자(지용성과 수용성류 ) 성분 및 조성에 따른 입자체의 성질 변화 관찰

2.1 고분자 성분에 따른 입자체의 성질 변화 확인

고분자의 성질 변화에 따른 입자체 분해 속도 다변화를 확인하기 위해, PLGA 50:50(lactide:glycolide), PLGA 75:25(lactide:glycolide), PLA(lactide only) 고분자가 사용되었다. 각 고분자는 0.03 mg의 동일한 양이 사용되었으며, 내부에는 핵산을 포집하였다. 제조 방식 또한 모두 동일하였다. 매 측정 시간마다 용액을 취하여, 원심분리를 통해 부유하고 있는 입자체를 제거한 뒤, 상층액의 핵산 농도를 Quant-iT™ PicoGreen ® dsDNA Reagent and Kits를 이용하여 측정하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에서 나타난 바와 같이, 상층액 상의 핵산 농도는 PLGA 50:50(lactide:glycolide), PLGA 75:25(lactide:glycolide), PLA(lactide only)의 순으로 증가되기 시작하였으며, 이는 입자체의 분해가 PLGA 50:50, PLGA 75:25, PLA의 순으로 진행되었다는 것을 의미한다(◆:PLGA 50:50, ▲:PLGA 75:25, ■: PLA).

상기 결과를 볼 때, 본 발명의 제조방법을 이용해 제조된 입자체는 그 분해 속도를 미세하게 조정가능하다는 것을 의미한다. 따라서 이러한 성질을 이용하면, 본 발명의 입자체를 이용해 체내 약물 방출의 양상을 조절할 수 있다. 이는 현재 백신 접종시 확고한 면역체계의 정립을 위해 사용되는 다중 접종의 대체 방식으로 한번의 접종으로도 다중 접종과 동일한 효과를 내는 것에 응용될 수 있다.

2.2 수용성 고분자 성분에 따른 입자체의 성질 변화 확인

수용성 고분자의 실험에 대표적으로 사용된 핵산고분자의 경우 기본단위 핵산이 리가아제에 의하여 입자체 내에서 구조체를 형성 할 수 있다는 것을 확인하였다. 따라서 본 실시예에서는 다양한 에멀젼 형성 방식이 실험되었으며, 이 실험에서는 유기 용매로 liquid paraffin이 사용되었다.

에멀젼 형성 방식은 최대 출력으로 30초 동안 와동시키는 방식(vortexing for 30s with maximum power) 형성된 입자체를 Triton X-100으로 처리하여 표면 리포좀을 제거한 뒤, 전기영동법을 통하여 기본 단위 이상의 분자량을 가지는 핵산들을 검출하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이 입자체 내 거대 핵산 구조물의 형성을 확인하였다. 이는 입자체 내부에서 리가아제의 활성이 유지되었다는 것을 보여주고, 실제적인 핵산 구조물이 형성되었다는 것을 증명하는 하나의 증거가 될 수 있다.

2.3 수용성 고분자 성분에 따른 입자체의 성질 변화 확인

수용성 고분자로 핵산젤을 사용하여, 핵산젤을 충진한 입자체의 이미지는 공초점현미경 (LSM 510)을 이용하여 확인되었다. 지질막은 Texa-Red DHPE로 선택 염색되었고, 핵산은 핵산에 선택적으로 염색이 되지만 리가아제의 활성에는 영향을 주지 않는 것으로 알려진 SYBR-green I이 사용되었다. 그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 수용성 고분자인 핵산젤이 입자체 내부에 위치하고 있는 것을 확인할 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

Claims

지질로 형성되는 리포좀 내부에, 수용성 고분자 또는 지용성 고분자, 및 약물로 오발부민 또는 CpG 올리고디옥시뉴클레오티드가 융합된 입자체로서,
상기 지질은 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (DOPG), cholesterol, 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 및 Triethylammonium Salt (Texas Red DHPE)이고,
상기 수용성 고분자는 X-모양 DNA이며,
상기 지용성 고분자는 폴리락타이드(Poly lactide)와 폴리글라이콜라이드(poly glycolide)가 25~75:75~25의 몰비로 혼합된 고분자인 것을 특징으로 하는, 입자체.
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제 1항에 있어서,
상기 고분자가 수용성 고분자일 경우, 지질의 농도는 1mM 내지 10mM인 것을 특징으로 하는, 입자체.
제 1항에 있어서,
상기 고분자가 지용성 고분자일 경우, 지질의 농도는 3M 내지 5M인 것을 특징으로 하는, 입자체.
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제 1항에 있어서,
상기 입자체의 지름은 200nm 내지 1500nm인 것을 특징으로 하는, 입자체.
하기 단계를 포함하는 수용성 고분자가 융합된 입자체의 제조방법으로, 상기 수용성 고분자는 X-모양 DNA인 것을 특징으로 하는, 제조방법:
a) X-모양 DNA, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (DOPG), cholesterol, 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 및 Triethylammonium Salt (Texas Red DHPE)를 혼합하는 단계;
b) 상기 a) 단계에서 혼합된 용액에 핵산(DNA) 또는 오발부민(OVA)을 혼합하는 단계;
c) 상기 b) 단계에서 혼합된 용액에 교반 또는 초음파처리하여 에멀젼을 제조하여, 리포좀을 형성하는 단계; 및
d) 상기 리포좀을 원심분리하여 상층의 유기용매를 제거하는 단계.
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하기 단계를 포함하는 지용성 고분자가 융합된 입자체의 제조방법으로, 상기 지용성 고분자는 폴리락타이드(Poly lactide)와 폴리글라이콜라이드(poly glycolide)가 25~75:75~25의 몰비로 혼합된 고분자인 것을 특징으로 하는, 제조방법:
a) 폴리락타이드(Poly lactide)와 폴리글라이콜라이드(poly glycolide)가 25~75:75~25의 몰비로 혼합된 고분자 및 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (DOPG), cholesterol, 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt (Texas Red DHPE)를 혼합하는 단계;
b) 상기 혼합된 용액에 초음파처리하여 단일 에멀젼을 제조하는 단계;
c) 상기 단일 에멀젼에 핵산(DNA) 또는 오발부민(OVA)을 포함한 수용액을 첨가하여 초음파처리하여 다중 에멀젼을 제조하여, 리포좀을 형성하는 단계;
d) 상기 리포좀을 교반하여 유기용매를 제거하는 단계; 및
e) 상기 d) 단계에서 유기용매가 제거된 리포좀을 원심분리하는 단계.
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