ES2634669T3 - Composición y formulación lipídica de una enzima de degradación de hialuronano y uso de la misma para el tratamiento de la hiperplasia benigna de próstata - Google Patents

Abstract

Un liposoma multivesicular (LMV) que comprende una enzima de degradación de hialuronano, en donde el LMV comprende: un lípido neutro; un lípido anfipático; y una enzima de degradación de hialuronano, en donde la concentración de la enzima de degradación de hialuronano está entre o entre aproximadamente 0,1 mg/mL y 1 mg/mL.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

DESCRIPCION

Composicion y formulacion lipidica de una enzima de degradacion de hialuronano y uso de la misma para el tratamiento de la hiperplasia benigna de prostata

Campo de la invencion

Se proporcionan composiciones y formulaciones o co-formulaciones que contienen una enzima de degradacion de hialuronano. Las composiciones, formulaciones o co-formulaciones tambien pueden contener otro agente terapeutico, tal como uno que sea adecuado para el tratamiento de la Hiperplasia Prostatica Benigna, por ejemplo, un inhibidor de la 5-alfa reductasa. Las composiciones y formulaciones se pueden utilizar para el tratamiento de la Hiperplasia Prostatica Benigna. Las composiciones y formulaciones se pueden proporcionar combinadas con uno o mas agentes para el tratamiento de la Hiperplasia Prostatica Benigna.

Compendio

Se proporcionan en la presente memoria liposomas multivesiculares (LMV) que contienen un lfpido neutro, un lfpido anfipatico y una enzima de degradacion de hialuronano. La enzima de degradacion de hialuronano en los LMV tiene generalmente una actividad de al menos 40.000 U/mg. La concentracion de la enzima de degradacion de hialuronano esta comprendida entre 0,1 mg/mL y 1 mg/mL, 0,2 mg/mL y 0,5 mg/mL, o es al menos aproximadamente 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,7 mg/mL, 0,8 mg/mL o 0,9 mg/mL.

En algunos ejemplos, los LMV contienen acido hialuronico (HA). El HA puede estar presente en una cantidad suficiente para aumentar la encapsulacion y la actividad enzimatica de la enzima de degradacion de hialuronano. La concentracion de acido hialuronico en los LMV esta entre o aproximadamente entre 0,05 mg/mL y 50 mg/mL, 0,75 mg/mL y 13,0 mg/mL, o entre 1 mg/mL y 10 mg/mL o es al menos o aproximadamente 0,1 mg/mL, 0,5 mg/mL o 1 mg/mL. En algunos ejemplos, la razon de acido hialuronico con respecto a la enzima de degradacion de hialuronano es de 1:500, 1:400, 1:300, 1:200, 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 200:1, 300:1, 400:1, 500:1.

En los ejemplos de la presente invencion, los LMV se pueden elaborar mediante un procedimiento o se pueden obtener mediante un procedimiento que incluye a) formar un primer componente acuoso que contiene una enzima de degradacion de hialuronano a una concentracion inferior a 2 mg/mL; b) formar un componente lipfdico que contiene al menos un disolvente organico, al menos un lfpido anfipatico y al menos un lfpido neutro; c) formar una emulsion a partir del primer componente acuoso y del componente lipfdico; d) dispersar la emulsion en un segundo componente acuoso para formar esferulas de disolvente; y e) separar el disolvente organico de las esferulas de disolvente para formar liposomas multivesiculares suspendidos en el segundo componente acuoso. En el procedimiento, la enzima de degradacion de hialuronano en el primer componente acuoso esta en una concentracion entre aproximadamente 0,1 mg/mL y 1,9 mg/mL, 0,5 mg/mL y 1,5 mg/mL o es de aproximadamente 1 mg/mL. El primer componente acuoso tambien puede contener un excipiente que es sacarosa, cloruro de calcio (CaCl2), glicerol, dextrano, PEG (p.ej. PEG-6000), acido hialuronico (HA), prolina, Arg-HCl, sorbitol, trehalosa, albumina de suero humano (HSA), o una combinacion de los mismos. En tales ejemplos, el CaCl2 esta entre o aproximadamente entre CaCl2 1 mM y 50 mM, CaCl2 5 mM y 25 mM, CaCl2 10 mM y 20 mM, o al menos o aproximadamente o 10 mM, 15 mM o 20 mM; el dextrano esta entre o aproximadamente entre 0,01% y 1% o 0,05% y 0,5% o al menos o aproximadamente o 0,1%; el PEG esta entre o aproximadamente entre 0,01% y 1% o 0,05% y 0,5% o al menos o aproximadamente o 0,1%; la prolina esta entre o aproximadamente entre prolina 1 mM y 1 M, 10 mM y 500 mM o al menos o aproximadamente o 100 mM; la arginina esta entre o aproximadamente entre 1 mM y 1 M, 10 mM y 500 mM o al menos o aproximadamente o 100 mM; el sorbitol esta entre, o aproximadamente entre sorbitol al 1% y 20%, al 5% y 15% o al menos o aproximadamente o 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%; y/o la trehalosa esta entre o aproximadamente entre trehalosa al 1% y 20%, 5% y 15% o al menos o aproximadamente o al 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%; y/o el acido hialuronico (HA) esta entre aproximadamente 1 mg/mL y 100 mg/mL, 10 mg/mL y 75 mg/mL, o 15 mg/mL y 50 mg/mL, o al menos o aproximadamente o 1 mg/mL de HA, 2 mg/mL de HA, 3 mg/mL de HA, 4 mg/mL de HA, 5 mg/mL de HA, 6 mg/mL de HA, 7 mg/mL de HA, 8 mg/mL de HA, 9 mg/mL de HA, 10 mg/mL de HA, 11 mg/mL de HA, 12 mg/mL de HA, 13 mg/mL de HA, 14 mg/mL de HA, 15 mg/mL de HA, 16 mg/mL de HA, 17 mg/mL de HA, 18 mg/mL de HA, 19 mg/mL de HA, 20 mg/mL de HA, 25 mg/mL de HA, 30 mg/mL de HA, 40 mg/mL de HA, 50 mg/mL de HA.

En los LMV proporcionados en la presente memoria, los LMV se pueden elaborar mediante un procedimiento que incluye tambien la eliminacion del segundo componente acuoso y la suspension de los liposomas multivesiculares en un tercer componente acuoso. El tercer componente acuoso puede contener NaCl, por ejemplo, entre o aproximadamente entre 100 mM y 150 mM o es al menos o aproximadamente o 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM o 150 mM; y/o la histidina es, por ejemplo entre 1 mM y 100 mM, 5 mM y 15 mM o es al menos o

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

aproximadamente 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 40 mM o 50 mM. El pH del tercer tampon acuoso es o esta aproximadamente entre 6,0 y 8,0 o entre 6,5 y 7,5 o es al menos o aproximadamente o 6,0, 6,5, 7,0 o 7,4.

En los LMV proporcionados en la presente memoria, los LMV pueden contener o pueden ser elaborados o se pueden obtener mediante un procedimiento que contiene un lfpido neutro que es un diglicerido o un triglicerido. Por ejemplo, el lfpido neutro es un triglicerido que consiste en triolema o tricaprilina, o una mezcla de triolema y tricaprilina. En algunos ejemplos, la triolema y la tricaprilina estan en una razon molar 50:50 (1:1). En los ejemplos de los LMV proporcionados en la presente memoria, los LMV pueden contener o se pueden elaborar o se pueden obtener mediante un procedimiento que contiene un lfpido anfipatico que es un fosfatidilglicerol (PG), cardiolipina (CL), fosfatidilserina (PS), acido fosfatidico (PA), fosfatidilinositol, fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), esfingomielina o diaciltrimetilamoniopropano (DITAP). Por ejemplo, el lfpido anfipatico es una fosfatidilcolina que es DEPC o DOPC, o una mezcla de dEpC y DOPC. El DEPC y el DOPC estan en una razon molar que es al menos o aproximadamente al menos una razon molar 50:50 (1 DEPC:1 DOPC), 75/25 o 90/10. En los ejemplos de los LMV proporcionados en la presente memoria, los LMV pueden contener o se pueden elaborar adicionalmente mediante un procedimiento que contiene DPPG, colesterol o DPPG y colesterol.

En cualquiera de los LMV proporcionados en la presente memoria, los LMV contienen, por ejemplo a partir de la elaboracion mediante un procedimiento que contiene, un agente terapeutico adicional. El agente terapeutico puede ser hidrofilo o hidrofobo. Tfpicamente, el agente terapeutico es un agente para el tratamiento de la hiperplasia benigna de prostata. Por ejemplo, el agente terapeutico es un antiandrogeno, un bloqueador alfa, una toxina botulmica o una enzima hidrolttica. El antiandrogeno puede ser un antiandrogeno esteroide, un antiandrogeno no esteroide o un inhibidor de la 5a-reductasa. En ejemplos particulares, el agente es finasterida o dutasterida.

Tambien se proporcionan en la presente memoria composiciones o combinaciones que contienen cualquiera de los LMV proporcionados en la presente memoria. Las composiciones o combinaciones pueden contener adicionalmente un agente terapeutico. El agente terapeutico se puede formular por separado del liposoma multivesicular. Es ilustrativo de un agente terapeutico un agente adecuado para el tratamiento de la hiperplasia benigna de prostata. Por ejemplo, el agente terapeutico es un antiandrogeno, un bloqueador alfa, una toxina botulmica y una enzima hidrolftica. El antiandrogeno es un antiandrogeno esteroide, un antiandrogeno no esteroide o un inhibidor de la 5a- reductasa. Los inhibidores de la 5a-reductasa son finasterida o dutasterida. Tambien se proporcionan en la presente memoria contenedores o kits que contienen cualquiera de las composiciones o combinaciones.

Tambien se proporcionan en la presente memoria composiciones que contienen una enzima de degradacion de hialuronano; y acido hialuronico, por medio de lo cual la enzima de degradacion de hialuronano conserva al menos 50% de la actividad hialuronidasa durante al menos seis meses entre 28°C y 32°C o al menos un ano entre 2°C y 8°C. Por ejemplo, se conserva al menos una actividad hialuronidasa de 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o mas. La enzima de degradacion de hialuronano y el acido hialuronico en la composicion estan a una razon molar de o aproximadamente 5000:1, 4000:1, 3000:1, 2000:1, 1900:1, 1800:1, 1700:1, 1650:1, 1600:1, 1500:1, 1200:1, 1200:1, 1000:1, 900:1, 800:1, 700:1, 600:1, 500:1, 100:1, 90:1, 80:1, 70:1, 60:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 10:1, 1:1, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:500, 1:600, 1:700, 1:800, 1:900, 1:1000, 1:1100, 1:1200, 1:1300, 1:1400, 1:1500, 1:1600, 1:1700, 1:1800, 1:1900, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000. La concentracion de la enzima de degradacion de hialuronano en la composicion es, o esta aproximadamente entre o es de al menos, 1 U/mL a 10000 U/mL, 10 U/mL a 5000 U/mL, 100 U/mL a 1000 U/mL o es al menos o aproximadamente o 10 U/mL, 50 U/mL, 100

U/mL, 200 U/mL, 300 U/mL, 400 U/mL, 500 U/mL, 600 U/mL, 700 U/mL, 800 U/ mL, 900 U/ mL, 1000 U/ mL o mas.

La concentracion de acido hialuronico es o esta aproximadamente entre 1 mg/mL a 100 mg/mL, de 10 mg/mL a 50 mg/mL, de 1 mg/mL a 20 mg/mL o es de al menos aproximadamente 1 mg/mL, 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg/mL, 10 mg/mL, 11 mg/mL, 12 mg/mL, 13 mg/mL, 15 mg/mL, 16 mg/mL, 17 mg/mL, 18 mg/mL, 19 mg/mL, 20 mg/mL, 30 mg/mL, 40 mg/mL, o 50 mg/mL. La composicion se puede formular para uso unico o multiple. La composicion se puede formular en un volumen por administracion de entre o aproximadamente 0,5 mLy50 mL, 1 mLy10 mL, 1 mLy5 mL o al menos o aproximadamente o 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL o 50 mL.

En cualquiera de los ejemplos de los LMV proporcionados en la presente memoria o en las composiciones

proporcionadas en la presente memoria, la enzima de degradacion de hialuronano es una hialuronidasa, una condroitinasa o una liasa. Por ejemplo, la hialuronidasa es una hialuronidasa de tipo marnffero o una hialuronidasa bacteriana. En algunos ejemplos, la hialuronidasa es una hialuronidasa PH20. La hialuronidasa PH20 puede ser PH20 ovina, de raton, de mono, bovina, bacteriana y humana. La PH20 es generalmente soluble o es una forma que se secreta cuando se expresa en una celula de mamffero, tal como una celula CHO. La PH20 soluble puede ser una que carezca de un sitio de anclaje a glicosilfosfatidilinositol (GPI) C-terminal o una porcion del sitio de anclaje a GPI. Por ejemplo, la PH20 soluble tiene una secuencia de aminoacidos que es una forma truncada del polipeptido expuesto en el SEQ ID NO: 2, por lo que la PH20 soluble carece de todo o de una porcion del sitio de anclaje a GPI C-terminal, o tiene una secuencia de aminoacidos que presenta una identidad de secuencia al menos de 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mas con su forma truncada. En ejemplos particulares, la PH20 soluble

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

tiene una secuencia de aminoacidos expuesta en cualquiera de los SEQ ID NO: 4-9 y 46-48, y variantes alelicas, variantes de especies y otras variantes de los mismos. En los ejemplos de la presente invencion, la enzima de degradacion de hialuronano esta glicosilada. La enzima de degradacion de hialuronano tambien se puede modificar por conjugacion a un poUmero. El polfmero es PEG o dextrano. La enzima de degradacion de hialuronano tambien puede estar ligada, directa o indirectamente, a una marca o a un radical detectable. Por ejemplo, la marca o el radical detectable es una protema fluorescente.

Se proporcionan en la presente memoria metodos de tratamiento de una enzima de degradacion de hialuronano, tal como la hiperplasia benigna de prostata mediante la administracion de cualquiera de las composiciones o combinaciones proporcionadas en la presente memoria. Tambien se proporcionan los usos de cualquiera de las composiciones o combinaciones proporcionadas en la presente memoria para el tratamiento de la hiperplasia benigna de prostata.

Antecedentes

La Hipertrofia o Hiperplasia Prostatica Benigna (HBP) es una afeccion no cancerosa resultante del crecimiento de la glandula prostatica como consecuencia de la progresion natural del crecimiento de la prostata con la edad. La capsula de la prostata alrededor de la glandula prostatica puede impedir que la glandula prostatica crezca aun mas. Esto hace que la region interna de la glandula prostatica apriete la uretra. La compresion de la uretra aumenta la resistencia al flujo de orina a traves de la region de la uretra rodeada por la prostata. La vejiga urinaria tiene que ejercer mas presion para forzar la orina a traves de la uretra restringida, lo que da como resultado la hipertrofia de las paredes de la vejiga urinaria, rigidez y exposicion de una variedad de smtomas del tracto urinario inferior (STUI). Los STUI incluyen flujo de orina debil o intermitente al orinar, tension al orinar, vacilacion antes de que la orina empiece a fluir, sensacion de que la vejiga no se ha vaciado completamente despues de orinar, goteo al final de la miccion o perdidas despues, aumento de la frecuencia de miccion particularmente durante la noche y necesidad urgente de orinar. La HBP es una de las afecciones medicas mas comunes que afectan a hombres, especialmente a hombres mayores. Se ha informado que la HBP afecta al 50% de los hombres a los 50 anos y al 75% de los hombres a los 80 anos. Debido al envejecimiento de la poblacion, se preve que la prevalencia de HBP aumente sustancialmente en los proximos 20 anos. La HBP grave puede causar problemas serios tales como una disminucion de la calidad de vida, infeccion del tracto urinario, lesion de la vejiga y los rinones, incontinencia y mas grave, hematuria macroscopica e insuficiencia renal por uropatfa obstructiva. De las estrategias actuales disponibles para el tratamiento de la hBp, incluyendo el uso de farmacos y la cirugfa, todas tienen consecuencias adversas. Por lo tanto, existe la necesidad de regfmenes de tratamiento alternativos.

Descripcion detallada

Esquema

A. DEFINICIONES

B. DESCRIPCION GENERAL - Hialuronano acumulado (HA) en la enfermedad e hidrolisis del mismo

C. ENZIMAS DE DEGRADACION de HIALURONANO

1. Hialuronidasas

a. Hialuronidasas de tipo mamifero

i. PH20

ii. PH20 humana

b. Hialuronidasas bacterianas

c. Hialuronidasas de sanguijuelas, otros parasitos y crustaceos

2. Otras enzimas de degradacion de hialuronano

3. Enzimas de degradacion de hialuronano solubles

a. PH20 humana soluble

4. Variantes de enzimas de degradacion de hialuronano

5. Glicosilacion de enzimas de degradacion de hialuronano

6. Enzimas de degradacion de hialuronano modificadas

7. Metodos de produccion de acidos nucleicos y polipeptidos codificados de enzimas de degradacion

de hialuronano

a. Vectores y celulas

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

b. Expresion

i. Celulas eucariotas

ii. Celulas de levadura

iii. Celulas de insectos

iv. Celulas de mamifero

v. Plantas

c. Tecnicas de purificacion

D. COMPOSICIONES Y FORMULACIONES DE LIBERACION SOSTENIDA DE ENZIMAS DE DEGRADACION DE HIALURONANO

1. Composiciones de enzimas de degradacion de haluronano

2. Formulaciones de liberacion sostenida

a. Formulacion de gel de deposito

b. Liposomas multivesiculares (LMV)

i. Parametros para mejorar la encapsulacion, estabilidad y velocidad de liberacion

ii. Ejemplos de formulaciones de LMV- enzimas de degradacion de hialuronano

iii. Co-Formulaciones de LMV

iv. Evaluacion de la encapsulacion y la eficacia

E. DOSIFICACION, ADMINISTRACION Y METODOS DE TRATAMIENTO

F. TERAPIA COMBINADA PARA EL TRATAMIENTO DE LA HIPERTROFfA PROSTATICA BENIGNA

1. Antiandrogenos

a. Anti-androgenos esteroides

b. Anti-androgenos no esteroides

c. Inhibidores de la 5a-reductasa

2. Agentes bloqueadores alfa

3. Toxina botulinica y BT modificadas

4. Otros agentes

5. Articulos de Fabricacion

6. Kits

G. METODOS DE EVALUACION DE LA EFICACIA

1. Modelos de animales

2. Procedimientos In Vitro

H. EJEMPLOS

A. DEFINICIONES

A menos que se definan de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientificos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que el entendido comunmente por un experto en la tecnica a la que pertenece la invencion. Todas las patentes, solicitudes de patentes, solicitudes y publicadas y publicaciones, secuencias de Genbank, bases de datos, sitios de la red y otros materiales publicados a los que se hace referencia a lo largo de toda la presente descripcion, a menos que se indique de otro modo, se incorporan como referencia en su totalidad. En el caso de que haya una pluralidad de definiciones para los terminos en la presente memoria, prevalecen los de esta seccion. Cuando se hace referencia a una URL u otro identificador o direccion, se entiende que tales identificadores pueden cambiar y que una informacion particular en Internet puede ir y venir, pero se puede encontrar informacion equivalente buscando en Internet. La referencia a la misma evidencia la disponibilidad y difusion publicas de dicha informacion.

Segun se utiliza en la presente memoria, aproximadamente lo mismo significa dentro de una cantidad que un experto en la tecnica considerana la misma. Tfpicamente, para composiciones farmaceuticas, al menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5% 10% se considera aproximadamente el mismo. Dicha cantidad puede variar dependiendo de la tolerancia de los sujetos a la variacion en la composicion particular.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Segun se utiliza en la presente memoria, cuando se hace referencia a la dosificacion basada en mg/kg del sujeto, se considera que un sujeto humano promedio tiene una masa de aproximadamente 70 kg.

Segun se utiliza en la presente memoria, "administracion intravenosa" hace referencia a la administracion de un farmaco directamente en una vena.

Segun se utiliza en la presente memoria, "hialuronidasa" hace referencia a una clase de enzimas que degradan el hialuronano. Las hialuronidasas incluyen, pero no se limitan a, hialuronidasas bacterianas (EC 4.2.2.1 o EC 4.2.99.1), hialuronidasas de sanguijuelas, otros parasitos y crustaceos (EC 3.2.1.36), y hialuronidasas de tipo mairnfero (EC 3.2.1.35). Las hialuronidasas incluyen cualquiera de origen no humano incluyendo, pero no limitadas a, murinas, caninas, felinas, leporinas, aviares, bovinas, ovinas, porcinas, equinas, pisdcolas, de ranas, bacterianas y cualquiera de sanguijuelas, otros parasitos y crustaceos. Las hialuronidasas humanas ilustrativas incluyen HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4 y PH20 (SEQ ID NO: 1). Tambien se incluyen entre las hialuronidasas las hialuronidasas solubles, incluyendo PH20 ovina y bovina, PH20 humana soluble y rHuPH20. Los ejemplos de hialuronidasas solubles bovinas u ovinas comercialmente disponibles son la hialuronidasa Vitrase® (hialuronidasa ovina) y la hialuronidasa Amphadase® (hialuronidasa bovina).

Segun se utiliza en la presente memoria, "PH20" hace referencia a un tipo de hialuronidasa que se produce en el esperma y es activa en condiciones neutras. La PH-20 se encuentra en la superficie del esperma, y en el acrosoma derivado del lisosoma, donde esta unida a la membrana interna del acrosoma. La pH20 incluye aquellas de cualquier origen incluyendo, pero no limitado a, humanos, chimpances, monos Cynomolgus, monos Rhesus, muridos, bovidos, ovidos, cobayas, conejos y ratas. Los polipeptidos PH20 ilustrativos incluyen los de los seres humanos (SEQ ID NO: 1), chimpance (SEQ iD NO: 101), mono Rhesus (SEQ ID NO: 102), mono Cynomolgus (SEQ ID NO: 29), vaca (SEQ ID NO: 11 y 64); raton (SEQ ID NO: 32); rata (SEQ ID NO: 31); conejo (SEQ ID NO: 25); oveja (SeQ ID NO: 27, 63 y 65) y cobaya (SEQ ID NO: 30). La referencia a PH20 incluye polipeptidos precursores de PH20 y polipeptidos pH20 maduros (tales como aquellos en los que se ha eliminado una secuencia senal), formas truncadas de los mismos que tienen actividad, e incluye variantes alelicas y variantes de especies, variantes codificadas por variantes de empalme y otras variantes, incluyendo polipeptidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o mas con los polipeptidos precursores expuestos en los SEQ ID NO: 93 y 95, o sus formas maduras. Los polipeptidos PH20 tambien incluyen aquellos que contienen modificaciones qmmicas o post-traduccionales y aquellos que no contienen modificaciones qmmicas o post-traduccionales. Dichas modificaciones incluyen, pero no se limitan a, pegilacion, albuminacion, glicosilacion, farnesilacion, carboxilacion, hidroxilacion, fosforilacion y otras modificaciones de polipeptidos conocidas en la tecnica. Una hialuronidasa PH20 truncada es cualquier forma acortada en el extremo C- terminal de la misma, particularmente formas que estan truncadas y son activas en condiciones neutras cuando estan N-glicosiladas.

Segun se utiliza en la presente memoria, una "PH20 soluble" hace referencia a cualquier forma de PH20 que sea soluble en condiciones fisiologicas. Una PH20 soluble puede ser identificada, por ejemplo, por su reparto en la fase acuosa de una solucion de Triton® X-114 a 37°C (Bordier et al., (1981) J. Biol. Chem., 256: 1604 - 7). La PH20 anclada a la membrana, tal como la PH20 anclada a lfpidos, incluyendo la PH20 anclada a GPI, se repartira en la fase rica en detergente, pero se repartira en la fase pobre en detergente o acuosa despues del tratamiento con fosfolipasa-C. Entre las PH20 solubles se encuentra la PH20 anclada a membrana en la que se han eliminado o modificado una o mas regiones asociadas con el anclaje de la PH20 a la membrana, donde la forma soluble conserva la actividad hialuronidasa. La PH20 soluble tambien incluye la PH20 soluble recombinante y las contenidas en o purificadas a partir de fuentes naturales, tales como, por ejemplo, extractos de testfculos de ovejas o vacas. Es ilustrativa de tales PH20 solubles la PH20 humana soluble.

Segun se utiliza en la presente memoria, la PH20 o sHuPH20 humana soluble incluye polipeptidos de PH20 que carecen de toda o una parte de la secuencia de anclaje a glicosilfosfatidilinositol (GPI) en el extremo C, de tal manera que, despues de la expresion, los polipeptidos son solubles en condiciones fisiologicas. La solubilidad se puede evaluar por cualquier metodo adecuado que demuestre solubilidad en condiciones fisiologicas. Son ilustrativos de tales metodos el analisis con Triton® X-114, que evalua el reparto en la fase acuosa y que se describe anteriormente y en los ejemplos. Ademas, un polipeptido de PH20 humano soluble es, si se produce en celulas CHO, tales como celulas CHO-S, un polipeptido que se expresa y se secreta en el medio de cultivo celular. Los polipeptidos humanos PH20 solubles, sin embargo, no se limitan a los producidos en celulas CHO, sino que se pueden producir en cualquier celula o mediante cualquier metodo, incluyendo la expresion recombinante y la smtesis de polipeptidos. La referencia a la secrecion en celulas CHO es conceptual. Por lo tanto, si un polipeptido pudiera ser expresado y secretado en celulas CHO y fuera soluble, es decir, se repartiera en la fase acuosa cuando se extrajera con Triton® X-114, sena un polipeptido PH20 soluble independientemente de que se produzca o no. Los polipeptidos precursores para polipeptidos sHuPH20 pueden incluir una secuencia senal, tal como una secuencia senal heterologa o no heterologa (es decir nativa). Los ejemplos de los precursores son aquellos que incluyen una secuencia senal, tal como la secuencia senal de 35 aminoacidos nativa en las posiciones de aminoacidos 1-35 (veanse, p.ej., los aminoacidos 1 - 35 del SEQ ID NO: 1).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Segun se utiliza en la presente memoria, una "PH20 soluble ampliada" o "esPH20" incluye polipeptidos PH20 solubles que contienen residuos hasta la secuencia senal de anclaje a GPI y uno o mas residuos contiguos de la secuencia senal de anclaje a GPI de manera que el esPH20 es soluble en condiciones fisiologicas. La solubilidad bajo condiciones fisiologicas se puede determinar por medio de cualquier metodo conocido por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, se puede evaluar mediante el analisis con Triton® X-114 descrito anteriormente y en los ejemplos. Ademas, como se discutio anteriormente, una PH20 soluble es, si se produce en celulas CHO, tales como celulas CHO-S, un polipeptido que se expresa y se secreta en el medio de cultivo celular. Los polipeptidos de PH20 humanos solubles, sin embargo, no se limitan a los producidos en celulas CHO, sino que pueden producirse en cualquier celula o mediante cualquier metodo, incluyendo la expresion recombinante y la smtesis de polipeptidos. La referencia a la secrecion en celulas CHO es conceptual. Por lo tanto, si un polipeptido pudiera ser expresado y secretado en celulas CHO y fuera soluble, es decir se repartiera en la fase acuosa cuando se extrajera con Triton® X-114, sena un polipeptido de PH20 soluble independientemente de que se produzca o no. Los polipeptidos esPH20 solubles humanos incluyen, ademas de los residuos 36-490, uno o mas aminoacidos contiguos de la posicion del residuo de aminoacido 491 del SEQ ID NO: 1 inclusive, de manera que el polipeptido resultante es soluble. Los polipeptidos solubles esPH20 humanos ilustrativos son aquellos que tienen residuos de aminoacidos correspondientes a los aminoacidos 36-491, 36-492, 36-493, 36-494, 36-495, 36-496 y 36-497 del SEQ ID NO: 1. Son ilustrativos de estos aquellos con una secuencia de aminoacidos expuesta en cualquiera de los SEC ID NO: 151-154 y 185-187. Tambien se incluyen variantes alelicas y otras variantes, tales como cualquiera con una identidad de secuencia de 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mas con los polipeptidos correspondientes de los SEQ ID NO: 151-154 y 185-187 que conservan actividad en condiciones neutras y son solubles. La referencia a la identidad de secuencia hace referencia a variantes con sustituciones de aminoacidos.

Segun se utiliza en la presente memoria, la referencia a "esPH20s" incluye polipeptidos esPH20 precursores y polipeptidos esPH20 maduros (tales como aquellos en los que se ha eliminado una secuencia senal), formas truncadas de los mismos que tienen actividad enzimatica (conservando al menos 1%, 10%, 30%, 40%, 50% o mas de la forma completa) y son solubles, e incluyen variantes alelicas y variantes de especies, variantes codificadas por variantes de empalme, y otras variantes, incluyendo polipeptidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 40%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% o mas con los polipeptidos precursores expuestos en los SEQ ID NO: 1 y 3, o sus formas maduras.

Segun se utiliza en la presente memoria, la referencia a "esPH20s" tambien incluye aquellas que contienen modificaciones qmmicas o post-traduccionales y aquellas que no contienen modificaciones qmmicas o post- traduccionales. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, PEGilacion, albuminacion, glicosilacion, famesilacion, carboxilacion, hidroxilacion, fosforilacion y otras modificaciones de polipeptidos conocidas en la tecnica.

Segun se utiliza en la presente memoria, "PH20 humana recombinante soluble (rHuPH20)" hace referencia a una forma soluble de PH20 humana que se expresa de forma recombinante y se secreta en celulas de ovario de hamster chino (CHO). La rHuPH20 soluble es codificada por un acido nucleico que incluye la secuencia senal y se expone en SEQ ID NO: 49. Tambien se incluyen moleculas de ADN que son variantes alelicas de la misma y otras variantes solubles. El acido nucleico que codifica la rHuPH20 soluble se expresa en celulas CHO que secretan el polipeptido maduro. Tal como se produce en el medio de cultivo, hay heterogeneidad en el extremo C, de manera que el producto incluye una mezcla de especies que pueden incluir uno o mas de los SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 9 con una abundancia diversa.

De manera similar, para otras formas de PH20, tales como las esPH20, los polipeptidos expresados de forma recombinante y sus composiciones pueden incluir una pluralidad de especies cuyo extremo C-terminal presenta heterogeneidad. Por ejemplo, las composiciones de esPH20 expresada de forma recombinante producidas por expresion del polipeptido del SEQ ID NO: 151, que codifica una esPH20 que tiene los aminoacidos 36-497, pueden incluir formas con menos aminoacidos, tales como 36-496, 36-495.

Segun se utiliza en la presente memoria, un "radical unido a N" hace referencia a un residuo de aminoacido asparragina (N) de un polipeptido que es susceptible de ser glicosilado por medio de una modificacion post- traduccional de un polipeptido. Los radicales ligados a N ilustrativos de la PH20 humana incluyen los aminoacidos N82, N166, N235, N254, N368 y N393 de la PH20 humana expuestos en el SEQ ID NO: 1.

Segun se utiliza en la presente memoria, un “polipeptido N-glicosilado” hace referencia a un polipeptido de PH20 o forma truncada que contiene una conexion oligosacarido de al menos tres residuos de aminoacidos ligados a N, por ejemplo, radicales ligados a N correspondientes a los residuos de aminoacidos N235, N368 y N393 del SEQ ID NO:

1. Un polipeptido N-glicosilado puede incluir un polipeptido en el que tres, cuatro, cinco y hasta todos los radicales ligados a N estan unidos a un oligosacarido. Los oligosacaridos ligados a N pueden incluir oligomanosa, oligosacaridos complejos, hforidos o sulfatados u otros oligosacaridos y monosacaridos.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Segun se utiliza en la presente memoria, un "polipeptido parcialmente N-glicosilado " hace referencia a un polipeptido que contiene mmimamente un N-acetilglucosaminoglicano unido a al menos tres radicales ligados a N. Un polipeptido parcialmente glicosilado puede incluir diversas formas de glicano, incluyendo monosacaridos, oligosacaridos y formas de azucar ramificadas, incluyendo las formadas por tratamiento de un polipeptido con EndoH, EndoFI, EndoF2 y/o EndoF3.

Segun se utiliza en la presente memoria, un "polipeptido de PH20 desglicosilado" hace referencia a un polipeptido de PH20 en el que no todos los sitios de glicosilacion posibles estan glicosilados. La desglicosilacion se puede efectuar, por ejemplo, eliminando la glicosilacion, impidiendola, o modificando el polipeptido para eliminar un sitio de glicosilacion. No se requieren sitios de N-glicosilacion particulares para la actividad, mientras que otros su

Segun se utiliza en la presente memoria, "pegilado" hace referencia al anclaje covalente u otro anclaje estable de moleculas polimericas, tales como polietilenglicol (radical de pegilacion PEG) a enzimas de degradacion de hialuronano, tales como hialuronidasas, tipicamente para aumentar la semivida de la enzima de degradacion de hialuronano.

Segun se utiliza en la presente memoria, un "producto conjugado" hace referencia a un polipeptido unido directa o indirectamente a uno o mas polipeptidos o radicales qmmicos distintos. Tales productos conjugados incluyen protemas de fusion, las producidas por productos conjugados qmmicos y las producidas por cualquier otro metodo. Por ejemplo, un producto conjugado hace referencia a polipeptidos de PH20 solubles unidos directa o indirectamente a uno o mas polipeptidos o radicales qmmicos, con lo cual al menos un polipeptido de PH20 soluble esta unido, directa o indirectamente a otro polipeptido o radical qmmico, siempre que el producto conjugado conserve la actividad hialuronidasa. Los ejemplos de los productos conjugados proporcionados en la presente memoria incluyen polipeptidos de PH20 unidos directa o indirectamente a un dominio de multimerizacion, tal como un radical Fc, una toxina, una marca o un farmaco.

Segun se utiliza en la presente memoria, una protema de "fusion" hace referencia a un polipeptido codificado por una secuencia de acido nucleico que contiene una secuencia codificante de una molecula de acido nucleico y la secuencia codificante de otra molecula de acido nucleico en la que las secuencias codificantes estan en el mismo marco de lectura de manera que cuando el constructo de fusion se transcribe y se traduce en una celula anfitriona, se produce la protema que contiene las dos protemas. Las dos moleculas pueden estar adyacentes en el constructo o estar separadas por un polipeptido conector que contiene 1, 2, 3 o mas, pero tipicamente menos de 10, 9, 8, 7 o 6 aminoacidos. El producto proteico codificado por un constructo de fusion se denomina polipeptido de fusion. Los ejemplos de polipeptidos de fusion incluyen las fusiones con Fc.

Segun se utiliza en la presente memoria, un "polfmero" hace referencia a cualquier radical natural o sintetico de elevado peso molecular que esta conjugado con, es decir, conectado de forma estable directa o indirectamente a traves de un conector, a un polipeptido. Tales polfmeros, tipicamente aumentan la semivida en el suero, e incluyen, pero no se limitan a, radicales sialicos, radicales de pegilacion, dextrano, y azucar y otros radicales, por ejemplo para la glicosilacion. Por ejemplo, las hialuronidasas, tales como una PH20 soluble o rHuPH20, se pueden conjugar con un polfmero.

Segun se utiliza en la presente memoria, "actividad" hace referencia a una actividad funcional o actividades de un polipeptido o porcion del mismo asociadas con una protema de longitud completa (completa). Por ejemplo, los fragmentos activos de un polipeptido pueden mostrar una actividad de una protema de longitud completa. Las actividades funcionales incluyen, pero no se limitan a, actividad biologica, actividad catalttica o enzimatica, antigenicidad (capacidad de unirse a, o competir con, un polipeptido por la union a un anticuerpo anti-polipeptido), inmunogenicidad, capacidad para formar multimeros y capacidad de unirse espedficamente a un receptor o ligando para el polipeptido.

Segun se utiliza en la presente memoria, la "actividad hialuronidasa" hace referencia a la capacidad para catalizar enzimaticamente la escision del acido hialuronico. El analisis XXII de la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) para la hialuronidasa determina indirectamente la actividad de la hialuronidasa midiendo la cantidad de acido hialuronico de mayor peso molecular o hialuronano, quedando sustrato (HA) despues de que la enzima se deje reaccionar con hA durante 30 min a 37°C (USP xXlI-NF XVII (1990) 644-645, United States Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD). Se puede utilizar una solucion Patron de Referencia en un analisis para determinar la actividad relativa, en unidades, de cualquier hialuronidasa. Se conocen en la tecnica analisis in vitro para determinar la actividad hialuronidasa de las hialuronidasas, tales como PH20, incluyendo PH20 soluble y esPH20 y se describen en la presente memoria. Los analisis ilustrativos incluyen el analisis de microturbidez que mide la escision del acido hialuronico por la hialuronidasa indirectamente detectando el precipitado insoluble formado cuando el acido hialuronico no escindido se une con la albumina del suero. Se pueden utilizar Patrones de Referencia, por ejemplo, para generar una curva patron para determinar la actividad en Unidades de la hialuronidasa que se esta sometiendo a ensayo.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Segun se utiliza en la presente memoria, "activo en condiciones neutras" hace referencia a la capacidad de un polipeptido de PH20 para catalizar enzimaticamente la escision del acido hialuronico a pH neutro fp.ej. a o aproximadamente pH 7,0). Generalmente, una PH20 activa en condiciones neutras, y soluble, p. ej., una PH20 truncada en el extremo C o parcialmente N-glicosilada, tiene o tiene aproximadamente 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91% 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000% o mas actividad en comparacion con la actividad hialuronidasa de una PH20 activa neutra correspondiente que no esta truncada en el extremo C o parcialmente N-glicosilada.

Segun se utiliza en la presente memoria, una "secuencia senal de union al ancla de GPI" es una secuencia C- terminal de aminoacidos que dirige la adicion de un ancla de GPI preformada al polipeptido dentro del lumen del RE. Las secuencias senal de union al ancla de GPI estan presentes en los polipeptidos precursores de polipeptidos anclados a GPI, tales como polipeptidos de PH20 anclados a GPI. La secuencia senal de union al ancla de GPI C- terminal tipicamente contiene una region predominantemente hidrofoba de 8-20 aminoacidos, precedida por una region espaciadora hidrofila de 8-12 aminoacidos, inmediatamente aguas abajo del sitio w o sitio de union al ancla de GPI. Las secuencias de senal de union al ancla de GPI se pueden identificar utilizando metodos bien conocidos en la tecnica. Estos incluyen, pero no se limitan a, metodos in silico y algoritmos (veanse, p.ej. Udenfriend et al. (1995) Methods Enzymol. 250: 571-582, Eisenhaber et al., (1999) J. Biol. Chem. 292:741-758, Fankhauser et al., (2005) Bioinformatics 21: 1846 - 1852, Omaetxebarria et al., (2007) Proteomics 7: 1951-1960, Pierleoni et al., (2008) BMC Bioinformatics 9: 392), Incluyendo aquellos que estan facilmente disponibles en sitios bioinformaticos de la red, tales como el sitio de herramientas ExPASy Proteomics (p.ej., el sitio WorldWideWeb expasy.ch/tools/).

Segun se utiliza en la presente memoria, "acidos nucleicos" incluye ADN, ARN y analogos de los mismos, incluyendo acidos peptidonucleicos (PNA) y mezclas de los mismos. Los acidos nucleicos pueden ser de hebra sencilla o de doble hebra. Cuando se hace referencia a sondas o cebadores, que estan marcados opcionalmente, por ejemplo con una marca detectable, tal como una molecula fluorescente o radiomarca, se contemplan moleculas de hebra sencilla. Tales moleculas tienen tfpicamente de una longitud tal que su diana es estadfsticamente unica o de bajo numero de copias (tfpicamente menor de 5, generalmente menor de 3) para sondear o cebar una biblioteca. Generalmente, una sonda o cebador contienen al menos 14, 16 o 30 nucleotidos contiguos de secuencia complementaria o identica a un gen de interes. Las sondas y los cebadores pueden tener 10, 20, 30, 50, 100 o mas acidos nucleicos de longitud.

Segun se utiliza en la presente memoria, un peptido hace referencia a un polipeptido que es mayor o igual a 2 aminoacidos de longitud, y menor o igual a 40 aminoacidos de longitud.

Segun se utilizan en la presente memoria, los aminoacidos que se producen en las diversas secuencias de aminoacidos proporcionados en la presente memoria se identifican de acuerdo con sus abreviaturas conocidas de tres letras o una letra (Tabla 1). Los nucleotidos que se encuentran en los diversos fragmentos de acido nucleico se designan con las designaciones convencionales de una sola letra utilizadas habitualmente en la tecnica.

Segun se utiliza en la presente memoria, un "aminoacido" es un compuesto organico que contiene un grupo amino y un grupo acido carboxflico. Un polipeptido contiene dos o mas aminoacidos. Para los fines de la presente invencion, los aminoacidos incluyen los veinte aminoacidos naturales, los aminoacidos no naturales y los analogos de aminoacidos (es decir, aminoacidos en donde el carbono a tiene una cadena lateral).

Segun se utiliza en la presente memoria, "residuo de aminoacido" hace referencia a un aminoacido formado por digestion qrnmica (hidrolisis) de un polipeptido en sus enlaces peptfdicos. Se supone que los residuos de aminoacidos descritos en la presente memoria estan en la forma isomera "L". Los residuos en la forma isomerica "D", que estan designados de esta manera, se pueden sustituir por cualquier residuo de L-aminoacido siempre que el polipeptido conserve la propiedad funcional deseada. NH2 hace referencia al grupo amino libre presente en el extremo amino de un polipeptido. COOH hace referencia al grupo carboxi libre presente en el extremo carboxilo de un polipeptido. De acuerdo con la nomenclatura de polipeptidos convencional descrita en J. Biol. Chem., 243: 3557 - 3559 (1968), y 37 C.F.R. □ §§ 1.821-1.822 adoptada, las abreviaturas para los residuos de aminoacidos se muestran en la Tabla 1:

Tabla 1 - Tabla de Correspondencia

SfMBOLO

1 Letra

3 Letras AMINOACIDO

Y

Tyr Tirosina

G

Gly Glicina

F

Phe Fenilalanina

5

10

15

20

25

SfMBOLO

1 Letra

3 Letras aminoAcido

M

Met Metionina

A

Ala Alanina

S

Ser Serina

I

Ile Isoleucina

L

Leu Leucina

T

Thr Treonina

V

Val Valina

P

Pro Prolina

K

Lys Lisina

H

HIs Histidina

Q

Gln Glutamina

E

Glu Acido glutamico

Z

Glx Glu y/o Gln

W

Trp Triptofano

R

Arg Arginina

D

Asp Acido aspartico

N

Asn Asparragina

B

Asx Asn y/o Asp

C

Cys Cistema

X

Xaa Desconocido u otro

Todas las secuencias de residuos de aminoacidos representadas en la presente memoria por formulas tienen una orientacion de izquierda a derecha en la direccion convencional del extremo amino a extremo carboxilo. Ademas, la expresion "residuo de aminoacido" se define para incluir los aminoacidos enumerados en la Tabla de Correspondencia (Tabla 1) y aminoacidos modificados e inusuales, tales como los mencionados en 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822, e incorporados a la presente memoria como referencia. Ademas, se debe observarse que un guion al principio o al final de una secuencia de residuos de aminoacidos indica un enlace peptidico a una secuencia adicional de uno o mas residuos de aminoacidos, a un grupo amino-terminal tal como NH2O o a un grupo carboxilo- terminal tal como COOH.

Segun se utiliza en la presente memoria, los "a-aminoacidos naturales" son los residuos de los 20 a-aminoacidos encontrados en la naturaleza que se incorporan a la protema mediante el reconocimiento espedfico de la molecula de ARNt cargada con su codon de ARNm cognado en seres humanos. Los aminoacidos no naturales comprenden de ese modo, por ejemplo, aminoacidos o analogos de aminoacidos distintos de los 20 aminoacidos de origen natural e incluyen, pero no se limitan a, los isostereomeros D de aminoacidos. Se describen en la presente memoria aminoacidos no naturales ilustrativos y son conocidos por los expertos en la tecnica.

Segun se utiliza en la presente memoria, un constructo de ADN es una molecula de ADN lineal o circular de una o dos hebras que contiene segmentos de ADN combinados y yuxtapuestos de una manera que no se encuentra en la naturaleza. Existen constructos de ADN como resultado de la manipulacion humana, e incluyen clones y otras copias de moleculas manipuladas.

Segun se utiliza en la presente memoria, un segmento de ADN es una porcion de una molecula de ADN mas grande que tiene atributos especificados. Por ejemplo, un segmento de ADN que codifica un polipeptido especificado es una porcion de una molecula de ADN mas larga, tal como un plasmido o fragmento de plasmido, que, cuando se lee desde la direccion 5 'a 3', codifica la secuencia de aminoacidos del polipeptido especificado.

Segun se utiliza en la presente memoria, el termino polinucleotido significa un polfmero de una o dos hebras de bases desoxirribonucleotfdicas o ribonucleotidicas lefdas del extremo 5' al extremo 3'. Los polinucleotidos incluyen

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

ARN y ADN, y se pueden aislar a partir de fuentes naturales, sintetizar in vitro o preparar a partir de una combinacion de moleculas naturales y sinteticas. La longitud de una molecula de polinucleotido se proporciona en la presente memoria en terminos de nucleotidos (abreviado "nt") o pares de bases (abreviado "pb"). El termino nucleotidos se utiliza para moleculas de hebra sencilla o doble donde el contexto lo permite. Cuando el termino se aplica a moleculas de doble hebra se utiliza para denotar la longitud total y se entendera que es equivalente al termino pares de bases. Los expertos en la tecnica reconoceran que las dos hebras de un polinucleotido de doble hebra pueden diferir ligeramente en longitud y que sus extremos pueden ser escalonados; por lo tanto, todos los nucleotidos dentro de una molecula de polinucleotido de doble hebra pueden no estar emparejados. Tales extremos desemparejados, en general, no excederan de 20 nucleotidos de longitud.

Segun se utiliza en la presente memoria, la "similitud" entre dos protemas o acidos nucleicos hace referencia a la relacion entre la secuencia de aminoacidos de las protemas o las secuencias de nucleotidos de los acidos nucleicos. La similitud se puede basar en el grado de identidad y/u homologfa de las secuencias de residuos y de los residuos contenidos en la misma. Los metodos para evaluar el grado de similitud entre protemas o acidos nucleicos son conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, en un metodo para evaluar la similitud de secuencias, dos secuencias de aminoacidos o nucleotidos estan alineadas de una manera que proporciona un nivel maximo de identidad entre las secuencias. "Identidad" hace referencia a la medida en que las secuencias de aminoacidos o nucleotidos son invariantes. El alineamiento de secuencias de aminoacidos y, en cierta medida, de secuencias de nucleotidos, tambien puede tener en cuenta diferencias conservativas y/o sustituciones frecuentes en aminoacidos (o nucleotidos). Las diferencias conservativas son las que conservan las propiedades ffsico-qmmicas de los residuos involucrados. Los alineamientos pueden ser globales (alineamiento de las secuencias comparadas en toda la longitud de las secuencias e incluyendo todos los residuos) o locales (alineamiento de una porcion de las secuencias que incluye solo la region o regiones mas similares).

La "identidad" por sf misma tiene un significado reconocido en a tecnica y se puede calcular utilizando tecnicas publicadas. (Vease, p.ej. Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991). Si bien existen numerosos metodos para medir la identidad entre dos polinucleotidos o polipeptidos, el termino “identidad” es bien conocido por los expertos en la tecnica (Carrillo, H. & Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988)).

Segun se utiliza en la presente memoria, homologo (con respecto a las secuencias de acido nucleico y/o aminoacidos) representa una homologfa de secuencia aproximadamente superior o igual a 25%, tfpicamente una homologfa de secuencia mayor o igual a 25%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95%; el porcentaje preciso se puede especificar si es necesario. Para los fines de la presente memoria, los terminos "homologfa" e "identidad" se usan a menudo indistintamente, a menos que se indique lo contrario. En general, para la determinacion del porcentaje de homologfa o identidad, las secuencias se alinean de manera que se obtiene la coincidencia de orden mas alto (vease, p.ej.: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Por medio de la homologfa de secuencia, se determina el numero de aminoacidos conservados mediante programas de algoritmos de alineamiento convencionales, y se puede utilizar con las penalizaciones por hueco por defecto establecidas por cada proveedor. Las moleculas de acido nucleico sustancialmente homologas hibridanan tfpicamente a una rigurosidad moderada o una alta rigurosidad a lo largo de la longitud del acido nucleico de interes. Tambien se contemplan moleculas de acido nucleico que contienen codones degenerados en lugar de codones en la molecula de acido nucleico hibridante.

Si dos moleculas cualesquiera tienen secuencias de nucleotidos o secuencias de aminoacidos que son “identicas” u “homologas” en al menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% se puede determinar utilizando algoritmos informaticos conocidos tales como el programa" FASTA ", utilizando, por ejemplo, los parametros por defecto como en Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (otros programas incluyen el paquete de programas GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Altschul, S.F., et al., J. Mol Biol 215: 403 (1990)); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, y Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Por ejemplo, se puede utilizar la funcion BLAST de la base de datos del National Center for Biotechnology Information para determinar la identidad. Otros programas comerciales o disponibles publicamente incluyen el programa "MegAlign" de DNAStar (Madison, WI) y el programa "Gap" (Madison WI) de la Universidad de Wisconsin Genetics Computer Group (UWG). El porcentaje de homologfa o identidad de protemas y/o moleculas de acido nucleico se puede determinar, por ejemplo, comparando la informacion de las secuencias utilizando un programa informatico GAP (p.ej., Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, revisado por Smith y Waterman ((1981) Adv. Appl. Math. 2: 482). Brevemente, el programa GAP define

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

similitud como el numero de s^bolos alineados (es dedr, nucleotidos o aminoacidos), que son similares, dividido por el numero total de sfmbolos en la mas corta de las dos secuencias. Los parametros por defecto para el programa GAP pueden incluir: (1) una matriz de comparacion unaria (que contiene un valor de 1 para las identidades y de 0 para las no identidades) y la matriz de comparacion ponderada de Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745, como describen Schwartz y Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, pags. 353-358 (1979); (2) una penalizacion de 3,0 por cada hueco y una penalizacion adicional de 0,10 por cada sfmbolo en cada hueco; y (3) ninguna penalizacion por los huecos finales.

Por lo tanto, segun se utiliza en la presente memoria, el termino “identidad” o “homologfa” representa una comparacion entre un polipeptido de ensayo y un polinucleotido de referencia. Segun se utiliza en la presente memoria, “identico al menos en 90%” hace referencia a porcentajes de identidad de 90 a 99,99 con respecto a la secuencia del acido nucleico o de aminoacidos del polipeptido de referencia. La identidad a un nivel de 90% o mas es indicativa del hecho de que, suponiendo con fines ilustrativos, que se compara una longitud del polipeptido de ensayo y de referencia de 100 aminoacidos. No mas del 10% (es decir., 10 de 100) de los aminoacidos en el polipeptido de ensayo difiere de los del polipeptido de referencia. Se pueden realizar comparaciones similares entre polinucleotidos de ensayo y de referencia. Tales diferencias se pueden representar como mutaciones puntuales distribuidas aleatoriamente en toda la longitud de un polipeptido o se pueden agrupar en una o mas ubicaciones de longitud variable hasta el maximo permitido, p.ej. una diferencia de 10/100 aminoacidos (aproximadamente 90% de identidad). Las diferencias se definen como sustituciones, inserciones o deleciones de acidos nucleicos o aminoacidos. A nivel de homologfas o identidades superiores a 85-90%, el resultado debe ser independiente de los parametros del programa y de hueco enunciados; tales altos niveles de identidad se pueden evaluar facilmente, a menudo mediante alineamiento manual sin depender del soporte logico.

Segun se utiliza en la presente memoria, una secuencia alineada hace referencia al uso de homologfa (similitud y/o identidad) para alinear las posiciones correspondientes en una secuencia de nucleotidos o aminoacidos. Tfpicamente, dos o mas secuencias que estan relacionadas por un 50% o mas de identidad estan alineadas. Un conjunto alineado de secuencias hace referencia a 2 o mas secuencias que estan alineadas en las posiciones correspondientes y pueden incluir alinear secuencias derivadas de ARN, tales como EST y otros ADNc, alineados con la secuencia de ADN genomico.

Segun se utiliza en la presente memoria, "cebador" hace referencia a una molecula de acido nucleico que puede actuar como un punto de iniciacion de la smtesis de ADN dirigida por un molde en condiciones apropiadas (p.ej., en presencia de cuatro nucleosidos trifosfato diferentes y un agente de polimerizacion, tal como una ADN polimerasa, una ARN polimerasa o una transcriptasa inversa) en un tampon apropiado y a una temperatura adecuada. Se apreciara que ciertas moleculas de acido nucleico pueden servir como una "sonda" y como un "cebador”. Un cebador, sin embargo, tiene un grupo hidroxilo 3' para su extension. Se puede utilizar un cebador en una variedad de metodos, incluyendo, por ejemplo, la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), la PCR-transcriptasa inversa (RT), la PCR de ARN, la lCr, la pCr multiple, la PCR angosta (“Panhandle”), la PCR de captura, la PCR de expresion, RACE 3' y 5', PCR in situ, PCR mediada por ligacion y otros protocolos de amplificacion.

Segun se utiliza en la presente memoria, "par de cebadores" hace referencia a un conjunto de cebadores que incluye un cebador 5' (aguas arriba) que hibrida con el extremo 5' de una secuencia que se va a amplificar ('p.ej. mediante PCR) y un cebador 3' (aguas abajo) que hibrida con el complemento del extremo 3' de la secuencia que se va a amplificar.

Segun se utiliza en la presente memoria, "hibrida espedficamente" hace referencia a la reasociacion, mediante emparejamiento de bases complementarias, de una molecula de acido nucleico (p.ej. un oligonucleotido) a una molecula de acido nucleico diana. Los expertos en la tecnica estan familiarizados con los parametros in vitro e in vivo que afectan a la hibridacion espedfica, tales como la longitud y la composicion de la molecula particular. Los parametros particularmente relevantes para la hibridacion in vitro incluyen adicionalmente la temperatura de reasociacion y lavado, la composicion del tampon y la concentracion de sal. Las condiciones de lavado ilustrativas para eliminar las moleculas de acido nucleico unidas no espedficamente a una alta rigurosidad son 0,1 x SSPE, SDS al 0,1%, 65°C y a una rigurosidad media son 0,2 x SsPE, SDS al 0,1%, 50°C. En la tecnica se conocen condiciones de restriccion equivalentes. El experto en la tecnica puede ajustar facilmente estos parametros para conseguir una hibridacion espedfica de una molecula de acido nucleico con una molecula de acido nucleico diana apropiada para una aplicacion particular. Como complemento, cuando se hace referencia a dos secuencias de nucleotidos, significa que las dos secuencias de nucleotidos son capaces de hibridar, tfpicamente con menos del 25%, 15% o 5% de emparejamientos erroneos entre nucleotidos opuestos. Si fuera necesario, se especificana el porcentaje de complementariedad. Tfpicamente, las dos moleculas se seleccionan de tal manera que hibriden en condiciones de alta rigurosidad.

Segun se utiliza en la presente memoria, sustancialmente identico a un producto significa suficientemente similar como para que la propiedad de interes este lo suficientemente intacta para que el producto sustancialmente identico pueda utilizarse en lugar del producto.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Segun se utiliza en la presente memoria, tambien se entiende que los terminos "sustancialmente identico" o "similar" vanan con el contexto tal como entienden los expertos en la tecnica relevante.

Segun se utiliza en la presente memoria, una variante alelica o una variacion alelica hacen referencia a cualquiera de dos o mas formas alternativas de un gen que ocupan el mismo locus cromosomico. La variacion alelica surge naturalmente a traves de la mutacion, y puede dar como resultado un polimorfismo fenotfpico dentro de las poblaciones. Las mutaciones geneticas pueden ser silenciosas (no hay cambio en el polipeptido codificado) o pueden codificar polipeptidos que tienen secuencia de aminoacidos alterada. El termino "variante alelica" tambien se utiliza en la presente memoria para designar una protema codificada por una variante alelica de un gen. Tfpicamente, la forma de referencia del gen codifica una forma de tipo salvaje y/o una forma predominante de un polipeptido de una poblacion o unico miembro de referencia de una especie. Tfpicamente, las variantes alelicas, que incluyen variantes entre dos y entre mas de dos especies tfpicamente tienen una identidad de aminoacidos de al menos 80%, 90% o mayor con una forma de tipo salvaje y/o predominante de la misma especie; el grado de identidad depende del gen y de si la comparacion es interespecie o intraespecie. Generalmente, las variantes alelicas intraespecie tienen una identidad de al menos 80%, 85%, 90% o 95% o mas con una forma de tipo salvaje y/o predominante, incluyendo una identidad de 96%, 97%, 98%, 99% o mas con una forma de tipo salvaje y/o predominante de un polipeptido. La referencia a una variante alelica en la presente memoria hace referencia generalmente a variaciones en las protemas entre los miembros de la misma especie.

Segun se utiliza en la presente memoria, “alelo”, que se utiliza indistintamente en la presente memoria con "variante alelica" hace referencia a formas alternativas de un gen o porciones del mismo. Los alelos ocupan el mismo locus o posicion sobre los cromosomas homologos. Cuando un sujeto tiene dos alelos identicos de un gen, se dice que el sujeto es homocigoto para ese gen o alelo. Cuando un sujeto tiene dos alelos diferentes de un gen, se dice que el sujeto es heterocigoto para el gen. Los alelos de un gen espedfico pueden diferir entre sf en un solo nucleotido o varios nucleotidos, y pueden incluir modificaciones tales como sustituciones, deleciones e inserciones de nucleotidos. Un alelo de un gen tambien puede ser una forma de un gen que contiene una mutacion.

Segun se utilizan en la presente memoria, las variantes de especie hace referencia a variantes en polipeptidos entre especies diferentes, incluyendo diferentes especies de mairnferos, tales como raton y ser humano. Por ejemplo, para PH20, los ejemplos de variantes de especie proporcionadas en la presente memoria son PH20 de primate, tales como, pero no limitados a, ser humano, chimpance, macaco y mono cynomologus. Generalmente, las variantes de especie tienen una identidad de secuencia de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, o 98%. Los residuos correspondientes entre dos y entre mas de dos variantes de especie se pueden determinar comparando y alineando secuencias para maximizar el numero de nucleotidos o residuos coincidentes, por ejemplo, de tal manera que la identidad entre las secuencias sea igual o mayor de 95%, igual o mayor de 96%, igual o mayor de 97%, igual o mayor de 98% o mayor de 99%. A la posicion de interes se le otorga a continuacion el numero asignado en la molecula de acido nucleico de referencia. El alineamiento se puede efectuar manualmente o a ojo, particularmente, cuando la identidad de secuencia es mayor de 80%.

Segun se utiliza en la presente memoria, una protema humana es una codificada por una molecula de acido nucleico, tal como ADN, presente en el genoma de un ser humano, incluyendo todas las variantes alelicas y sus variaciones conservativas. Una variante o modificacion de una protema es una protema humana si la modificacion se basa en el tipo salvaje o en la secuencia prominente de una protema humana.

Segun se utiliza en la presente memoria, una variante de empalme hace referencia a una variante producida por procesamiento diferencial de un transcrito primario de ADN genomico que da como resultado mas de un tipo de ARNm.

Segun se utiliza en la presente memoria, la modificacion hace referencia a la modificacion de una secuencia de aminoacidos de un polipeptido o una secuencia de nucleotidos en una molecula de acido nucleico e incluye deleciones, inserciones y sustituciones (p.ej. sustituciones) de aminoacidos y nucleotidos, respectivamente. Los ejemplos de las modificaciones son las sustituciones de aminoacidos. Un polipeptido con aminoacidos sustituidos puede presentar una identidad de secuencia de 65%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o mas con un polipeptido que no contiene las sustituciones de aminoacidos. Las sustituciones de aminoacidos pueden ser conservativas o no conservativas. Generalmente, cualquier modificacion de un polipeptido conserva una actividad del polipeptido. Los metodos de modificacion de un polipeptido son rutinarios para los expertos en la tecnica, por ejemplo utilizando metodologfas de ADN recombinante.

Segun se utilizan en la presente memoria, las sustituciones de aminoacidos conservativas adecuadas son conocidas por los expertos en la tecnica y se pueden realizar generalmente sin alterar la actividad biologica de la molecula resultante. Los expertos en la tecnica reconocen que, en general, las sustituciones de aminoacidos individuales en regiones no esenciales de un polipeptido no alteran sustancialmente la actividad biologica (vease, p.ej., Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4a Edicion, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., pag. 224). Tales sustituciones se pueden realizar de acuerdo con las que se indican en la TABLA 2 a continuacion:

5

10

15

20

25

30

TABLA 2

Residuo original

Sustitucion conservativa ilustrativa

Ala (A)

Gly; Ser

Arg (R)

Lys

Asn(N)

Gln; His

Cys(C)

Ser

Gln (Q)

Asn

Glu (E)

Asp

Gly (G)

Ala; Pro

His (H)

Asn; Gln

Ile (I)

Leu; Val

Leu (L)

Ile; Val

Lys (K)

Arg; Gln; Glu

Met (M)

Leu; Tyr; Ile

Phe (F)

Met; Leu; Tyr

Ser (S)

Thr

Thr(T)

Ser

Trp (W)

Tyr

Tyr(Y)

Trp; Phe

Val (V)

Ile; Leu

Tambien son permisibles otras sustituciones y se pueden determinar empmcamente o de acuerdo con las sustituciones conservativas conocidas.

Segun se utiliza en la presente memoria, el termino promotor significa una porcion de un gen que contiene secuencias de ADN que proporcionan la union de la ARN polimerasa y el inicio de la transcripcion. Las secuencias promotoras se encuentran comunmente, pero no siempre, en la region no codificante 5' de los genes.

Segun se utiliza en la presente memoria, el polipeptido o protema o porcion biologicamente activa aislada o purificada estan sustancialmente exentos de material celular u otras protemas contaminantes de la celula o tejido de la que deriva la protema o sustancialmente libre de precursores qmmicos u otros agentes qmmicos cuando se sintetizan qmmicamente Se puede determinar que las preparaciones esten sustancialmente libres si aparecen libres de impurezas facilmente detectables como se determina por metodos convencionales de analisis, tales como cromatograffa en capa fina (TLC), electroforesis en gel y cromatograffa lfquida de alto rendimiento (HPLC), utilizados por los expertos en la tecnica de evaluacion de dicha pureza o lo suficientemente puras como para que una purificacion adicional no altere de manera detectable las propiedades ffsicas y qmmicas de la sustancia, tales como las actividades enzimaticas y biologicas. Los metodos para la purificacion de los compuestos para producir compuestos sustancialmente qmmicamente puros son conocidos por los expertos en la tecnica. Sin embargo, un compuesto sustancialmente qmmicamente puro puede ser una mezcla de estereoisomeros. En tales casos, una purificacion adicional podna aumentar la actividad espedfica del compuesto.

Por lo tanto, la referencia a un polipeptido sustancialmente purificado, tal como una PH20 soluble sustancialmente purificada, hace referencia a preparaciones de protemas que estan sustancialmente libres de material celular incluyendo preparaciones de protemas en las que la protema se separa de los componentes celulares de las celulas de las que se afsla se produce de forma recombinante. En una realizacion, el termino sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de protemas enzimaticas que tienen menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de protemas no enzimaticas (tambien referidas en la presente memoria como protema contaminante), generalmente menos de aproximadamente 20% de protemas no enzimaticas o 10% de protemas no enzimaticas o menos de aproximadamente 5% de protemas no enzimaticas. Cuando la protema enzimatica se produce de forma recombinante, tambien esta sustancialmente exenta de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente o 20%, 10% o 5% del volumen de la preparacion de protema enzimatica.

Segun se utiliza en la presente memoria, el termino sustancialmente libre de precursores qmmicos u otros agentes qmmicos incluye preparaciones de protemas enzimaticas en las que la protema se separa de los precursores

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

qmmicos u otros agentes qmmicos que estan implicados en la smtesis de la protema. El termino incluye preparaciones de protemas enzimaticas quetienen menos de aproximadamente 30% (en peso seco), 20%, 10%, 5% o menos de precursores qmmicos o agentes qmmicos o componentes no enzimaticos.

Segun se utiliza en la presente memoria, sintetico, con referencia, por ejemplo, a una molecula de acido nucleico sintetico o un gen sintetico o un peptido sintetico hace referencia a una molecula de acido nucleico o una molecula de polipeptido que se producen mediante metodos recombinantes y/o mediante metodos de smtesis qmmica.

Segun se utiliza en la presente memoria, la produccion por medios recombinantes o utilizando metodos de ADN recombinante representa el uso de los metodos bien conocidos de biologfa molecular para expresar protemas codificadas por ADN clonado.

Segun se utiliza en la presente memoria descriptiva, vector (o plasmido) hace referencia a elementos discretos que se utilizan para introducir un acido nucleico heterologo en celulas para su expresion o replicacion. Los vectores tfpicamente permanecen como episomicos, pero se pueden disenar para que efectuen la integracion de un gen o porcion del mismo en un cromosoma del genoma. Tambien se contemplan vectores que son cromosomas artificiales, tales como cromosomas artificiales de levadura y cromosomas artificiales de mairnferos. La seleccion y el uso de tales vehmulos son bien conocidos por los expertos en la tecnica.

Segun se utiliza en la presente memoria, un vector de expresion incluye vectores capaces de expresar ADN que esta operativamente ligado a secuencias reguladoras, tales como regiones promotoras, que son capaces de efectuar la expresion de tales fragmentos de ADN. Tales segmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y terminadoras, y opcionalmente pueden incluir uno o mas ongenes de replicacion, uno o mas marcadores seleccionables, un potenciador, una senal de poliadenilacion, y similares. Los vectores de expresion derivan generalmente de aDn plasmfdico o viral, o pueden contener elementos de ambos. Por lo tanto, un vector de expresion hace referencia a un constructo de ADN o ARN recombinante, tal como un plasmido, un fago, virus recombinante u otro vector que, tras la introduccion en una celula anfitriona apropiada, da como resultado la expresion del ADN clonado. Los vectores de expresion apropiados son bien conocidos por los expertos en la tecnica e incluyen aquellos que son replicables en celulas eucariotas y/o celulas procariotas y aquellos que permanecen en estado episomal o aquellos que se integran en el genoma de la celula anfitriona.

Segun se utiliza en la presente memoria, el vector tambien incluye "vectores de virus" o "vectores virales". Los vectores virales son virus manipulados geneticamente que estan operativamente ligados a genes exogenos para transferir (como vehmulos o lanzaderas) los genes exogenos a las celulas.

Segun se utiliza en la presente memoria, "operablemente" o "unido operativamente" cuando se hace referencia a segmentos de ADN significa que los segmentos estan dispuestos de modo que funcionan en conjunto para los fines previstos, p.ej, la transcripcion se inicia aguas abajo del promotor y aguas arriba de cualquier secuencia transcrita. El promotor es usualmente el dominio al que se une la maquinaria transcripcional para iniciar la transcripcion y procede a traves del segmento codificante hacia el terminador.

Segun se utiliza en la presente memoria, se pretende que el termino "evaluacion" incluya la determinacion cuantitativa y cualitativa en el sentido de obtener un valor absoluto para la actividad de una protema, tal como una enzima, o un dominio de la misma, presente en la muestra, y tambien de obtener un mdice, razon, porcentaje, valor visual u otro valor indicativo del nivel de la actividad. La evaluacion puede ser directa o indirecta. Por ejemplo, las especies qmmicas realmente detectadas no tienen que ser, por supuesto, el producto enzimaticamente escindido en sf mismo, pero pueden ser, por ejemplo, un derivado del mismo o alguna otra sustancia. Por ejemplo, la deteccion de un producto de escision puede ser un radical detectable tal como un radical fluorescente.

Segun se utiliza en la presente memoria, la actividad biologica hace referencia a las actividades in vivo de un compuesto o las respuestas fisiologicas que se producen despues de la administracion in vivo de un compuesto, composicion u otra mezcla. La actividad biologica, por tanto, abarca los efectos terapeuticos y la actividad farmaceutica de tales compuestos, composiciones y mezclas. Las actividades biologicas se pueden observar en sistemas in vitro disenados para someter a ensayo o utilizar tales actividades. Por lo tanto, para los fines de la presente memoria, una actividad biologica de una enzima hialuronidasa es su degradacion del acido hialuronico. En otros ejemplos, una actividad biologica de un agente terapeutico de la HBP incluye su mecanismo de accion y su reduccion de uno o mas smtomas asociados con la HBP.

Segun se utiliza en la presente memoria, equivalente, cuando hace referencia a dos secuencias de acidos nucleicos, significa que las dos secuencias en cuestion codifican la misma secuencia de aminoacidos o protemas equivalentes. Cuando se utiliza equivalente para referirse a dos protemas o peptidos, significa que las dos protemas o peptidos tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoacidos con solo sustituciones de aminoacidos que no alteran sustancialmente la actividad o funcion de la protema o peptido. Cuando equivalente hace referencia a una propiedad, no es necesario que la propiedad este presente en la misma medida (p.ej., dos peptidos pueden

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

presentar diferentes velocidades del mismo tipo de actividad enzimatica), pero las actividades son usualmente sustancialmente las mismas.

Segun se utiliza en la presente memoria, "modular" y "modulacion" o "alterar" hacen referencia a un cambio de una actividad de una molecula, tal como una protema. Las actividades ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, actividades biologicas, tales como la transduccion de senales. La modulacion puede incluir un aumento de la actividad (es decir, una actividad reguladora al alza o agonista), una disminucion de la actividad (es decir, una regulacion a la baja o inhibicion) o cualquier otra alteracion de una actividad (tal como un cambio de periodicidad, frecuencia, duracion, cinetica u otro parametro). La modulacion puede depender del contexto y tipicamente la modulacion se compara con un estado designado, por ejemplo, la protema de tipo salvaje, la protema en estado constitutivo o la protema tal como se expresa en un tipo de celula o condicion designados.

Segun se utiliza en la presente memoria, una composicion hace referencia a cualquier mezcla. Puede ser una solucion, suspension, lfquido, polvo, pasta, medio acuoso, no acuoso o cualquier combinacion de los mismos.

Segun se utiliza en la presente memoria, una combinacion hace referencia a cualquier asociacion entre dos o entre mas de dos artmulos. La combinacion puede ser dos o mas artmulos separados, tales como dos composiciones o dos colecciones, puede ser una mezcla de los mismos, tal como una mezcla unica de los dos o mas artmulos, o cualquier variacion de los mismos. Los elementos de una combinacion estan generalmente asociados o relacionados funcionalmente.

Segun se utiliza en la presente memoria, "enfermedad o trastorno" hace referencia a un estado patologico en un organismo resultante de una causa o afeccion que incluye, pero no se limita a, infecciones, afecciones adquiridas, condiciones geneticas y caracterizadas por smtomas identificables.

Segun se utiliza en la presente memoria, "tratar" a un sujeto con una enfermedad o afeccion significa que los smtomas del sujeto se alivian parcial o totalmente o permanecen estaticos despues del tratamiento. Por lo tanto, el tratamiento abarca la profilaxis, la terapia y/o la curacion. La profilaxis hace referencia a la prevencion de una enfermedad potencial y/o a la prevencion del empeoramiento de los smtomas o la progresion de una enfermedad.

Segun se utiliza en la presente memoria, tratamiento significa cualquier forma en la que los smtomas de una afeccion, trastorno o enfermedad u otra indicacion, se mejoran o se alteran de otro modo beneficiosamente.

Segun se utiliza en la presente memoria, un agente terapeutico hace referencia a cualquier agente que sea capaz de proporcionar un efecto terapeutico cuando se administra a un sujeto. Por ejemplo, para el tratamiento de la hiperplasia benigna de prostata, un agente terapeutico es cualquier agente que produce la reduccion del volumen, el crecimiento o el tamano de la prostata y, en algunos casos, la reduccion de la prostata.

Segun se utiliza en la presente memoria, el agente o farmaco hidrofobo es un agente que no se absorbe o disuelve facilmente en agua u otra disolucion acuosa, y que generalmente no es soluble en soluciones acuosas. En la tecnica se conocen varios metodos para determinar el caracter hidrofobo de un farmaco o agente (Wasik et al. (1981) NBS Techn. Rep., 81: S1 - 56; Sangster J. A Databank of evaluated octanol-water partition coefficients (LogP), logkow.cisti.nrc.ca/logkow/). Por ejemplo, se puede determinar el coeficiente de reparto de octanol/agua (log Po/w) que es una razon de la concentracion en equilibrio de una sustancia disuelta en un sistema bifasico, formado por dos disolventes no miscibles (agua y un disolvente hidrofobo tal como octanol). Esto se puede realizar utilizando la cromatograffa lfquida de alto rendimiento (HPLC).

Segun se utiliza en la presente memoria, un agente o farmaco hidrofilo es un agente que se puede absorber o disolver facilmente en agua u otra disolucion acuosa. Tambien se puede utilizar una medicion del coeficiente de reparto como se ha descrito anteriormente para medir cuan hidrofilo es un farmaco o agente.

Segun se utiliza en la presente memoria, efecto terapeutico significa un efecto resultante del tratamiento de un sujeto que altera, tfpicamente mejora o alivia los smtomas de una enfermedad o afeccion o que cura una enfermedad o afeccion. Una cantidad terapeuticamente eficaz hace referencia a la cantidad de una composicion, molecula o compuesto que da como resultado un efecto terapeutico despues de la administracion a un sujeto. Una cantidad terapeuticamente eficaz es la dosificacion suficiente para reducir uno o mas smtomas de HBP en un sujeto durante al menos una semana, mas preferiblemente un mes y lo mas preferiblemente de 6 a 8 meses o mas. Los indicadores de mejona o tratamiento exitoso incluyen la reduccion en el tamano del tejido prostatico obstructivo y el alivio de los smtomas de obstruccion urinaria.

Segun se utiliza en la presente memoria, el termino “sujeto” hace referencia a un animal, incluyendo un marnffero, tal como un ser humano.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

una enfermedad o trastorno.

Segun se utiliza en la presente memoria, el alivio de los smtomas de una enfermedad o trastorno particulares mediante un tratamiento, tal como mediante la administracion de una composicion farmaceutica u otro agente terapeutico, hace referencia a cualquier disminucion, ya sea permanente o temporal, duradera o transitoria de los smtomas que puede ser atribuida a, o asociada con, la administracion de la composicion o agente terapeutico.

Segun se utiliza en la presente memoria, la prevencion o profilaxis hace referencia a metodos en los que se reduce el riesgo de desarrollar una enfermedad o afeccion.

Segun se utiliza en la presente memoria, una "cantidad terapeuticamente eficaz" o una "dosis terapeuticamente eficaz" hacen referencia a la cantidad de un agente, compuesto, material o composicion que contiene un compuesto que es al menos suficiente para producir un efecto terapeutico. Por lo tanto, es la cantidad necesaria para prevenir, curar, aliviar, detener o detener parcialmente un smtoma de una enfermedad o trastorno.

Segun se utiliza en la presente memoria, la forma de dosis unitaria hace referencia a unidades ffsicamente discretas adecuadas para sujetos humanos y animales y envasadas individualmente como se conoce en latecnica.

Segun se utiliza en la presente memoria, una formulacion de dosificacion unica hace referencia a una formulacion para la administracion directa.

Segun se utiliza en la presente memoria, un "artmulo de fabricacion" es un producto que se elabora y vende. Segun se utiliza a lo largo de esta solicitud, se pretende que el termino abarque una hialuronidasa, p.ej. una PH20 soluble, y uno o mas un antiandrogeno, un agente bloqueador alfa y una toxina botulmica contenidos en el mismo artmulo o en artmulos de envasado separados.

Segun se utiliza en la presente memoria, el fluido hace referencia a cualquier composicion que pueda fluir. Por lo tanto, los fluidos abarcan composiciones que estan en forma de semisolidos, pastas, soluciones, mezclas acuosas, geles, lociones, cremas y otras composiciones de este tipo.

Segun se utiliza en la presente memoria, un "kit" hace referencia a una combinacion de composiciones proporcionada en la presente memoria y otro artmulo con un proposito que incluye, pero no se limita a, la reconstitucion, activacion y aparatos/dispositivos para el suministro, diagnostico y evaluacion de una actividad biologica o propiedad. Los kits incluyen opcionalmente instrucciones de uso.

Segun se utiliza en la presente memoria, un extracto o producto lisado celular hacen referencia a una preparacion o fraccion que se elabora a partir de una celula lisada o desorganizada.

Segun se utiliza en la presente memoria, animal incluye cualquier animal, tal como, pero no limitado a, primates incluyendo seres humanos, gorilas y monos; roedores, tales como ratones y ratas; aves, tales como pollos; rumiantes, tales como cabras, vacas, ciervos, ovejas; cerdos y otros animales. Los animales no humanos excluyen a los seres humanos como animal contemplado. Las hialuronidasas proporcionadas en la presente memoria son de cualquier fuente, animal, vegetal, procariotico y fungico. La mayona de las hialuronidasas son de origen animal, incluyendo el origen de marnfferos. Generalmente las hialuronidasas son de origen humano.

Segun se utiliza en la presente memoria, un control hace referencia a una muestra que es sustancialmente identica a la muestra de ensayo, excepto que no se trata con un parametro de ensayo o, si se trata de una muestra de plasma, puede ser de un voluntario normal no afectado con la afeccion de interes. Un control tambien puede ser un control interno.

Segun se utiliza en la presente memoria, una enfermedad, trastorno o afeccion asociados a hialuronano hacen referencia a cualquier enfermedad o afeccion en la que los niveles de hialuronano se elevan como causa, consecuencia u observado de otro modo en la enfermedad o afeccion. Las enfermedades y afecciones asociadas a hialuronano estan asociadas con una elevada expresion de hialuronano en un tejido o celula, un aumento de la presion del lfquido intersticial, una disminucion del volumen vascular y/o un aumento del contenido de agua en un tejido. Las enfermedades y afecciones asociadas a hialuronano ilustrativas incluyen enfermedades y afecciones asociadas con una presion elevada de lfquido intersticial, una disminucion del volumen vascular y/o un aumento del contenido de agua en un tejido, incluyendo canceres, presion de disco y edema. En un ejemplo, el tratamiento de la afeccion, enfermedad o trastorno asociados a hialuronano incluye el alivio, la reduccion u otro efecto beneficioso en uno o mas del aumento de la presion del lfquido intersticial (PLl), disminucion del volumen vascular y aumento del contenido de agua en un tejido.

Segun se utiliza en la presente memoria, "tratar" a un sujeto con una enfermedad o condicion significa que los smtomas del sujeto se alivian parcial o totalmente o permanecen estaticos despues del tratamiento. Por lo tanto, el

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

tratamiento abarca la profilaxis, la terapia y/o la curacion. La profilaxis hace referencia a la prevencion de una enfermedad potencial y/o a la prevencion del empeoramiento de los smtomas o la progresion de una enfermedad. El tratamiento tambien abarca cualquier uso farmaceutico de un interferon modificado y composiciones proporcionadas en la presente memoria.

Segun se utiliza en la presente memoria, la "Hiperplasia Prostatica Benigna" (HBP) hace referencia a una enfermedad o afeccion de la glandula en donde la prostata se agranda o muestra hiperplasia y que no es una enfermedad o afeccion maligna.

Segun se utiliza en la presente memoria, la referencia a un agente que es adecuado para el tratamiento de la hiperplasia benigna de prostata hace referencia a cualquier agente que efectua una reduccion en el volumen o crecimiento de la prostata cuando se administra a un sujeto y en algunos casos afecta a la contraccion de la prostata. Tales agentes incluyen, pero no se limitan a, antiandrogenos, bloqueadores alfa, toxinas botulmicas. Tales agentes son bien conocidos por un experto en la tecnica. Se describen en la presente memoria agentes ilustrativos.

Segun se utiliza en la presente memoria, "antiandrogeno" hace referencia a una clase amplia de agentes que ejercen su efecto ya sea interfiriendo en la union de androgenos al receptor de androgeno ya sea interfiriendo en la produccion de androgenos. Los antiandrogenos que actuan a traves del receptor de androgeno se clasifican como antiandrogenos esteroides o no esteroides basandose en su estructura qmmica. Los antiandrogenos esteroides tienen la estructura de un esteroide, es decir, son hidrocarburos tetradclicos compuestos por tres anillos de ciclohexano y un anillo de ciclopentano. Los antiandrogenos no esteroides no tienen la estructura qmmica de un esteroide. Un ejemplo de un antiandrogeno que interfiere en la produccion de androgenos es un inhibidor de la 5a- reductasa.

Segun se utiliza en la presente memoria, "agente bloqueador alfa" hace referencia a un agente que interfiere en o impide la estimulacion de los adrenorreceptores alfal y actua para relajar el tejido del musculo liso que se encuentra en la prostata y el cuello de la vejiga, permitiendo que la orina fluya fuera de la vejiga mas facilmente.

Segun se utiliza en la presente memoria, "inhibidor de la 5a-reductasa" hace referencia a un agente que inhibe la enzima 5a-reductasa de manera que la testosterona no se convierte en 5a-dihidrotestosterona.

Segun se utiliza en la presente memoria, "toxina botulmica" hace referencia a la neurotoxina producida por Clostridium botulinum; la toxina botulmica (o la cadena ligera o la cadena pesada) elaborada recombinantemente por una especie no Clostridial; los serotipos A, B, C, D, E, F y G de la toxina botulmica; un complejo de toxina botulmica (los complejos de 300, 600 y 900 kDa); una toxina botulmica modificada, toxina botulmica PEGilada, toxina botulmica quimerica, toxina botulmica recombinante, toxina botulmica Imbrida y toxina botulmica modificada qmmicamente. Una toxina de botulismo modificada es una toxina de botulismo que tiene al menos uno de sus aminoacidos eliminado, modificado o reemplazado, en comparacion con una toxina botulmica nativa. Una toxina botulmica modificada puede ser una neurotoxina producida de forma recombinante, o un derivado o fragmento de una neurotoxina producida de forma recombinante. Una toxina botulmica modificada conserva al menos una actividad biologica de la toxina botulmica nativa.

Segun se utiliza en la presente memoria, "intraprostaticamente" hace referencia a directamente a la prostata mediante inyeccion o infusion e incluye, pero no se limita a, la administracion transuretral, transperineal y transrectal.

Segun se utiliza en la presente memoria, la expresion "liberacion prolongada o sostenida" o "formulacion de liberacion controlada" hacen referencia a la formulacion de una composicion farmaceutica de uno o mas agentes terapeuticos que despues de la inyeccion localizada en la prostata permite que el agente o agentes terapeuticos sean liberados de la composicion farmaceutica, con el fin de contactar con celulas y tejidos circundantes, durante un penodo de tiempo, en oposicion a todo a la vez, entre 1 dfa y aproximadamente 1 ano. Los agentes terapeuticos se suministran asf a las celulas de la prostata y a las celulas y tejidos circundantes durante un penodo de tiempo (horas, dfas, semanas, meses) en lugar de inmediatamente. Las formulaciones de liberacion sostenida incluyen, pero no se limitan a, vesmulas lipfdicas que incluyen vesmulas unilamelares (VUL) y vesmulas multilamelares (VML), complejos de farmaco-resina (resinatos) y formulaciones de deposito.

Segun se utiliza en la presente memoria, "enzima hidrolttica" hace referencia a enzimas hidroltticas que se pueden utilizar para digerir o disolver el tejido prostatico, incluyendo pero sin limitarse a, colagenasa, hialuronidasa, tripsina, quimotripsina, pronasa, elastasa, ADNasa I, dispasa, plasmina, bromelina, clostripama, termolisina, neuraminidasa, fosfolipasa, colesterol esterasa, subtilisina, papama, quimopapama, activador de plasminogeno, estreptoquinasa, uroquinasa, fibrinolisina, serratiopeptidasa, pancreatina, amilasa, lisozima, catepsina G y las serina proteasas de leucocitos PMN.

Segun se utiliza en la presente memoria, "actividad total" hace referencia a la actividad enzimatica del agente activo, por ejemplo, la enzima de degradacion de hialuronano, que esta encapsulada dentro del liposoma.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Segun se utiliza en la presente memoria, "liposoma multivesicular" o "vesmula de membrana lipfdica" o "liposoma" hacen referencia a vesmulas lip^dicas microscopicas elaboradas por el hombre que contienen membranas lip^dicas que encierran multiples camaras acuosas no concentricas. Un liposoma multivesicular, tal como se utiliza en la presente memoria, es una emulsion de agua en aceite en agua (w/o/w).

Segun se utiliza en la presente memoria, "disolvente organico volatil" hace referencia a un disolvente organico que se evapora facilmente. Los ejemplos de disolventes organicos volatiles incluyen, pero no se limitan a eteres, eteres halogenados, hidrocarburos, esteres, hidrocarburos halogenados o Freones, por ejemplo, eter dietilico, isopropilo y otros eteres, cloroformo, tetrahidrofurano, acetato de etilo, Forane y combinaciones de los mismos.

Segun se utiliza en la presente memoria, "lfpido neutro" hace referencia a un aceite o grasa que no tiene capacidad de formacion de membrana por sf mismo y carece de un grupo con "cabeza" hidrofilo. Los ejemplos de lfpidos neutros incluyen digliceridos, tales como diolefina, dipalmitolema; esteres de propilenglicol tales como diesteres mixtos de acidos capnlico/caprico sobre propilenglicol; trigliceridos tales como triolema, tripalmitolema, trilinolema, tricaprilina y trilaurina; aceites vegetales, tales como aceite de soja; manteca de cerdo o grasa de ternera; escualeno; tocoferol; y combinaciones de los mismos. Los lfpidos neutros incluyen tanto lfpidos neutros de liberacion lenta como lfpidos neutros de liberacion rapida. Los lfpidos neutros de liberacion lenta incluyen, por ejemplo, triolema, tripalmitolema, trimiristolema, trilaurina y tricaprina. Los lfpidos neutros de liberacion rapida incluyen, por ejemplo, tricaprilina y tricaproma y mezclas de las mismas.

Segun se utiliza en la presente memoria, "lfpido anfipatico" hace referencia a una molecula que tiene un grupo de "cabeza" hidrofilo y un grupo de "cola" hidrofobo y tiene capacidad de formacion de membrana. Los lfpidos anfipaticos incluyen aquellos con carga neta negativa, carga neta cero y carga neta positiva a pH 7,4, incluyendo lfpidos zwitterionicos, acidos o cationicos. Tales lfpidos anfipaticos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, fosfatidilglicerol (PG), cardiolipina (CL), fosfatidilserina (PS), acido fosfatfdico (AP), fosfatidilinositol, fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), esfingomielina, diaciltrimetilamoniopropano (DITAP) y combinaciones de los mismos.

Segun se utiliza en la presente memoria, "lfpido anfipatico de cadena larga" hace referencia a un lfpido anfipatico que tiene un mayor numero de carbonos en la cadena de carbono, incluyendo pero no limitado a DOPC o DC18:1PC = 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina ; DLPC o DC12:0PC = 1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfocolina; DMPC o DC14:0PC = 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina; DPPC o DC16:0PC = 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina; DSPC o DC18:0PC = 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina; DAPC o DC20:0PC = 1,2-diaracidoil-sn-glicero-3- fosfocolina; DBPC o DC22:0PC = 1,2-dibehenoil-sn-glicero-3-fosfocolina; DC16:1PC = 1,2-dipalmitoleoil-sn-glicero-3- fosfocolina; DC20:1PC= 1,2-dieicosenoil-sn-glicero-3-fosfocolina; DC22:1PC= 1,2-dierucoil-sn-glicero-3-fosfocolina; DPPG = 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol; DOPG = 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol. Tfpicamente, el uso de un lfpido anfipatico de cadena larga aumentara la eficacia de encapsulacion de la formulacion liposomal.

Segun se utiliza en la presente memoria, "acido hialuronico" o "HA" hace referencia a un glicosaminoglicano no sulfatado que esta ampliamente distribuido a lo largo de tejidos conectivos, epiteliales y neurales. Es un polfmero de hasta 25.000 unidades disacaridas, compuestas a su vez por acido D-glucuronico y D-N-acetilglucosamina. El peso molecular del HA oscila entre aproximadamente 5 kDa y 20.000 kDa. Los oligomeros de acido hialuronico utilizados en la presente memoria son fragmentos de acido hialuronico.

Segun se utiliza en la presente memoria, "estable" o "estabilidad" con referencia a una enzima de degradacion de hialuronano o composicion que contiene una enzima de degradacion de hialuronano significa que la enzima de degradacion de hialuronano conserva al menos un nivel requerido de su actividad de al menos 50% de la actividad de degradacion de hialuronano en condiciones definidas, por ejemplo, condiciones de temperatura de temperaturas bajas o refrigeradas de 2°C a 8°C, temperaturas ambiente de 20°C a 30°C o temperaturas elevadas de 32°C a 40°C durante un penodo de tiempo superior a 6 meses. Por ejemplo, la enzima de degradacion de hialuronano conserva al menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o mas de su actividad a una temperatura de 2°C a 8°C, 20°C a 30°C o 32°C a 40°C durante un penodo de tiempo superior a 6 meses.

Segun se utiliza en la presente memoria, "agente activo" o "agente biologicamente activo" cuando se utiliza para describir agentes presentes en las camaras del liposoma multivesicular o en la solucion acuosa utilizada durante la fabricacion de liposomas, incluye agentes que poseen una actividad biologica deseada, incluyendo, pero no limitada a, enzimas, farmacos y profarmacos, moleculas pequenas y protemas de degradacion de hialuronanos.

Segun se utiliza en la presente memoria, "osmolaridad" hace referencia a la suma de las concentraciones molares de los solutos presentes en la solucion acuosa, incluyendo cualquier excipiente anadido.

Segun se utiliza en la presente memoria, un "excipiente" hace referencia a cualquier molecula, agente o compuesto que mantiene o potencia la estabilidad de una enzima de degradacion de hialuronano, o modula (aumenta) la eficacia de encapsulacion de la enzima de degradacion de hialuronano. Los excipientes son conocidos por los

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

expertos en la tecnica o se pueden determinar empmcamente. En la presente memoria se describen excipientes ilustrativos.

Segun se utiliza en la presente memoria, "excipiente osmotico" hace referencia a una molecula de soluto biologicamente compatible en una solucion acuosa que no es el agente biologicamente activo. Se puede utilizar un excipiente osmotico para alterar la osmolaridad del componente acuoso en el que se disuelve el agente activo para la encapsulacion. Tanto los electrolitos como los no electrolitos funcionan como excipientes osmoticos. Cuando se determina si alguna molecula particular funcionara como un excipiente osmotico o cuando se determina la concentracion de un excipiente osmotico en una solucion, por ejemplo, una encapsulada en un liposoma multivesicular, se debe considerar si, en las condiciones dentro de la solucion, por ejemplo, el pH, la molecula esta parcial o totalmente ionizada. Los excipientes osmoticos incluyen aquellos que pueden facilitar la actividad del agente activo. Los excipientes osmoticos que se pueden utilizar para formar liposomas multivesiculares y para modular la carga de farmaco del agente encapsulado a partir de liposomas multivesiculares incluyen, pero no se limitan a, glucosa, sacarosa, trehalosa, succinato, glicilglicina, acido gluconico, ciclodextrina, arginina, galactosa, manosa, maltosa, manitol, glicina, lisina, citrato, sorbitol, dextrano y combinaciones de los mismos.

Segun se utiliza en la presente memoria, "estabilizador" hace referencia a un excipiente, que cuando se anade a un liposoma multivesicular, estabiliza el agente activo.

Segun se utiliza en la presente memoria, “gel de deposito” o “formulacion de deposito” hace referencia a una formulacion en gel que permite la liberacion sostenida de un agente activo. Generalmente, el gel es un hidrogel, un gel que contiene una cantidad sustancial de agua, es biocompatible y el gel es biodegradable. Los materiales formadores de gel incluyen, pero no se limitan a, polisacaridos tales como alginato y formas modificadas de los mismos, otros precursores de hidrogel polimericos incluyen polfmeros de bloque de oxido de polietileno- polipropilenglicol tales como Pluronics® o Tetronics®.

Segun se utiliza en la presente memoria, "eficacia de encapsulacion" o "encapsulacion porcentual" hace referencia a la razon de la cantidad de compuesto que se va a encapsular en la suspension final del liposoma con respecto a la cantidad total de compuesto que se va a encapsular utilizado en la primera solucion acuosa del proceso multiplicada por 100.

Segun se utiliza en la presente memoria, "capacidad de carga de farmaco" hace referencia a la cantidad del agente activo, es dear, la enzima de degradacion de hialuronano, cargada en la suspension de liposomas del producto. La capacidad de carga de farmaco es una medida de la cantidad de agente activo disponible en un volumen unitario de formulacion de liposomas y es la razon de farmaco encapsulado por unidad de volumen de suspension de liposomas con respecto al porcentaje de volumen encapsulado en los propios liposomas. Es aproximadamente igual a la concentracion del agente activo en la suspension dividida por el lipocrito de la suspension para el bajo porcentaje de farmaco libre.

Segun se utiliza en la presente memoria, "lipocrito" hace referencia a la razon de volumen ocupado por los liposomas con respecto al volumen de suspension total multiplicado por 100.

Segun se utiliza en la presente memoria, "porcentaje de farmaco libre" hace referencia a la razon de la cantidad de farmaco exterior a los liposomas en la suspension de liposomas final con respecto a la cantidad total de farmaco en la suspension final multiplicada por 100.

Segun se utiliza en la presente memoria, "otros agentes utiles para tratar la HBP" hace referencia a agentes distintos de los antiandrogenos, agentes bloqueadores alfa y toxina botulmica.

Segun se utiliza en la presente memoria, las formas singulares "un", "una", “uno” y "el" y “la” incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Asf, por ejemplo, la referencia a un compuesto que contiene "un dominio extracelular" incluye compuestos con uno o una pluralidad de dominios extracelulares.

Segun se utilizan en la presente memoria, los intervalos y las cantidades se pueden expresar como "aproximadamente" un valor o intervalo particular. Aproximadamente tambien incluye la cantidad exacta. Por lo tanto, "aproximadamente 5 bases" significa "aproximadamente 5 bases" y tambien "5 bases".

Segun se utiliza en la presente memoria, "opcional" u "opcionalmente" significa que el evento o circunstancia descrito posteriormente ocurre o no ocurre, y que la descripcion incluye los casos en las que dicho evento o circunstancia ocurre y los casos en los que no lo hace. Por ejemplo, un grupo opcionalmente sustituido significa que el grupo no esta sustituido o esta sustituido.

Segun se utilizan en la presente memoria, las abreviaturas para cualquier grupo protector, aminoacido y otros compuestos, a menos que se indique lo contrario, estan de acuerdo con su uso comun, abreviaturas reconocidas, o

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

la Comision IUPAC-IUB sobre Nomenclature Bioqmmica (vease (1972) Biochem. 11:1726).

B. DESCRIPCION GENERAL - HIALURONANO (HA) ACUMULADO EN LA ENFERMEDAD E HIDROLISIS DEL MISMO

En la presente memoria, se proporcionan composiciones que contienen formulaciones de liberacion sostenida, tales como formulaciones de Kpidos, de una enzima de degradacion de hialuronano. Las enzimas de degradacion de hialuronano se pueden utilizar en metodos de tratamiento de enfermedades o afecciones asociadas a hialuronano (HA) en las que los niveles elevados o acumulados de hialuronano son una causa o estan asociados de otra manera con la enfermedad o afeccion. Se encuentra, sin embargo, que un problema con el uso de enzimas de degradacion de hialuronano para degradar el HA en sitios de tejido locales es que, una vez administradas, las enzimas de degradacion de hialuronano desaparecen rapidamente. Por el contrario, las celulas que producen HA se regeneran cada 3 a 10 dfas. Por lo tanto, se encuentra en la presente memoria que la liberacion sostenida o controlada de una enzima de degradacion de hialuronano se puede utilizar para proporcionar una fuente continua o persistente de enzima para degradar el HA en sitios locales, por ejemplo en las celulas del estroma de la prostata, para proporcionar una hidrolisis focal prolongada del HA. Por lo tanto, como se describe en la presente memoria, las formulaciones de liberacion sostenida de una enzima de degradacion de hialuronano se pueden proporcionar para promover la localizacion de la enzima, para proporcionar una alta concentracion de enzima en el sitio diana, p.ej. glandula prostatica, y/o para proporcionar una liberacion prolongada de la enzima en el sitio diana.

En particular, la acumulacion de hialuronano (HA) en el estroma es una caractenstica de la HBP. Por lo tanto, las composiciones que contienen formulaciones de liberacion sostenida, y combinaciones de las mismas, son utiles para el tratamiento de la hiperplasia benigna de prostata (HBP), en particular en hombres con una prostata agrandada. Se encuentra en la presente memoria que las enzimas de degradacion de hialuronano, p.ej., las hialuronidasas, cuando se suministran a la glandula prostatica hipertrofiada, degradan el acido hialuronico que se acumula en el estroma de la glandula hipertrofiada y provocan la apoptosis de las celulas presentes en el estroma de la glandula. El agotamiento del HA en el estroma da como resultado la apoptosis selectiva de las celulas del estroma que son estimuladas por la testosterona, mientras que las celulas normales del estroma no se ven afectadas. La apoptosis de las celulas estromales detiene la expansion del estroma y produce la contraccion de la prostata y reduce o detiene la progresion de la HBP. Por lo tanto, la exposicion de la glandula prostatica hipertrofiada a hialuronidasa da como resultado una disminucion en el tamano de la glandula hipertrofiada y una inhibicion de la proliferacion adicional. En particular, el efecto de las enzimas de degradacion de hialuronano es selectivo para las celulas del estroma estimuladas por la testosterona, y no provoca la apoptosis de la celula epitelial que podna dar lugar a resultados indeseables como la disfuncion organica. Por lo tanto, el uso de enzimas de degradacion de hialuronano es seguro y no esta asociado con efectos secundarios relacionados con los tejidos.

Para el tratamiento de la HBP, las formulaciones de liberacion sostenida que contienen una enzima de degradacion de hialuronano, tal como hialuronidasa, pueden inyectarse directamente en la glandula prostatica. La composicion enzimatica de degradacion de hialuronano se puede formular como deposito para ser liberada durante un periodo de tiempo prolongado una vez introducido en la prostata. Tales metodos de administracion son beneficiosos ya que reducen los efectos secundarios al minimizar la exposicion de tejidos y organos distintos de la prostata a estos agentes, permiten a los agentes terapeuticos alcanzar una alta concentracion local y prolongar el tiempo que la prostata y las celulas y tejidos circundantes estan expuestos a los agentes terapeuticos.

El uso de enzimas de degradacion de hialuronano representa un metodo previamente no reconocido para tratar la HBP. Este efecto de las enzimas de degradacion de hialuronano en la prostata hipertrofiada es distinto de su uso como agente dispersante. Por ejemplo, los usos conocidos de las enzimas de degradacion de hialuronano incluyen el uso como agentes dispersantes para potenciar el efecto de un agente terapeutico facilitando el acceso del agente terapeutico a su diana.

El tratamiento de la HBP con enzimas de degradacion de hialuronano muestra propiedades eficaces que no muestran los tratamientos existentes de la HBP. Por ejemplo, los tratamientos existentes que utilizan bloqueadores alfa o inhibidores de la 5-alfa-reductasa tienen limitaciones. Si bien los bloqueadores alfa, como la finasterida, alivian los smtomas, no reducen el tamano de la prostata o la progresion del impacto. Ademas, aunque los inhibidores de la 5-alfa-reductasa reducen la prostata, pueden tardar mas de 6 meses en funcionar, los pacientes pueden llegar a ser refractarios y los efectos secundarios sexuales son comunes. Adicionalmente, otros metodos de tratamiento de la HBP que implican cirugfa, como la reseccion transuretral de la prostata (RTUP) u otras intervenciones quirurgicas, estan asociados con efectos secundarios no deseados que pueden incluir, por ejemplo, la eyaculacion retrograda, la infeccion y el estrechamiento uretral. Por el contrario, el tratamiento de la HBP con enzimas de degradacion de hialuronano, por ejemplo hialuronidasa tal como PH20, da como resultado una reduccion rapida del volumen prostatico, sin efectos sexuales secundarios y sin efectos secundarios asociados con la cirugfa.

En algunos ejemplos, la composicion o las formulaciones que contienen una enzima de degradacion de hialuronano se pueden combinar en tratamientos combinados con uno o mas agentes distintos utiles para el tratamiento de la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

hiperplasia benigna de prostata. Tales otros agentes incluyen, pero no se limitan a, antiandrogenos, agentes bloqueadores alfa, toxina botulmica y cualquier otro tipo de agente util para el tratamiento de la HBP. Los otros agentes se pueden administrar por separado o se pueden coadministrar en una formulacion de liberacion sostenida con una enzima de degradacion de hialuronano. La combinacion de hialuronidasa como agente terapeutico para la HBP y otros agentes terapeuticos de la HBP complementarios puede dar como resultado una mejor capacidad para reducir el tamano de la glandula hipertrofiada durante un penodo de tiempo prolongado, alcanzando potencialmente de ese modo un mayor efecto terapeutico que el observado cuando se utiliza un agente terapeutico solo.

Las secciones siguientes proporcionan una descripcion no limitante de las enzimas de degradacion de hialuronano, las formulaciones de liberacion sostenida, los tratamientos combinados y el metodo y los usos de estos, por ejemplo, para tratar la HBP.

C. ENZIMAS DE DEGRADACION DE HIALURONANO

Se proporcionan en la presente memoria composiciones y formulaciones que contienen enzimas de degradacion de hialuronano, incluyendo formulaciones de liberacion sostenida o controlada. Las composiciones que contienen formulaciones de liberacion sostenida se pueden utilizar en inyecciones locales para evitar la acumulacion de HA asociada con la enfermedad. Por ejemplo, tales composiciones y formulaciones se pueden utilizar en metodos para el tratamiento de la hiperplasia benigna de prostata degradando el HA asociado al estroma. Las enzimas de degradacion de hialuronano, tales como hialuronidasas, pueden ser utilizadas como agentes terapeuticos para la HBP para reducir el tamano del tejido prostatico hipertrofiado y tambien para prevenir una proliferacion adicional.

El hialuronano, tambien llamado acido hialuronico o hialuronato, es un glicosaminoglicano no sulfatado que esta ampliamente distribuido a lo largo de los tejidos conectivos, epiteliales y neurales. El hialuronano es un componente esencial de la matriz extracelular y un componente importante de la barrera intersticial. Mediante la catalisis de la hidrolisis del hialuronano, las enzimas de degradacion de hialuronano disminuyen la viscosidad del hialuronano, aumentando asf la permeabilidad del tejido y aumentando la tasa de absorcion de los fluidos administrados por via parenteral. Como tales, las enzimas de degradacion de hialuronano, tales como las hialuronidasas, se han utilizado, por ejemplo, como agentes de propagacion o dispersion junto con otros agentes, farmacos y protemas para mejorar su dispersion y suministro. Las enzimas que degradan el hialuronano tambien se utilizan como coadyuvantes para aumentar la absorcion y dispersion de otros farmacos inyectados, para la hipodermoclisis (administracion subcutanea de fluidos) y como un complemento en la urograffa subcutanea para mejorar la reabsorcion de agentes radiopacos. Las enzimas que degradan el hialuronano, por ejemplo, la hialuronidasa, se pueden utilizar en aplicaciones de procedimientos oftalmicos, por ejemplo, bloqueo peribulbar y sub-Tenon en anestesia local antes de la cirugfa oftalmica. La hialuronidasa tambien se puede utilizar en otros usos terapeuticos y cosmeticos, por ejemplo, promoviendo la acinesia en la cirugfa estetica, tales como las blefaroplastias y las elevaciones faciales.

Las enzimas de degradacion de hialuronano actuan para degradar el hialuronano mediante la escision de los polfmeros de hialuronano, que estan compuestos por unidades repetitivas de disacaridos, acido D-glucuronico (GlcA) y N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) unidos entre sf por enlaces glucosfdicos (3-1 —^ 4 y p-1 — 3. Las cadenas de hialuronano pueden alcanzar aproximadamente 25.000 repeticiones de disacaridos o mas de longitud y los polfmeros de hialuronano pueden tener un tamano que vana de aproximadamente 5.000 a 20.000.000 Da in vivo. Por consiguiente, las enzimas de degradacion de hialuronano en las formulaciones de la presente memoria incluyen cualquier enzima que tenga la capacidad de catalizar la escision de una cadena o polfmero de disacarido de hialuronano. En algunos ejemplos, la enzima de degradacion de hialuronano escinde el enlace glicosfdico p-1 — 4 en la cadena o polfmero de hialuronano. En otros ejemplos, la enzima de degradacion de hialuronano cataliza la escision del enlace glicosfdico p-1— 3 en la cadena o polfmero de hialuronano.

Las enzimas de degradacion de hialuronano para su uso en las formulaciones, metodos y combinaciones de la presente memoria incluyen, por ejemplo, hialuronidasas y condroidasasas, y formas solubles de las mismas que carecen de todo o una parte de un ancla a GPI y son secretadas a partir de celulas. A continuacion se proporciona una descripcion de varias enzimas de degradacion de hialuronano. Se entiende que cualquier enzima de degradacion de hialuronano que degrada o escinde HA, y en particular cualquiera que degrada el acido hialuronico que se acumula en el estroma de la glandula prostatica hipertrofiada, se puede utilizar en las formulaciones y metodos de la presente memoria. En particular, la enzima de degradacion de hialuronano es una PH20, tal como una PH20 humana y en particular una PH20 truncada en el extremo C-terminal. Cuando los metodos y usos proporcionados en la presente memoria describen el uso de una hialuronidasa soluble, en consecuencia cualquier enzima de degradacion de hialuronano, generalmente se puede utilizar una enzima de degradacion de hialuronano soluble. Se entiende que cualquier hialuronidasa se puede utilizar en los metodos y usos proporcionados en la presente memoria (veanse, p.ej., las Publicaciones de Estados Unidos Num. US20040268425 y US20100143457).

En particular, la enzima de degradacion de hialuronano es una enzima soluble que se secreta de las celulas tras la expresion. Por ejemplo, las enzimas ilustrativas de degradacion de hialuronano proporcionadas en la presente memoria contienen truncamientos C-terminales para eliminartoda o parte del ancla a GPI. En ejemplos particulares,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

la enzima de degradacion de hialuronano es una enzima PH20. La enzima de degradacion de hialuronano tambien se puede modificar adicionalmente, por ejemplo, para prolongar adicionalmente su semivida.

^picamente, para su uso en las composiciones, formulaciones, combinaciones y metodos de la presente memoria, se utiliza una enzima de degradacion de hialuronano humano soluble, tal como PH20 humana soluble. Aunque se pueden utilizar enzimas de degradacion de hialauronano, tales como PH20, de otros animales, tales preparaciones son potencialmente inmunogenicas, ya que son protemas animales. Por ejemplo, una proporcion significativa de pacientes manifiestan una sensibilizacion previa secundaria a los alimentos ingeridos, y como estos son protemas animales, todos los pacientes tienen un riesgo de sensibilizacion posterior. Por lo tanto, las preparaciones no humanas pueden no ser adecuadas para uso cronico. Si se desean preparaciones no humanas, se contempla en la presente memoria que tales polipeptidos se pueden preparar para que tengan una inmunogenicidad reducida. Tales modificaciones estan dentro del nivel de un experto en la tecnica y pueden incluir, por ejemplo, la eliminacion y/o la sustitucion de uno o mas epttopos antigenicos sobre la molecula.

Las enzimas de degradacion del hialuronano, incluidas las hialuronidasas (p.ej, PH20), utilizadas en los metodos de la presente memoria se pueden de forma recombinante o se pueden purificar o purificar parcialmente a partir de fuentes naturales, tales como, por ejemplo, a partir de extractos de testmulos. En la presente memoria se proporcionan metodos para la produccion de protemas recombinantes, incluyendo enzimas de degradacion de hialuronano recombinantes, y son bien conocidos en la tecnica.

Si se requiere glicosilacion de una hialuronidasa para la actividad, generalmente se producen enzimas de degradacion de hialuronano utilizando sistemas de expresion de protemas que facilitan la N-glicosilacion correcta para asegurar que el polipeptido conserva la actividad. Por ejemplo, la glicosilacion es importante para la actividad catalftica y la estabilidad de las hialuronidasas tales como PH20 humana. Tales celulas incluyen, por ejemplo, celulas de ovario de hamster chino (CHO) ('p.ej. celulas CHO DG44).

1. Hialuronidasas

Las hialuronidasas son miembros de una gran familia de enzimas de degradacion de hialuronano. Existen tres clases generales de hialuronidasas: hialuronidasas detipo mairnfero, hialuronidasas bacterianas e hialuronidasas de sanguijuelas, otros parasitos y crustaceos. Tales enzimas se pueden utilizar en las composiciones, formulaciones, combinaciones y metodos proporcionados.

a. Hialuronidasas de tipo mamifero

Las hialuronidasas de tipo mamffero (EC 3.2.1.35) son endo-S-W-acetil-hexosaminidasas que hidrolizan el enlace glucosfdico p-1^ 4 del hialuronano en varias longitudes de oligosacaridos tales como tetrasacaridos y hexasacaridos. Estas enzimas tienen actividades tanto hidrolfticas como transglicosidasa, y pueden degradar hialuronano y sulfatos de condroitina (CS), generalmente C4-S y C6-S. Las hialuronidasas de este tipo incluyen, pero no se limitan a, hialuronidasas de vaca (bovinas) (SEQ ID NO: 10, 11 y 64 y BH55U.S. Patentes de Estados Unidos Num. 5.747.027 y 5.827.721), ovejas (ovis aries) (SEQ ID NO: 26, 27, 63 y 65), avispa amarilla (SEQ ID NO: 12 y 13), abeja de miel (SeQ ID NO: 14), avispa de cara blanca (SEQ ID NO: 15), avispa de papel (SeQ ID NO: 16), raton (SEQ ID NO: 17-19, 32), cerdo (SEQ ID NO: 20-21), rata, (SEQ ID NO: 22-24, 31), conejo (SEQ ID NO: 25), orangutan (SEQ ID NO: 28), mono cynomolgus (SEQ ID NO: 29), conejillo de indias (SEQ ID nO: 30), chimpance (SEQ ID NO: 101), mono rhesus (SEQ ID NO: 102), y hialuronidasas humanas. Los ejemplos de hialuronidasas en las composiciones, combinaciones y metodos proporcionados en la presente memoria son las hialuronidasas solubles.

Las hialuronidasas de mamfferos pueden subdividirse adicionalmente en aquellas que son activas en condiciones neutras, predominantemente encontradas en extractos de testmulos, y las que son activas en condiciones acidas, predominantemente encontradas en organos como el hfgado. Las hialuronidasas activas en condiciones neutras ilustrativas incluyen PH20, incluyendo pero no limitadas a, PH20 derivada de diferentes especies tales como ovidos (SEQ ID NO: 27), bovidos (SEQ ID nO: 11) y seres humanos (SEQ ID NO: 1). La PH20 humana (tambien conocida como SPAM1 o protema de superficie del espermatozoide PH20), esta anclada generalmente a la membrana plasmatica a traves de un ancla de glicosilfosfatidil inositol (GPI). Esta naturalmente implicada en la adherencia del espermatozoide-ovulo y ayuda a la penetracion por el espermatozoide de la capa de celulas del cumulus por digestion del acido hialuronico.

Ademas de la PH20 humana (tambien denominada SPAM1), se han identificado cinco genes de tipo hialuronidasa en el genoma humano, HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4 y HYALP1. HYALP1 es un pseudogen, y no se ha demostrado que HYAL3 (SEQ ID NO: 38) posea actividad enzimatica hacia ningun sustrato conocido. HYAL4 (polipeptido precursor expuesto en el SEQ ID NO: 39) es una condroitinasa y muestra poca actividad hacia el hialuronano. HYAL1 (polipeptido precursor expuesto en el SEQ ID NO: 36) es la enzima prototipo activa en condiciones acidas y PH20 (polipeptido precursor expuesto en el SEQ ID NO: 1) es la enzima prototipo activa en

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

condiciones neutras. Las hialuronidasas activas en condiciones acidas, tales como HYAL1 y HYAL2 (polipeptido precursor expuesto en el SEQ ID NO: 37) generalmente carecen de actividad catalttica a pH neutro (es dear pH 7). Por ejemplo, HYAL1 tiene poca actividad catalftica in vitro por encima de pH 4,5 (Frost et al. (1997) Anal. Biochem. 251: 263-269). HYAL2 es una enzima activa en condiciones acidas con una actividad espedfica muy baja in vitro. Las enzimas de tipo hialuronidasa tambien se pueden caracterizar por aquellas que estan generalmente ancladas a la membrana plasmatica a traves de un ancla de glicosilfosfatidil-inositol (GPI) tal como HYAL2 humana y PH20 humana (Danilkovitch-Miagkova, et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100(8):4580-5), y las que son generalmente solubles tales como HYAL1 humana (Frost et al. (1997) Biochem Biophys Res Commun. 236(1):10- 5).

i. PH20

La PH20, al igual que otras hialuronidasas de mairnferos, es una endo-p-N-acetil-hexosaminidasa que hidroliza el enlace glicosfdico p1-4 del acido hialuronico en varias longitudes de oligosacaridos tales como tetrasacaridos y hexasacaridos. Tienen actividades tanto hidrolftica como transglicosidasa y pueden degradar el acido hialuronico y los sulfatos de condroitina, tales como C4-S y C6-S. La PH20 esta naturalmente involucrado en la adherencia espermatozoide-ovulo y ayuda a la penetracion de espermatozoides en la capa de celulas del cumulus mediante la digestion del acido hialuronico. La PH20 se localiza sobre la superficie del espermatozoide, y en el acrosoma derivado del lisosoma, donde esta unido a la membrana acrosomal interna. La PH20 de la membrana plasmatica tiene actividad hialuronidasa solo a pH neutro, mientras que la PH20 de la membrana acrosomal interna tiene actividad tanto a pH neutro como acido. Ademas de ser una hialuronidasa, la PH20 tambien parece ser un receptor para la senalizacion celular inducida por HA, y un receptor para la zona pelucida que rodea al ovocito.

Las protemas PH20 ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, los polipeptidos de pH20 de ser humano (polipeptido precursor expuesto en el SEQ ID NO: 1, polipeptido maduro expuesto en el SEQ ID NO: 2), de chimpance (SEQ ID NO: 101), de mono Rhesus (SEQ ID NO: 102) de bovido (SEQ ID NO: 11 y 64), de conejo (SEQ ID NO: 25), PH20 de ovido (SEQ ID NO: 27, 63 y 65), de mono Cynomolgus (SEQ ID NO: 29), de cobaya (SEQ ID NO: 30), de rata (SEQ ID NO: 31) y de raton (SEQ ID NO: 32).

La PH20 bovina es un polipeptido precursor de 553 aminoacidos (SEQ ID NO: 11). El alineamiento de la PH20 bovina con la PH20 humana muestra solamente una homologfa debil, con multiples huecos existentes desde el aminoacido 470 hasta los respectivos extremos carboxi debido a la ausencia de un ancla a GPI en el polipeptido bovino (vease p.ej., Frost GI (2007) Expert Opin. Drug. Deliv. 4:427-440). De hecho, las anclas claras de GPI no se pronostican en muchas otras especies de pH20 ademas de la de ser humano. De este modo, los polipeptidos de PH20 producidos a partir de ovidos y bovidos existen naturalmente como formas solubles. Aunque la PH20 bovina existe anclada muy laxamente a la membrana plasmatica, no esta anclada a traves de un ancla sensible a la fosfolipasa (Lalancette et al. (2001) Biol Reprod. 65(2): 628-36).

La estructura de la hialuronidasa bovina ha permitido el uso de la enzima hialuronidasa de testfculos bovinos soluble como un extracto para uso clmico (Wydase®, Hyalase®). Otras preparaciones de hialuronidasa PH20 derivadas de animales incluyen Vitrase® (ISTA Pharmaceuticals), una hialuronidasa testicular ovina purificada, Amphadase® (Amphastar Pharmaceuticals), una hialuronidasa testicular bovina e Hydase (Akorn), una hialuronidasa testicular bovina.

ii. PH20 humana

El transcrito de ARNm de PH20 humana se traduce normalmente para generar un polipeptido precursor de 509 aminoacidos (SEQ ID NO: 1) que contiene una secuencia senal de 35 aminoacidos en el extremo N (posiciones 1-35 de residuos de aminoacidos) y un anclaje de ancla de glucosilfosfatidilinositol de 19 aminoacidos (GPI) en el extremo C (posiciones 491 - 509 de residuos de aminoacidos). La PH20 madura es, por lo tanto, un polipeptido de 474 aminoacidos expuesto en el SEQ ID NO: 2. Tras el transporte del polipeptido precursor al RE y la eliminacion del peptido senal, el peptido senal de anclaje a GPI C-terminal se escinde para facilitar la union covalente de un ancla de GPI al aminoacido C-terminal recien formado en la posicion de aminoacido correspondiente a la posicion 490 del polipeptido precursor expuesto en el SEQ ID NO: 1. De este modo, se produce un polipeptido maduro anclado a GPI de 474 aminoacidos con una secuencia de aminoacidos expuesta en el SEQ ID NO: 2.

La PH20 humana muestra actividad hialuronidasa tanto a pH neutro como acido. En un aspecto, la PH20 humana es la hialuronidasa activa en condiciones neutras prototipo que esta generalmente trabada a la membrana plasmatica a traves de un ancla de GPI. En otro aspecto, la PH20 se expresa en la membrana acrosomal interna donde tiene actividad de hialuronidasa tanto a pH neutro como acido. Parece que la PH20 contiene dos sitios cataltticos en regiones distintas del polipeptido: las regiones del Peptido 1 y del Peptido 3 (Cherr et al., (2001) Matrix Biology 20: 515-525). La evidencia sugiere que la region del Peptido 1 de PH20, que corresponde a las posiciones de aminoacidos 107-137 del polipeptido maduro expuesto en el SEQ ID NO: 2 y las posiciones 142-172 del polipeptido precursor expuesto en el SeQ ID NO: 1, es necesaria para la actividad enzimatica a pH neutro. Los aminoacidos en las posiciones 111 y 113 (correspondientes al polipeptido PH20 maduro expuesto en el SEQ ID NO: 2) dentro de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

esta region parecen ser importantes para la actividad, ya que la mutagenesis por sustitucion de aminoacidos da lugar a polipeptidos de PH20 con una actividad hialuronidasa de 3% o una actividad hialuronidasa indectable, respectivamente, en comparacion con la PH20 detipo salvaje (Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247: 810-814).

La region del Peptido 3, que corresponde a las posiciones de aminoacidos 242 - 262 del polipeptido maduro expuesto en el sEq ID NO: 2, y las posiciones 277 - 297 del polipeptido precursor expuesto en el SEQ ID NO: 1, parece ser importante para Actividad enzimatica a pH acido. Dentro de esta region, los aminoacidos en las posiciones 249 y 252 del polipeptido PH20 maduro parecen ser esenciales para la actividad, y la mutagenesis de cualquiera de los dos resulta en un polipeptido esencialmente desprovisto de actividad (Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247: 810-814).

Ademas de los sitios cataltticos, la PH20 tambien contiene un sitio de union al hialuronano. La evidencia experimental sugiere que este sitio esta localizado en la region del Peptido 2, que corresponde a las posiciones de aminoacidos 205-235 del polipeptido precursor expuesto en el SEQ ID NO: 1 y las posiciones 170-200 del polipeptido maduro expuesto en el SEQ ID NO: 2. Esta region esta altamente conservada entre las hialuronidasas y es similar al motivo de union a la heparina. La mutacion del residuo de arginina en la posicion 176 (correspondiente al polipeptido de PH20 maduro expuesto en el SEQ ID NO: 2) a glicina da como resultado un polipeptido con solo aproximadamente 1% de la actividad hialuronidasa del polipeptido de tipo salvaje (Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247: 810-814).

Existen siete sitios potenciales de glicosilacion unida a N en la PH20 humana en N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 del polipeptido ilustrado en el SEQ ID NO: 1. Dado que los aminoacidos 36 a 464 del SEQ ID NO: 1 parecen contener el dominio hialuronidasa de PH20 humana mmimamente activa, no se requiere el sitio de glicosilacion ligada a N-490 para la actividad hialuronidasa apropiada. Hay seis enlaces disulfuro en la PH20 humana. Dos enlaces disulfuro entre los residuos de cistema C60 y C351 y entre C224 y C238 del polipeptido ilustrado en el SEQ ID NO: 1 (correspondientes a los residuos C25 y C316 y C189 y C203 del polipeptido maduro expuesto en el SEQ ID NO: 2, respectivamente). Se forman otros cuatro enlaces disulfuro entre los residuos de cistema C376 y C387; entre C381 y C435; entre C437 y C443; y entre C458 y C464 del polipeptido ilustrado en el SEQ ID NO: 1 (correspondiente a los residuos C341 y C352, entre C346 y C400; entre C402 y C408; y entre C423 y C429 del polipeptido maduro expuesto en el SEQ ID NO: 2, respectivamente).

A diferencia de la mayona de las preparaciones animales de PH20, la PH20 humana contiene un ancla de GPI que ancla la protema expresada a la membrana celular. Tfpicamente, las preparaciones terapeuticas de PH20 humana se proporcionan como polipeptidos que carecen de residuos de aminoacidos C-terminales. A continuacion se describen hialuronidasas solubles ilustrativas, incluyendo hialuronidasas PH20 solubles. Las preparaciones de PH20 humana incluyen Tecnologfa Hylenex® y Enhanze™.

b. Hialuronidasas bacterianas

Las hialuronidasas bacterianas (EC 4.2.2.1 o EC 4.2.99.1) degradan el hialuronano y, en mayor o menor medida, los sulfatos de condroitina y los dermatan sulfatos. Las liasas de hialuronano aisladas de las bacterias difieren de las hialuronidasas (de otras fuentes, p.ej., hialuronoglucosaminidasas, EC 3.2.1.35) por su modo de accion. Son endo-p- N-acetilhexosaminidasas que catalizan una reaccion de eliminacion, en lugar de hidrolisis, del enlace p1 —^4- glicosfdico entre N-acetil-beta-D-glucosamina y residuos de acido D-glucuronico en el hialuronano, proporcionando 3-(4-desoxi-p-D-gluc-4-enuronosil)-N-acetil-D-glucosamina, y productos disacaridos finales. La reaccion da lugar a la formacion de oligosacaridos con residuos de acido hexuronico insaturados en sus extremos no reductores.

Las hialuronidasas de bacterias ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, enzimas de degradacion de hialuronano en microorganismos, incluyendo cepas de Arthrobacter, Bdellovibrio, Clostridium, Micrococcus, Streptococcus, Peptococcus, Propionibacterium, Bacteroides, y Streptomyces. Los ejemplos particulares de tales enzimas incluyen, pero no se limitan a, Arthrobacter sp. (cepa FB24) (SEQ ID NO: 67), Bdellovibrio bacteriovorus (SEQ ID NO: 68), Propionibacterium acnes (SEQ ID NO: 69), Streptococcus agalactiae (SEQ ID NO: 70), 18RS21 (SEQ ID NO: 71), serotipo Ia (SEQ ID NO: 72): serotipo III (SEQ ID NO: 73)), Staphylococcus aureus (cepa COL (SEQ ID NO: 74), cepa MRSA252 (SEQ ID NO: 75 y 76), cepa MSSA476 (SEQ ID NO: 77), cepa NCTC 8325 (SEQ ID NO: 78), cepa bovina RF122 (SEQ ID NO: 79 y 80), cepa USA300 (SEQ ID NO: 81)), Streptococus pneumoniae (SEQ ID NO: 82), cepa ATCC BAA-255/R6 (SEQ ID NO: 83), serotipo 2, cepa D39/NCTC 7466 (SEQ ID NO: 84)), Streptococcus pyogenes(Serotipo M1) (SEQ ID NO: 85), serotipo M2, cepa MGAS10270 (SEQ ID NO: 86), serotipo M4, cepa MGAS10750 (SEQ ID NO: 87), serotipo M6 (SEQ ID NO: 88), serotipo M12, cepa MGAS2096 (SEQ ID NO: 89 y 90), serotipo M12, cepa MGAS9429 (SEQ ID NO: 91), serotipo M28 (SEQ ID NO: 92)); Streptococcus suis (SEQ iD NO: 93-95); Vibrio fischeri (cepa AtCc 700601/ES 114 (SEQ ID nO: 96)), y la enzima hialuronidasa de Streptomyces hyaluronolyticus, que es espedfica para el acido hialuronico y no escinde condroitina ni sulfato de condroitina (Ohya, T. y Kaneko, Y. (1970) Biochim. Biophys. Acta 198: 607).

c. Hialuronidasas de sanguijuelas, otros parasitos y crustaceos

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Las hialuronidasas de sanguijuelas, otros parasitos y crustaceos (EC 3.2.1.36) son endo-p-glucuronidasas que generan productos finales de tetra y hexasacarido. Estas enzimas catalizan la hidrolisis de los enlaces 1^-3 entre el p-D-glucuronato y los residuos de N-acetil-D-glucosamina a hialuronato. Las hialuronidasas ilustrativas de sanguijuelas incluyen, pero no se limitan a, hialuronidasa de Hirudinidae (p.ej., Hirudo medicinalis), Erpobdellidae (p.ej., Nephelopsis obscura y Erpobdella punctata), Glossiphoniidae (p.ej., Desserobdella picta, Helobdella stagnalis, Glossiphonia complanata, Placobdella ornata y Theromyzon sp.) y Haemopidae (Haemopis marmorata) (Hovingh et al. (1999) Comp Biochem Physiol Biochem Mol Biol. 124(3): 319-26). Una hialuronidasa ilustrativa de bacterias que tiene el mismo mecanismo de accion que la hialuronidasa de sanguijuela es la de las cianobacterias, Synechococcus sp. (cepa RCC307, SEQ ID No: 97).

2. Otras enzimas de degradacion de hialuronano

Ademas de la familia de la hialuronidasa, se pueden utilizar otras enzimas de degradacion de hialuronano en las composiciones, formulaciones, combinaciones y metodos proporcionados. Por ejemplo, se pueden emplear enzimas, que incluyen condroitinasas y liasas particulares, que tienen la capacidad de escindir el hialuronano. Las condroitinasas ilustrativas que pueden degradar el hialuronano incluyen, aunque sin limitacion, condroitina ABC liasa (tambien conocida como condroitinasa ABC), condroitina AC liasa (tambien conocida como condroitina sulfato liasa o condroitina sulfato eliminasa) y condroitina C lasa. Los metodos para la produccion y purificacion de tales enzimas para su uso en las composiciones, formulaciones, combinaciones y metodos proporcionados son conocidos en la tecnica (p.ej., Patente de Estados Unidos Num. 6.054.569; Yamagata, et al. (1968) J. Biol. Chem. 243(7): 15231535; Yang et al. (1985) J. Biol. Chem. 160(30): 1849-1857).

La condroitina ABC liasa contiene dos enzimas, condroitin-sulfato-ABC endoliasa (EC 4.2.2.20) y condroitin-sulfato- ABC exolasa (EC 4.2.2.21) (Hamai et al. (1997) J Biol Chem. 272(14): 9123 - 30), que degradan una variedad de glicosaminoglicanos del tipo condroitin-sulfato y dermatan-sulfato. El sulfato de condroitina, el proteoglicano de condroitin sulfato y el dermatan sulfato son los sustratos preferidos para la condroitin-sulfato-ABC endoliasa, pero la enzima tambien puede actuar sobre hialuronano a una velocidad menor. La condroitin-sulfato-ABC endoliasa degrada una variedad de glicosaminoglicanos del tipo condroitin-sulfato y dermatan-sulfato, produciendo una mezcla de oligosacaridos A4-insaturados de diferentes tamanos que finalmente se degradan a tetra- y di-sacaridos A4 insaturados. La condroitin-sulfato-ABC exoliasa tiene la misma especificidad de sustrato, pero elimina los residuos de disacarido de los extremos no reductores de los condroitin-sulfatos polimericos y sus fragmentos de oligosacaridos producidos por la condroitin-sulfato-ABC endoliasa (Hamai, A. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 91239130). Una condroitin-sulfato-ABC endoliasas y una condroitin-sulfato-ABC exoliasa ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, las de Proteus vulgaris y Flavobacterium heparinum (la condroitin-sulfato-ABC endoliasa de Proteus vulgaris se expone en el SEQ ID NO: 98 (Sato et al. (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41(1): 39 - 46).

La condroitina AC liasa (EC 4.2.2.5) es activa sobre los sulfatos de condroitina A y C, la condroitina y el acido hialuronico, pero no es activa sobre sulfato de dermatan (sulfato de condroitina B). Las enzimas condroitinasa AC ilustrativas de bacterias incluyen, pero no se limitan a, las de Flavobacterium heparinum y Victivallis vadensis, expuestas en los SEQ ID NO: 99 y 100, respectivamente, y Arthrobacter aurescens (Tkalec et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology 66 (1): 29-35; Ernst et al. (1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444). La condroitinasa C separa el sulfato de condroitina C que produce tetrasacarido mas un disacarido 6-sulfatado insaturado (delta Di-6S). Tambien escinde acido hialuronico produciendo disacarido insaturado no sulfatado (delta Di-OS). Las enzimas condroitinasa C ilustrativas de bacterias incluyen, pero no se limitan a, las de Estreptococcus y Flavobacterium (Hlibi et al. (1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2): 121-4; Michelacci et al. (1976) J. Biol. Chem. 251: 1154-8; Tsuda et al. (1999) Eur. J. Biochem. 262: 127-133)

3. Enzimas de degradacion de hialuronano solubles

En ejemplos particulares, las enzimas de degradacion de hialuronano se proporcionan como enzimas solubles que pueden ser secretadas de las celulas tras la expresion. Por lo tanto, las enzimas solubles incluyen enzimas que, cuando se expresan, se secretan al medio celular donde pueden aislarse o purificarse. Como se ha descrito anteriormente, las enzimas de degradacion de hialuronano existen en formas ligadas a la membrana o solubles que son secretadas a partir de celulas. Por lo tanto, cuando las enzimas de degradacion de hialuronano incluyen un ancla a glicosilfosfatidilinositol (GPI) y/o estan ancladas a la membrana de otra manera o son insolubles, tales enzimas de degradacion de hialuronano se proporcionan en la presente memoria en forma soluble por truncamiento o delecion de toda o parte del ancla de GPl para hacer que la enzima sea secretada y soluble. Un experto en la tecnica puede determinar si un polipeptido esta anclado a GPI utilizando metodos bien conocidos en la tecnica. Tales metodos incluyen, pero no se limitan a, el uso de algoritmos conocidos para pronosticar la presencia y localizacion de la secuencia senal de union de anclaje de GPI y el sitio w y realizar analisis de solubilidad antes y despues de la digestion con fosfolipasa C espedfica de fosfatidilinositol (PI-PLC ) o D (PI-PLD). En un ejemplo, la hialuronidasa PH20 humana, que normalmente esta anclada a la membrana a traves de un ancla GPI, puede hacerse soluble por truncamiento y eliminacion de la totalidad o una parte del ancla GPI en el extremo C-terminal.

Las enzimas de degradacion de hialuronano solubles tambien incluyen hialuronidasas activas en condiciones

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

neutras y activas en condiciones acidas. Dependiendo de factores, tales como, pero no limitados a, el nivel deseado de actividad de la enzima despues de la administracion y/o el sitio de administracion, se pueden seleccionar hialuronidasas activas en condiciones neutras y activas en condiciones acidas. En un ejemplo particular, la enzima de degradacion de hialuronano para su uso en las composiciones, combinaciones y metodos de la presente memoria es una hialuronidasa activa en condiciones neutras. Los analisis para la evaluacion de la actividad de la hialuronidasa a diversas condiciones de pH, incluyendo a pH neutro, son bien conocidos por un experto en la tecnica.

Por lo tanto, las enzimas que degradan hialuronano incluyen variantes truncadas, p.ej. variantes truncadas dentro del extremo C del polipeptido para eliminartoda o una porcion de un ancla GPI. Tales enzimas incluyen, pero no se limitan a, hialuronidasas solubles, incluyendo hialuronidasas solubles no humanas, hialuronidasas solubles bacterianas y hialuronidasas humanas, Hyall, PH20 bovina y PH20 ovina, variantes alelicas de las mismas y otras variantes de las mismas. Los ejemplos de hialuronidasas solubles son las PH20 de cualquier especie, tales como cualquiera de las establecidas en cualquiera de los SEQ ID NO: 1, 2, 11, 25, 27-32, 63-65 y 101-102, variantes de las mismas que presentan una identidad de secuencia de al menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% o mas, con cualquiera de los SEQ ID NO: 1, 2, 11, 25, 27-32, 63-65 y 101-102, o formas truncadas de las mismas que carecen de toda o una porcion del ancla GPI C-terminal, siempre y cuando la hialuronidasa se secrete desde las celulas al medio tras la expresion de la misma y conserve la actividad hialuronidasa. La enzima de degradacion de hialuronano soluble proporcionada en la presente memoria se puede truncar dentro del extremo C en al menos o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60 o mas aminoacidos en comparacion con el polipeptido detipo salvaje, siempre que el polipeptido truncado resultante muestre actividad hialuronidasa. Por ejemplo, el dominio de hialuronidasa mmimo de la PH20 humana requerido para la actividad consiste en los aminoacidos 36-464 (vease p.ej. la Patente de los Estados unidos Num. 7.767.429). Asf, en una hialuronidasa PH20 humana, se pueden eliminar al menos 45 aminoacidos del extremo C-terminal. La actividad de la hialuronidasa puede estar entre o aproximadamente 0,5% y 100% de la actividad del polipeptido de partida, por ejemplo, al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 80%, 90% o mas de la actividad de la enzima que degrada hialuronano que contiene el ancla GPI.

En los casos en los que la enzima de degradacion de hialuronano soluble conserva una porcion de la secuencia senal de fijacion del ancla de GPI, se pueden conservar al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o mas residuos de aminoacidos en la secuencia de senal de fijacion del ancla GPI, siempre que el polipeptido se pueda aislar del medio celulartras la expresion, p.ej. anclado laxamente a la membrana celular o secretado desde las celulas al medio tras la expresion del mismo. Los polipeptidos que contienen uno o mas aminoacidos del ancla de GPI se denominan enzimas de degradacion de hialuronano solubles ampliadas (vease, la solicitud de los Estados Unidos publicada Num. 20100143457 para enzimas de degradacion de hialuronano solubles ampliadas).

a. HP20 humana soluble

La HP20 humana soluble es un ejemplo de hialuronidasa soluble. Se han producido formas solubles de PH20 humana recombinante y se pueden utilizar en las composiciones, formulaciones, combinaciones y metodos descritos en la presente memoria. La produccion de tales formas solubles de PH20 se describe en las Solicitudes de Patente de Estados Unidos Num. US20040268425; US 20050260186 y US20060104968 y en la solicitud Internacional PCT Num. WO2009111066.

Los polipeptidos de PH20 humanos truncados en el extremo C ilustrativos proporcionados en la presente memoria incluyen cualquiera que tenga un residuo de aminoacido C-terminal 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 o 500 de la secuencia de aminoacidos expuesta en el SEQ ID NO: 1, o posiciones correspondientes en una variante alelica o de especie del mismo u otra variante. Cuando se expresa en celulas de mairnfero, la secuencia senal N - terminal de 35 aminoacidos se escinde durante el procesamiento, y la forma madura de la protema es secretada. Por lo tanto, los polipeptidos de PH20 solubles truncados en el extremo C maduros ilustrativos pueden contener los aminoacidos 36 a 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 o 500 de la secuencia de aminoacidos expuesta en el SEQ ID NO: 1 o posiciones correspondientes en una variante alelica o de especie del mismo u otras variantes. Por ejemplo, los polipeptidos de PH20 truncados en el extremo C ilustrativos para su uso en las composiciones y formulaciones proporcionadas en la presente invencion son cualquiera que muestre una identidad de secuencia de al menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% o mas con los aminoacidos 36 a 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 o 500 de la secuencia de aminoacidos expuesta en el SEQ ID NO: 1. Se entiende que la variabilidad en los residuos de aminoacidos N- terminales del polipeptido puede existir debido al variado procesamiento del polipeptido en las celulas. Ademas, se puede utilizar una secuencia senal heterologa para alterar o mejorar la expresion del acido nucleico codificante en las celulas.

La Tabla 3 proporciona ejemplos no limitantes de polipeptidos de PH20 ilustrativos truncados en el extremo C, incluyendo polipeptidos de pH20 solubles truncados en el extremo C terminal. En la Tabla 3 a continuacion, se exponen la longitud (en aminoacidos) de los polipeptidos precursores y maduros y el identificador de secuencia (SEQ ID NO) en el que se establecen secuencias de aminoacidos ilustrativas de los polipeptidos precursores y 5 maduros de las protemas PH20 truncadas en el extremo C-terminal. El polipeptido de PH20 de tipo salvaje tambien se incluye en la Tabla 3 para la comparacion. Tales polipeptidos de PH20 ilustrativos truncados en el extremo C incluyen cualquiera de los expuestos en cualquiera de los Sec ID NO: 4-9, 47, 48, 151-170, 185-189, 242, 275 o 276, o un polipeptido que muestra una identidad de secuencia de al menos 85% 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% o mas con cualquiera de los SEQ ID NO: 4-9, 47, 48, 151-170, 185-189, 242, 275 o 276.

10

En particular, son ejemplos de tales polipeptidos los generados a partir de una molecula de acido nucleico que codifica los aminoacidos 1-482 del SEQ ID NO: 1 (expuestos en el SEQ ID NO: 3). Tal molecula de acido nucleico ilustrativa se expone en el SEQ ID NO: 49. El procesamiento postraduccional elimina la secuencia senal de 35 aminoacidos, dejando una PH20 humana recombinante soluble de 447 aminoacidos (SEQ ID NO: 4). Tal como se

15 produce en el medio de cultivo hay heterogeneidad en el extremo C de manera que el producto, designado rHuPH20, incluye una mezcla de especies que pueden incluir uno o mas de los SEQ ID NO: 4-9 en diversas abundancias. Tfpicamente, rHuPH20 se produce en celulas que facilitan la N-glicosilacion correcta para conservar la actividad, tales como celulas CHO (p.ej. celulas CHO DG44).

Tabla 3. Polipeptidos de PH20 truncados en el extremo C ilustrativos

Polipeptido

Precursor (aminoacidos) Precursor SEQ ID NO Maduro (aminoacidos) SEQ ID NO.

tipo salvaje

509 1 474 2

SPAM1-SILF

500 231 465 275

SPAM-VSIL

499 198 464 242

SPAM1-IVSI

498 232 463 276

SPAM1-FIVS

497 107 462 151

SPAM1-MFIV

496 141 461 185

SPAM1-TMFI

495 108 460 152

SPAM1-ATMF

494 142 459 186

SPAM1-SATM

493 109 458 153

SPAM1-LSAT

492 143 457 187

SPAM1-TLSA

491 110 456 154

SPAM1-PSTL

489 111 454 155

SPAM1-SPST

488 144 453 188

SPAM1-STLS

490 112 455 156

SPAM1-ASPS

487 113 452 157

SPAM1-NASP

486 145 451 189

SPAM1-YNAS

485 114 450 158

SPAM1-FYNA

484 115 449 159

SPAM1-IFYN

483 46 448 48

SPAM1-QIFY

482 3 447 4

SPAM1-PQIF

481 45 446 5

SPAM1-EPQI

480 44 445 6

SPAM1-EEPQ

479 43 444 7

SPAM1-TEEP

478 42 443 8

SPAM1-ETEE

477 41 442 9

SPAM 1-METE

476 116 441 160

5

10

15

20

25

30

35

40

Tabla 3. Polipeptidos de PH20 truncados en el extremo C ilustrativos

Polipeptido

Precursor (aminoacidos) Precursor SEQ ID NO Maduro (aminoacidos) SEQ ID NO.

SPAM1-PMET

475 117 440 161

SPAM1-PPME

474 118 439 162

SPAM1-KPPM

473 119 438 163

SPAM1-LKPP

472 120 437 164

SPAM1-FLKP

471 121 436 165

SPAM1-AFLK

470 122 435 166

SPAM1-DAFL

469 123 434 167

SPAM1-IDAF

468 124 433 168

SPAM1-CIDA

467 40 432 47

SPAM1-VCID

466 125 431 169

SPAM1-GVCI

465 126 430 170

4. Enzimas de degradacion de hialuronano variantes

Las enzimas de degradacion de hialuronano que se proporcionan en la presente memoria tambien incluyen variantes alelicas o de especies u otras variantes de una enzima de degradacion de hialuronano. Por ejemplo, las enzimas de degradacion de hialuronano pueden contener una o mas variaciones en su secuencia primaria, tales como sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoacidos. Una variante de una enzima de degradacion de hialuronano generalmente muestra una identidad de secuencia de al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% o mas en comparacion con la enzima de degradacion de hialuronano que no contiene la variacion. Para los propositos de la presente memoria se puede incluir cualquier variacion en la enzima de degradacion de hialuronano, siempre que la enzima conserve la actividad de hialuronidasa, tal como al menos o aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o mas de la actividad de una enzima de degradacion de hialuronano que no contiene la variacion (medida mediante analisis in vitro y/o en vivo bien conocidos en la tecnica).

Por ejemplo, tambien se incluyen entre las enzimas de degradacion de haluronano variantes alelicas u otras variantes de cualquiera de los SEC ID NO: 1, 2, 11, 25, 27-32, 63-65 y 101-102, o formas truncadas de las mismas. Las variantes alelicas y otras variantes incluyen polipeptidos que tienen una identidad de secuencia de 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%. 98% o mas con cualquiera de los SEQ ID NO: 1, 2, 11, 25, 27 - 32, 63 - 65 y 101 - 102, o formas truncadas de los mismos. Las variantes de aminoacidos incluyen mutaciones conservativas y no conservativas. Se entiende que los residuos que son importantes o necesarios de otro modo para la actividad de una hialuronidasa, tal como cualquiera de los descritos anteriormente o conocidos en la tecnica, son generalmente invariantes y no pueden ser cambiados. Estos incluyen, por ejemplo, los residuos del sitio activo. Asf, por ejemplo, los residuos de aminoacidos 111, 113 y 176 (correspondientes a residuos en el polipeptido de PH20 maduro expuesto en el SEQ ID NO: 2) de un polipeptido de PH20 humano, o forma soluble del mismo, son generalmente invariantes y no se alteran. Otros residuos que confieren glicosilacion y formacion de enlaces disulfuro necesarios para el plegado adecuado tambien pueden ser invariantes.

5. Glicosilacion de enzimas de degradacion de hialuronano

La glicosilacion, incluyendo la glicosilacion unida a N y O, de algunas enzimas de degradacion de hialuronano, incluyendo las hialuronidasas, puede ser importante para su actividad catalftica y su estabilidad. Aunque la alteracion del tipo de glicano que modifica una glicoprotema puede tener efectos notables sobre la antigenicidad, el plegamiento estructural, la solubilidad y la estabilidad de una protema, se cree que la mayona de las enzimas no requieren glicosilacion para una actividad enzimatica optima. Para algunas hialuronidasas, la eliminacion de la glicosilacion unida a N puede dar como resultado una inactivacion casi completa de la actividad hialuronidasa. Asf, para tales hialuronidasas, la presencia de glicanos ligados a N es cntica para generar una enzima activa.

Los oligosacaridos ligados a N se dividen en varios tipos principales (oligomanosa, complejos, hforidos, sulfatados), todos los cuales tienen nucleos (Man) 3-GlcNAc-GlcNAc- unidos mediante el nitrogeno amfdico de los residuos de Asn que caen dentro de las secuencias -Asn-Xaa-Thr/Ser- (donde Xaa no es Pro). Se ha informado de una glicosilacion en el sitio -Asn-Xaa-Cys- para la protema C de coagulacion. En algunos casos, una enzima de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

degradacion de hialuronano, tal como una hialuronidasa, puede contener enlaces tanto N-glicosfdicos como O- glicos^dicos. Por ejemplo, la PH20 tiene oligosacaridos unidos a O asf como oligosacaridos ligados a N. Existen siete sitios potenciales de glicosilacion unida a N en N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 de la PH20 humana ilustrada en el SEQ ID NO: 1. Los residuos de aminoacidos N82, N166 y N254 estan ocupados por glicanos de tipo complejo, mientras que los residuos de aminoacidos N368 y N393 estan ocupados por glicanos de alto contenido de manosa. El residuo de aminoacido N235 esta ocupado por aproximadamente 80% de glicanos de tipo alto contenido de manosa y 20% de glicanos de tipo complejo. Como se ha indicado anteriormente, la glicosilacion unida a N en N490 no es necesaria para la actividad hialuronidasa.

En algunos ejemplos, las enzimas de degradacion de hialuronano para su uso en las composiciones, formulaciones, combinaciones y/o metodos proporcionados son glicosiladas en uno o en todos los sitios de glicosilacion. Por ejemplo, para PH20 humana, o una forma soluble de la misma, estan glicosilados 2, 3, 4, 5 o 6 de los sitios de N- glicosilacion correspondientes a los aminoacidos N82, N166, N235, N254, N368 y N393 del SEQ ID NO: 1. En algunos ejemplos, las enzimas de degradacion de hialuronano estan glicosiladas en uno o mas sitios de glicosilacion nativos. En otros ejemplos, las enzimas de degradacion de hialuronano se modifican en uno o mas sitios de glicosilacion no nativos para conferir la glicosilacion del polipeptido a uno o mas sitios adicionales. En tales ejemplos, el anclaje de radicales de azucar adicionales puede mejorar las propiedades farmacocineticas de la molecula, tales como una mejor semivida y/o una mejor actividad.

En otros ejemplos, las enzimas de degradacion de hialuronano para su uso en las composiciones, formulaciones, combinaciones y/o metodos proporcionados en la presente memoria estan parcialmente desglicosiladas (o polipeptidos parcialmente N-glicosilados). Las glicosidasas o glicosido hidrolasas son enzimas que catalizan la hidrolisis del enlace glicosfdico para generar dos azucares mas pequenos. Los principales tipos de N-glicanos en los vertebrados incluyen glicanos de alto contenido de manosa, glicanos tubridos y glicanos complejos. Existen glicosidasas que dan como resultado solo una desglicosilacion parcial de protemas, incluyendo: EndoFI, que escinde glicanos de elevado contenido de manosa y de tipo tubrido; EndoF2, que escinde glicanos de tipo complejo biantenario; EndoF3, que escinde glicanos biantenarios y complejos mas ramificados; y EndoH, que escinde glicanos de elevado contenido de manosa y de tipo tubrido. El tratamiento de una enzima de degradacion de hialuronano, tal como una hialuronidasa soluble, tal como una PH20 soluble, con una o todas estas glicosidasas, puede dar lugarsolo a una desglicosilacion parcial y, por tanto, a la conservacion de la actividad hialuronidasa.

Las enzimas de degradacion de hialuronano parcialmente desglicosiladas, tales como las hialuronidasas solubles parcialmente desglicosiladas, se pueden producir por digestion con una o mas glicosidasas, generalmente una glicosidasa que no elimina todos los N-glicanos sino que desglicosila parcialmente la protema. Por ejemplo, el tratamiento de PH20 (p.ej. una PH20 recombinante designada rHuPH20) con una o todas las glicosidasas anteriores (p.ej. EndoFI, EndoF2 y/o EndoF3) da como resultado una desglicosilacion parcial. Estos polipeptidos de PH20 parcialmente desglicosilados pueden mostrar actividad enzimatica de hialuronidasa que es comparable a la de los polipeptidos totalmente glicosilados. Por el contrario, el tratamiento de PH20 con PNGasaF, una glicosidasa que escinde todos los N-glicanos, da como resultado la eliminacion completa de todos los N-glicanos y, por lo tanto, hace que la PH20 sea enzimaticamente inactiva. Asf, aunque todos los sitios de glicosilacion unida a N (tales como, por ejemplo, los de los aminoacidos N82, N166, N235, N254, N368 y N393 de PH20 humana, ilustrados en el SEQ ID NO: 1) pueden ser glicosilados, el tratamiento con una o mas glicosidasas puede reducir el grado de glicosilacion en comparacion con una hialuronidasa que no se digiere con una o mas glicosidasas.

Las enzimas de degradacion de hialuronano parcialmente desglicosiladas, que incluyen polipeptidos de PH20 solubles parcialmente desglosilados, pueden tener un 10%, 20%, 30%, 40%, 5o%, 60%, 70% o 80% del nivel de glicosilacion de un polipeptido totalmente glicosilado. En un ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 de los sitios de N-glicosilacion correspondientes a los aminoacidos N82, N166, N235, N254, N368 y N393 del SEQ ID NO: 1 son parcialmente desglicosilados, de manera que ya no contienen glicanos de alto contenido de manosa o de tipo complejo, sino que contienen al menos un radical de N-acetilglucosamina. En algunos ejemplos, 1, 2 o 3 de los sitios de N-glicosilacion correspondientes a los aminoacidos N82, N166 y N254 del SEQ ID NO: 93 son desglicosilados, es decir, no contienen un radical azucar. En otros ejemplos, 3, 4, 5 o 6 de los sitios de N-glicosilacion correspondientes a los aminoacidos N82, N166, N235, N254, N368 y N393 del SEQ ID NO: 1 estan glicosilados. Los residuos de aminoacidos glicosilados contienen mmimamente un residuo de N-acetilglucosamina. Tfpicamente, las enzimas de degradacion de hialuronano parcialmente desglicosiladas, que incluyen polipeptidos de PH20 solubles parcialmente desglicosilados, presentan actividad hialuronidasa que es 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000% o mas de la actividad hialuronidasa mostrada por el polipeptido totalmente glicosilado.

6. Enzimas de degradacion de hialuronano modificadas

En un ejemplo, las composiciones y combinaciones proporcionadas contienen enzimas de degradacion de hialuronano, en particular hialuronidasas solubles, que se han modificado para aumentar la semivida de la enzima de degradacion de hialuronano, por ejemplo, para promover efectos de tratamiento prolongado/sostenido en un

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

sujeto. Las modificaciones ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, anclaje, directa o indirectamente a traves de un conector, tal como covalentemente o por otra union estable, de un polfmero, tal como dextrano, polietilenglicol (PEG), albumina o radical sialilo u otros de tales polfmeros, tales como polfmeros naturales o de azucares. Otras modificaciones incluyen la generacion de protemas de fusion, por ejemplo por medio de conexion con albumina de suero humano (HAS) o Fc de inmunoglobulina.

Por ejemplo, las enzimas de degradacion de hialuronano pueden ser modificadas por conjugacion con una o mas moleculas polimericas (polfmero). El anclaje covalente u otra union estable (conjugacion) de moleculas polimericas, tales como polietilenglicol (radical de pegilacion (PEG)) confieren propiedades beneficiosas a la composicion de enzima de degradacion de hialuronano-polfmero resultante. Tales propiedades incluyen una mejor biocompatibilidad, una prolongacion de la semivida de la protema (y actividad enzimatica) en la sangre, celulas y/u otros tejidos dentro de un sujeto, una proteccion eficaz de la protema frente a las proteasas y la hidrolisis, una mejor biodistribucion, una mejor farmacocinetica y/o farmacodinamica, y un aumento de la solubilidad en agua.

Los polfmeros ilustrativos que se pueden conjugar con la enzima de degradacion de hialuronano, tal como la hialuronidasa, incluyen homopolfmeros naturales y sinteticos, tales como polioles (es dear poli-OH), poliaminas (es decir poli-NH2) y acidos policarboxflicos (es dear poli-COOH), y otros heteropolfmeros es dear polfmeros que contienen uno o mas grupos de acoplamiento diferentes p.ej. un grupo hidroxilo y grupos amina. Los ejemplos de moleculas polimericas adecuadas incluyen moleculas polimericas seleccionadas entre los poli(oxidos de alquileno) (PAO), tales como polialquilenglicoles (PAG), incluyendo polietilenglicoles (PEG), metoxipolietilenglicoles (mPEG) y polipropilenglicoles, PEG-glicidileteres (Epox-PEG), PEG-oxicarbonilimidazol (CDI-PEG), polietilenglicoles ramificados (PEG), poli(alcohol vimlico) (PVA), policarboxilatos, polivinilpirrolidona, poli-D,L-aminoacidos, antudrido de polietileno-co-acido maleico, antudrido poliestireno-co-acido maleico, dextranos incluyendo carboximetil- dextranos, heparina, albumina homologa, celulosas, incluyendo metilcelulosa, carboximetilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa carboxietilcelulosa e hidroxipropilcelulosa, productos hidrolizados de quitosano, almidones tales como hidroxietilalmidones e hidroxipropilalmidones, glucogeno, agarosas y sus derivados, goma de guar, pululano, inulina, goma de xantano carragenano, pectina, productos hidrolizados de acido algmico y bio-polfmeros.

Tfpicamente, los polfmeros son poli(oxidos de alquileno) (PAO), tales como poli(oxidos de etileno), tales como PEG, tfpicamente mPEG, que, en comparacion con los polisacaridos tales como dextrano y pululano, tienen pocos grupos reactivos susceptibles de entrecruzamiento. Tfpicamente, los polfmeros son moleculas polimericas no toxicas tales como (m)polietilenglicol (mPEG) que se pueden conjugar covalentemente con la enzima de degradacion de hialuronano, tal como la hialuronidasa (p.ej. a grupos de anclaje sobre la superficie de la protema) utilizando una qrnmica relativamente simple.

El polietilenglicol (PEG) ha sido ampliamente utilizado en biomateriales, biotecnologfa y medicina principalmente porque el PEG es un polfmero biocompatible, no toxico, no inmunogenico y soluble en agua (Zhao y Harris, ACS Symposium Series 680: 458-72, 1997). En el area de administracion de farmacos, los derivados de PEG se han utilizado ampliamente en la union covalente (es decir, "PEGilacion") a protemas para reducir la inmunogenicidad, la proteolisis y el aclaramiento renal y para aumentar la solubilidad (Zalipsky, Adv. Drug Del. Rdo. 16: 157-82, 1995). De forma similar, el PEG se ha unido a farmacos relativamente hidrofobos de bajo peso molecular para aumentar la solubilidad, reducir la toxicidad y alterar la biodistribucion. Tfpicamente, los farmacos PEGilados se inyectan en forma de soluciones.

Las moleculas polimericas adecuadas para la union a las enzimas de degradacion de hialuronano, incluyendo las hialuronidasas, incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG) y derivados de PEG tales como metoxipolietilenglicoles (mPEG), PEG-glicidileteres (Epox-PEG) PEG-oxicarbonilimidazol (CDI-PEG), PEG ramificados y poli(oxido de etileno) (PEO) (vease p.ej. Roberts et al., Advanced Drug Delivery Review 2002, 54: 459476; Harris y Zalipsky, S (eds.) "Poly(ethylene glicol), Chemistry and Biological Applications" ACS Symposium Serie 680, 1997; Mehvar et al., J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3(1):125-136, 2000; Harris, Nature Reviews 2:215 y siguientes (2003); y Tsubery, J Biol. Chem 279(37):38118-24, 2004).

Se han descrito en la tecnica numerosos reactivos para la PEGilacion. Tales reactivos incluyen, pero no se limitan a, PEG activado con N-hidroxisuccinimidilo (NHS), mPEG-succinimidilo, mPEG-N-hidroxisuccinimida, mPEG- alfa- metilbutanoato de succinimidilo, mPEG-propionato de succinimidilo, mPEG-butanoato de succinimidilo, ester de succinimidilo de acido 3-hidroxibutanoico de carboxilmetil-mPEG, PEG-propionato de succinimidilo homobifuncional, PEG-propionaldehudo homobifuncional, PEG-butiraldehfdo homobifuncional, PEG-maleimida, PEG-hidrazida, PEG- carbonato de p-nitrofenilo, mPEG-carbonato de benzotriazol, PEG-propionaldetudo, mPEG-butiraldetudo, mPEG2- butiraldehfdo ramificado, mPEG-acetilo, mPEG-piperidona, mPEG-metilcetona, mPEG-maleimida "sin conector", mPEG-vinilsulfona, mPEG-tiol, mPEG-ortopiridiltioester, mPEG-disulfuro de ortopiridilo, Fmoc-PEG-NHS, Boc-PEG- NHS, PEG-vinilsulfona-NHS, acrilato de PEG-NHS, fluorescema-PEG-NHS, y biotina-PEG-NHS (veanse, p.ej., Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995; Veronese et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997; documentos U.S. 5.672.662; U.S. 5.932.462; U.S. 6.495.659; U.S. 6.737.505; U.S. 4.002.531; U.S. 4.179.337; U.S. 5.122.614; U.S. 5.324. 844; U.S. 5.446.090; U.S. 5.612.460; U.S. 5.643.575; U.S. 5.766.581; U.S. 5.795. 569;

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

U.S. 5.808.096; U.S. 5.900.461; U.S. 5.919.455; U.S. 5.985.263; U.S. 5.990. 237; U.S. 6.113.906; U.S. 6.214.966; U.S. 6.258.351; U.S. 6.340.742; U.S. 6.413.507; U.S. 6.420.339; U.S. 6.437.025; U.S. 6.448.369; U.S. 6.461.802; U.S. 6.828.401; U.S. 6.858.736; U.S. 2001/0021763; U.S. 2001/0044526; U.S. 2001/0046481; U.S. 2002/0052430; U.S. 2002/0072573; U.S. 2002/0156047; U.S. 2003/0114647; U.S. 2003/0143596; U.S. 2003/0158333; U.S. 2003/0220447; U.S. 2004/0013637; US 2004/0235734; U.S. 2005/0114037; U.S. 2005/0171328; U.S. 2005/0209416; EP 1064951; EP 0822199; WO 01076640; WO 0002017; WO 0249673; WO 9428024; WO 0187925; y WO 0500360).

La molecula polimerica puede tener un peso molecular tipicamente comprendido entre aproximadamente 3 kDa y aproximadamente 60 kDa. En algunas realizaciones, la molecula polimerica que esta conjugada con una protema, tal como rHuPH20, tiene un peso molecular de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 o mas de 60 kDa. En un ejemplo, el polietilenglicol tiene un peso molecular que vana de aproximadamente 3 kD a aproximadamente 50 kD, y preferiblemente de aproximadamente 5 kD a aproximadamente 30 kD. La union covalente del PEG al farmaco (conocida como "PEGilacion") se puede llevar a cabo mediante tecnicas de smtesis qmmica conocidas. Por ejemplo, la PEGilacion de la protema se puede realizar haciendo reaccionar el PEG activado con NHS con la protema en condiciones de reaccion adecuadas.

Se conocen en la tecnica varios metodos para modificar polipeptidos mediante union covalente (conjugacion) de un PEG o derivado de PEG (es decir "PEGilacion") (veanse p.ej.,los documentos U.S. 2006/0104968; U.S. 5-672.662; U.S. 6.737.505; y U.S. 2004/0235734). Las tecnicas para la PEGilacion incluyen, pero no se limitan a, conectores y qmmicas de acoplamiento especializados (vease p.ej., Roberts et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 54: 459-476, 2002), union de multiples radicales de PEG a un unico sitio de conjugacion (tal como mediante el uso de PEG ramificados, vease p.ej., Guiotto et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180, 2002), PEGilacion y/o mono-PEGilacion espedfica del sitio (vease p.ej., Chapman et al., Nature Biotech. 17:780-783, 1999), y PEGilacion enzimatica dirigida al sitio (ver p.ej., Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002). Los metodos y mecanismos descritos en la tecnica pueden producir protemas que tienen 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas de 10 PEG o derivados de PEG unidos a una unica molecula de protema (vease p.ej., el documento U.S. 2006/0104968).

Las enzimas de degradacion de hialuronano modificadas, en particular las hialuronidasas recombinantes humanas solubles (p.ej. RHuPH20), se pueden preparar utilizando diversos reactivos de PEG. Los reactivos de PEG ilustrativos incluyen, por ejemplo, el uso de mPEG-SBA (30 kD), mPEG-SMB (30 kD) y versiones ramificadas basadas en mPEG2-NHS (40 kD), mPEG2-NHS (60 kD). Las versiones PEGiladas de una enzima de degradacion de hialuronano, tal como una PH20, por ejemplo rHuPH20, se pueden preparar utilizando la qmmica de NHS, asf como carbonatos y aldetudos, utilizando cada uno de los siguientes reactivos: mPEG2-NHS-40K ramificado, mPEG- NHS-10K ramificado, mPEG-NHS-20K ramificado, mPEG-NHS-40K ramificado, mPEG2-NHS-60K ramificado; mPEG-SBA-5K; mPEG-SBA-20K; MPEG-SBA-30K; mPEG-SMB-20K; MPEG-SMB-30K; mPEG-butiraldemdo-; mPEG-SPA-20K; MPEG-SPA-30K; y PEG-NHS-5K- biotina. Las enzimas de degradacion de hialuronano PEGiladas tambien se pueden preparar utilizando reactivos de PEG disponibles de Dowpharma, una division de Dow Chemical Corporation; incluyendo hialuronidasas PEGiladas con PEG-carbonato de p-nitrofenilo de Dowpharma (30 kDa) y con propionaldetudo PEG (30 kDa).

Si bien se han descrito numerosas reacciones para la PEGilacion, las que son mas aplicables en general aplican direccionalidad, utilizan condiciones de reaccion suaves y no requieren un procesamiento exhaustivo aguas abajo para eliminar catalizadores toxicos o sub-productos. Por ejemplo, el monometoxi PEG (mPEG) tiene solamente un hidroxilo terminal reactivo, y por lo tanto su uso limita algo de la heterogeneidad de la mezcla de producto PEG- protema resultante. La activacion del grupo hidroxilo en el extremo del poftmero opuesto al grupo metoxi terminal es generalmente necesaria para conseguir una PEGilacion de protema eficaz, con el objetivo de hacer que el PEG derivatizado sea mas susceptible al ataque nucleofilo. El nucleofilo atacante es usualmente el grupo epsilon-amino de un residuo lisilo, pero tambien pueden reaccionar otras aminas (p.ej. la alfa-amina N-terminal o las aminas del anillo de histidina) si las condiciones locales son favorables. Es posible un anclaje mas dirigido en protemas que contienen una unica lisina o cistema. Este ultimo residuo puede ser elegido como diana por la PEG-maleimida para la modificacion espedfica del tiol. Alternativamente, la PEG-hidrazida de se puede hacer reaccionar con una enzima de degradacion de hialuronano oxidada con peryodato y reducida en presencia de NaCNBH3. Mas espedficamente, los azucares de CMP PEGilados se pueden hacer reaccionar con una enzima de degradacion de hialuronano en presencia de glicosil-transferasas apropiadas. Una tecnica es la tecnica de "PEGilacion" en la que un numero de moleculas polimericas estan acopladas al polipeptido en cuestion. Cuando se utiliza esta tecnica, el sistema inmunologico tiene dificultades para reconocer los epftopos sobre la superficie del polipeptido responsables de la formacion de anticuerpos, reduciendo asf la respuesta inmunitaria. Para polipeptidos introducidos directamente en el sistema circulatorio del organismo humano para proporcionar un efecto fisiologico particular (es decir farmacos), la respuesta inmunitaria potencial tfpica es una respuesta de IgG y/o IgM, mientras que los polipeptidos que son inhalados a traves del sistema respiratorio (es decir polipeptido industrial) potencialmente pueden causar una respuesta de IgE (es decir respuesta alergica). Una de las teonas que explican la reduccion de la respuesta inmunitaria es que la molecula o las moleculas polimericas protegen los epftopos sobre la superficie del polipeptido responsable de la respuesta inmunitaria que conduce a la formacion de anticuerpos. Otra teona o al menos un factor

5

10

15

20

25

30

35

40

45

parcial es que cuanto mas pesado sea el producto conjugado, mas reducida sera la respuesta inmunitaria.

Los succinimidil-PEG que contienen PEG lineales o ramificados se pueden conjugar con una enzima de degradation de hialuronano. Porejemplo, una enzima de degradacion de hialuronano, tal como una PH20, porejemplo, rHuPH20 se puede conjugar con reactivos de succinimidil-monoPEG (mPEG) que incluyen Propionatos de Succinimidil-mPEG (mpEG-SPA), Butanoatos de Succinimidil-mPEG (mPEG-SBA) y (para unir PEG "ramificados") mPEG2-N- Hidroxilsuccinimida. Estos esteres de succinimidilo pegilados contienen cadenas principales de carbono de longitudes diferentes entre el grupo PEG y el entrecruzador activado, y un grupo PEG sencillo o ramificado. Estas diferencias se pueden utilizar, por ejemplo, para proporcionar diferentes cineticas de reaction y potencialmente restringir sitios disponibles para la union de PEG a la enzima durante el proceso de conjugation.

En un ejemplo, la PEGilacion incluye la conjugacion de mPEG-SBA, por ejemplo, mPEG-SBA-30K (que tiene un peso molecular de aproximadamente 30 KDa) u otros esteres de succinimidilo de derivado de acido PEG butanoico, a una hialuronidasa soluble. Los esteres de succinimidilo de derivados de acido PEG butanoico, tales como mPEG- SBA-30K, se acoplan facilmente a grupos amino de protemas. Por ejemplo, la conjugacion covalente de mPEG- SBA-30Ky rHuPH20 (que tiene un tamano de aproximadamente 60 KDa) proporciona enlaces amida estables entre rHuPH20 y mPEG, como se muestra en el Esquema 1, a continuation.

Esquema 1

imagen1

Tipicamente, se anade el mPEG-SBA-30K u otro PEG a la enzima de degradacion de hialuronano, en algunos casos una hialuronidasa, a una razon molar de PEG:polipeptido de 10:1 en un tampon adecuado, p.ej. NaCl 130 mM/HEPES 10 mM a pH 6,8, seguido de esterilizacion, p.ej. filtration en condiciones esteriles y conjugacion continua, por ejemplo, con agitation, durante la noche a 4°C en una habitation fria. En un ejemplo, el PEG-enzima de degradacion de hialuronano conjugado se concentra y se intercambia con tampon.

Otros metodos de acoplamiento de esteres de succinimidilo de derivados de acido PEG butanoico, tales como mPEG-SBA-30K son conocidos en la tecnica (veanse p.ej., los documentos U.S. 5.672.662; U.S. 6.737.505; y U.S. 2004/0235734). Por ejemplo, un polipeptido, tal como una enzima de degradacion de hialuronano (p.ej. una hialuronidasa), se puede acoplar a un derivado de PEG activado con NHS por reaccion en un tampon de borato (0,1 M, pH 8,0) durante una hora a 4°C. La protema PEGilada resultante se puede purificar por ultrafiltracion. Alternativamente, la PEGilacion de una fosfatasa alcalina bovina se puede lograr mezclando la fosfatasa con mPEG- SBA en un tampon que contiene fosfato de sodio 0,2 M y NaCl 0,5 M (pH 7,5) a 4°C durante 30 minutos. El PEG sin reaccionar se puede eliminar por ultrafiltracion. Otro metodo hace reaccionar el polipeptido con mPEG-SBA en agua desionizada a la que se anade trietilamina para elevar el pH a 7,2-9. La mezcla resultante se agita a temperatura ambiente durante varias horas para completar la PEGilacion.

Los PEG se pueden utilizar para generar enzimas de degradacion de hialuronano, tales como una PH20, por ejemplo rHuPH20, que tienen entre aproximadamente tres y seis moleculas de PEG por enzima. Tales composiciones de rHuPH20 pegiladas se pueden purificar facilmente para producir composiciones que tienen actividades espedficas de aproximadamente 25.000 o 30.000 unidades/mg de actividad hialuronidasa de protema, y estan sustancialmente libres de enzima no PEGilada (menos de 5% no PEGilada).

7. Metodos de production de acidos nucleicos y polipeptidos codificados de enzimas de degradacion de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

hialuronano

Los polipeptidos de una enzima de degradacion de hialuronano, tal como una hialuronidasa soluble, expuestos en la presente memoria, se pueden obtener por metodos bien conocidos en la tecnica para la purificacion de protemas y la expresion de protemas recombinantes. Se puede utilizar cualquier metodo conocido por los expertos en la tecnica para la identificacion de acidos nucleicos que codifican los genes deseados. Se puede utilizar cualquier metodo disponible en la tecnica para obtener un ADNc completo (es dedr, que abarca toda la region codificante) o un clon de ADN genomico que codifica una hialuronidasa, por ejemplo de una fuente celular o tisular. Las hialuronidasas solubles modificadas o variantes, pueden ser modificadas geneticamente a partir de un polipeptido de tipo salvaje, por ejemplo, mediante mutagenesis dirigida.

Los polipeptidos se pueden clonar o aislar utilizando cualquier metodo disponible conocido en la tecnica para clonar y aislar moleculas de acido nucleico. Tales metodos incluyen la amplificacion por PCR de acidos nucleicos y el escrutinio de bibliotecas, incluyendo el escrutinio por hibridacion de acido nucleico, el escrutinio basado en anticuerpos y el escrutinio basado en la actividad.

Se pueden utilizar metodos para la amplificacion de acidos nucleicos para aislar moleculas de acido nucleico que codifican un polipeptido deseado, incluyendo por ejemplo, metodos de reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). Se puede utilizar un material que contiene acido nucleico como un material de partida a partir del que se puede aislar una molecula de acido nucleico codificante del polipeptido deseado. Por ejemplo, preparaciones de ADN y ARNm, extractos celulares, extractos de tejidos, muestras de fluidos (p.ej. sangre, suero, saliva), se pueden utilizar muestras de sujetos sanos y/o enfermos en metodos de amplificacion. Tambien se pueden utilizar bibliotecas de acido nucleico como fuente de material de partida. Los cebadores se pueden disenar para amplificar un polipeptido deseado. Por ejemplo, los cebadores se pueden disenar basandose en secuencias expresadas a partir de las cuales se genera un polipeptido deseado. Los cebadores se pueden disenar basandose en la traduccion de una secuencia de aminoacidos polipeptndica. Las moleculas de acido nucleico generadas por amplificacion se pueden secuenciar y confirmar para codificar un polipeptido deseado.

Se pueden unir secuencias de nucleotidos adicionales a una molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido, incluyendo secuencias conectoras que contienen sitios de endonucleasas de restriccion con el proposito de clonar el gen sintetico en un vector, por ejemplo, un vector de expresion de protema o un vector disenado para la amplificacion de las secuencias de aDn que codifican la protema nucleo. Ademas, secuencias de nucleotidos adicionales que especifican elementos de ADN funcionales pueden estar operativamente unidas a una molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido. Los ejemplos de tales secuencias incluyen, pero no se limitan a, secuencias promotoras disenadas para facilitar la expresion de protemas intracelulares, y secuencias de secrecion, por ejemplo secuencias senal heterologas, disenadas para facilitar la secrecion de protemas. Tales secuencias son conocidas por los expertos en la tecnica. Tambien se pueden conectar secuencias de residuos de nucleotidos adicionales tales como secuencias de bases que especifican regiones de union de protemas a moleculas de acido nucleico que codifican enzimas. Tales regiones incluyen, pero no se limitan a, secuencias de residuos que facilitan o codifican protemas que facilitan la captacion de una enzima en celulas diana espedficas, o alteran de otro modo la farmacocinetica de un producto de un gen sintetico. Por ejemplo, las enzimas pueden estar conectadas a radicales de PEG.

Ademas, se pueden anadir etiquetas o otros radicales, por ejemplo, para ayudar a la deteccion o purificacion por afinidad del polipeptido. Por ejemplo, tambien se pueden conectar secuencias de residuos de nucleotidos adicionales tales como secuencias de bases que especifican una etiqueta epitopica u otro marcador detectable a moleculas de acido nucleico que codifican enzimas. Los ejemplos de tales secuencias incluyen secuencias de acido nucleico que codifican una etiqueta His (p.ej., 6XHis, HHHHHH; SEQ ID NO: 54) o una Etiqueta Flag (DYKDDDDK; SEQ ID NO: 55).

Los acidos nucleicos identificados y aislados se pueden insertar entonces en un vector de clonacion apropiado. Se puede utilizar un gran numero de sistemas vector-anfitrion conocidos en la tecnica. Los vectores posibles incluyen, pero no se limitan a, plasmidos o virus modificados, pero el sistema vectorial debe ser compatible con la celula anfitriona utilizada. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, bacteriofagos tales como derivados de lambda, o plasmidos tales como pCMV4, pBR322 o derivados plasirndicos pUC o el vector Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA). Otros vectores de expresion incluyen el vector de expresion HZ24. La insercion en un vector de clonacion se puede lograr, por ejemplo, ligando el fragmento de ADN a un vector de clonacion que tiene extremos cohesivos complementarios. La insercion se puede efectuar utilizando vectores de clonacion TOPo (Invitrogen, Carlsbad, CA). Si los sitios de restriccion complementarios utilizados para fragmentar el ADN no estan presentes en el vector de clonacion, los extremos de las moleculas de ADN se pueden modificar enzimaticamente. Alternativamente, se puede producir cualquier sitio deseado ligando secuencias de nucleotidos (conectores) sobre los extremos de ADN; estos conectores ligados pueden contener oligonucleotidos espedficos sintetizados qmmicamente que codifican secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restriccion. En un metodo alternativo, el vector escindido y el gen de la protema se pueden modificar por medio de colas homopolimericas. Las moleculas recombinantes se

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

pueden introducir en celulas anfitrionas a traves, por ejemplo, de transformacion, transfeccion, infeccion, electroporacion y sonoporacion, de manera que se generen muchas copias de la secuencia genica.

En realizaciones espedficas, la transformacion de celulas anfitrionas con moleculas de ADN recombinante que incorporan el gen de la protema aislado, ADNc o secuencia de ADN sintetizada permite la generacion de multiples copias del gen. De este modo, se puede obtener el gen en grandes cantidades mediante el crecimiento de transformantes, el aislamiento de las moleculas de ADN recombinante de los transformantes y, cuando sea necesario, la recuperacion del gen insertado desde del ADN recombinante aislado.

a. Vectores y celulas

Para la expresion recombinante de una o mas de las protemas deseadas, tal como cualquiera de las descritas en la presente memoria, se puede insertar el acido nucleico que contiene toda o una porcion de la secuencia de nucleotidos que codifica la protema en un vector de expresion apropiado, es dear, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripcion y traduccion de la secuencia codificante de la protema insertada. Las senales transcripcionales y traduccionales necesarias tambien pueden ser suministradas por el promotor nativo para genes enzimaticos y/o sus regiones flanqueantes.

Tambien se proporcionan vectores que contienen un acido nucleico que codifica la enzima. Tambien se proporcionan celulas que contienen los vectores. Las celulas incluyen celulas eucariotas y procariotas, y los vectores son cualquiera adecuado para su uso en las mismas.

Se proporcionan celulas procariotas y eucariotas, incluyendo celulas endoteliales, que contienen los vectores. Tales celulas incluyen celulas bacterianas, celulas de levadura, celulas fungicas, Arqueobacterias, celulas vegetales, celulas de insecto y celulas animales. Las celulas se utilizan para producir una protema de las mismas mediante el cultivo de las celulas anteriormente descritas en condiciones en las que la protema codificada sea expresada por la celula y recuperar la protema expresada. Para los fines de la presente memoria, por ejemplo, la enzima puede ser secretada al medio.

Se proporcionan vectores que contienen una secuencia de nucleotidos que codifica el polipeptido de la enzima de degradacion de hialuronano, en algunos ejemplos un polipeptido de hialuronidasa soluble, acoplado a la secuencia senal nativa o heterologa, asf como multiples copias de la misma. Los vectores se pueden seleccionar para la expresion de la protema enzimatica en la celula o de manera que la protema enzimatica se exprese como una protema secretada.

Se puede utilizar una variedad de sistemas anfitrion-vector para expresar la secuencia que codifica la protema. Estos incluyen pero no se limitan a sistemas de celulas de mairnferos infectados con virus (p.ej. virus vaccinia, adenovirus y otros virus); sistemas de celulas de insectos infectados con virus (p.ej. baculovirus); microorganismos tales como levaduras que contienen vectores de levadura; o bacterias transformadas con bacteriofagos, ADN, ADN plasmfdico o ADN cosmfdico. Los elementos de expresion de los vectores vanan en sus fuerzas y especificidades. Dependiendo del sistema anfitrion-vector utilizado, se puede utilizar cualquiera de una serie de elementos de transcripcion y traduccion adecuados.

Se puede utilizar cualquiera metodo conocido por los expertos en la tecnica para la insercion de fragmentos de ADN en un vector para construir vectores de expresion que contienen un gen quimerico que contiene senales de control de la transcripcion/traduccion apropiadas y secuencias codificantes de protemas. Estos metodos pueden incluir tecnicas de ADN recombinane in vitro y sinteticas y recombinantes in vivo (recombinacion genetica). La expresion de secuencias de acidos nucleicos que codifican protemas, o dominios, derivados, fragmentos u homologos de los mismos, se puede regular mediante una segunda secuencia de acido nucleico de modo que los genes o fragmentos de los mismos se expresen en un anfitrion transformado con una o varias moleculas de ADN recombinante. Por ejemplo, la expresion de las protemas puede ser controlada por cualquier promotor/potenciador conocido en la tecnica. En una realizacion espedfica, el promotor no es nativo de los genes para una protema deseada. Los promotores que se pueden utilizar incluyen pero no se limitan al promotor temprano de SV40 (Bemoist y Chambon, Nature 290: 304-310 (1981)), el promotor contenido en la repeticion terminal larga 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto et al. Cell 22:787-797 (1980)), el promotor de la timidina quinasa del herpes (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1441-1445 (1981)), las secuencias reguladoras del gen de la metalotionema (Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982)); vectores de expresion procarioticos tales como el promotor de la p-lactamasa (Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 5543) o el promotor tac (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25 (1983)); vease tambien "Useful Proteins from Recombinant Bacteria": en Scientific American 242:79-94 (1980)); vectores de expresion vegetales que contienen el promotor de la nopalina sintasa (Herrera-Estrella et al., Nature 303:209-213 (1984)) o el promotor del ARN de 35S del virus del mosaico de la coliflor (Gardner et al., Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)), y el promotor de la enzima fotosintetica ribulosa bisfosfato carboxilasa (Herrera-Estrella et al., Nature 310:115-120 (1984)); elementos promotores de levadura y otros hongos tales como el promotor de Gal4, el promotor de la alcohol deshidrogenasa, el promotor de la fosfoglicerol quinasa, el promotor de la fosfatasa alcalina, y

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

las siguientes regiones de control transcripcional animales que muestras especificidad de tejido y han sido utilizadas en animales transgenicos: la region de control del gen de la elastasa I que es activa en celulas acinares pancreaticas (Swift et al., Cell 38:639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)); la region de control del gen de la insulina que es activa en celulas beta pancreaticas (Hanahan et al., Nature 315:115-122 (1985)), la region de control del gen de la inmunoglobulina que es activa en celulas linfoides (Grosschedl et al., Cell 38:647-658 (1984); Adams et al., Nature 318:533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987)), la region de control del virus del tumor mamario de raton que es activa en celulas testiculares, mamarias, linfoides y mastocitos (Leder et al., Cell 45:485-495 (1986)), la region de control del gen de la albumina que es activa en tngado (Pinkert et al., Genes and Devel. 1:268-276 (1987)), la region de control del gen de la alfa-fetoprotema que es activa en tngado (Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985); Hammer et al., Science 235:53-58 1987)), la region de control del gen de la antitripsina alfa-1 que es activa en tngado (Kelsey et al., Genes and Devel. 1:161-171 (1987)), la region de control del gen de la beta globina que es activa en celulas mieloides (Magram et al., Nature 315:338-340 (1985); Kollias et al., Cell 46:89-94 (1986)), la region de control del gen de la protema basica mielina que es activa en oligodendrocitos del cerebro (Readhead et al., Cell 48:703-712 (1987)), la region de control del gen de la cadena ligera 2 de miosina que es activa en el musculo esqueletico (Shani, Nature 314:283-286 (1985)), y la region de control del gen de la hormona liberadora de gonadotropina que es activa en gonadotrofos del hipotalamo (Mason et al., Science 234:1372-1378 (1986)).

En una realizacion espedfica, se utiliza un vector que contiene un promotor unido operablemente a acidos nucleicos que codifican una protema deseada, o un dominio, fragmento, derivado u homologo de la misma, uno o mas ongenes de replicacion y, opcionalmente, uno o mas marcadores seleccionables (p.ej., un gen de resistencia a antibiotico). Los vectores plasmfdicos ilustrativos para la transformacion de celulas de E coli, Incluyen, por ejemplo, los vectores de expresion pQE (disponibles en Qiagen, Valencia, CA; vease tambien la bibliograffa publicada por Qiagen que describe el sistema). Los vectores pQE tienen un promotor de fago T5 (reconocido por la ARN polimerasa de E coli) y un doble modulo de represion del operador lac para proporcionar una expresion fuertemente regulada y de alto nivel de protemas recombinantes en E. coli, un sitio de union al ribosoma sintetico (RBS II) para una traduccion eficaz, una secuencia codificante de la etiqueta 6XHis, terminadores de la transcripcion fe y T1, el origen de replicacion de ColE1 y un gen de beta-lactamasa para conferir resistencia a la ampicilina. Los vectores pQE permiten la colocacion de una etiqueta 6xHis en el extremo N- o C-terminal de la protema recombinante. Tales plasmidos incluyen pQE 32, pQE 30 y pQ E31 que proporcionan multiples sitios de clonacion para lostres marcos de lectura y proporcionan la expresion de protemas etiquetadas con 6xHis en el extremo N-terminal. Otros vectores plasmfdicos ilustrativos para la transformacion de celulas de E. coli, incluyen, por ejemplo, los vectores de expresion pET (vease, la Patente de Estados Unidos 4.952.496; disponible de Novagen, Madison, WI; vease, tambien la bibliograffa publicada por Novagen que describe el sistema). Tales plasmidos incluyen pET 11a, que contiene el promotor T7lac, el terminador T7, el operador lac de E. coli inducible; y el gen represor de lac; PET 12a-c, que contiene el promotor T7, el terminador T7 y la senal de secrecion ompT de E. coli; y pET 15b y pET19b (Novagen, Madison, WI), que contienen una secuencia lfder His-Tag™ para su uso en purificacion con una columna His y un sitio de escision de trombina que permite la escision tras la purificacion sobre la columna, la region promotora de T7- lac y el terminador T7.

Un ejemplo de un vector para la expresion en celulas de mairnfero es el vector de expresion HZ24. El vector de expresion HZ24 se obtuvo de la cadena principal del vector pCI (Promega). Contiene ADN que codifica el gen de resistencia a beta-lactamasa (AmpR), un origen de replicacion F1, una region potenciadora/promotora inmediata- temprana de citomegalovirus (CMV) y una senal de poliadenilacion tardfa de SV40 (SV40). El vector de expresion tambien tiene un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) del virus ECMV (Clontech) y el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) de raton.

b. Expresion

Los polipeptidos de enzimas de degradacion de hialuronano, incluyendo los polipeptidos de hialuronidasa solubles, pueden ser producidos por cualquier metodo conocido por los expertos en la tecnica incluyendo metodos in vivo e in vitro. Las protemas deseadas se pueden expresar en cualquier organismo adecuado para producir las cantidades y formas requeridas de las protemas, tales como por ejemplo, las necesarias para la administracion y el tratamiento. Los anfitriones de expresion incluyen organismos procariotas y eucariotas tales como E. coli, levadura, plantas, celulas de insecto, celulas de mai^ero, incluyendo lmeas celulares humanas y de animales transgenicos. Los anfitriones de expresion pueden diferir en sus niveles de produccion de protemas, asf como en los tipos de modificaciones post-traduccionales que estan presentes en las protemas expresadas. La eleccion del anfitrion de expresion se puede realizar basandose en estos y otros factores, tales como consideraciones reguladoras y de seguridad, costes de produccion y la necesidad y los metodos para la purificacion.

Se encuentran disponibles muchos vectores de expresion y son conocidos por los expertos en la tecnica y se pueden utilizar para la expresion de protemas. La eleccion del vector de expresion estara influenciada por la eleccion del sistema de expresion del anfitrion. En general, los vectores de expresion pueden incluir promotores transcripcionales y opcionalmente potenciadores, senales de traduccion y senales de terminacion de la transcripcion

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

y la traduccion. Los vectores de expresion que se utilizan para la transformacion estable tipicamente tienen un marcador seleccionable que permite la seleccion y el mantenimiento de las celulas transformadas. En algunos casos, se puede utilizar un origen de replicacion para amplificar el numero de copias del vector.

Los polipeptidos de enzimas de degradacion de hialuronano, tales como los polipeptidos de hialuronidasa solubles, tambien se pueden utilizar o expresar como fusiones de protemas. Por ejemplo, se puede generar una fusion enzimatica para anadir una funcionalidad adicional a una enzima. Los ejemplos de protemas de fusion de enzimas incluyen, pero no se limitan a, fusiones de una secuencia senal, una etiqueta por ejemplo para la localizacion, p.ej. una etiqueta de his6 o una etiqueta myc, o una etiqueta para la purificacion, por ejemplo, una fusion GST, y una secuencia para dirigir la secrecion de la protema y/o la asociacion a la membrana.

i. Celulas procarioticas

Los procariotas, especialmente E. coli, proporcionan un sistema para producir grandes cantidades de protemas. La transformacion de E. coli es un mecanismo simple y rapido bien conocido por los expertos en la tecnica. Los vectores de expresion para E. coli pueden contener promotores inducibles, tales promotores son utiles para inducir altos niveles de expresion de protema y para expresar protemas que muestran cierta toxicidad para las celulas anfitrionas. Los ejemplos de promotores inducibles incluyen el promotor lac, el promotor trp, el promotor tac hforido, los promotores de ARN de T7 y SP6 y el promotor APL regulado por temperatura.

Las protemas, tales como las proporcionadas en la presente memoria, se pueden expresar en el entorno citoplasmico de E. coli. El citoplasma es un entorno reductor y para algunas moleculas, esto puede dar lugar a la formacion de cuerpos de inclusion insolubles. Se pueden utilizar agentes reductores tales como ditiotreitol y p- mercaptoetanol y desnaturalizantes, tales como guanidina-HCl y urea para resolubilizar las protemas. Un enfoque alternativo es la expresion de protemas en el espacio periplasmico de bacterias que proporciona un entorno oxidante e isomerasas de tipo chaperonina y disulfuro y puede conducir a la produccion de una protema soluble. Tfpicamente, se fusiona una secuencia lfder con la protema que se va a expresar que dirige la protema al periplasma. El lfder se elimina a continuacion por medio de peptidasas senal dentro del periplasma. Los ejemplos de las secuencias lfder de orientacion al periplasma incluyen el lfder pelB del gen de la pectato liasa y el lfder derivado del gen de la fosfatasa alcalina. En algunos casos, la expresion periplasmica permite la fuga de la protema expresada al medio de cultivo. La secrecion de protemas permite una purificacion rapida y sencilla a partir del sobrenadante del cultivo. Las protemas que no se secretan se pueden obtener del periplasma mediante lisis osmotica. De forma similar a la expresion citoplasmica, en algunos casos las protemas pueden volverse insolubles y se pueden utilizar desnaturalizantes y agentes reductores para facilitar la solubilizacion y el replegamiento. La temperatura de induccion y crecimiento tambien puede influir en los niveles de expresion y la solubilidad, tfpicamente se utilizan temperaturas entre 25°C y 37°C. Tfpicamente, las bacterias producen protemas aglicosiladas. Por lo tanto, si las protemas requieren glicosilacion para su funcion, se puede anadir la glicosilacion in vitro despues de la purificacion de las celulas anfitrionas.

ii. Celulas de levadura

Las levaduras tales como Saccharomyces cerevisae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces lactis y Pichia pastoris son anfitriones de expresion de levadura bien conocidos que se pueden utilizar para la produccion de protemas, tales como cualquiera de las descritas en la presente memoria. La levadura puede ser transformada con vectores de replicacion episomal o por integracion cromosomica estable mediante recombinacion homologa. Tfpicamente, se utilizan promotores inducibles para regular la expresion genica. Los ejemplos de tales promotores incluyen los promotores GAL1, GAL7 y GAL5 y de metalotionema, tales como CUP1, AOX1 u otros promotores de Pichia u otra levadura. Los vectores de expresion a menudo incluyen un marcador seleccionable tal como LEU2, TRP1, HIS3 y URA3 para la seleccion y el mantenimiento del ADN transformado. Las protemas expresadas en levadura son a menudo solubles. La expresion simultanea con chaperoninas tales como Bip y la protema disulfuro isomerasa puede mejorar los niveles de expresion y la solubilidad. Ademas, las protemas expresadas en levadura se pueden dirigir para la secrecion utilizando fusiones de peptidos senal de secrecion tales como la senal de secrecion del factor alfa de tipo de apareamiento de levadura de Saccharomyces cerevisae y fusiones con protemas de la superficie celular de levadura tales como el receptor de adherencia del apareamiento Aga2p o la glucoamilasa de Arxula adeninivorans. Un sitio de escision de proteasa por ejemplo para la proteasa Kex-2, se puede ser modificar geneticamente para eliminar las secuencias fusionadas de los polipeptidos expresados a medida que salen de la via de secrecion. La levadura tambien es susceptible de glicosilacion en los motivos Asn-X-Ser/Thr.

iii. Celulas de Insectos

Las celulas de insecto, que utilizan particularmente la expresion de baculovirus, son utiles para expresar polipeptidos tales como polipeptidos de hialuronidasa. Las celulas de insecto expresan altos niveles de protema y son susceptibles de la mayona de las modificaciones post-traduccionales utilizadas por los eucariotas superiores. Los

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

baculovirus tienen una gama de anfitriones restringida, lo que mejora la seguridad y reduce los problemas reguladoras de la expresion eucariotica. Los vectores de expresion tipicos utilizan un promotor para expresion de alto nivel, tal como el promotor de polihedrina de baculovirus. Los sistemas de baculovirus de uso comun incluyen los baculovirus tales como el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) y el virus de la polihedrosis nuclear de Bombyx mori (BmNPV) y una lmea celular de insecto tal como Sf9 derivada de Spodoptera frugiperda, Pseudaletia unipuncta (A7S) y Danaus plexippus (DpN_1). Para una expresion de alto nivel, la secuencia de nucleotidos de la molecula que se va a expresar se fusiona inmediatamente aguas abajo del codon de iniciacion del virus de la polihedrina del virus. Las senales de secrecion de mairnferos se procesan con precision en celulas de insecto y se pueden utilizar para secretar la protema expresada al medio de cultivo. Ademas, las lmeas celulares de Pseudaletia unipuncta (A7S) y Danaus plexippus (DpN1) producen protemas con patrones de glicosilacion similares a los sistemas de celulas de marnfferos.

Un sistema de expresion alternativo en celulas de insecto consiste en la utilizacion de celulas transformadas establemente. Las lmeas celulares tales como las celulas Schneider 2 (S2) y Kc (Drosophila melanogaster) y celulas C7 (Aedes albopictus) se puede utilizar para la expresion. El promotor de metalotioneina de Drosophila se puede utilizar para inducir altos niveles de expresion en presencia de induccion de metales pesados con cadmio o cobre. Los vectores de expresion se mantienen tfpicamente mediante el uso de marcadores seleccionables tales como neomicina e higromicina.

iv. Celulas de mamifero

Se pueden utilizar sistemas de expresion de marnfferos para expresar protemas que incluyen polipeptidos de enzimas de degradacion de hialuronano, tales como polipeptidos de hialuronidasa solubles. Los constructos de expresion se pueden transferir a celulas de mamffero por infeccion vmca tal como adenovirus o por transferencia directa de ADN tales como liposomas, fosfato de calcio, DEAE-dextrano y por medios ffsicos tales como electroporacion y microinyeccion. Los vectores de expresion para celulas de mamfferos incluyen tfpicamente un sitio de proteccion terminal de ARNm, una caja TATA, una secuencia de iniciacion de la traduccion (secuencia consenso de Kozak) y elementos de poliadenilacion. Tambien se pueden anadir elementos IRES para permitir la expresion bicistronica con otro gen, tal como un marcador seleccionable. Tales vectores incluyen a menudo promotores- potenciadores de la transcripcion para un alto nivel de expresion, por ejemplo, el promotor-potenciador de SV40, el promotor de citomegalovirus humano (CMV) y la repeticion terminal larga del virus del sarcoma de Rous (RSV). Estos promotores-potenciadores son activos en muchos tipos de celulas. Tambien se pueden utilizar promotores de tejidos y de tipo celular y regiones potenciadoras para la expresion. Las regiones promotoras/potenciadoras ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, aquellas de genes tales como elastasa I, insulina, inmunoglobulina, virus de tumor mamario de raton, albumina, alfa-fetoprotema, alfa-1-antitripsina, beta-globina, protema basica de mielina, cadena ligera 2 de miosina, y el control del gen de la hormona liberadora gonadotropica. Se pueden utilizar marcadores seleccionables para seleccionar y mantener celulas con el constructo de expresion. Los ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen, pero no se limitan a, higromicina B fosfotransferasa, adenosina desaminasa, xantina-guanina fosforribosil transferasa, aminoglucosido fosfotransferasa, dihidrofolato reductasa (DHFR) y timidina quinasa. Por ejemplo, la expresion se puede realizar en presencia de metotrexato para seleccionar solo aquellas celulas que expresan el gen DHFR. La fusion con moleculas de senalizacion de la superficie celular tales como TCR-Z y FceRI-y puede dirigir la expresion de las protemas en un estado activo sobre la superficie celular.

Se encuentran disponibles muchas lmeas celulares para la expresion en mamfferos, incluyendo celulas de raton, rata, ser humano, mono, pollo y hamster. Las lmeas celulares ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, lmeas celulares CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, NS0 de raton (sin secrecion) y otras lmeas celulares de mieloma, lmeas celulares de hibridoma y heterohibridoma, linfocitos, fibroblastos, Sp2/o, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2B8 y HKB. Tambien estan disponibles lmeas celulares adaptadas a medios libres de suero que facilitan la purificacion de protemas secretadas a partir de los medios de cultivo celular. Los ejemplos incluyen celulas CHO-S (Invitrogen, Carlsbad, CA, num. de cat.11619-012) y la lmea celular EBNA-1 libre de suero (Pham et al., (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42.). Tambien estan disponibles lmeas celulares que estan adaptadas para crecer en medios especiales optimizados para una expresion maxima. Por ejemplo, las celulas CHO DG44 se adaptan para crecer en cultivo en suspension en un medio qmmicamente definido, libre de producto animal.

v. Plantas

Se pueden utilizar celulas de plantas y plantas transgenicas para expresar protemas tales como las descritas en la presente memoria. Los constructos de expresion tfpicamente se transfieren a plantas utilizando la transferencia directa de ADN tal como bombardeo con microproyectiles y transferencia mediada por PEG a protoplastos, y con transformacion mediada por agrobacterium. Los vectores de expresion pueden incluir secuencias promotoras y potenciadoras, elementos de terminacion de la transcripcion y elementos de control de la traduccion. Los vectores de expresion y las tecnicas de transformacion se dividen habitualmente entre dicotiledoneas anfitrionas, tales como Arabidopsis y el tabaco, y monocotiledoneas anfitrionas, tales como el mafz y el arroz. Los ejemplos de promotores

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

de plantas utilizados para la expresion incluyen el promotor del virus del mosaico de la coliflor, el promotor de la nopalina sintetasa, el promotor de la ribosa bisfosfato carboxilasa y los promotores de ubiquitina y UBQ3. Los marcadores seleccionables tales como higromicina, fosfomanosa isomerasa y neomicina fosfotransferasa se utilizan a menudo para facilitar la seleccion y el mantenimiento de las celulas transformadas. Las celulas vegetales transformadas se pueden mantener en cultivo en forma de celulas, agregados (tejido de callo) o regeneradas en plantas enteras. Las celulas vegetales transgenicas tambien pueden incluir algas modificadas geneticamente para producir polipeptidos de hialuronidasa. Debido a que las plantas tienen diferentes patrones de glicosilacion que las celulas de mairnferos, esto puede influir en la eleccion de la protema producida en estos anfitriones.

c. Tecnicas de Purificacion

El metodo para la purificacion de polipeptidos, incluyendo polipeptidos de enzimas de degradacion de hialuronano (p.ej. polipeptidos de hialuronidasa solubles) u otras protemas, a partir de celulas anfitriona dependera de las celulas anfitrionas y de los sistemas de expresion elegidos. Para las moleculas secretadas, las protemas generalmente se purifican a partir del medio de cultivo despues de retirar las celulas. Para la expresion intracelular, las celulas se pueden lisar y las protemas se pueden purificar a partir del extracto. Cuando se utilizan organismos transgenicos tales como plantas y animales transgenicos para la expresion, se pueden utilizar tejidos u organos como material de partida para preparar un extracto de celulas lisadas. Ademas, la produccion de animales transgenicos puede incluir la produccion de polipeptidos en la leche o los huevos, que pueden ser recogidos, y si es necesario, las protemas se pueden extraer y purificar adicionalmente utilizando metodos convencionales en la tecnica.

Las protemas, tales como polipeptidos de hialuronidasa solubles, se pueden purificar utilizando mecanismos convencionales de purificacion de protemas conocidos en la tecnica incluyendo, pero no limitados a, SDS-PAGE, fraccionamiento por tamano y cromatograffa de exclusion por tamano, precipitacion con sulfato de amonio y cromatograffa de intercambio ionico. Tambien se pueden utilizar tecnicas de purificacion de afinidad para mejorar la eficacia y la pureza de las preparaciones. Por ejemplo, se pueden utilizar anticuerpos, receptores y otras moleculas que se unen a las enzimas hialuronidasas en la purificacion por afinidad. Los constructos de expresion tambien pueden ser modificados geneticamente para anadir una etiqueta de afinidad a una protema tal como un epftopo myc, una fusion GST o His6 y purificados por afinidad con anticuerpo para myc, resina de glutation y resina de Ni, respectivamente. La pureza se puede evaluar por cualquier metodo conocido en la tecnica incluyendo tecnicas de electroforesis en gel y tincion y espectrofotometricas. Las composiciones de rHuPH20 purificadas, como las proporcionadas en la presente memoria, tienen tfpicamente una actividad espedfica de al menos 70.000 a 100.000 unidades/mg, por ejemplo, aproximadamente 120.000 unidades/mg. La actividad espedfica puede variar tras la modificacion, por ejemplo con un polfmero.

D. Composiciones y formulaciones de liberacion sostenida de enzimas de degradacion de hialuronano

Se proporcionan en la presente memoria composiciones y formulaciones de liberacion sostenida o controlada que contienen una composicion de enzima de degradacion de hialuronano. Tambien se proporcionan en la presente memoria composiciones y formulaciones de liberacion sostenida o controlada que contienen una enzima de degradacion de hialuronano y otro agente terapeutico para la HBP, tal como un inhibidor de la 5-alfa reductasa. La enzima de degradacion de hialuronano en las composiciones y formulaciones de liberacion sostenida son estables y conservan la actividad hialuronidasa que no esta formulada de este modo. Las formulaciones de liberacion sostenida incluyen aquellas que permiten la liberacion sostenida, impiden el acceso a la circulacion general y aumentan la localizacion espedfica en la prostata de las composiciones. Los ejemplos no limitantes de las formulaciones de liberacion sostenida incluyen, por ejemplo, formulaciones de deposito y vesmulas de membrana lipfdica que contienen una enzima de degradacion de hialuronano.

1. Composiciones de enzimas de degradacion de hialuronano

Las composiciones farmaceuticamente aceptables se preparan teniendo en cuenta las aprobaciones para una agencia reguladora u otra agencia preparada de acuerdo con la farmacopea generalmente reconocida para uso en animales y en seres humanos. Los compuestos se pueden formular en cualquier preparacion farmaceutica adecuada para cualquier administracion oral, subcutanea, intravenosa e intraprostatica tal como soluciones, suspensiones, polvos o formulaciones de liberacion sostenida. Tfpicamente, los compuestos se formulan en composiciones farmaceuticas utilizando mecanismos y procedimientos bien conocidos en la tecnica (vease p.ej., Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Cuarta Edicion, 1985, 126. La formulacion debe adaptarse al modo de administracion.

Se contempla en la presente memoria la introduccion directa de la enzima en la prostata caracterizada generalmente por medio de inyeccion o infusion. Los inyectables se pueden preparar en formas convencionales, ya sea como soluciones o suspensiones lfquidas, formas solidas adecuadas para solucion o suspension en lfquido antes de la inyeccion, o como emulsiones. Las preparaciones para administracion intraprostatica incluyen soluciones esteriles listas para inyeccion, productos solubles secos esteriles, tales como polvos liofilizados, listos para ser combinados

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

con un disolvente justo antes del uso, incluyendo comprimidos hipodermicos, suspensiones esteriles listas para inyeccion, productos insolubles secos esteriles listos para ser combinados con un vetuculo justo antes del uso, emulsiones esteriles, geles esteriles y soluciones esteriles que forman geles en el organismo. Las soluciones pueden ser acuosas o no acuosas. Por lo tanto, las composiciones se pueden formular en forma liofilizada o lfquida. Cuando las composiciones se proporcionan en forma liofilizada, se pueden reconstituir justo antes de su uso mediante un tampon apropiado, por ejemplo, una solucion salina esteril.

En un ejemplo, la preparacion farmaceutica puede estar en forma lfquida, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones. Si se proporcionan en forma lfquida, las preparaciones farmaceuticas se pueden proporcionar en forma de una preparacion concentrada para ser diluida hasta una concentracion terapeuticamente eficaz antes de su uso. Tales preparaciones lfquidas se pueden preparar por medios convencionales con aditivos farmaceuticamente aceptables tales como agentes de suspension (p.ej., jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (p.ej., lecitina o acacia); vetuculos no acuosos (p.ej., aceite de almendras, esteres oleosos o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (p.ej., p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o acido sorbico).

En otro ejemplo, las preparaciones farmaceuticas se pueden presentar en forma liofilizada para su reconstitucion con agua u otro vetuculo adecuado antes del uso. Por ejemplo, los polvos liofilizados se pueden reconstituir para su administracion como soluciones, emulsiones y otras mezclas. Tambien se pueden reconstituir y formular como solidos o geles. El polvo liofilizado esteril se prepara disolviendo un compuesto activo en una solucion tampon. La solucion tampon puede contener un excipiente que mejore la estabilidad u otro componente farmacologico del polvo o solucion reconstituida, preparada a partir del polvo. La subsiguiente filtracion en condiciones esteriles de la solucion seguida de liofilizacion bajo condiciones convencionales conocidas por los expertos en la tecnica proporciona la formulacion deseada. En resumen, el polvo liofilizado se prepara disolviendo un excipiente, tal como dextrosa, sorbital, fructosa, jarabe de mafz, xilitol, glicerina, glucosa, sacarosa u otro agente adecuado, en un tampon adecuado, tal como citrato, fosfato de sodio o potasico u otro tampon semejante conocido por los expertos en la tecnica. A continuacion, se anade un compuesto seleccionado a la mezcla resultante, y se agita hasta que se disuelve. La mezcla resultante se filtra en condiciones esteriles o se trata para eliminar las partfculas y asegurar la esterilidad, y se reparte en viales para la liofilizacion. Cada vial contendra una dosis unica o dosis multiples del compuesto. El polvo liofilizado se puede almacenar en condiciones apropiadas, tales como de aproximadamente 4°C a la temperatura ambiente. La reconstitucion de este polvo liofilizado con una solucion tampon proporciona una formulacion para su uso en la administracion.

Las composiciones farmaceuticas pueden incluir portadores tales como un diluyente, coadyuvante, excipiente o vetuculo con el que se administra la hialuronidasa. Los ejemplos de portadores farmaceuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin. Dichas composiciones contendran una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto o agente, generalmente en forma purificada o parcialmente purificada, junto con una cantidad adecuada de portador de modo que proporcione la forma para la administracion apropiada al paciente. Tales portadores farmaceuticos pueden ser lfquidos esteriles, tales como agua y aceites, incluyendo los de petroleo, de origen animal, vegetal o sintetico, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral y aceite de sesamo. El agua es un portador tfpico. Tambien se pueden emplear disoluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como portadores lfquidos, particularmente para soluciones inyectables. Las composiciones pueden contener junto con un ingrediente activo: un diluyente tal como lactosa, sacarosa, fosfato dicalcico o carboximetilcelulosa; un lubricante, tal como estearato de magnesio, estearato de calcio y talco; y un aglutinante tal como almidon, gomas naturales, tales como goma arabiga, gelatina, glucosa, melaza, polivinilpirrolidina, celulosas y derivados de las mismas, povidona, crospovidonas y otros aglutinantes semejantes conocidos por los expertos en la tecnica. Los excipientes farmaceuticos adecuados incluyen almidon, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sflice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada seca, glicerol, propileno, glicol, agua y etanol. Por ejemplo, los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solucion salina, dextrosa, glicerol o etanol. Una composicion, si se desea, tambien puede contener otras cantidades menores de sustancias auxiliares no toxicas tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores de pH, estabilizadores, potenciadores de la solubilidad y otros agentes semejantes, tales como, por ejemplo, acetato de sodio, monolaurato de sorbitan, oleato de trietanolamina y ciclodextrinas.

Los portadores farmaceuticamente aceptables utilizados en preparaciones parenterales incluyen vehfculos acuosos, vehfculos no acuosos, agentes antimicrobianos, agentes osmoticos, tampones, antioxidantes, anestesicos locales, agentes de suspension y dispersion, agentes emulsionantes, agentes secuestrantes o quelantes y otras sustancias farmaceuticamente aceptables. Los ejemplos de vehfculos acuosos incluyen inyeccion de cloruro de sodio, inyeccion de Ringer, inyeccion de dextrosa isotonica, inyeccion de agua esteril, dextrosa e inyeccion de Ringer con lactato anadido. Los vehfculos parenterales no acuosos incluyen aceites fijados de origen vegetal, aceite de semilla de algodon, aceite de mafz, aceite de sesamo y aceite de cacahuete. Se pueden anadir agentes antimicrobianos en concentraciones bacteriostaticas o fungistaticas a preparaciones parenterales envasadas en recipientes de dosis multiples, que incluyen fenoles o cresoles, mercuriales, alcohol bendlico, clorobutanol, esteres de acido p-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

hidroxibenzoico de metilo y propilo, timerosal, cloruro de benzalconio y cloruro de bencetonio. Los agentes isotonicos incluyen cloruro de sodio y dextrosa. Los tampones incluyen fosfato y citrato. Los antioxidantes incluyen bisulfato de sodio. Los anestesicos locales incluyen clorhidrato de procama. Los agentes de suspension y dispersion incluyen carboximetilcelulosa sodica, hidroxipropilmetilcelulosa y polivinilpirrolidona. Los agentes emulsionantes incluyen Polisorbato 80 (TWEEN 80). Un agente secuestrante o quelante de iones metalicos incluye EDTA. Los portadores farmaceuticos tambien incluyen alcohol etilico, polietilenglicol y propilenglicol para vetnculos miscibles con agua e hidroxido de sodio, acido clortndrico, acido cftrico o acido lactico para el ajuste del pH.

Las composiciones de una enzima de degradacion de hialuronano son generalmente estables durante dfas, semanas o anos en un amplio intervalo de temperaturas. Por ejemplo, las composiciones de enzimas de degradacion de hialuronano son estables a temperaturas entre 4°C y 37°C, y en particular a temperaturas de al menos 5°C, 25°C, 30°C o 37°C. Las enzimas de degradacion de hialuronano son estables durante al menos 1 mes, 6 meses, 1 ano 2 anos o mas. Generalmente, las composiciones son estables durante al menos 2 anos entre 2°C y 8°C.

Entre los tipos de estabilizadores que se pueden incluir en las composiciones de enzimas de degradacion de hialuronano estan incluidos aminoacidos, derivados de aminoacidos, aminas, polioles y otros agentes. Los estabilizadores ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, poloxamero 188 (p.ej. Pluronic® F68), polisorbato 80 (PS80), polisorbato 20 (PS20), L-arginina, glutamina, lisina, metionina, prolina, Lys-Lys, Gly-Gly, oxido de trimetilamina, betama, glicerol, sorbitol, manitol, inositol, sacarosa, trehalosa, cloruro de magnesio, cinc, albumina de suero (tal como albumina de suero humano), acido fenilbutmco, taurocolato, polivinilpirrolidona (PVP), dextrano y polietilenglicol (PEG).

En algunos ejemplos, se incluyen oligomeros de acido hialuronico (HA) en las formulaciones proporcionadas en la presente memoria para estabilizar las enzimas de degradacion de hialuronano. El acido hialuronico (HA, tambien conocido como hialuronano y hialuronato) es el sustrato natural para las enzimas de degradacion de hialuronano tales como las hialuronidasas solubles, incluyendo rHuPH20. El HA es un glicosaminoglicano no sulfatado que esta ampliamente distribuido a lo largo de los tejidos conectivos, epiteliales y neurales. Es un polfmero de hasta 25.000 unidades disacaridas, compuestas a su vez de acido D-glucuronico y D-N-acetilglucosamina. El peso molecular del HA oscila entre aproximadamente 5 kDa y 20.000 kDa. Mediante la catalisis de la hidrolisis de hialuronano, las enzimas de degradacion de hialuronano, por ejemplo hialuronidasas solubles tales como rHuPH20, disminuyen la viscosidad del hialuronano, aumentando de este modo la permeabilidad del tejido y aumentando la tasa de absorcion de fluidos administrados por via parenteral.

Como se demuestra en la presente memoria, el acido hialuronico (HA) es un estabilizador eficaz de enzimas de degradacion de hialuronano, por ejemplo hialuronidasas solubles tales como rHuPH20. En particular, el hialuronano es un estabilizador eficaz en presencia de agentes y condiciones desestabilizantes, tales como, por ejemplo, baja concentracion de sal, pH elevado y temperaturas elevadas. De este modo, se proporcionan en la presente memoria composiciones que contienen HA y una enzima de degradacion de hialuronano. Se puede utilizar cualquier tamano de HA en las composiciones como estabilizador. En algunos ejemplos, el peso molecular del HA es desde, o desde aproximadamente 5 kDa hasta, o hasta aproximadamente 5.000 kDa; desde, o desde aproximadamente 5 kDa hasta, o hasta aproximadamente 1.000 kDa; desde, o desde aproximadamente 5 kDa hasta, o hasta aproximadamente 500 kDa; o desde, o desde aproximadamente 5 kDa hasta, o hasta aproximadamente 200 kDa. Por ejemplo, se incluyen entre las composiciones proporcionadas en la presente memoria de HA y una enzima de degradacion de hialuronano, tal como una hialuronidasa soluble (p.ej. RHuPH20), aquellas que contienen HA que tiene un peso molecular de al menos o aproximadamente al menos 5 kDa, 6 kDa, 7 kDa, 8 kDa, 9 kDa, 10 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 30 kDa, 40 kDa, 50 KDa, 60 kDa, 70 kDa, 80 kDa, 90 kDa, 100 kDa, 120 kDa, 140 kDa, 160 kDa, 180 kDa, 200 kDa, 220 kDa, 240 kDa, 260 kDa, 280 kDa, 300 kDa, 3500 kDa, 400 kDa, 450 kDa, o 500 kDa.

Los oligomeros de HA se incluyen en composiciones de una enzima de degradacion de hialuronano de o entre 1 mg/mL y 100 mg/mL, tal como 1 mg/mL y 20 mg/mL, y en particular al menos o aproximadamente al menos 1 mg/mL, 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg/mL, 10 mg/mL, 11 mg/mL, 12 mg/mL, 13 mg/mL, 14 mg/mL, 14 mg/mL, 15 mg/mL, 16 mg/mL, 17 mg/mL, 18 mg/mL, 19 mg/mL, 20 mg/mL o mas HA. Las formulaciones estables ilustrativas de una enzima de degradacion de hialuronano, por ejemplo una hialuronidasa soluble tal como rHuPH20, incluyen desde o desde aproximadamente 8 mg/mL hasta o hasta aproximadamente 15 mg/mL de HA, tal como, por ejemplo, 10 mg/mL o aproximadamente 10 mg/mL o 15 mg/mL o aproximadamente 15 mg/mL. En algunos ejemplos, la razon molar de HA con respecto a la enzima de degradacion de hialuronano es o es de aproximadamente 5000:1, 4000:1, 3000:1, 2000:1, 1900:1, 1800:1, 1700:1, 1650:1, 1600:1, 1500:1, 1400:1, 1300:1, 1200:1, 1100:1, 1000:1, 900:1, 800:1, 700:1, 600:1, 500:1, 100:1, 90:1, 80:1, 70:1, 60:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 10:1, 1:1, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:500, 1:600, 1:700, 1:800, 1:900, 1:1000, 1:1100, 1:1200, 1:1300, 1:1400, 1:1500, 1:1600, 1:1700, 1:1800, 1:1900, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000 o menos.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

como la proporcionada en la presente se formula con uno o mas de EDTA, NaCI, CaCl2, histidina, lactosa, albumina, Pluronic® F68, TWEEN® y/u otros detergentes u otros agentes similares. Por ejemplo, las composiciones proporcionadas en la presente memoria pueden contener uno o mas tampones de pH (tales como, por ejemplo, histidina, fosfato u otros tampones), o tampon acido (tal como acetato, citrato, piruvato, Gly-HCl, succinato, lactato, maleato u otros tampones), estabilizadores, agentes quelantes, tales como acido etilendiaminotetraacetico, etilendiaminotetraacetato o EDTA de calcio, captador de oxfgeno, tal como metionina, acido ascorbico/ascorbato, acido cftrico/citrato o albumina, y/o un conservante, tal como un conservante que contiene un anillo aromatico (p.ej. fenol o cresol).

Por ejemplo, los tampones que se pueden incluir en las co-formulaciones proporcionadas en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, Tris (Trometamina), histidina, tampones de fosfato, tales como fosfato de sodio dibasico y tampones de citrato. Tales agentes tamponadores pueden estar presentes a concentraciones entre o aproximadamente 1 mM y 100 mM, por ejemplo, al menos o aproximadamente al menos o aproximadamente o 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM , 18 mM, 19 mM, 20 mM , 25 mM , 30 mM , 35 mM, 40 mM , 45 mM , 50 mM , 55 mM, 60 mM, 65 mM , 70 mM , 75 mM, o mas.

Los estabilizadores ilustrativos que son utiles para composiciones que contienen una enzima de degradacion de hialuronano incluyen detergentes, tales como polisorbatos y protemas tales como albumina de suero humano. Las concentraciones ilustrativas de albumina de suero que son utiles en las composiciones de la presente invencion incluyen entre 0,1 mg/mL y 1 mg/mL, por ejemplo al menos o 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,7 mg/mL, 0,8 mg/mL, 0,9 mg/mL o 1 mg/mL, pero puede ser mas o menos. Los polisorbatos tambien pueden estar presentes en las composiciones, por ejemplo, a concentraciones de, o de aproximadamente 0,001% a 0,1%, por ejemplo al menos o 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008%, 0,009%, 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09% o 0,1%. Tambien puede estar presente un agente quelante metalico, tal como EDTA de calcio (CaEDTA), tal como por ejemplo, a concentraciones comprendidas entre aproximadamente 0,02 mM y 20 mM, tal como al menos o 0,02 mM, 0,04 mM, 0,06 mM, 0,08 mM, 0,1 mM, 0,2 mM, 0,3 mM, 0,4 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20

mM o mas. El pH y la osmolaridad de las composiciones pueden ser ajustados por un experto en la materia para

optimizar las condiciones para la actividad deseada y la estabilidad de la composicion. En algunos ejemplos, las composiciones proporcionadas en la presente memoria tienen una osmolaridad de, o de aproximadamente, entre 100 mOsm/kg y 500 mOsm/kg, por ejemplo al menos, o aproximadamente 100 mOsm/kg, 120 mOsm/kg, 140 mOsm/kg, 160 mOsm/Kg, 180 mOsm/kg, 200 mOsm/kg, 220 mOsm/kg, 260 mOsm/kg, 280 mOsm/kg, 300

mOsm/kg, 320 mOsm/kg, 360 mOsm/kg, 380 mOsm/kg, 400 mOsm/kg, 420 mOsm/kg, 440 mOsm/kg, 460

mOsm/kg, 500 o mas mOsm/kg, y un pH de, o de aproximadamente, 6, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8 o 8.

Generalmente se proporciona NaCl en las formulaciones de la presente invencion, por ejemplo, en una cantidad que es, o es aproximadamente 100 mM - 150 mM o mas. Por ejemplo, una formulacion ilustrativa puede contener histidina 10 mM o aproximadamente 10 mM y/o NaCl 130 mM o aproximadamente 130 mM. Otras formulaciones pueden contener ademas o alternativamente lactosa, por ejemplo, a, o aproximadamente a, 13 mg/mL. Adicionalmente, puede estar presente en la formulacion un agente anti-bacteriano o antifungico, incluyendo, pero no limitado a timerosal. Las formulaciones pueden contener adicionalmente albumina, Pluronic® F68, TWEEN® y/u otro detergente. Las formulaciones se proporcionan a un pH que es, o esta aproximadamente entre, 6,0 y 7,4, por ejemplo al menos o 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3 o 7,4, generalmente que es, o es aproximadamente, pH 6,5. Las formulaciones concentradas de una enzima de degradacion de hialuronano, por ejemplo una hialuronidasa soluble tal como rHuPH20 para su uso en la presente invencion, se diluyen generalmente en una solucion salina u otra solucion salina tamponada antes de la administracion para mantener la concentracion de sal apropiada.

Las composiciones farmaceuticas de hialuronidasas solubles, por ejemplo, la PH20 recombinante denominada rHuPH20, son conocidas en la tecnica (veanse p.ej., las Solicitud de los Estados Unidos publicadas Num. 20040268425, 20050260186 y 20060104968).

2. Formulaciones de liberacion sostenida

Las composiciones enzimaticas de degradacion de hialuronano se proporcionan en formulaciones de liberacion sostenida o controlada. En algunos ejemplos, las formulaciones de liberacion sostenida o controlada tambien contienen un segundo agente terapeutico, por ejemplo, un agente terapeutico para la HBP. Las formulaciones se pueden formular para inyeccion local. Por ejemplo, las formulaciones se formulan para inyecciones intraprostaticas, tales como mediante inyeccion transrectal, transuretral o transperineal en la prostata.

Las formulaciones de liberacion sostenida ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, vesfculas lipfdicas que incluyen vesfculas unilamelares (VUL) y vesfculas multilamelares (VML), complejos farmaco-resina (resinatos) y formulaciones de deposito. Tales formulaciones de liberacion sostenida o controlada son conocidas por un experto

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

en la tecnica. Por ejemplo, se puede encapsular una enzima de degradacion de hialuronano en un sistema de dispersion coloidal o en cristales estabilizados con poUmero. Los sistemas de dispersion coloidal utiles incluyen nanocapsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lfpidos, incluyendo emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Algunos ejemplos de productos conjugados de lfpido-polfmero y liposomas se describen en la Patente de Estados Unidos Num. 5.631.018, que se incorpora a la presente memoria como referencia en su totalidad. Los ejemplos de los procedimientos para fabricar liposomas multilamelares y unilamelares son conocidos en la tecnica (veanse p.ej. las Patentes de Estados Unidos Num. 4.522.803, 4.310.506, 4.235.871, 4.224.179, 4.078.052, 4.394.372, 4.308.166, 4.485.054 y 4.508.703). Otros ejemplos de vehuculos de suministro de liberacion lenta son matrices de hidrogel biodegradables (Patente de Estados Unidos Num. 5.041.292), productos conjugados de polfmero dendntico (Patente de Estados Unidos Num. 5.714.166), y liposomas multivesiculares (Depofoam®, Depotech, San Diego, Calif.) (Patentes de Estados Unidos Num. 5.723.147 y 5.766.627). Un tipo de microesferas adecuadas para encapsular las composiciones para inyeccion local, por ejemplo en la prostata, son microesferas de poli (D,L-lactida), como describen Fletcher, D. Anesth. Analg. 84: 90- 94 (1997).

En particular, las formulaciones de liberacion sostenida proporcionadas en la presente memoria se pueden disenar de tal manera que la enzima (u otro agente o agentes) se libere a una velocidad predeterminada o de tal manera que se mantenga un nivel constante de farmaco durante un penodo de tiempo espedfico. En particular, las formulaciones permiten una liberacion controlada de la enzima de degradacion de hialuronano (u otro agente o agentes) al tejido local, tal como tejido prostatico. La velocidad de liberacion es suficientemente lenta de manera que el efecto resultante de la enzima sobre la degradacion de HA en el tejido (p.ej. estroma) se prolongue durante muchas horas, dfas, semanas o meses. Por ejemplo, la liberacion de la hialuronidasa y otros agentes terapeuticos una vez introducidos en la prostata puede ser de aproximadamente 24 horas, 36 horas o 48 horas a aproximadamente 90 dfas. Por ejemplo, se proporcionan formulaciones de liberacion sostenida que permiten dosificar la formulacion al menos una vez por semana, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada cuatro meses, una vez cada cinco meses, una vez cada seis meses, una vez cada siete meses, una vez cada ocho meses, una vez cada nueve meses, una vez cada diez meses, una vez cada once meses, o una vez al ano por medio de inyeccion local en el tejido, por ejemplo por medio de inyeccion intraprostatica. La velocidad de liberacion y la duracion optimas para las formulaciones de liberacion sostenida de una enzima de degradacion de hialuronano pueden ser determinadas por los expertos en la tecnica basandose en las propiedades farmacologicas de los agentes espedficos, la gravedad de la afeccion, la edad y la salud del sujeto, y otros factores.

Esta dentro del nivel de un experto en la tecnica determinar empmcamente si la velocidad de liberacion de la enzima o el nivel del farmaco son suficientes para producir un efecto sobre el tejido local, tal como el tejido prostatico. Por ejemplo, se puede examinar el tamano de la prostata (p.ej. retraccion). En otros ejemplos, la degradacion de HA en el tejido local (p.ej. estroma) se puede controlar con el tiempo mediante histologfa, u otro metodo, de una muestra de tejido, por ejemplo una muestra de prostata, tal como de una muestra de biopsia. En un ejemplo adicional, se puede medir la actividad de la enzima de degradacion de hialuronano liberada en la sangre o suero. Se puede realizar cualquier analisis conocido por un experto en la tecnica para medir la hialuronidasa en el plasma. Por ejemplo, se puede realizar un analisis de microturbidez o un analisis enzimatico sobre la protema en plasma. Se entiende que el plasma contiene normalmente enzimas hialuronidasa. Tales enzimas hialuronidasa del plasma tienen tfpicamente actividad a un pH acido (Patente de Estados Unidos Num. 7.105.330). Por lo tanto, antes del tratamiento con una formulacion de liberacion sostenida como se describe en la presente memoria, se deben determinar los niveles plasmaticos de hialuronidasa y utilizarlos como referencia. Se pueden comparar mediciones posteriores de los niveles de hialuronidasa plasmatica despues del tratamiento con los niveles previos a los tratamientos. Alternativamente, el analisis se puede realizar en condiciones de pH que suprimen la actividad de hialuronidasa lisosomica endogena en el plasma, que normalmente muestra actividad a pH acido. Asf, cuando la enzima de degradacion de hialuronano es activa a pH neutro (p.ej. PH20 humana), solo se mide el nivel de la enzima activa en condiciones neutras.

Adicionalmente, las formulaciones de liberacion sostenida proporcionadas en la presente memoria se pueden disenar de tal manera que la enzima de degradacion de hialuronano sea relativamente estable y activa. Por ejemplo, se proporcionan las formulaciones de liberacion sostenida de manera que la actividad de la enzima de degradacion de hialuronano total de la formulacion sea de, o este entre, 25.000 U/mg y 200.000 U/mg, por ejemplo 40.000 U/mg y 150.000 U/mg, tal como 75.000 U/Mg y 120.000 U/mg y en particular al menos o 40.000 U/mg, 50.000 U/mg, 60.000 U/mg, 70.000 U/mg, 80.000 U/mg, 90.000 U/mg, 100.000 U/mg, 110.000 U/mg, 120.000 U/mg, 130.000 U/mg, 140.000 U/mg, 150.000 U/mg o mas. En particular, las formulaciones de liberacion sostenida estan disenadas de modo que la estabilidad se produzca a temperaturas de o entre 2°C y 37°C, por ejemplo, de 4°C a 25°C y en particular de o entre 2°C a 8°C o de o entre 20°C y 30°C, tal como, o aproximadamente, 25°C. En los ejemplos particulares, las formulaciones de liberacion sostenida son estables en condiciones de almacenamiento durante al menos 1 semana, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, siete meses, ocho meses, nueve meses, diez meses, once meses, 1 ano, 2 anos o mas.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

enzima de degradacion de hialuronano y otro agente terapeutico para tratar una enfermedad o afeccion deseadas. Por ejemplo, si la enfermedad o afeccion es la HBP, se pueden preparar formulaciones de liberacion sostenida que, ademas de una enzima de degradacion de hialuronano, tambien contienen otro agente adecuado para el tratamiento de la HBP. Las formulaciones combinadas de liberacion sostenida proporcionan una actividad prolongada de larga duracion de al menos dos agentes para el tratamiento de la enfermedad o afeccion. La terapia combinada para el tratamiento de la HBP se describe adicionalmente en la Seccion F de la presente memoria. Por lo tanto, cualquiera de los agentes terapeuticos expuestos en la Seccion F puede ser co-formulado con una enzima de degradacion de hialuronano en las formulaciones de liberacion sostenida de la presente memoria.

A continuacion se proporcionan ejemplos no limitantes de formulaciones de liberacion sostenida y formulaciones ilustrativas.

a. Formulacion en gel de deposito

Las composiciones de enzimas de degradacion de hialuronano se pueden administrar en forma de una formulacion en gel de deposito que permite la liberacion sostenida, impide el acceso a la circulacion general y aumenta la localizacion espedfica de la prostata de las composiciones. Los expertos en la tecnica estan familiarizados con materiales y metodos que se pueden utilizar para formular farmacos individuales y combinaciones como lfquidos inyectables, geles o pastas que se pueden depositar en el organismo con velocidades de liberacion y duraciones predeterminadas.

Las composiciones se pueden proporcionar en un gel o formar un gel despues de la administracion, que es tfpicamente por medio de inyeccion. Los geles se pueden suministrar como composiciones lfquidas que contienen un material que forma un gel despues de la introduccion en el organismo. Se puede preparar una solucion que contiene el material formador de gel y la enzima de degradacion de hialuronano combinando el material formador de gel y la enzima en solucion utilizando cualquier metodo adecuado, p.ej., anadiendo la enzima a una solucion que contiene el material formador de gel. La solucion forma un gel despues de la introduccion en el organismo, p.ej., al contactar con un fluido fisiologico.

La liberacion de los agentes desde el gel puede ocurrir por cualquier mecanismo, p.ej., por difusion de los agentes fuera del gel, como resultado de la rotura del gel, o ambos. El material formador de gel puede contener tambien algunos otros materiales, tales como un solido, que pueden modular la liberacion de la enzima u otros agentes terapeuticos.

Se puede utilizar una variedad de materiales formadores de gel diferentes. Generalmente, el gel es un hidrogel, un gel que contiene una cantidad sustancial de agua, es biocompatible y el gel es biodegradable. Los materiales formadores de gel incluyen, pero no se limitan a, polisacaridos tales como alginato y formas modificadas del mismo, otros precursores polimericos de hidrogeles incluyen polfmeros de bloque de poli(oxido de etileno)-polipropilenglicol tal como Pluronics® o Tetronics® (BASF, Florham Park, Nueva Jersey) que se entrecruzan mediante enlaces de hidrogeno y/o por cambio de temperatura, mezclas de polfmeros, p.ej., una mezcla de poli(oxido de etileno) y poli(acido acnlico) que se gelifica por enlaces de hidrogeno durante el mezclado y otros materiales formadores de gel solubles (Patente de Estados Unidos Num. 6.129.761). Otros hidrogeles adecuados se describen en Peppas, N.A., et al. (2000) Eur J Pharm Biopharm. 50(1): 27-46; Megeed, Z., et al., (2002) Pharm Res. 19(7): 954-9 y Patente de los Estados Unidos Num. 6129761. Un aditivo adecuado para formar un gel inyectable es un agente gelificante de calidad medica. Uno de tales agentes gelificantes es el polvo esteril Gelfoam® (Pfizer, Nueva York). Gelfoam® es un polvo de gelatina que contiene partfculas en el intervalo de tamano de 40-60 micras.

Las formulaciones en gel de deposito para su uso en las formulaciones de degradacion de hialuronano proporcionadas en la presente memoria tambien pueden incluir composiciones en gel de fosfolfpidos que contienen de 20 a 80%, tal como de 25 a 70% en peso, por ejemplo de 30 a 60% en peso de uno o mas fosfolfpidos y de 0,1 a 70% en peso de agua de manera que la composicion en gel puede ser extruida a traves de una aguja para inyectables. Los depositos de fosfolfpidos son geles monofasicos que pueden ser acuosos o sustancialmente anhidros. Asf, en algunos ejemplos, en lugar de agua, las composiciones en gel de fosfolfpidos monofasicos se pueden preparar con 5 a 60%, tal como 10 a 50%, por ejemplo 20 a 40% en peso de un componente no acuoso. El componente no acuoso puede ser un azucar, un aceite o un disolvente. Por ejemplo, el aceite puede ser aceite de sesamo, aceite de cadena media, oleato de etilo o triglicerido sintetico. Tales composiciones en gel de deposito de fosfolfpidos monofasicos se describen con detalle en la Solicitud Internacional Publicada PCT Num. WO2011/075623. Tales formulaciones en gel de deposito son particularmente utiles para disolver agentes insolubles en agua o hidrofobos, tales como finasterida y otros agentes terapeuticos para la HBP. Las composiciones en gel monofasicas se pueden utilizar para preparar formulaciones de deposito que contienen una enzima de degradacion de hialuronano y otro farmaco terapeutico que es un farmaco hidrofobo, tal como finasterida.

b. Liposomas multivesiculares (LMV)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Se proporcionan en la presente memoria vesfculas de membrana sinteticas, tales como formulaciones de liposomas multivesiculares (LMV), que tienen encapsulada en los mismos una enzima de degradacion de hialuronano, y en particular una hialuronidasa tal como PH20 o PH20 soluble o recombinante. En algunos ejemplos descritos en la presente memoria, se proporcionan coformulaciones de LMV que contienen adicionalmente la encapsulacion de otro farmaco terapeutico. Las formulaciones de liposomas multivesiculares contienen partfculas microscopicas, esfericas compuestas por numerosas camaras acuosas no concentricas que encapsulan un farmaco o un agente que se va a suministrar. Las camaras individuales estan separadas por membranas de bicapas lipfdicas compuestas por duplicados sinteticos o lfpidos naturales, dando como resultado un vetuculo de suministro que es biocompatible y biodegradable. En los ejemplos de la presente memoria, las enzimas de degradacion de hialuronano u otros agentes terapeuticos que son hidrofilos se pueden encapsular en la fase acuosa. En otros ejemplos de la presente memoria, se proporciona una co-formulacion de LMV por co-encapsulacion de un farmaco hidrofilo y un farmaco hidrofobo en la misma formulacion. Por ejemplo, en tales co-formulaciones de LMV, la enzima de degradacion de hialuronano se encapsula en la fase acuosa y un farmaco hidrofobo, por ejemplo finasterida o dutasterida, se intercala en la fase lipfdica.

Las vesfculas de membrana se pueden utilizar en metodos para suministrar una enzima de degradacion de hialuronano, y si se desea tambien otro agente, a un sujeto para ser utilizado como un coadyuvante, agente de extension o terapeutico. En particular, las vesfculas de membrana se proporcionan en composiciones farmaceuticas para su uso como un agente terapeutico. Por ejemplo, las enzimas de degradacion de hialuronano, y en particular las vesfculas de membrana que contienen enzimas de degradacion de hialuronano, se pueden utilizar en metodos, usos y procedimientos para el tratamiento de la hiperplasia benigna de prostata (HBP). Los ejemplos de vesfculas de membrana son aquellas que logran liberacion controlada o sostenida de la enzima de degradacion de hialuronano.

Los liposomas multivesiculares (LMV) proporcionados en la presente memoria se fabrican basandose en procedimientos conocidos por los expertos en la tecnica (vease p.ej. la Patente de Estados Unidos Num. 5.723.147; 5.766.627; 6.106.858; 6.306.432; 5.962.016; 6.241.999; la Solicitud de Patente de Estados Unidos Num. US2007/0235889 y US2010/030550; y la Solicitud Internacional publicada Num. WO02/096368). En la generacion de tales liposomas, cualquiera de las composiciones enzimaticas de degradacion de hialuronano descritas anteriormente en la Seccion C, o conocidas por un experto en la tecnica, se pueden encapsular dentro de los liposomas multivesiculares. En resumen, una emulsion de "agua-en-aceite" que contiene una enzima de degradacion de hialuronano que se va a encapsular se prepara primero disolviendo lfpidos anfipaticos y lfpidos neutros en un disolvente organico volatil para el componente lipfdico, anadiendo al componente lipfdico un primer componente acuoso no miscible que contiene la enzima y/u otro agente que se vaya a encapsular y una o mas moleculas coadyuvantes, es decir excipientes osmoticos, que proporcionan propiedades utiles y beneficiosas a los LMV. La mezcla se emulsiona mediante mezclado, por ejemplo, mecanicamente mediante mezclado, agitacion, sonicacion, por energfa ultrasonica, atomizacion con boquilla, o combinaciones de los mismos. La enzima de degradacion de hialuronano que se va a encapsular puede estar contenida en el primer componente acuoso o el componente lipfdico o ambos. La emulsion de agua en aceite en su totalidad se mezcla a continuacion con el segundo componente acuoso y despues se agita mecanicamente, como se ha indicado anteriormente, para formar esferas de disolvente suspendidas en el segundo componente acuoso. Las esferulas de disolvente contienen multiples gotitas acuosas con la sustancia que se va a encapsular disuelta en ellas. El disolvente organico volatil se elimina, por ejemplo por evaporacion, de las esferulas. Cuando el disolvente se evapora completamente, se forman liposomas multivesiculares. Los LMV se resuspenden, se lavan y se almacenan en una tercera solucion acuosa tal como solucion salina o tampon adecuado que permite la estabilidad de las partfculas a temperaturas de almacenamiento. Los gases representativos satisfactorios para su uso en la evaporacion del disolvente incluyen nitrogeno, helio, argon, oxfgeno, hidrogeno y dioxido de carbono. Alternativamente, el disolvente organico se puede eliminar por purgado, evaporacion rotatoria o membranas selectivas para el disolvente.

Generalmente, la encapsulacion satisfactoria solo se puede conseguir para moleculas hidrofilas. Como se describe mas adelante, se encuentra en la presente memoria que las moleculas hidrofobas se pueden incorporar a la bicapa lipfdica disolviendo los lfpidos y el farmaco hidrofobo en un disolvente organico antes de mezclar con un primer componente acuoso que contiene el farmaco hidrofilo (p.ej. una enzima de degradacion de hialuronano). Por lo tanto, los metodos de la presente memoria se pueden utilizar para generar tambien co-formulaciones de LMV por co- encapsulacion de un farmaco hidrofobo e hidrofilo en la misma formulacion.

Se pueden utilizar muchos tipos diferentes de disolventes hidrofobicos volatiles, tales como eteres, eteres halogenados, hidrocarburos, esteres, hidrocarburos halogenados o Freones como disolvente de la fase lipfdica. Por ejemplo, se pueden utilizar eter dietflico, isopropilo y otros eteres, cloroformo, cloruro de metileno, tetrahidrofurano, acetato de etilo, Forane y combinaciones de los mismos para preparar liposomas multivesiculares.

Se pueden utilizar diversos tipos de lfpidos para elaborar liposomas multivesiculares, siempre que el componente lipfdico contenga un lfpido neutro y un lfpido anfipatico. Los ejemplos de lfpidos neutros incluyen digliceridos, tales como diolefina, dipalmitolema; esteres de propilenglicol tales como diesteres mixtos de acidos capnlico/caprico sobre propilenglicol; trigliceridos tales como trioleina, tripalmitolema, trilinolema, tricaprilina y trilaurina; aceites vegetales,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

tales como aceite de soja; grasa o manteca de ternera; escualeno; tocoferol; y combinaciones de los mismos. En los ejemplos particulares, los Kpidos neutros de liberacion lenta incluyen, por ejemplo, triolema, tripalmitolema, tririristolema, trilaurina y tricaprina. Los lfpidos neutros de liberacion rapida incluyen, por ejemplo, tricaprilina y tricaproma y mezclas de las mismas. Los ejemplos de lfpidos anfipaticos incluyen aquellos con carga neta negativa, carga neta cero y carga positiva neta a pH 7,4. Estos incluyen lfpidos zwitterionicos, acidos o cationicos. Tales lfpidos anfipaticos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, fosfatidilglicerol (PG), cardiolipina (CL), fosfatidilserina (PS), acido fosfatfdico (PA), fosfatidilinositol, fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), esfingomielina, diaciltrimetilamoniopropano DITAP) y combinaciones de los mismos. Adicionalmente, se pueden utilizar colesterol o esteroles vegetales para elaborar liposomas multivesiculares. El componente lipfdico elegido tambien puede ser uno que tenga un punto de fusion por debajo de la temperatura a la que se va a almacenar y/o utilizar el LMV (vease p.ej. la Patente de Estados Unidos Num. 5.962.016).

En los ejemplos de las vesfculas de membrana sintetica proporcionadas en la presente memoria, la enzima de degradacion de hialuronano, y en particular una hialuronidasa tal como PH20 o PH20 recombinante, se encapsula en presencia de uno o mas excipientes que conservan o aumentan la estabilidad de la enzima y/o aumentan la velocidad de encapsulacion de la enzima. En ejemplos particulares, el excipiente es acido hialuronico (tambien denominado hialuronano, HA). Por ejemplo, se proporcionan en la presente memoria liposomas multivesiculares (LMV) para la liberacion sostenida o controlada que han encapsulado en ellos una enzima de degradacion de hialuronano y en particular una hialuronidasa tal como PH20 o PH20 recombinante y uno o mas excipientes que conservan o mejoran la estabilidad de la enzima y/o aumentan la velocidad de encapsulacion de la enzima.

Los ejemplos de los mezcladores que se pueden utilizar en los metodos proporcionados son los homogeneizadores (tambien llamados cizallas), por ejemplo, homogeneizadores de laboratorio de alta cizalla, que se pueden utilizar, por ejemplo, para emulsionar la primera fase acuosa y el disolvente, p.ej., cloroformo, o emulsionar la primera emulsion con la segunda fase acuosa. Los ejemplos de homogeneizadores que se pueden utilizar en los metodos proporcionados son homogeneizadores de alta cizalla, por ejemplo, mezcladores Omni comercializados por Omni International, Kennesaw, GA, por ejemplo, un homogeneizador Omni Macro o un homogeneizador Omni Macro ES, que tienen motores de 1.800 vatios, control de velocidad de 1.000 a 20.000 rpm, volumen de procesamiento de muestras de 0,25 mL a 30 L, y conjuntos de cuchillas variables para mezclar.

El tamano de partfcula del LMV resultante puede variar. Esta dentro del nivel de un experto en la tecnica determinar el tamano de una vesfcula de membrana y seleccionar una vesfcula basandose en una aplicacion deseada. Por ejemplo, se puede realizar el analisis del tamano de partfcula, por ejemplo utilizando un analizador de tamano de partfcula de difraccion laser. En algunos ejemplos, las vesfculas de membrana proporcionadas en la presente memoria tienen un diametro medio que esta comprendido entre aproximadamente 0,5 pm y 100 pm, por ejemplo al menos, o aproximadamente 0,5 pm, 1 pm, 5 pm, 10 pm, 15 pm, 20 pM, 50 pm o 100 pm.

Las formulaciones o co-formulaciones de LMV resultantes se pueden diluir o suspender adicionalmente por adicion de un medio de suspension u otro portador biologicamente aceptable para obtener formulaciones de deposito de liberacion lenta inyectables o implantables. Los portadores adecuados comunes incluyen soluciones suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas. Los ejemplos de soluciones no acuosas son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y esteres organicos inyectables tales como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones acuosas alcoholicas, emulsiones o suspensiones, incluyendo medios salinos y tamponados. Los vehfculos parenterales incluyen soluciones de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y solucion de Ringer con lactato anadido. Los vehfculos intravenosos incluyen reponedores de lfquidos y nutrientes, reponedores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer). Tambien pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes (vease, Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16a Ed., A. Oslo, ed., Mack, Easton, Pa. 1980).

En la presente memoria se proporcionan composiciones estables de formulaciones de LMV encapsulados con una enzima de degradacion de hialuronano. Tambien se proporcionan composiciones estables de co-formulaciones de LMV encapsulados con una enzima de degradacion de hialuronano y un farmaco hidrofobo, en particular un farmaco tal como finasterida, diasturida u otro farmaco adecuado. Las formulaciones o co-formulaciones son estables entre 2°C y 32°C durante al menos un mes, al menos dos meses, al menos tres meses, al menos cuatro meses, al menos cinco meses, al menos seis meses, al menos siete meses, al menos ocho meses, al menos nueve meses, al menos diez meses, al menos once meses, al menos un ano, al menos dos anos o mas. Por ejemplo, las formulaciones o co- formulaciones son estables a una temperatura de 2°C a 8°C durante al menos un ano o al menos 2 anos. En otro ejemplo, las formulaciones de co-formulaciones son estables a 28°C-32°C durante al menos 6 meses o al menos un ano.

i. Parametros para mejorar la encapsulacion, la estabilidad y la velocidad de liberacion

Al generar formulaciones de LMV como se ha descrito anteriormente, se ha encontrado en la presente memoria que la eficacia de encapsulacion, la estabilidad y la velocidad de liberacion de una enzima de degradacion de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

hialuronano pueden ser modificadas (p.ej. aumentadas o mejoradas) basandose en parametros y condiciones particulares. Por ejemplo, se pueden emplear metodos para aumentar la eficacia de encapsulacion de la enzima de degradacion de hialuronano. La eficacia con la que un agente (p.ej. enzima de degradacion de hialuronano) se encapsula se puede modular modificando el numero de carbonos en la cadena carbonada de al menos uno de los lfpidos anfipaticos utilizados en la preparacion de la formulacion liposomal. Por ejemplo, el eficacia de la encapsulacion se puede incrementar aumentando el numero de carbonos en la cadena carbonada de al menos uno de los lfpidos anfipaticos utilizados en la preparacion de la formulacion liposomal (vease p.ej., la Patente de Estados Unidos Num. 6.241.999). Una lista no limitante de lfpidos anfipaticos de cadena larga que se pueden utilizar en la generacion de liposomas multivesiculares en la presente invencion incluye, por ejemplo: DOPC o DC18:1PC = 1,2- dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina; DLPC o DC12:0pC = 1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfocolina; DMPC o DC14:0PC = 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina; DPPC o DC16:0PC=1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina; DSPC o DC18:0PC=1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina; DAPC o DC20:0PC=1,2diaraquidoil-sn-glicero-3-fosfocolina; DBPC o DC22:0PC=1,2-dibehenoil-sn-glicero-3-fosfocolina; DC14:1PC=1,2-dimiristoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina; DC16:1PC=1,2-dipalmitoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina; DC20:1PC=1,2-dieicosenoil-sn-glicero-3-fosfocolina;

DC22:1PC=1,2-dierucoil-sn-glicero-3-fosfocolina; DPPG=1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol; DOPG=1,2-dioleol- sn-glicero-3-fosfoglicerol.

La velocidad de liberacion de un agente activo (p.ej. enzima de degradacion de hialuronano) a partir de una formulacion liposomal se puede modificar mediante la seleccion del lfpido anfipatico, el lfpido formador de membrana aceptado, mediante la manipulacion de la razon fosfolfpido/colesterol, mediante la modulacion de la razon molar de componentes lfpidos neutros de liberacion lenta y liberacion rapida y/o por otros factores conocidos por los expertos en la tecnica (vease p.ej. la Patente de Estados Unidos Num. 5.962.016). Por ejemplo, el componente lipfdico neutro en los liposomas puede ser de 0% a 100% de los componentes de liberacion lenta y rapida. Por ejemplo, el componente lipfdico neutro puede ser una mezcla de un lfpido neutro de liberacion lenta y un lfpido neutro de liberacion rapida en una razon molar de 0,0:1,0 a 1,0:0,0 por ejemplo de aproximadamente 1:1 a 1:100 o de 1:4 a 1:18.

La velocidad de liberacion del agente activo (p.ej. enzima) puede ser determinada o controlada. Por ejemplo, las velocidades de liberacion se pueden realizar sobre la suspension de lfpidos in vitro en solucion salina, un tampon adecuado o en medio de plasma o de tipo plasma incubado a temperaturas variadas (p.ej. al menos, o aproximadamente 4°C o al menos, o aproximadamente 37°C) durante tiempos variados ('p.ej. al menos 10 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 24 horas, 2 dfas, 3 dfas, 4 dfas, 5 dfas, 6 dfas, 7 dfas, 8 dfas, 9 dfas, 10 dfas, 30 dfas o mas). Despues de la incubacion durante el tiempo y/o a la temperatura designados, los tubos incubados se pueden centrifugar y la solucion sobrenadante se recoge y se analiza. La velocidad de liberacion de la enzima se puede determinar, por ejemplo, por deteccion o cuantificacion de la protema y/o mediante determinacion de la actividad hialuronidasa. En particular, la conjugacion de la enzima a un marca u otro radical detectable puede ayudar en la deteccion de las enzimas liberadas. Un ejemplo de un radical detectable es una etiqueta fluorescente (p.ej. GFP o Alexa488). Tambien se pueden realizar analisis similares in vivo. Por ejemplo, una enzima de degradacion de hialuronano marcada u otra enzima detectable (p.ej. PH20 Alexa488) se pueden encapsular en una suspension de LMV en la presente memoria, y su liberacion se puede controlar directamente en el sitio local de la prostata.

La velocidad de liberacion particular se puede modular empmcamente alterando los componentes lipfdicos, la concentracion de enzima de degradacion de hialuronano, anadiendo el excipiente y/u otros parametros descritos en la presente memoria o conocidos en la tecnica dependiendo de la aplicacion particular de interes. Por lo tanto, la velocidad de liberacion de la enzima puede ser controlada. Para los fines de la presente memoria, la velocidad de liberacion de la enzima de degradacion de hialuronano de las formulaciones de liposomas es tal que la enzima puede contrarrestar la smtesis de HA en el estroma de la prostata. Por lo tanto, la velocidad de liberacion se mantiene a lo largo del tiempo. La vida media de la hialuronidasa y otras enzimas de degradacion de hialuronano es relativamente corta. Por lo tanto, dado que la enzima desaparece rapidamente, se necesita una liberacion sostenida para una actividad prolongada e hidrolisis del HA. Dado que el HA en el estroma se regenera cada 3-10 dfas, es necesario mantener la enzima activa en el estroma local para combatir los efectos del HA.

Como se ha descrito anteriormente en la presente memoria, cualquiera de las composiciones de enzima de degradacion de hialuronano descritas anteriormente en la Seccion C, o conocidas por un experto en la tecnica, se puede encapsular dentro de los liposomas multivesiculares. La concentracion de la enzima encapsulada puede variar desde unos pocos picomoles hasta aproximadamente varios cientos de milimoles. La concentracion de agente variara dependiendo de caractensticas tales como la enfermedad a tratar, la edad y estado del paciente y las propiedades particulares del agente. Generalmente, la concentracion de enzima en solucion en el primer componente acuoso durante la fabricacion es directamente proporcional a la cantidad de enzima que se puede cargar en cualquier formulacion dada. Se encuentra en la presente memoria, sin embargo, que la concentracion de protema tiene impacto en la encapsulacion de la enzima de degradacion de hialuronano, y en particular de la hialuronidasa PH20. Por ejemplo, como se ilustra en la presente memoria, los procesos de encapsulacion con cantidades iniciales de una enzima de degradacion de hialuronano de 2 mg/mL dan como resultado una disminucion

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

de la actividad y de la actividad espedfica de la enzima. Por lo tanto, las formulaciones de la presente memoria se preparan formando una primera fase acuosa para la encapsulacion de una enzima de degradacion de hialuronano que contiene menos de 2 mg/mL de enzima de degradacion de hialuronano. Por ejemplo, el primer componente acuoso contiene generalmente menos de 2 mg/mL de enzima de degradacion de hialuronano, tal como entre, aproximadamente entre 0,1 y 1,9 mg/mL de enzima, por ejemplo de 0,25 a 1,9 mg/mL de enzima, de 0,5 mg/mL a 1,5 mg/ mL, tal como de 0,75 mg/mL a 1,25 mg/mL y en particular al menos o aproximadamente 1 mg/mL de enzima de degradacion de hialuronano pero menos de 2 mg/mL de enzima. Las formulaciones de LMV resultantes contienen entre, o aproximadamente entre 0,1 mg/mL y 1 mg/mL de enzima de degradacion de hialuronano, por ejemplo de 0,2 mg/mL a 0,5 mg/mL, tal como al menos, o aproximadamente 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,7 mg/mL, 0,8 mg/mL, 0,9 mg/mL, y en particular al menos 0,3 mg/mL de concentracion de enzima en una suspension de liposomas al 50% en tampon o solucion salina.

Se sabe tambien que el pH puede afectar a la solubilidad de los agentes activos en la solucion acuosa. Por ejemplo, la solubilidad del IGF-I en solucion acuosa cae precipitadamente a un pH de aproximadamente 5 (vease, p.ej. la Patente de Estados Unidos Num. 6.306.432). Asf, tfpicamente en la tecnica, para obtener y mantener suficiente agente en solucion en la primera solucion acuosa, se le anade un tampon o un acido durante la fabricacion para asegurar una concentracion suficientemente alta. Se ha encontrado en la presente memoria, sin embargo, que se pueden utilizar intervalos de pH mas altos, manteniendo al mismo tiempo la solubilidad, la actividad y la estabilidad de la enzima de degradacion de hialuronano encapsulada resultante. Por ejemplo, el pH de la primera solucion acuosa esta entre, o aproximadamente en el intervalo de 6,0 a 7,5, de 6,0 a 7,0 o de 6,0 a 6,5, y en particular al menos, o aproximadamente 6,0, tal como al menos, o aproximadamente 6,5.

Los excipientes tambien se pueden anadir a la primera fase acuosa con el fin de aumentar la eficacia de la encapsulacion. En algunos ejemplos, los excipientes anadidos modulan la velocidad de liberacion del agente activo (p.ej. enzima de degradacion de hialuronano). En otros ejemplos, pueden anadirse excipientes para mejorar o conservar la estabilidad de la enzima de degradacion de hialuronano encapsulada. Tfpicamente, se anaden excipientes que actuan ambos aumentando la eficacia de la encapsulacion y/o la velocidad de liberacion de la enzima, al tiempo que tambien potencian o conservan la estabilidad de la enzima de degradacion de hialuronano encapsulada. La estabilidad, la eficacia de encapsulacion y la velocidad de liberacion utilizando cualquiera de una variedad de excipientes se pueden determinar empmcamente. Los metodos para evaluar la eficacia de la encapsulacion, la estabilidad y la velocidad de liberacion son conocidos por un experto en la tecnica.

Por ejemplo, se pueden anadir varios tipos de excipientes osmoticos. Tanto los electrolitos como los no electrolitos funcionan como excipientes osmoticos. Para determinar si una molecula particular es un excipiente osmotico o para determinar la concentracion de excipiente osmotico en una solucion, por ejemplo una encapsulada dentro de un liposoma multivesicular, se debe tener en cuenta si, en las condiciones de la solucion (por ejemplo, pH) la molecula esta total o parcialmente ionizada. Tambien se debe determinar si tales iones penetraran en la membrana lipfdica (Mahendra K. Jain, van Nostrand Reinhold Co., The Bimollcular Lipid Bilayer Membrane, 1972, 470 pag.). Un experto en la tecnica apreciara que el excipiente osmotico se debe seleccionar de manera que se eviten aquellos que resultanan toxicos o nocivos de otro modo para un sujeto sometido a terapia mediante el uso del liposoma. Generalmente, se seleccionan excipientes osmoticos que por sf mismos no tienen un efecto biologico o terapeutico sobre un sujeto.

Generalmente, se puede utilizar un excipiente osmotico para alterar la osmolaridad del componente acuoso en el que se disuelve el agente activo para la encapsulacion. Existe una relacion inversa entre osmolaridad y la carga de farmaco aumentando generalmente la carga de agente activo a medida que disminuye la osmolaridad del componente acuoso (Patente de Estados Unidos Num. 6.106.858). La osmolaridad es la suma de las concentraciones molares de los solutos presentes en la solucion acuosa, incluyendo cualquier excipiente anadido. Por lo tanto, para cualquier concentracion seleccionada de enzima de degradacion de hialuronano que se utilice, la carga de farmaco durante la fabricacion puede ser modulada variando las contribuciones hechas por los excipientes en solucion a la osmolaridad global del primer componente acuoso.

Los excipientes osmoticos incluyen aquellos que pueden facilitar la actividad del agente activo, es decir una enzima de degradacion de hialuronano. Por ejemplo, los iones de calcio se pueden co-encapsular en forma de un contraion para aumentar la vida util o facilitar la biodisponibilidad del agente. Ademas, se pueden utilizar diversos estabilizantes. Los excipientes osmoticos que se pueden utilizar para formar liposomas multivesiculares y para modular la carga de farmaco del agente encapsulado a partir de liposomas multivesiculares incluyen, pero no se limitan a, glucosa, sacarosa, trehalosa, succinato, glicilglicina, acido gluconico, ciclodextrina, arginina, galactosa, manosa, maltosa, manitol, glicina, histidina, lisina, citrato, fosfato, sorbitol, dextrano y combinaciones de los mismos.

Se puede anadir un hidrocloruro a uno o ambos de los primeros componentes acuosos y el componente lipfdico antes de la primera emulsificacion. La adicion de suficiente hidrocloruro puede ser un factor para lograr una elevada eficacia de encapsulacion y para una velocidad de liberacion controlada de la enzima encapsulada (vease, p.ej. la Patente de Estados Unidos Num. 5.723.147). Los hidrocloruros que se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

acido clortndrico, hidrocloruro de lisina, clorhidrato de histidina, hidrocloruro de arginina, hidrocloruro de trietanolamina, hidrocloruro de piridina y combinaciones de los mismos. Tambien se pueden utilizar otros acidos hidrohalogenados, tales como acido clortndrico, acido fluorhndrico, acido bromhndrico y acido yodhndrico. Por ejemplo, la modulacion de la velocidad de liberacion de la enzima encapsulada se puede lograr ajustando la concentracion de hidrocloruro presente en el componente lipfdico o en el primer acuoso utilizado para formar la emulsion de agua en aceite durante la formacion de los liposomas multivesiculares para llegar a la velocidad de liberacion deseada, es decir una velocidad de liberacion terapeuticamente eficaz de la enzima. Se debe tener en cuenta que, dependiendo de la concentracion de hidrocloruro utilizada, la velocidad de liberacion de la enzima a partir de los liposomas multivesiculares puede aumentar o disminuir con respecto a la obtenida cuando no se utiliza el hidrocloruro en la fabricacion de los liposomas. La cantidad de hidrocloruro utilizada con cualquier formulacion de liposomas multivesicular particular dependera de las propiedades qmmicas del liposoma (es decir, la combinacion de lfpidos utilizada en la formulacion), la solucion acuosa encapsulada en el liposoma, el entorno en el que se coloca el liposoma, asf como de la enzima particular encapsulada.

En otro ejemplo, se puede anadir un acido no hidrohalogenado a uno o ambos de los primeros componentes acuosos y el componente lipfdico antes de la primera emulsificacion. La adicion de un acido no hidrohalogenado puede ser un factor en el control de la velocidad de liberacion de la enzima desde el LMV (vease p.ej. la Patente de Estados Unidos Num. 5.766.627). Los acidos incluyen, pero no se limitan a, acido perclorico, acido mtrico, acido glucuronico, acido dtrico, acido formico, acido acetico, acido trifluoroacetico, acido tricloroacetico, acido sulfurico, acido fosforico y combinaciones de los mismos. La cantidad de acido utilizada es la eficaz para proporcionar una velocidad de liberacion deseada y controlada, en particular una velocidad de liberacion que da como resultado niveles terapeuticamente eficaces de la enzima encapsulada en el estroma prostatico. Por ejemplo, la concentracion del acido no hidrohalogenado en el componente lipfdico o el primer componente acuoso al que se puede anadir puede estar entre 0,1 mM y 0,5 M, por ejemplo, de 1o mM a 200 mM, tal como al menos 0,1 mM, 10 mM, 100 mM o 200 mM.

Otros excipientes que se pueden utilizar incluyen aquellos que conservan o aumentan la estabilidad de la enzima y/o aumentan la velocidad de encapsulacion de la enzima. Se ha encontrado en la presente memoria que el acido hialuronico (hialuronano, HA) cuando se incluye en la primera fase acuosa, aumenta la encapsulacion de la enzima de degradacion de hialuronano. El HA tambien conserva y/o mejora la estabilidad de la enzima de degradacion de hialuronano. Por lo tanto, se proporcionan en la presente memoria formulaciones de LMV que contienen una enzima de degradacion de hialuronano y HA. Tales formulaciones de LMV se obtienen utilizando durante la fabricacion un primer componente acuoso que contiene una enzima de degradacion de hialuronano, un acido hialuronico en un intervalo entre aproximadamente 1 mg/mL de HA y 100 mg/mL de HA, por ejemplo de 10 mg/mL de HA a 75 mg/mL HA, tal como de 15 mg/mL HA a 50 mg/mL HA, y en particular al menos o aproximadamente 1 mg/mL HA, 2 mg/mL HA, 3 mg/mL HA, 4 mg/mL HA, 5 mg/mL de HA, 6 mg/mL de HA, 7 mg/mL de HA, 8 mg/mL de HA, 9 mg/mL de HA, 10 mg/mL de HA, 11 mg/mL de HA, 12 mg/mL de HA, 13 mg/mL de HA, 14 mg/mL de HA, 15 mg/mL de HA, 16 mg/mL de HA, 17 mg/mL de HA, 18 mg/mL de HA, 19 mg/mL de HA, 20 mg/mL de HA, 25 mg/mL de HA, 30 mg/mL de HA, 40 mg/mL de HA, 50 mg/mL de HA o mas. En algunos ejemplos, las formulaciones de LMV se obtienen utilizando durante la fabricacion un primer componente acuoso que contiene una razon molar de HA con respecto a enzima de degradacion de hialuronano, que es, o es de aproximadamente 1:500, 1:400, 1:300, 1:200, 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 200:1, 300:1, 400:1, 500:1, o mas. Dependiendo de la eficacia de la encapsulacion, las formulaciones de LMV resultantes contienen una HA encapsulado que es al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85% o mas del HA utilizado en el proceso de fabricacion. Por ejemplo, las formulaciones de LMV resultantes contienen HA en una cantidad que es, o esta entre 0,05 mg/mL y 90 mg/mL, por ejemplo, de 0,75 mg/mL a 13,0 mg/mL, tal como de 1 mg/mL a 10 mg/mL, generalmente al menos 0,1 mg/mL de Ha. En algunos ejemplos, la razon molar de HA con respecto a enzima de degradacion de hialuronano es de aproximadamente 1:500, 1:400, 1:300, 1:200, 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 200:1, 300:1, 400:1, 500:1, o mas.

ii. Formulaciones de LMV-enzima de degradacion de hialuronano ilustrativas

Se proporcionan en la presente memoria formulaciones que contienen una enzima de degradacion de hialuronano, por ejemplo una hialuronidasa tal como PH20 o PH20 recombinante, que esta encapsulada en un liposoma multivesicular (LMV). Las formulaciones de LMV se obtienen utilizando durante la fabricacion un primer componente acuoso que contiene una concentracion de enzima de degradacion de hialuronano disuelta inferior a 2 mg/mL de enzima de degradacion de hialuronano, tal como entre, o aproximadamente entre 0,1 y 1,9 mg/mL de enzima o entre 0,25 y 1,9, por ejemplo de 0,5 mg/mL a 1,5 mg/mL, tal como de 0,75 mg/mL a 1,25 mg/mL y en particular al menos, o aproximadamente 1 mg/mL de enzima de degradacion de hialuronano pero menos de 2 mg/mL enzima. Las formulaciones de LMV resultantes contienen entre, o aproximadamente entre 0,1 mg/mL y 1 mg/mL de enzima de degradacion de hialuronano, por ejemplo de 0,2 mg/mL a 0,5 mg/mL, tal como al menos o aproximadamente 0,05 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,7 mg/mL, 0,8 mg/mL, 0,9 mg/mL de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

enzima y en particular al menos 0,3 mg/mL de enzima en la concentracion de la suspension.

En algunos ejemplos, el primer componente acuoso utilizado en la preparacion de la formulacion esta a, o cerca del pH neutro. Esta dentro del nivel de un experto en la tecnica ajustar el pH de un tampon o solucion acuosa. Generalmente, las formulaciones de LMV se obtienen utilizando durante la fabricacion una primera solucion acuosa que tiene un pH que esta entre o aproximadamente en el intervalo de 6,0 a 7,5, 6,0 a 7,0 o 6,0 a 6,5, y en particular al menos o aproximadamente 6,0, tal como al menos, o aproximadamente 6,5.

En otros ejemplos, el primer componente acuoso puede contener uno o mas excipientes, tales como excipientes osmoticos. En particular, los excipientes son aquellos que aumentan la estabilidad de la enzima de degradacion de hialuronano, aumentan la velocidad de encapsulacion de la enzima de degradacion de hialuronano o que aumentan la estabilidad y aumentan la velocidad de encapsulacion de la enzima de degradacion de hialuronano. Los ejemplos no limitantes de los excipientes son sacarosa, cloruro de calcio (CaCh), glicerol, dextrano, PEG (p.ej. PEG-6000), acido hialuronico (HA), prolina, Arg-HCl, sorbitol, trehalosa o albumina de suero humano (HSA) o combinaciones de cualquiera de los anteriores. Por ejemplo, se obtienen formulaciones de LMV ilustrativas utilizando durante la fabricacion un primer componente acuoso que contiene CaCl2 de 1 mM a 50 mM, por ejemplo CaCl2 de 5 mM a 25 mM, tal como CaCl2 de l0 mM a 20 mM y en particular al menos o aproximadamente CaCl2 10 mM, 15 mM o 20 mM. En otro ejemplo, se obtienen formulaciones de LMV ilustrativas utilizando mezclador Vortex durante la fabricacion de un primer componente acuoso estratificado sobre una interfase que contiene de 10 pl a 500 pl de glicerol, por ejemplo de 100 pl a 200 pl, tal como al menos o aproximadamente 150 pl de glicerol para minimizar la exposicion inicial de la enzima de degradacion de hialuronano a la fase de disolvente organico. En un ejemplo adicional, se obtienen formulaciones de LMV ilustrativas utilizando durante la fabricacion un primer componente acuoso que contiene dextrano entre, o aproximadamente entre 0,01% y 1% (p.ej. dextrano 40.000), por ejemplo dextrano de 0,05% a 0,5% tal como por al menos o aproximadamente dextrano al 0,1%. En otros ejemplos, se obtienen formulaciones de LMV ilustrativas utilizando durante la fabricacion un primer componente acuoso que contiene PEG entre, o aproximadamente entre 0,01% y 1% (p.ej. PEG-6000), por ejemplo PEG de 0,05% a 0,5% tal como PEG al menos o aproximadamente al 0,1%. En otro ejemplo, se obtienen formulaciones de LMV ilustrativas utilizando durante la fabricacion un primer componente acuoso que contiene prolina entre, o aproximadamente entre 1 mM y 1 M, por ejemplo prolina de 10 mM a 500 mM tal como prolina al menos o aproximadamente 100 mM. En un ejemplo adicional, se obtienen formulaciones de LMV ilustrativas utilizando durante la fabricacion un primer componente acuoso que contiene entre Arg-HCl entre, o aproximadamente entre 1 mM y 1 M (p.ej. pH 6,44), por ejemplo, Arg-HCl de 10 mM a 500 mM, tal como Arg-HCl al menos o aproximadamente 100 mM. En un ejemplo adicional, se obtienen formulaciones de LMV ilustrativas utilizando durante la fabricacion un primer componente acuoso que contiene sorbitol entre, o aproximadamente entre 1% y 20%, por ejemplo sorbitol del 5% al 15%, tal como sorbitol a al menos o aproximadamente 5%, 6 %, 7%, 8%, 9%, 10% o mas. En algunos ejemplos, se obtienen formulaciones de LMV ilustrativas utilizando durante la fabricacion un primer componente acuoso que contiene trehalosa entre, o aproximadamente entre 1% y 20%, por ejemplo trehalosa del 5% al 15%, tal como trehalosa al menos, o aproximadamente 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% o mas. Se entiende que se puede utilizar una combinacion de cualquiera de los anteriores.

En los ejemplos particulares, se obtienen formulaciones de LMV utilizando durante la fabricacion un primer componente acuoso que contiene un acido hialuronico (HA) en un intervalo de, o entre aproximadamente 1 mg/mL de HA y 100 mg/mL de HA, por ejemplo 10 mg/mL de HA a 75 mg/mL de HA, tal como 15 mg/mL de HA a 50 mg/mL de HA, y en particular al menos o aproximadamente 1 mg/mL de HA, 2 mg/mL de HA, 3 mg/mL de HA, 4 mg/mL de HA, 5 mg/mL de HA, 6 mg/mL de hA, 7 mg/mL de HA, 8 mg/mL de HA, 9 mg/mL de HA, 10 mg/mL de HA, 11 mg/mL de H, 12 mg/mL de HA, 13 mg/mL de HA, 14 mg/mL de HA, 15 mg/mL de HA, 16 mg/mL de HA, 17 mg/mL de HA, 18 mg/mL de HA, 19 mg/mL de HA, 20 mg/mL de HA, 25 mg/mL de HA, 30 mg/mL de HA, 40 mg/mL de HA, 50 mg/mL de HA o mas. Dependiendo de la eficacia de la encapsulacion, las formulaciones de LMV resultantes contienen un HA encapsulado que es al menos 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 85% o mas del HA utilizado en el proceso de fabricacion. Por ejemplo, las formulaciones de LMV resultantes contienen HA en una cantidad que esta, o esta entre 0,05 mg/mL a 90 mg/mL, por ejemplo, de 0,75 mg/mL a 13,0 mg/mL, tal como de 1 mg/mL a 10 mg/mL, generalmente al menos 0,1 mg/mL de Ha.

Las formulaciones de LMV proporcionadas en la presente memoria que encapsulan una enzima de degradacion de hialuronano se preparan conteniendo una mezcla de lfpidos neutros, una mezcla de lfpidos anfipaticos. Los lfpidos neutros y los lfpidos anfipaticos ilustrativos para las formulaciones de lfpidos se proporcionan anteriormente. Generalmente, las formulaciones tambien contienen colesterol. En algunos ejemplos, las formulaciones contienen ademas DPPG. Por ejemplo, el componente lipfdico neutro contiene una mezcla de un lfpido neutro de liberacion lenta (p.ej. triolema u otro lfpido neutro de liberacion lenta) y un lfpido neutro de liberacion rapida (p.ej. tricaprilina u otro lfpido neutro de liberacion rapida) a una razon molar de 25/75 (lento/rapido), 50/50, 75/25 o 90/10, y en particular 50/50. El componente lipfdico anfipatico tambien es generalmente una mezcla que contiene DEPc y DOPC a una razon molar (DEPC/DOPC) de 50/50, 75/25 o 90/10 y en particular 50/50. Por ejemplo, las formulaciones de LMV se obtienen utilizando durante la fabricacion un lfpido anfipatico y un lfpido neutro en un disolvente organico volatil como una mezcla 50:50 de una mezcla que contiene DEPC 19,8 mM, colesterol 30 mM,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

trioleina 3,75 mM y una mezcla que contiene DOPC 19,8 mM, colesterol 30 mM y tricaprilina 3,75 mM. Las formulaciones de lMv ilustrativas se exponen en la Tabla 19.

iii. Co-Formulaciones de LMV

en la presente memoria se proporcionan co-formulaciones de LMV que contienen adicionalmente otro agente terapeutico co-encapsulado con la enzima de degradacion de hialuronano. El otro agente terapeutico puede ser cualquier farmaco o agente conocido por un experto en la tecnica. El otro agente puede ser hidrofilo o hidrofobo. Generalmente, al generar tales formulaciones de liposomas, se pueden utilizar los procedimientos y parametros descritos anteriormente en la Seccion D.2, y en particular las subsecciones i. y ii.. Por ejemplo, las formulaciones de LMV se preparan generalmente utilizando durante la fabricacion una mezcla de lfpidos neutros y anfipaticos. Como se describe en la presente memoria, los lfpidos neutros y anfipaticos se pueden proporcionar cada uno como una mezcla. Generalmente, las formulaciones tambien contienen colesterol. En algunos ejemplos, las formulaciones contienen adicionalmente DPPG.

En algunos ejemplos, las co-formulaciones de LMV se preparan mezclando un primer componente acuoso que contiene la enzima de degradacion de hialuronano y otro agente con el componente lipfdico en disolvente organico. En otros ejemplos, el otro agente es un farmaco hidrofobo y las co-formulaciones de LMV se preparan mezclando un primer componente acuoso que contiene la enzima de degradacion de hialuronano y el componente lipfdico en disolvente organico que tambien contiene el farmaco hidrofobo. Se encuentra en la presente memoria que la inclusion del farmaco hidrofobo con el componente lipfdico en disolvente organico da como resultado la encapsulacion o intercalacion del farmaco hidrofobo en la fase lipfdica del LMV. Por lo tanto, cuando se generan combinadas con una enzima de degradacion de hialuronano, las formulaciones de LMV contienen un farmaco hidrofilo e hidrofobo co-encapsulado en la misma formulacion, por lo que la enzima de degradacion de hialuronano esta en la fase acuosa y el farmaco hidrofobo esta en la fase lipfdica. Cualquier farmaco hidrofobo conocido por un experto en la tecnica puede ser co-encapsulado en una formulacion de LMV con una enzima de degradacion de hialuronano. Tales farmacos hidrofobos incluyen, pero no se limitan a, docetaxel, prednisona, prednisolona, ibuprofeno, clotriamazol, risperidona, citrato de tamoxifeno, diasepina, insulina NPH, benzodiazepina, clofibrato, clorfeniramina, dinitirato, digoxina, digitoxina, tartrato de ergotamina, estradiol, fenofibrato, griscofulvina, hidroclorotiazida, hidrocortisona, isosorbida, medrogestona, oxifenbutazona, politiazida, progesterona,

espironolactona, tolbutamida, 10,11-dihidro-5H-dibenzo[a,d]ciclohepteno-5-carboxamida, 5H-dibenzo[a,d]

ciclohepteno-5-carboxamida, inhibidores de la 5a-reductasa tales como finasterida o dutasterida, y otros conocidos por un experto en la tecnica.

Con respecto a la generacion de co-formulaciones de LMV que contienen un farmaco hidrofobo, se encuentra en la presente memoria que la morfologfa de las partfculas de co-formulacion de lfpidos puede verse afectada por la concentracion de farmaco y la concentracion de lfpidos. Esta dentro del nivel de 09/03/2015 para un experto en la tecnica determinar las concentraciones optimas de farmaco y lfpidos con el fin de obtener una partfcula de morfologfa suficiente para aplicaciones terapeuticas a la vez que se mantiene la actividad de los farmacos encapsulados activos. Los ejemplos ilustran procedimientos para evaluar y verificar la morfologfa y las actividades.

En un ejemplo, se generan co-formulaciones de LMV en las que la concentracion de farmaco hidrofobo es de aproximadamente 5 mg/mL o inferior a 5 mg/mL y generalmente entre o entre aproximadamente 0,1 mg/mL y 5 mg/mL. Ademas, se pueden generar co-formulaciones de LMV que utilizan una concentracion de lfpidos total elevada durante la fabricacion de la co-formulacion. Por ejemplo, al generar las co-formulaciones proporcionadas en la presente memoria, la concentracion de lfpidos puede incluir una cantidad de un lfpido anfifatico (p.ej. DEPC o DOPC o mezclas de los mismos), que es superior a 20 mM, tal como de 20 mM a 100 mM, por ejemplo, de 30 mM a 60 mM; una cantidad de un lfpido neutro (p.ej. trioleina o tricaprilina o sus mezclas) en una cantidad que es o es mayor de 3 mM tal como 4 mM a 20 mM, por ejemplo 5 mM a 12 mM; una cantidad de DPPG que es mayor de 3 mM, tal como 4 mM a 20 mM, por ejemplo 5 mM a 12 mM; y/o una cantidad de colesterol que es superior a 15 mM, por ejemplo, 15 mM a 100 mM, tal como 20 mM a 80 mM o 30 mM a 60 mM, tal como al menos 30 mM.

En los ejemplos concretos de la presente invencion, el otro agente es un agente que es adecuado para tratar la HBP como se describe en la presente memoria. Tales agentes incluyen cualquiera de los enunciados en la Seccion F siguiente. Por ejemplo, el agente puede ser un antiandrogeno, tal como un antiandrogeno esteroideo, un antiandrogeno no esteroideo o inhibidores de la 5a-reductasa; un agente bloqueador alfa tal como un antagonista de adrenorreceptores alfa1; o toxina botulmica o una toxina botulmica modificada. En ejemplos concretos, el otro agente consiste en inhibidores hidrofobos de la 5a-reductasa, finasterida o dutasterida. Por ejemplo, las formulaciones de LMV proporcionadas en la presente memoria incluyen aquellas en las que la enzima de degradacion de hialuronano esta en la fase acuosa y la finasterida o dutasterida esta en la fase lipfdica. Las co- formulaciones de LMV ilustrativas se exponen en el Ejemplo 8 de la presente memoria y en la Tabla 20. Tales co- formulaciones de LMV se pueden utilizar en el tratamiento de la HBP como se describe en la presente memoria.

iv. Evaluacion de la Encapsulacion y la Eficiencia

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Los analisis para evaluar las cantidades relativas de protema presentes en una muestra de liposomas son conocidos por un experto en la tecnica. Por ejemplo, tales analisis incluyen, pero no se limitan a, cromatograffa de exclusion por tamano-HPLC (SEC-HPLC) para caracterizar protemas de alto peso molecular (HMWP), tales como agregados, y analisis de contenido mediante RP-HPLC. En estos ejemplos, se encuentra en la presente memoria que los metodos de extraccion de farmacos proteicos hidrofilos requieren detergentes concretos. Por ejemplo, el uso dedodecilsulfato de sodio al 1% (SDS) para el analisis de contenido mediante RP-HPLC. En otro ejemplo, el uso de octilglucosido al 1% para el analisis SEC-HPLC para caracterizar los agregados de HMWP.

Por ejemplo, la eficacia de la encapsulacion puede evaluarse determinando el contenido de la enzima de degradacion de hialuronano u otro farmaco (concentracion en suspension y/o concentracion libre en porcentaje) de la formulacion de LMV resultante, por ejemplo, utilizando RP-HPLC como se describe en la presente memoria. Se puede determinar la eficacia de la encapsulacion. El porcentaje de encapsulacion se puede determinar como la razon de la cantidad de compuesto encapsulado en la suspension final del procedimiento de fabricacion de liposomas a la cantidad total de compuesto que se debe encapsular utilizada en la primera solucion acuosa del procedimiento multiplicada por 100. El porcentaje de encapsulacion generalmente es al menos o es de aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85% o mas.

En otros ejemplos, se puede determinar la capacidad de carga del farmaco, es decir la cantidad del agente activo (p.ej. enzima de degradacion de hialuronano u otro farmaco) cargado en la suspension de liposomas del producto. Es una medida de la cantidad de agente activo disponible en un volumen unitario de formulacion de liposomas y es la razon de farmaco encapsulado por unidad de volumen de suspension de liposomas a volumen porcentual encapsulado en los propios liposomas. Es aproximadamente igual a la concentracion del agente activo en la suspension dividida por el lipocrito de la suspension para el farmaco libre de bajo porcentaje. El lipocrito es la razon entre el volumen ocupado por los liposomas y el volumen de suspension total multiplicado por 100.

En otro ejemplo, la estabilidad de la enzima de degradacion de hialuronano encapsulada u otro farmaco se puede determinar evaluando la agregacion, la solubilidad y/o la actividad del agente activo (p.ej. enzima de degradacion de hialuronano, tal como PH20 u otro farmaco) en las formulaciones. Por ejemplo, se puede determinar la actividad de la enzima de degradacion de hialuronano (actividad total y/o porcentaje de actividad enzimatica libre) como se ilustra en la presente memoria mediante analisis que evaluan la escision o degradacion del sustrato. Dichos analisis son conocidos por un experto en la tecnica. Por ejemplo, el analisis USP XXII para la hialuronidasa determina indirectamente la actividad midiendo la cantidad de sustrato de acido hialuronico, o hialuronano (HA) no degradado, despues de que la enzima se deja reaccionar con el HA durante 30 min a 37°C (USP XXII-NF XvII (1990) 644-645 United States Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD). Se puede utilizar una solucion Hyaluronidase Reference Standard (USP) o National Formulary (NF) Standard Hyaluronidase en un analisis para determinar la actividad, en unidades, de cualquier hialuronidasa. En un ejemplo, la actividad se mide utilizando un ensayo de microturbidez. Esto se basa en la formacion de un precipitado insoluble cuando el acido hialuronico se une a albumina serica. La actividad se mide incubando hialuronidasa con hialuronato de sodio (acido hialuronico) durante un periodo de tiempo determinado (p.ej. 10 minutos) y a continuacion precipitando el hialuronato de sodio no digerido con la adicion de albumina serica acidulada. La turbidez de la muestra resultante se mide a 640 nm despues de un penodo de desarrollo adicional. La disminucion de la turbidez resultante de la actividad hialuronidasa sobre el sustrato de hialuronato de sodio es una medida de la actividad enzimatica de la hialuronidasa. En otro ejemplo, la actividad hialuronidasa se mide utilizando un analisis de microtitulacion en el que se mide el acido hialuronico residual biotinilado despues de la incubacion con hialuronidasa (veanse p.ej. Frost y Stern (1997) Anal. Biochem. 251:263-269, la Publicacion de Patente de Estados Unidos Num. 20050260186). Los grupos carboxilo libres en los residuos de acido glucuronico del acido hialuronico se biotinilan y el sustrato de acido hialuronico biotinilado se acopla covalentemente a una placa de microtitulacion. Despues de la incubacion con hialuronidasa, el sustrato de acido hialuronico biotinilado residual se detecta utilizando una reaccion de avidina-peroxidasa, y se compara con el obtenido despues de la reaccion con patrones de hialuronidasa de actividad conocida. Otros analisis para medir la actividad de hialuronidasa tambien se conocen en la tecnica y se pueden utilizar en los metodos de la presente invencion (veanse p.ej. Delpech et al., (1995) Anal. Biochem. 229:35-41; Takahashi et al., (2003) Anal. Biochem. 322:257-263).

E. Dosificacion, administracion y metodos de tratamiento

Se puede administrar cualquiera de las enzimas de degradacion de hialuronano anteriores, en particular formulaciones de liberacion sostenida de una enzima de degradacion de hialuronano, tales como formulaciones de LMV, para el tratamiento de una enfermedad o afeccion asociada a hialuronano. Por ejemplo, se puede administrar cualquiera de las enzimas de degradacion de hialuronano anteriores, en particular formulaciones de liberacion sostenida de una enzima de degradacion de hialuronano, tales como formulaciones de LMV, para el tratamiento de la hiperplasia benigna de prostata (HBP).

Las composiciones y formulaciones se pueden administrar por cualquier via deseada, por ejemplo, intratumoral, intraarticular (en las articulaciones), intraocular, intramuscular, intratecal, intraperitoneal, subcutanea, intravenosa,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

intralinfatica, oral y submucosa y bucal (p.ej., sublingual). Las composiciones proporcionadas en la presente memoria se formulan tipicamente para su administracion por v^a intraprostatica (transuretral, transperineal y transrectal). Las formulaciones adecuadas para tales rutas son conocidas por un experto en la tecnica. La administracion puede ser local, topica o sistemica. La administracion local a una zona que necesita tratamiento puede conseguirse, por ejemplo, pero sin limitarse a, infusion local durante la cirugfa, inyeccion o instilacion por medio de un cateter, por medio de un supositorio o por medio de un implante. Las composiciones tambien se pueden administrar con otros agentes biologicamente activos, ya sea secuencialmente, intermitentemente o en la misma composicion. La administracion tambien puede incluir sistemas de liberacion controlada que incluyen formulaciones de liberacion controlada y liberacion controlada del dispositivo, tal como por medio de una bomba.

La via mas adecuada en cada caso depende de una variedad de factores, tales como el progreso de la enfermedad, la gravedad de la enfermedad, la composicion o composiciones concretas que se utilizan para el tratamiento. Para los fines de la presente invencion, se desea que las hialuronidasas y otros agentes se administren de manera que alcancen una alta concentracion terapeutica y se localicen en la prostata. De este modo, se contempla la administracion directa a la prostata, tal como por medio de inyeccion intraprostatica. Por ejemplo, la administracion local puede conseguirse por medio de inyeccion, tal como a partir de una jeringa u otro artfculo de fabricacion que contiene un dispositivo de inyeccion tal como una aguja. En otro ejemplo, la administracion local puede conseguirse por infusion, lo que puede facilitarse mediante el uso de una bomba u otro dispositivo similar. Tambien se contemplan otros modos de administracion. La composicion farmaceutica se puede formular en formas de dosificacion apropiadas para cada via de administracion.

La administracion de agentes directamente a la prostata es un procedimiento conocido por los expertos en la tecnica. Los sitios de inyeccion preferidos en la glandula prostatica hipertrofiada incluyen los lobulos laterales derecho e izquierdo y el lobulo medial. El volumen de la inyeccion o de las inyecciones, se inyecten uno o mas lobulos y posiciones dentro de cada lobulo puede ser determinado por el medico a carga utilizando los datos en los que se basa el diagnostico de HBP o utilizando la informacion recopilada mediante equipo de ultrasonido para ayudar a la administracion de los agentes.

Las inyecciones intraprostaticas se realizan mediante una aguja larga y fina insertada en la prostata bajo control rectal digital y/o grna ultrasonica. Las inyecciones se realizan generalmente bajo anestesia local. La solucion inyectable puede diluirse con lidocama. Durante la inyeccion, la aguja puede ser frecuentemente reubicada para obtener la mejor distribucion posible de la composicion o composiciones. Un volumen tfpico de lfquido o gel inyectado en la prostata es aproximadamente 20-30% del volumen prostatico. Existen varias vfas de inyeccion para la introduccion de la composicion descrita en la prostata.

Una via de administracion es mediante inyeccion transuretral intraprostatica (intralesional). La tecnica transuretral es precedida inmediatamente por cateterizacion. El volumen, de la composicion inyectada tipicamente vana de 1 a 20 cc/lobulo. Para optimizar los efectos de la composicion inyectada, puede ser deseable dilatar la uretra prostatica con un balon inflable. El balon insertado cistoscopicamente inhibe la salida inmediata de la solucion de enzima inyectada a traves del sistema de conducto poroso que desemboca en la uretra. La ventaja de esta via de inyeccion es que el metodo permite la visualizacion citoscopica directa de las zonas de patologfa nodular y el emplazamiento de una alta concentracion de la composicion en el lugardeseado sin riesgo de inactivacion metabolica. El dolor y la incomodidad experimentados por los pacientes durante la inyeccion directa de la prostata son tipicamente mmimos y comparables a las inyecciones intramusculares.

Alternativamente, se pueden utilizar las vfas transperineal o transrectal de inyeccion prostatica. La via transperineal de inyeccion implica el emplazamiento de 22 g x 20 cm de aguja de biopsia por aspiracion a traves del perineo en la prostata guiada por ultrasonido y/o palpacion digital. De nuevo, se inyectan tipicamente de 1 a 20 cc de la composicion descrita a cada lobulo lateral de la prostata. Las inyecciones se realizan generalmente bajo anestesia local. Durante la inyeccion, la aguja se reubica frecuentemente para obtener la mejor distribucion posible de la composicion. La posicion de la aguja puede ser guiada por ultrasonido mientras se mantiene bajo control rectal digital constante. La via de inyeccion transperineal puede ser una mejor alternativa que las rutas transuretral o transrectal en terminos de reduccion de la posibles complicaciones debidas a la infeccion bacteriana post-inyeccion.

La via transrectal permite la introduccion de la aguja a traves de la pared rectal y la inyeccion de la prostata mientras se realiza la palpacion rectal digital. La inyeccion a traves de la via transrectal puede realizarse con una aguja de biopsia por aspiracion flexible de 22 g x 20 cm ligeramente curvada. El uso de una grna de aguja de Franzen (Precision Dynamics, San Fernando, CA), por ejemplo, permite que la aguja sea dirigida con seguridad hacia una lesion sospechosa bajo tecnicas de grna ultrasonicas y/o tactiles. La grna de la aguja de prostata esterilizada se coloca en un dedo mdice enguantado. Se coloca un dedil sobre la grna de la aguja. El dedo mdice y la grna de la aguja se insertan en el recto y se palpan las lesiones sospechosas de la prostata. La aguja se inserta a traves de la grna y se introduce en el tejido. Aproximadamente se pueden inyectar de 1 a 20 cc de la solucion a los lobulos laterales de la prostata. Para inyectar material suficiente, la aguja se puede mover hacia atras y hacia adelante de tres a cinco veces. Se puede aplicar una gelatina anestesica antes de la inyeccion para reducir el dolor durante la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

puncion de la aguja. Otros dispositivos son bien conocidos por los expertos en la tecnica y pueden aplicarse y utilizarse en los metodos de la presente invencion. Por ejemplo, un Tratamiento de Inyeccion de Gel Intra-prostatica con GelTx™, combinado con obtencion de imagenes por ultrasonido (p.ej. utilizando una sonda Trans-Rectal biplano) puede proporcionar una excelente gma de imagen para la colocacion de la aguja de inyeccion (vease, p.ej. ProSurg, San Jose, CA).

La concentracion del agente o de los agentes farmaceuticamente activos se ajusta de manera que una inyeccion proporcione una cantidad eficaz para producir el efecto farmacologico deseado. La dosis exacta depende de la edad, el peso y el estado del paciente o animal como se conoce en la tecnica. Las preparaciones parenterales de dosis unitaria se envasan en una ampolla, un vial o una jeringa con una aguja. El volumen de solucion lfquida o preparacion de polvo reconstituido, que contiene el agente o agentes farmaceuticamente activos, esta en funcion de la gravedad de la enfermedad y del artmulo de fabricacion concreto elegido para el envase. Todas las preparaciones para administracion parenteral deben ser esteriles, como es conocido y puesto en practica en la tecnica.

Se pueden emplear metodos de administracion para disminuir la exposicion de agentes seleccionados a procesos degradativos, tales como degradacion proteolftica e intervencion inmunologica a traves de respuestas antigenicas e inmunogenicas. Los ejemplos de tales metodos incluyen administracion local en el sitio de tratamiento. Se ha informado de que la pegilacion de agentes terapeuticos aumenta la resistencia a la proteolisis, aumenta la semivida plasmatica y disminuye la antigenicidad y la inmunogenicidad. Los ejemplos de las metodologfas de pegilacion son conocidos en la tecnica (veanse, por ejemplo, Lu and Felix, Int. J. Peptide Protein Res., 43: 127-138, 1994; Lu and Felix, Peptide Res., 6: l4o-6, 1993; Felix et al., Int. J. Peptide Res., 46 : 253-64, 1995; Benhar et al., J. Biol. Chem., 269: 13398-404, 1994; Brumeanu et al., J Immunol., 154: 3088-95, 1995; veanse tambien, Caliceti et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55(10): 1261-77 y Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8S). La pegilacion tambien se puede utilizar en el suministro de moleculas de acido nucleico en vivo. Por ejemplo, la pegilacion de adenovirus puede aumentar la estabilidad y la transferencia genica (vease, p.ej., Cheng et al. (2003) Pharm. Res. 20(9): 144451).

Los agentes terapeuticamente activos desde el punto de vista farmaceutico y sus derivados se formulan y administran tipicamente en formas de dosificacion unitaria o formas de dosificacion multiples. Cada dosis unitaria contiene una cantidad predeterminada de agente terapeuticamente activo suficiente para producir el efecto terapeutico deseado, asociado con los portadores, vehmulos, o diluyentes farmaceuticos requeridos. Los ejemplos de formas de dosis unitarias incluyen ampollas y jeringas y comprimidos o capsulas envasadas individualmente. Las formas de dosis unitarias se pueden administrar en fracciones o multiplos de las mismas. Una forma de dosis multiples es una pluralidad de formas de dosificacion unitarias identicas envasadas en un solo recipiente para ser administradas en formas de dosis unitarias segregadas. Los ejemplos de formas de dosis multiples incluyen viales, botes de comprimidos o capsulas o botes de litros o galones. Por lo tanto, la forma de dosis multiples es un multiplo de dosis unitarias que no estan segregadas en el envase. Generalmente, se pueden preparar formas de dosificacion o composiciones que contienen ingrediente activo en el intervalo de 0,005% a 100% formando el resto a partir de un portador no toxico.

Tambien se contempla en la presente memoria la implantacion de un sistema de liberacion lenta o de liberacion sostenida, de manera que se mantenga un nivel constante de dosificacion (vease, p.ej., la Patente de Estados Unidos Num. 3.710.795). Por ejemplo, se puede administrar cualquiera de las formulaciones de LMV u otras formulaciones de liberacion sostenida. El porcentaje de agente activo contenido en tales composiciones depende en gran medida de su naturaleza espedfica, asf como de la actividad del agente y de las necesidades del sujeto. Las formulaciones de liberacion controlada y sostenida tambien se pueden proporcionar en formas de dosis unica y multiple.

Por ejemplo, las formulaciones de lfpidos, tales como las formulaciones de LMV proporcionadas en la presente memoria, se proporcionan en una jeringa. En algunos ejemplos, la jeringa tiene una camara unica que contiene las vesmulas de membrana. En otros ejemplos, la jeringa tiene dos camaras, por lo que las vesmulas de membrana estan en una camara y otro agente para tratar la HBP esta en otra camara. La jeringa puede ser de inyeccion de uso unico o de uso multiple. En otros ejemplos, las formulaciones se proporcionan en un recipiente esteril, por ejemplo un recipiente de un solo uso o de uso multiple. Si se proporciona como un recipiente de uso multiple, generalmente se incluye un conservante. Adicionalmente, se proporcionan kits que contienen una jeringa o un recipiente e instrucciones de uso.

En ejemplos concretos, se administra un agente terapeutico en una cantidad o regimen de dosificacion que es terapeuticamente eficaz para mejorar o reducir los smtomas de la HBP. Una cantidad terapeuticamente eficaz es la dosificacion suficiente para reducir uno o mas smtomas de la HBP en un sujeto durante al menos una semana, generalmente al menos un mes, por ejemplo, al menos dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, siete meses, ocho meses o mas. Los indicadores de mejona o tratamiento satisfactorio incluyen la reduccion del tamano del tejido prostatico obstructivo y el alivio de los smtomas de obstruccion urinaria. La evaluacion objetiva de los efectos del tratamiento puede medirse por medio de metodos convencionales, incluyendo analisis de flujo

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

urodinamico, examen transuretral, ultrasonograffa transrectal o por medio de un cuestionario de puntuacion de smtomas obstructivos, como el fodice Internacional de Smtomas de la Prostata (IPSS) o el fodice de Smtomas de la Asociacion Urologica Americana (hdice AUA).

El agente terapeutico para la HBP se proporciona en una dosis terapeuticamente eficaz. La concentracion terapeuticamente eficaz se puede determinar empmcamente sometiendo a ensayo los compuestos en sistemas in vitro e in vivo conocidos, tales como los analisis proporcionados en la presente memoria. La concentracion de un agente terapeutico seleccionado en la composicion depende de las velocidades de absorcion, inactivacion y excrecion, las caractensticas fisicoqmmicas, el programa de dosificacion y la cantidad administrada, asf como de otros factores conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, se entiende que la dosificacion precisa y la duracion del tratamiento esta en funcion del tejido que se esta tratando y se puede determinar empmcamente utilizando protocolos de ensayo conocidos o por extrapolacion de datos de ensayo in vivo o in vitro. Debe observarse que las concentraciones y los valores de dosificacion tambien pueden variar con la edad del individuo tratado. Debe entenderse ademas que para cualquier sujeto particular, los regfmenes de dosificacion espedficos deben ser ajustados en el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administracion de las formulaciones, y que los intervalos de concentracion enunciados en la presente memoria son unicamente ilustrativos y no se pretende que limiten su alcance. La cantidad de los uno o varios agentes terapeuticos seleccionados para la HBP que se van a administrar para el tratamiento de la HBP se puede determinar mediante tecnicas clmicas convencionales. Ademas, se pueden emplear analisis ensayos in vitro y modelos animales para ayudar a identificar intervalos de dosificacion optimos.

Por lo tanto, la dosificacion precisa, que se puede determinar empmcamente, puede depender de la preparacion terapeutica concreta, del regimen y del programa de dosificacion, de la via de administracion y de la gravedad de la enfermedad. Por lo tanto, las dosificaciones y cantidades precisas son conocidas por los expertos en la tecnica o pueden determinarse empmcamente basandose en la bibliograffa o en experimentos in vitro o in vivo (p.ej. modelo animal). Por ejemplo, la dosificacion o cantidad para administracion intraprostatica puede ser una dosificacion y una cantidad que se utilizan para administraciones orales o intravenosas o la dosificacion o la cantidad se pueden extrapolar a partir de esa dosificacion. Un experto en la tecnica esta familiarizado con los regfmenes de dosificacion para la administracion de agentes terapeuticos para la HBP concretos.

Se proporciona una hialuronidasa soluble en las combinaciones, formulaciones y composiciones proporcionadas en la presente memoria. La hialuronidasa soluble seleccionada se incluye en una cantidad suficiente para ejercer un efecto terapeuticamente util. La concentracion terapeuticamente eficaz puede determinarse empmcamente mediante ensayos en sistemas in vitro e in vivo conocidos, tal como utilizando los analisis proporcionados en la presente memoria o conocidos en la tecnica (veanse p.ej., Taliani et al. (1996) Anal. Biochem., 240: 60-67; Filocamo et al. (1997) J Virology, 71: 1417-1427; Sudo et al. (1996) Antiviral Res. 32: 9-18; Buffard et al. (1995) Virology, 209:52-59; Bianchi et al. (1996) Anal. Biochem., 237: 239-244; Hamatake et al. (1996) Intervirology 39:249-258; Steinkuhler et al. (1998) Biochem., 37:8899-8905; D'Souza et al. (1995) J Gen. Virol., 76:1729-1736; Takeshita et al. (1997) Anal. Biochem., 247:242-246; veanse tambien p.ej., Shimizu et al. (1994) J. Virol. 68:8406-8408; Mizutani et al. (1996) J. Virol. 70:7219-7223; Mizutani et al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun., 227:822-826; Lu et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci (USA), 93:1412-1417; Hahm et al., (1996) Virology, 226:318-326; Ito et al. (1996) J. Gen. Virol., 77:1043-1054; Mizutani et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun., 212:906-911; Cho et al. (1997) J. Virol. Meth. 65:201-207 y despues extrapolando de allf para determinar las dosificaciones para los seres humanos.

Al mejorar el estado de un paciente, se puede administrar una dosis de mantenimiento de un compuesto o de las composiciones, si fuera necesario; y se pueden modificar la dosificacion, la forma de dosificacion, o la frecuencia de administracion, o una de sus combinaciones. En algunos casos, un sujeto puede requerir tratamiento intermitente a largo plazo despues de cualquier reaparicion de los smtomas de la enfermedad o basandose de dosificaciones programadas.

En ejemplos concretos, las formulaciones de LMV, incluyendo las co-formulaciones, u otras formulaciones de lfpidos proporcionadas en la presente memoria se administran en volumenes de dosificacion para infeccion o infusion de 0,1 mLa 50 mL, por ejemplo, 0,5 mL a 10 mL, tal como 1 mL a 2 mL. Generalmente, se suministra al menos 1 mL de una formulacion de LMV u otra formulacion de lfpidos encapsulada con una enzima de degradacion de hialuronano. Las formulaciones se pueden inyectar en un sitio o multiples sitios prostaticos diferentes. Por ejemplo, se realiza una inyeccion en cada lobulo de la prostata. Para propositos de tratamiento de la HBP, la formulacion de LMV se administra mediante inyeccion transrectal, transuretral o transperineal en la prostata bajo ultrasonograffa transrectal. Las formulaciones de LMV se administran en un regimen de dosificacion al menos una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada cuatro meses, una vez cada cinco meses, una vez cada seis meses, una vez cada siete meses, una vez cada nueve meses, una vez cada diez meses, una vez cada once meses o una vez al ano. Por ejemplo, las formulaciones de LMV se administran cada 3 a 6 meses.

F. Terapia combinada para el tratamiento de la hipertrofia prostatica benigna

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Se puede administrar cualquiera de las enzimas de degradacion de hialuronano anteriores, en particular formulaciones de liberacion sostenida de una enzima de degradacion de hialuronano, tales como las formulaciones de LMV descritas anteriormente, junto con uno o mas de otros agentes adecuados para el tratamiento de la HBP. Los otros agentes se pueden administrar secuencialmente (p.ej. antes de o posteriormente o intermitentemente) o simultaneamente a la enzima de degradacion de hialuronano (p.ej. LMV que contiene una enzima encapsulada que degrada el hialuronano). Las enzimas que degradan el hialuronano y otros agentes terapeuticos con modos terapeuticos complementarios mejoran el tratamiento de la HBP si se administran simultanea o secuencialmente. Por ejemplo, se puede combinar una enzima de degradacion de hialuronano, por ejemplo una hialuronidasa tal como PH20, y en particular cualquiera encapsulada en una vesmula de membrana como se proporciona en la presente memoria, con uno o mas de antiandrogenos, bloqueadores alfa, toxinas botulmicas y otros agentes utiles para tratar la HBP. Los antiandrogenos incluyen, por ejemplo, anti-androgenos esteroideos, anti-androgenos no esteroideos y/o inhibidores de la 5a-reductasa. Se contempla cualquier combinacion. Ademas, tal como se ha descrito anteriormente, pueden generarse formulaciones de liberacion sostenida, tales como co-formulaciones de LMV que contienen adicionalmente otro agente terapeutico encapsulado en los mismos, tal como un agente adecuado para tratar la HBP. Por lo tanto, en tales ejemplos, la enzima de degradacion de hialuronano y otro agente se administran simultaneamente tras la administracion de las co-formulaciones de LMV. Otros agentes adecuados para el tratamiento de la HBP pueden administrarse adicionalmente en combinacion con una co-formulacion LMV como se proporciona en la presente memoria.

Como se describe en la presente memoria mas adelante, en la tecnica se conocen otros agentes para el tratamiento de la HBP. Tales agentes se pueden utilizar solos o en diversas combinaciones con las formulaciones de enzimas de degradacion de hialuronano proporcionadas en la presente memoria. Por ejemplo, se conocen combinaciones de agentes para la HBP. Las combinaciones administradas oralmente de un inhibidor de la 5a-reductasa y un agente bloqueador alfa, finasterida y terazosina (Patente de Estados Unidos Num. 5.753.641), extracto de palmito enano y terazoma (Patente de Estados Unidos Num. 6.200.573) y dutasterida y tamsulosina (sitio web de GSK) se han utilizado para tratar la HBP. La combinacion de un inhibidor de la 5a-reductasa, tal como la finasterida, y un antiandrogeno no esteroideo, tal como la flutamida o la bicalutamida, se ha utilizado para el cancer de prostata (Patente de Estados Unidos Num. 5.994.362). Ademas, latoxina botulmica se ha utilizado como un complemento en la terapia con la terapia combinada. Los pacientes que recibieron tratamiento combinado de un inhibidor de la 5a- reductasa y un bloqueador alfa a los que se les administro una sola inyeccion intraprostatica de toxina Botulmica A (200-600U) mostraron una reduccion del volumen de la prostata y una mejora de las puntuaciones de los smtomas del tracto urinario en comparacion con los pacientes que recibieron unicamente terapia combinada en el plazo de 6 meses de tratamiento. A los 12 meses despues del tratamiento no se observo diferencia entre los pacientes que recibieron terapia combinada y los que recibieron terapia combinada mas Botox anadido durante la terapia (Kuo et al., Scand J Urol Nephrol. 43(3):206 (2009).

En la presente memoria se proporcionan composiciones farmaceuticas y combinaciones de composiciones de enzima de degradacion de hialuronano con uno o mas agentes de tratamiento de la HBP. La enzima de degradacion de hialuronano y los otros agentes pueden administrarse por separado o conjuntamente. Cuando se formulan por separado, las composiciones separadas se pueden administrar secuencialmente, intermitentemente o posteriormente a los otros componentes. El agente de tratamiento de la HBP y la enzima de degradacion de hialuronano pueden envasarse como composiciones separadas para administracion conjunta, secuencialmente o intermitentemente. Las combinaciones se pueden envasar como un kit.

Las vfas de administracion para la enzima de degradacion de hialuronano y los otros agentes pueden ser iguales o diferentes. Por ejemplo, se administra un agente por via oral o intravenosa y se administra otro agente mediante administracion intraprostatica. Por ejemplo, cuando la enzima de degradacion de hialuronano se administra con un antiandrogeno o un agente bloqueador alfa, el agente antiandrogeno o de bloqueo alfa puede administrarse por via oral mientras que la enzima tfpicamente se administra intravenosamente o directamente a la prostata. Para los propositos de tratamiento de la HBP, un modo particularmente util de administrar combinaciones terapeuticas es suministrando los agentes directamente a la prostata como una co-formulacion. Pueden administrarse directamente a la prostata una enzima de degradacion de hialuronano combinada con uno o mas anti-androgenos, agentes bloqueadores alfa, toxina botulmica y otros agentes terapeuticos para la HBP, p.ej. mediante inyeccion intraprostatica, transuretral, transperineal o transrectal. Como se discute en la presente memoria, es ventajoso adicionalmente formular tales combinaciones de enzima de degradacion de hialuronano y uno o mas de otros agentes de modo que una vez introducidos en la glandula prostatica, los agentes se liberen lentamente durante un periodo de tiempo prolongado dando como resultado un efecto terapeutico prolongado y una reduccion del numero de tratamientos requeridos para lograr un efecto terapeutico.

La dosis de otros agentes terapeuticos (p.ej., antiandrogenos, agentes bloqueadores alfa y toxina botulmica) puede variar dependiendo de las condiciones, es dear, el tamano de la prostata y la gravedad de los smtomas, las vfas de administracion, el paciente y la combinacion particular de agentes terapeuticos que se esten administrando.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

agentes, formulaciones espedficas y modos de administracion para reducir el numero de tratamientos al numero mmimo requerido para obtener el efecto terapeutico deseado. La inyeccion intraprostatica de formulaciones de una enzima de degradacion de hialuronano proporcionada en la presente memoria combinada con otros agentes terapeuticos debe permitir que el tratamiento se administre solo mensualmente, trimestralmente, bianualmente, anualmente u optimamente solo una vez.

Tambien se entiende que la dosificacion precisa y la duracion del tratamiento para agentes y combinaciones de agentes pueden determinarse empmcamente utilizando protocolos de ensayo conocidos o por extrapolacion a partir de datos de ensayo in vivo o in vitro. Debe observarse que las concentraciones y valores de dosificacion tambien pueden variar con la gravedad de la afeccion que se vaya a aliviar. Debe entenderse adicionalmente que para cualquier sujeto concreto, los regfmenes de dosificacion espedficos deben ajustarse en el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administracion de las composiciones y que los intervalos de concentracion enunciados en la presente memoria son unicamente ilustrativos y no pretenden limitar el alcance o el uso de las composiciones y combinaciones que las contienen. Las composiciones se pueden administrar diariamente, semanalmente, mensualmente, anualmente o una vez. Generalmente, los regfmenes de dosificacion se eligen para limitar la toxicidad. Debe observarse que el medico asistente sabra como y cuando terminar, interrumpir o ajustar la terapia a dosificacion mas baja debido a la toxicidad, o a disfunciones de la medula osea, el tugado, el rinon u otros tejidos. Por el contrario, el medico asistente tambien sabna como y cuando ajustar el tratamiento a niveles mas altos si la respuesta clmica no fuera la adecuada (excluyendo los efectos secundarios toxicos). La administracion de un agente terapeutico no debe exceder los niveles maximos de dosificacion enunciados por la Administracion de Alimentos y Farmacos de los Estados Unidos o publicados en Physician's Desk Reference.

Si fuera necesario, se puede determinar o extrapolar empmcamente una dosificacion y una duracion y un protocolo de tratamiento particulares. Por ejemplo, se pueden utilizar dosis ilustrativas de agentes terapeuticos para la HBP administrados oralmente o intravenosamente como punto de partida para determinar dosificaciones apropiadas para inyeccion directa en la prostata. Para cualquiera de los agentes terapeuticos para la HBP, se puede estimar inicialmente una dosis particular que es terapeuticamente eficaz utilizando una variedad de mecanismos bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, una dosis puede formularse en modelos animales para conseguir un intervalo de concentracion circulante que incluya la CI50 como se determina en el cultivo celular. Puede determinarse el intervalo de dosificacion apropiado para sujetos humanos, por ejemplo utilizando los datos obtenidos a partir de analisis de cultivo celular y otros estudios en animales.

Los niveles y regfmenes de dosificacion pueden determinarse basandose en dosificaciones y regfmenes conocidos o pueden determinarse empmcamente basandose en una variedad de factores. Estos factores incluyen el peso corporal del individuo, la salud general, la edad, la actividad de los agentes espedficos empleados, el sexo, la dieta, el tiempo de administracion, la frecuencia de administracion, la tasa de excrecion, las combinaciones espedficas de los agentes terapeuticos, la gravedad y el curso de la enfermedad del paciente, la disposicion del paciente a la enfermedad, la reduccion deseada de los smtomas, el criterio del medico a cargo del tratamiento y otros factores bien conocidos que afectan a la eficacia de los agentes farmaceuticos administrados.

A continuacion se proporcionan ejemplos de otros agentes para el tratamiento de la HBP. Los agentes para el tratamiento de la HbP son conocidos por un experto en la tecnica. Se entiende que la discusion de agentes terapeuticos para el tratamiento de HBP proporcionada a continuacion es unicamente ilustrativa. Esta dentro del nivel de un experto en la tecnica el uso de cualquier agente para el tratamiento de la HBP en las composiciones y combinaciones de la presente invencion.

1. Antiandrogenos

El papel de los androgenos en el desarrollo de la hiperplasia benigna de prostata en los hombres esta bien documentado (Wilsom, N. Engl. J. Med. 317, 628 (1987)). En la prostata, la testosterona es convertida en la potente hormona androgenica 5a-dihidrotestosterona (DHT) por la enzima 5a reductasa. La expansion de la glandula prostatica depende de la DHT. La DHT esta ligada a los receptores de androgenos del citosol dentro del citoplasma y el complejo del receptor DHT es transportado al nucleo de la celula, donde efectua la transcripcion de los genes implicados en el crecimiento.

Los antiandrogenos son una amplia clase de agentes que ejercen su efecto ya sea interfiriendo en la union de los androgenos al receptor de androgenos evitando asf que las hormonas androgenicas entren en el nucleo y ejerzan su efecto androgenico sobre la prostata o interfiriendo en la produccion de androgenos. Los antiandrogenos que actuan a traves del receptor de androgenos se clasifican como antiandrogenos esteroideos o no esteroideos basandose en su estructura qmmica. Los anti-androgenos esteroideos tienen la estructura de un esteroide, es decir un hidrocarburo tetradclico compuesto por tres anillos de ciclohexano y uno de ciclopentano. Los anti-androgenos no esteroideos no tienen la estructura qrnmica de un esteroide.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Los antiandrogenos que inhiben competitivamente la accion de las hormonas androgenicas al unirse a los receptores de androgenos son una clase de farmacos que han sido aprobados para el tratamiento de la HBP. Estos farmacos antiandrogenicos incluyen farmacos esteroideos y farmacos no esteroideos.

a. Anti-androgenos esteroideos

Los farmacos anti-androgenos esteroideos incluyen, pero no se limitan a, compuestos de progestina tales como acetato de ciproterona (CPA) (disponible fuera de los EE.UU. como Androcur® (Schering, Alemania)) o Cyprostat® (Bayer, plc, Reino Unido), acetato de megestrol (Megace®, Strativa Pharmaceuticals, Woodcliff Lake, New Jersey), acetato de medroxiprogesterona (Provera®, Pfizer, Nueva York), acetato de clormadinona (CMA) (disponible en Japon), Zanoterona (denominada WIN 49596, LGM Pharmaceuticals, Inc., Boca Raton, Florida) y acetato de osaterona (TZP - 4238) (Takezawa et al. Prostate 1992; 21(4):315-329; Takezawa et al. Prostate 1993; 27:321-328). El alilestemol es un esterodide sintetico con actividad progestacional que ha demostrado ser eficaz en el tratamiento de la HBP (vease Noguchi et al., International Journal of Urology 5(5):466-470 (2007)).

Esta dentro del nivel de un experto en la tecnica determinar empmcamente una dosis que se va a combinar en la presente memoria para su uso en el tratamiento de la HBP. Se inyecto intraprostaticamente una dosis unica de acetato de clormadinona de liberacion sostenida (CMA-SR) de 8 mg/kg o 25 mg/kg en ratas (Goya et al. (2006) Journal Compilation BJU International, 99:202-206).

b. Anti-androgenos no esteroideos

Los farmacos antiandrogenos no esteroideos incluyen, pero no se limitan a, bicalutamida (Casodex®, AstraZeneca Wilmington, Del), nilutamida (Nilandron®, Sanofi Aventis, Bridgewater, N.J); Anandron® (Sanofi Aventis Australia Pty Ltd, Macquarie Park NSW 2113), flutamida (Eulexin®, Schering Laboratories, Kenilworth, Nueva Jersey); y rU 58642 (Battman y col., J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 64,103 (1998)). El antiandrogeno no esteroide RU 58841 (Kouting Chemical Co. Ltd., Shanghai) se ha explorado como un tratamiento topico para la perdida del cabello, pero tambien puede ser eficaz en laterapia hormonal para las enfermedades de la prostata.

El nombre qmmico de la bicalutamida es (±)N[4-ciano-3-(trifluorometil)fenil]-3-[(4-fluorofenil)sulfonil]-2-hidroxi-2- metilpropanimida (descrita en la Patente de Estados Unidos Num. 4.636.505 de Tucker, que se incorpora a la presente memoria como referencia). El enantiomero R de la bicalutamida tiene la mayor parte de la actividad. Las pautas de dosificacion para Casodex® publicadas en The Physician's Desk Reference informan de que una dosis tfpica en una terapia combinada (es dear, Casodex® combinado con un analogo de LHRH) para el carcinoma prostatico es una administracion oral una vez al dfa de un comprimido de 50 mg. Se ha informado de que las dosis hasta 200 mg por dfa son bien toleradas en las pruebas clmicas a largo plazo.

Nilandron® ha sido aprobado para el tratamiento del cancer de prostata a una dosis recomendada de 300 mg/dfa durante 30 dfas, seguido de 150 mg/dfa despues de eso (ver Informacion sobre la Prescripcion de Nilandron, products.sanofi-aventis.us/nilandron/nilandron.ht mL).

Otros antiandrogenos no esteroideos adecuados incluyen antiandrogenos no esteroideos descritos en la Patente de Estados Unidos Num. 3.875.229 de Gold, la Patente de Estados Unidos Num. 4.097.578 de Perronnet, et al., la Patente de Estados Unidos Num. 4.239.776 de Glen, et al., la Patente de Estados Unidos Num. 4.386.080 de Crossley, et al., la Patente de Estados Unidos Num. 5.994.362 de GormLey, et al. o la Patente de Estados Unidos Num. 5.872.150 de Elbrecht, et al. (el contenido completo de cada una de las cuales se incorpora a la presente memoria como referencia).

Esta dentro del nivel de un experto en la tecnica determinar empmcamente una dosis que se va a combinar en la presente memoria para su uso en el tratamiento de la HBP. Por ejemplo, Nilutamida (Nilandron®) 150Casodex 50 mg diarios combinada con un analogo de la hormona liberadora de la hormona lutenizante para el tratamiento del carcinoma metastasico de la prostata.

c. Inhibidores de 5a-reductasa

Otra clase de farmacos anti-androgenos que han recibido aprobacion para el tratamiento de la HBP son los inhibidores de la enzima 5a-reductasa. La enzima 5a-reductasa existe en dos formas de Tipo I y Tipo II. El Tipo II se expresa predominantemente en la prostata. El tratamiento con un inhibidor de la 5a-reductasa puede reducir la produccion de DHT y retardar el crecimiento del tejido prostatico. Los inhibidores de la 5a-reductasa ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, finasterida, dutasterida, FR146687O PNU 157706. A estos inhibidores de la 5a- reductasa, incluyendo finasterida y dutasterida, se les han atribuido la prevencion de la progresion del crecimiento de la prostata y la retraccion real de la prostata.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

finasterida esta disponible bajo el nombre comercial Proscar® (Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, N.J.). La finasterida tiene el nombre qmmico (5a,17p)-N-(1,1-dimetetiletil)-3-oxo-4-azaandrost-1-eno-17- carboxamida. La finasterida inhibe la 5a-reductasa formando un complejo estable con la enzima. Se ha informado de que la finasterida no tiene afinidad por los receptores de androgenos del citoplasma. Las Patentes de Estados Unidos Num. 4.220.735, 4.377.584, 4.760.071 y 4.859.681 de Rasmusson et al. describen la smtesis de finasterida y describen otros compuestos 4-azasteroides adecuados utiles para tratar la HBP. La dosificacion de finasterida puede determinarse tomando en consideracion el modo de administracion, el efecto terapeutico de la enzima de degradacion de hialuronano y otros agentes terapeuticos incluidos en la composicion, la gravedad de la enfermedad y generalmente esta de acuerdo con las pautas aceptadas para el tratamiento de la HBP. A modo de ejemplo, la dosis diaria recomendada de finasterida es de 5 mg, administrada oralmente.

La dutasterida (Duagen®, Avodart®, GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC), (5a,17p)-N-[2,5- bis(trifluorometil)fenil]-2-oxo-4-azaandrost-1-eno-17-carboximida, es un farmaco 4-azasteroide sintetico aprobado que se informa que inhibe la 5a-reductasa tanto de Tipo I como de Tipo II. La dosis oral recomendada de dutasterida es de 0,5 mg al dfa.

FR156687 es tambien un inhibidor que se ha demostrado que reduce el crecimiento de la prostata in vivo e in vitro (vease p.ej. Nakayama et al. (1997) Prostate, 31:241-9). Otro denominado "inhibidor dual" se denomina PNU 157706, [N-(1,1,1,3,3,3-hexafluorofenil-propil)-3-oxo-4-aza-5a-androst-1-eno-17p-carboxamida] (diSalle, et al., J Steroid Biochem. Mol. Biol. 64,179 (1998)).

El suplemento herbal de palmito enano, se ha tomado para la salud de la prostata, y contiene un inhibidor de la 5a- reductasa.

Esta dentro del nivel de un experto en la tecnica determinar empmcamente una dosis que se va a combinar en la presente memoria para su uso en el tratamiento de la HBP. La finasterida se administra a 5 mg/dfa por via oral durante un penodo de tratamiento de anos (Lam et al. Urologfa, 2003 Feb;61(2):354-8). La dutasterida (Avodart®) se administra a 0,5 mg/dfa por via oral durante un penodo de tratamiento de anos.

2. Agentes bloqueadores alfa

Se han utilizado antagonistas de adrenorreceptores alfa (bloqueadores a o bloqueantes a) en el tratamiento de la HBP. Los farmacos aprobados incluyen terazosina (Hytrin®, Deflox®, Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois), doxazosina (Cardura®, Pfizer. Nueva York), tamosina (Flomax®, Boehringer Ingelheim, Ridgefield, CT), alfuzosina (Uroxatral® Sanofi-Aventis, Bridgewater, Nueva Jersey), naftopidil (Flivas®, Asahi Kasei Pharma Corp., Tokio, Japon) y silodosin (Rapaflo®, Watson Pharmaceuticals, Inc, Corona, CA)). Estos farmacos actuan para relajar la musculatura lisa de la prostata y el cuello de la vejiga, reduciendo la resistencia uretral y produciendo una mejora del flujo de orina. Los antagonistas de los receptores adrenergicos solo tratan los smtomas de la HBP y no reducen el tamano de la prostata.

Esta dentro del nivel de un experto en la tecnica determinar empmcamente una dosis que se va a combinar en la presente memoria para su uso en el tratamiento de la HBP. Por ejemplo, la dosis oral mmima/maxima diaria de terazosina es de 1,0 mg/20,0 mg; la silodosina se administra por via oral a 8 mg/dfa; la alfuzosina (SR, liberacion sostenida) se administra a 5 mg dos veces al dfa (Debruyne et al. Eur Urol 1998; 34:169-175); La tamsulosina (Flomax®) tiene una dosis oral eficaz de 0,4 mg al dfa o 0,8 mg al dfa. La dosificacion oral de Hytrin se incrementa gradualmente de 1 mg/dfa a 2 mg/dfa a 5 mg/dfa.

Tfpicamente, cuando se ha administrado mas de un tratamiento para la BHP al mismo tiempo a un paciente, tal como un inhibidor de la 5a-reductasa y un agente bloqueador alfa, cada agente se ha proporcionado a la dosis determinada cuando se administra solo. Dutasterida un inhibidor de la 5a-reductasa 0,5 mg/dfa y tamsulosina un bloqueador alfa 0,4 mg/dfa.

3. Toxina botulmica y toxinas botulmicas modificadas

La toxina botulinica se ha utilizado en el tratamiento de la HBP para reducir el tamano de la prostata agrandada. Un centenar de unidades de toxina botulinica de tipo A formuladas en Poloxamer 407 al 20% (BASF, Florham Park, New Jersey) en cloruro de sodio al 0,9% para liberacion sostenida cuando se inyecto transperinealmente a cada uno de los lobulos bilaterales de la prostata dio como resultado efectos beneficiosos durante aproximadamente seis meses (Solicitud de Estados Unidos Num. 20090214685)

La toxina botulinica incluye la neurotoxina producida por Clostridium botulinum; la toxina botulinica (o la cadena ligera o la cadena pesada) preparada de forma recombinante por una especie no Clostridial; los serotipos A, B, C, D, E, F y G de la toxina botulinica; un complejo de toxina botulinica (los complejos de 300, 600 y 900 kDa); una toxina botulinica modificada, una toxina botulinica pegilada, una toxina botulinica quimerica, una toxina botulinica

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

recombinante, una toxina botulmica tubrida y una toxina botulmica modificada qmmicamente. Una toxina botulmica modificada es una toxina botulmica que tiene al menos uno de sus aminoacidos suprimido, modificado o reemplazado, en comparacion con una toxina botulmica nativa. Una toxina botulmica modificada puede ser una neurotoxina producida de forma recombinante, o un derivado o fragmento de una neurotoxina producida de forma recombinante. Una toxina botulmica modificada conserva al menos una actividad biologica de la toxina botulmica nativa.

Las composiciones farmaceuticas que contienen toxina botulmica disponibles comercialmente incluyen Botox®, complejo de neurotoxina de toxina Botulmica tipo A en albumina de suero humano y cloruro de sodio (Allergen, Inc., Irvine, CA); Dysport®, complejo de hemaglutinina de toxina del tipo A de Clostridium botulinum con albumina serica humana y lactosa (Ipsen Limited, Berkshire, UK) y Myobloc®, toxina botulmica tipo B, succinato de sodio de albumina humana y cloruro de sodio (Solstice Neurosciences, Inc., South San Francisco, CA).

La toxina botulmica util para las composiciones de la presente memoria incluyen la toxina de tipo A, la toxina botulmica de tipo B, la toxina botulmica de tipo C, la toxina botulmica de tipo D, la toxina botulmica de tipo E, la toxina botulmica de tipo F y la toxina botulmica de tipo G. Las toxinas botulmicas preferidas para su uso incluyen la toxina botulmica tipo A y la toxina botulmica tipo B. Otras formas de toxina botulmica que son utiles son las toxinas botulmicas quimericas o tubridas, vease, p.ej., la Patente de Estados Unidos Num. 5.939.070, que se incorpora a la presente memoria como referencia en su totalidad; toxinas botulmicas preparadas de manera recombinante, vease, p.ej., la Patente de Estados Unidos Num. 5.919.665, que se incorpora en la presente memoria como referencia en su totalidad; y toxinas botulmicas redirigidas, veanse, p.ej., las Patentes de Estados Unidos Num. 5.989.545 y/o 6.461.617, que se incorporan a la presente memoria como referencia en su totalidad. Las toxinas botulmicas dirigidas hace referencia a toxinas botulmicas que estan unidas a un radical de direccionamiento no nativo con afinidad por el tejido diana seleccionado. Las formulaciones de toxina botulmica que son compatibles con las combinaciones de la presente invencion incluyen formulaciones retardadas, p.ej., Implantes polimericos, microesferas, obleas y geles, para liberacion sostenida o controlada. Veanse, p.ej., las Patentes de Estados Unidos Num.: 6.585.993; 6.506.399; 6.306.423; 6.312.708; 6.383.509, todas los cuales se incorporan a la presente memoria como referencia en su totalidad.

Tfpicamente, la cantidad de toxina botulmica administrada a un paciente es de aproximadamente 1 a aproximadamente 2000 unidades de toxina botulmica de tipo A o de aproximadamente 50 a aproximadamente 25.000 unidades de toxina botulmica de tipo B.

La preparacion y el uso de toxina botulmica se describe en Patentes de Estados Unidos Num.: 7.579.010, 7.556.817, 7.491.799, 7.491.403, 7.465.457, 7.455.845, 7.452.697, 7.449.192, 7.445.914, 7.262.291, 7.233.577, 7.189.541, 7.148.041, 7.041.792, 5.955.368, 5.837.265 y 5.696.077, que se incorporan como referencia en su totalidad.

Esta dentro del nivel de un experto en la tecnica determinar empmcamente una dosis que se va a combinar en la presente memoria para su uso en el tratamiento de la HBP. Por ejemplo, la Solicitud de Patente de Estados Unidos publicada Num. 7.153.514 describe un tratamiento unico de la hiperplasia benigna de prostata mediante tres inyecciones intraprostaticas de 50 unidades de hialuronidasa seguidas de tres inyecciones de 50 unidades de inyeccion de toxina botulmica tipo A. En otro ejemplo, el tratamiento de la HBP es inyectando en la prostata de 100 UI/70 kg a 1200 UI/70 kg de toxina botulmica tipo A en una dosis unica o dividida (vease p.ej. la Patente de Estados Unidos Num. 7.153.514). Vease tambien Chuang el al. Journal Compilation BJU International 98:28-32 (2006).

4. Otros agentes

Otros agentes que son utiles para el tratamiento de la HBP pueden administrarse con una enzima de degradacion de hialuronano (p.ej. hialuronidasa) y, en particular, formulaciones de liberacion sostenida, en lugar de o junto con los antiandrogenos, agentes bloqueadores alfa y toxinas botulmicas. Los siguientes son algunos ejemplos de otros agentes utiles para el tratamiento de la HBP y no se pretende que sean limitantes.

PRX302 es una protoxina bacteriana activada por PSA que se puede inyectar intraprostaticamente para tratar la HBP. (Protox Therapeutics vease
www.protox.com WO2006/133553).

Los productos conjugados utiles para tratar la HBP incluyen oligopeptidos con secuencias de aminoacidos que se escinden selectivamente mediante PSA, ligados qmmicamente a agentes citotoxicos alcaloides de vinca (USP 20040081659).

NX-1207 (2,5 mg) se administra mediante inyeccion intraprostatica, tratamiento unico (Nymox Pharmaceuticals).

Se ha demostrado que el extracto de polen Cernilton® mejora el flujo de orina y disminuye el volumen de la prostata cuando se administra a pacientes con HBP (vease Dutkiewicz, International Urology and Nephrology 28(1):49-53 (1996).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

El elocalcitol es un agonista de la vitamina D no hipercalcemico que se ha demostrado que detiene el crecimiento de la prostata cuando se administra por v^a oral a una dosis de 150 mcg/dfa (vease el sitio web de BioXell,
www.bioxell.com).

En el tratamiento de la HBP se puede utilizar la ablacion con etanol (veanse, p.ej. Ditrolio et al. (2002) Journal of Urology, 167:2100-2104; Grise et al. (2004) Eur. Urol., 46:496-501). Por lo tanto, en los ejemplos de la presente invencion, se puede utilizar una enzima de degradacion de hialuronano (p.ej. hialuronidasa) y, en particular, formulaciones de liberacion sostenida, combinada con la ablacion con etanol para tratar la HBP.

5. Articulos de Fabricacion

Los compuestos farmaceuticos de agentes terapeuticos seleccionados pueden envasarse combinados con una formulacion enzimatica de degradacion de hialuronano como artmulos de fabricacion que contienen material de envasado, una composicion farmaceutica que es eficaz para tratar HBP y una etiqueta que indica que el agente o los agentes seleccionados es se deben utilizar para tratar la enfermedad o trastorno. Las combinaciones de una formulacion enzimatica de degradacion de hialuronano y uno o mas de antiandrogenos, agentes bloqueadores alfa, toxina botulmica y otros agentes de tratamiento de HBP se pueden envasar en un artmulo de fabricacion.

Los artmulos de fabricacion proporcionados en la presente memoria contienen materiales de envasado. Los materiales de envasado para su uso en el envasado de productos farmaceuticos son bien conocidos por los expertos en la tecnica. Veanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Num. 5.323.907, 5.052.558 y 5.033.252, cada una de las cuales se incorpora a la presente memoria en su totalidad. Los ejemplos de materiales de envasado farmaceuticos incluyen, pero no se limitan a, envases de tipo burbuja, botes, tubos, inhaladores, bombas, bolsas, viales, recipientes, jeringuillas, botellas y cualquier material de envasado adecuado para una formulacion seleccionada y modo de administracion y tratamiento previstos. Los artmulos de fabricacion pueden incluir una aguja u otro dispositivo de inyeccion para facilitar la administracion con fines de inyeccion local. Se contempla una amplia gama de formulaciones de los compuestos y composiciones proporcionados en la presente memoria, asf como una variedad de tratamientos para la hBp.

La eleccion del envase depende de la enzima de degradacion del hialuronano y de otros agentes, y de si tales composiciones se envasaran juntas o por separado. En general, el envase no es reactivo con las composiciones contenidas en el mismo. En un ejemplo, la enzima de degradacion de hialuronano puede envasarse como una mezcla con uno o mas de antiandrogenos, agentes bloqueadores alfa, toxinas botulmicas y otro agente de tratamiento de HBP. Por ejemplo, se contempla una formulacion de liberacion sostenida de una enzima de degradacion de hialuronano y un inhibidor de la 5a-reductasa, tal como finasterida o dutasterida. En otros ejemplos, algunos de los componentes se pueden envasar en forma de una mezcla. En otros ejemplos, todos los componentes se envasan por separado. Asf, por ejemplo, los componentes se pueden envasar en forma de composiciones separadas que, al mezclarse inmediatamente antes de la administracion, se pueden administrar directamente en conjunto. Alternativamente, los componentes se pueden envasar en forma de composiciones separadas para administracion por separado.

Los componentes pueden envasarse en un recipiente. El recipiente puede tener un unico compartimento que contiene una formulacion enzimatica de degradacion de hialuronano y que es susceptible de adicion de uno o mas de los otros agentes por el usuario, por ejemplo a traves de una abertura en el compartimiento. Se contempla cualquier recipiente u otro artmulo de fabricacion que sea susceptible de tener un espacio de definicion para la contencion de hialuronidasa y que sea susceptible de manipulacion sencilla para permitir la adicion de los componentes finales. Los otros componentes se anaden antes de su uso.

En otros ejemplos, los componentes se envasan por separado en el mismo recipiente. Generalmente, los ejemplos de tales recipientes incluyen aquellos que tienen un espacio cerrado y definido que contiene hialuronidasa, y un espacio separado, cerrado y definido que contiene los otros componentes o componente de tal manera que las areas subsiguientes se separan por una membrana facilmente extrafble que, despues de su retirada, permite que se mezclen los componentes. Se contempla cualquier recipiente u otro aiimulo de fabricacion, siempre y cuando la hialuronidasa se separe de los otros componentes antes de la administracion. Para las realizaciones adecuadas veanse, p.ej., los recipientes descritos en Patentes de Estados Unidos Num. 3.539.794 y 5.171.081.

Por ejemplo, un aparato de una sola camara incluye aquellos en los que el aparato contiene una sola camara o recipiente y, si es necesario, medios de inyeccion. Los alojamientos o recipientes de una sola camara incluyen cualquier artmulo en el que se incluye una hialuronidasa en el recipiente. La enzima de degradacion de hialuronano se aloja en el recipiente en fase lfquida o en forma de polvo u otra pasta u otra composicion conveniente. Los otros componentes, p.ej., el antiandrogeno, el agente bloqueador alfa o la toxina botulmica se introducen inmediatamente antes de su uso o se administran por separado.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

varias camaras. En general, este aparato tiene al menos dos camaras o compartimentos que mantienen de este modo la enzima de degradacion de hialuronano separada del anti-androgeno y/o agente bloqueador alfa o toxina botulmica hasta que se desee su mezcla. El aparato puede incluir una camara de mezclado para permitir la mezcla de los componentes antes de la dispensacion del aparato. Alternativamente, el mezclado puede ocurrir mediante la eyeccion de un componente de una camara a una segunda camara que contiene la hialuronidasa. Por ejemplo, la enzima de degradacion de hialuronano puede proporcionarse en forma liofilizada, y la reconstitucion puede conseguirse mediante la eyeccion del agente antiandrogeno o bloqueador alfa, tal como en una solucion lfquida, desde una primera camara a la segunda camara que contiene la hialuronidasa liofilizada .

En algunos ejemplos, un aparato de doble camara o de varias camaras emplea un mecanismo de bombeo mecanico en su funcionamiento. En tal ejemplo, el aparato dispensador mantiene los componentes en camaras separadas. El mecanismo de bombeo funciona para retirar el contenido de cada camara y dentro de una camara de mezclado, o desde una camara a la segunda camara. El mecanismo de bombeo puede accionarse manualmente, por ejemplo, mediante un embolo. Los ejemplos de tales aparatos de doble camara incluyen jeringas de doble camara (veanse p.ej., las Patentes de Estados Unidos Num. 6.972.005, 6.692.468, 5.971953, 4.529.403, 4.202.314, 4.214.584, 4.983.164, 5.788.670, 5.395.326; y las Solicitudes de Patentes Internacionales Num. W02007006030 y WO2001047584).

Otro ejemplo de un aparato dispensador de fluido de camara doble o de camara multiple contemplado para su uso en la presente memoria adopta la forma de un bote o tubo compresible u otro dispositivo similar. El dispositivo tiene al menos dos compartimientos en su interior que mantienen los componentes separados. La tapa del dispositivo puede servir como una camara de mezclado, una camara de mezclado puede estar situada entre las dos camaras y la tapa, o se puede lograr una mezcla dentro de una de las camaras. Los componentes son impelidos mediante compresion desde los compartimentos separados a la camara de mezcla. A continuacion se dispensan desde la camara de mezclado. Por ejemplo, los contenidos mezclados pueden ser retirados del dispositivo uniendo un aparato de embolo/jeringa al extremo de dispensacion y retirando el contenido a traves del mismo. Tales dispositivos son conocidos en la tecnica (vease p.ej., Solicitud de Patente Internacional. Num. WO1994015848).

6. Kits

Las composiciones y combinaciones seleccionadas de una enzima de degradacion de hialuronano y uno o mas de un agente anti-androgeno, bloqueador alfa, toxina botulmica u otro agente terapeutico de HBP, incluyendo artmulos de fabricacion de los mismos tambien se pueden proporcionar como kits. Los kits pueden incluir una composicion farmaceutica descrita en la presente memoria y un artmulo para su administracion proporcionado como un artmulo de fabricacion. Por ejemplo, se pueden suministrar una enzima de degradacion de hialuronano y uno o mas de antiandrogenos, agentes bloqueadores alfa, toxinas botulmicas y otros agentes terapeuticos de HBP con un dispositivo para administracion, tal como una jeringa. Las composiciones pueden estar contenidas en el artmulo para su administracion o pueden proporcionarse de forma separada para anadirse con posterioridad. Por ejemplo, se contempla una jeringuilla de un solo uso precargada con 1-2 mL de una enzima de degradacion de hialuronano formulada y antiandrogeno, tal como finasterida. Generalmente, los kits contienen un artmulo con una formulacion o composicion de enzima de degradacion de hialuronano, y una composicion antiandrogenica y/o una composicion de agente bloqueador alfa y/o toxina botulmica. El kit puede, opcionalmente, incluir instrucciones de aplicacion que incluyen dosificaciones, regfmenes de dosificacion e instrucciones para modos de administracion. Los kits tambien pueden incluir una composicion farmaceutica descrita en la presente memoria y un artmulo para el diagnostico. Por ejemplo, tales kits pueden incluir un elemento para medir la concentracion, cantidad de PSA en el sujeto.

G. Metodos de evaluacion de la eficacia

Una de las principales metas del tratamiento de la HBP es aliviar la obstruccion urinaria y los smtomas que la acompanan. La reduccion del tamano del tejido prostatico obstructivo y el posterior alivio de los smtomas de obstruccion urinaria son indicativos de una terapia exitosa. Fundamental para el papel desempenado por las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, es la metodologfa implicada en la evaluacion de la terapia. La evaluacion objetiva de los efectos de la terapia puede medirse por metodos convencionales incluyendo analisis de flujo urodinamico, examen transuretral o ultrasonograffa transrectal junto con una tabla de puntuacion de smtomas obstructivos.

Para evaluar el papel de los presentes metodos, composiciones y combinaciones en el alivio de los smtomas obstructivos de la HBP, son esenciales medios precisos para cuantificar el tamano de la prostata y determinar el flujo urinario maximo. La evaluacion de la respuesta al tratamiento de la HBP debe basarse en criterios objetivos. Se ha demostrado que las tecnicas actuales de obtencion de imagenes de prostata y los metodos de analisis urodinamico son eficaces en la evaluacion de tratamientos terapeuticos para la HBP. En vista de la variabilidad del curso clmico de la HBP en general y en el paciente individual en particular, existe la necesidad de evaluaciones de referencia ampliadas antes y despues del tratamiento. La evaluacion inicial del paciente debe incluir: historial; examen ffsico; puntuacion de los smtomas; cistoscopia; recuento sangumeo completo y perfil bioqmmico; medicion de la orina

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

residual; y el caudal urinario. El tamano de la prostata se puede determinar con ultrasonograffa transrectal tridimensional. Despues de un curso de tratamiento, se debe realizar una evaluacion de seguimiento. El seguimiento post-terapia de los pacientes tratados de hipertrofia prostatica puede incluir: examen ffsico; cistoscopia; estudios de laboratorio; y procedimientos de obtencion de imagenes. Los pacientes que se consideran beneficiados de la terapia son aquellos que tienen mejoffa clmica, por ejemplo con respecto a las tasas de flujo urinario maximo y las puntuaciones de los smtomas.

Una convencion para estimar el tamano de la prostata en el examen ffsico implica una escala de clasificacion que vaffa de normal a 4+. Una glandula normal es aproximadamente del tamano de una castana, pesa aproximadamente 10 gm y se presenta como una impresion mmimamente perceptible en el examen rectal. Una prostata agrandada 1 + es aproximadamente del tamano de una ciruela, pesa aproximadamente 25 g y ocupa un poco menos de una cuarta parte de la luz rectal. Una prostata agrandada 3+ alcanza el tamano de una naranja, alcanza un peso de aproximadamente 75 gm y llena aproximadamente tres cuartos de un diametro rectal. Una glandula 4+ puede alcanzar el tamano de un pequeno pomelo, pesar mas de 100 gm y llenartanto la luz rectal que es diffcil un examen adecuado.

Los avances recientes en instrumentacion y tecnicas ultrasonicas de obtencion de imagenes han demostrado su utilidad en el diagnostico, la estadificacion y el tratamiento de enfermedades que afectan a la prostata. Se ha demostrado que las tecnicas de obtencion de imagenes tridimensionales empleando equipos transrectales (TRUS) o ultrasonidos transuretrales son precisas y valiosas para evaluar la respuesta local de la prostata al tratamiento. Se inserta una sonda en el ano para comprobar la prostata. La sonda se utiliza para hacer rebotar las ondas de sonido de los organos internos para producir un sonograma. Los estudios de miccion sonografica proporcionan informacion mas util desde el punto de vista clmico que los estudios convencionales que se emplean actualmente. Ademas, el uso de ultrasonograffa transrectal mejora la precision de las inyecciones prostaticas al permitir la colocacion de la aguja, bajo grna ultrasonica, directamente en zonas sospechosas. La ultrasonograffa transrectal de la prostata permite visualizar las porciones anteriores de la prostata, que no pueden ser palpadas digitalmente. Tambien pueden ser visualizadas la anatoirffa intraprostatica, la integridad de la capsula y las vesfculas seminales.

Se ha demostrado que el uso de ultrasonograffa transrectal en la determinacion del volumen prostatico es un metodo fiable y se ha demostrado que es exacto hasta en 5% del peso prostatico real. La gravedad espedfica de la prostata es cercana a 1,0 y el volumen prostatico en cenffmetros cubicos se considera igual a su peso en gramos. El peso prostatico se puede calcular utilizando la formula simple: Peso = 0,5 (D1 x D2 x D3) representando D1, D2 y D3 los diametros de las tres dimensiones de la prostata. Se cree que la reproducibilidad diaria de esta tecnica es de aproximadamente 95%. Otros procedimientos de obtencion de imagenes que se pueden emplear incluyen pielogramas del tracto urinario, tomograffa computarizada y tecnicas de resonancia magnetica.

Los pielogramas intravenosos tienen un valor limitado en la valoracion del tamano prostatico. La tomograffa computarizada puede revelar el area periprostatica y revelar el tamano del ganglio linfatico. El detalle intraprostatico, sin embargo, es pobre con masas raramente visualizadas. La deteccion de nodos ampliados es altamente sensible; sin embargo, los nodulos de tamano normal pueden contener carcinoma microscopico. La resonancia magnetica, como la ultrasonograffa transrectal, revela la anatomfa intraprostatica. La tecnica es tan precisa y sensible como la ultrasonograffa transrectal o la tomograffa computarizada para demostrar la adenopaffa pelvica, la invasion periprostatica y la afectacion de las vesfculas seminales.

1. Modelos animales

Los sistemas de modelos de marnfferos in vivo desarrollados para evaluar la terapia para la HBP deben proporcionar datos con respecto a las dosis eficaces, asf como informacion sobre posibles efectos secundarios toxicos o inmunologicos. De los animales experimentales, el canido ha sido considerado el modelo mas apropiado para el estudio de la HBP humana. El tamano grande de la prostata canina, asf como la aparicion espontanea de HBP en perros de edad avanzada proporcionan analogfas con el sistema humano. A pesar de las diferencias morfologicas y bioqmmicas, la prostata canina ofrece un modelo experimental adecuado para evaluar los efectos de la terapia.

Se pueden disenar estudios in vivo para evaluar la seguridad y eficacia de las composiciones descritas y el metodo de administracion en el modelo animal canino. El efecto en el tejido prostatico causado por la inyeccion intraprostatica in vivo de las composiciones puede ser evaluado por medio de barridos ultrasonicos en vivo e in vitro de la prostata y por el examen macroscopico y microscopico del tejido de necropsia. La evaluacion histopatologica de los efectos de la composicion inyectada incluyo el examen de la prostata, la uretra, la vejiga, los tesffculos, los rinones, el tffgado, el corazon y los pulmones. Ademas, se pueden examinar evidencias de estenosis, fistulas, adherencias y granulomas en los tejidos vecinos al sitio de inyeccion. Siguiendo un curso de las inyecciones intraprostaticas in vivo de las composiciones que se deben someter a ensayo, de acuerdo con un protocolo de GLP aprobado para estudios con canidos in vivo, el animal puede ser sacrificado con una sobredosis de pentobarbital sodico. La prostata puede ser expuesta mediante una incision de la lmea media, retirada, desprovista del exceso de restos, y pesada. Tras la extraccion, la prostata se coloca en un recipiente con solucion salina normal y a

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

continuacion se explora mediante ultrasonidos. Las imagenes ultrasonicas de la prostata se registran en una pelmula. Las exploraciones ultrasonicas se realizan de modo que los hallazgos ultrasonicos e histologicos puedan ser comparados en las mismas zonas con la mayor exactitud posible. Despues de la exploracion, toda la prostata puede ser cortada en serie en secciones de 0,5 cm, fotografiada y preparada para el examen histopatologico microscopico. Se debe tener cuidado de preservar la correcta orientacion anatomica para la comparacion con los ultrasonogramas. Cuando la prostata es explorada in vitro, no hubo tejido intermedio entre el transductor y el tejido diana y, por lo tanto, proporciono una imagen ultrasonica optima. Los patrones ultrasonicos de las exploraciones de la prostata in vivo no es identica al patron obtenido in vitro debido a la circulacion de sangre y tejidos interpuestos. Sin embargo, se pueden realizar comparaciones y encontrar buenas correlaciones entre las exploraciones ultrasonicas in vivo e in vitro.

Debido a las limitaciones en la extrapolacion de datos obtenidos de los experimentos con animales a las condiciones humanas, la evaluacion final de cualquier agente terapeutico biologico debe realizarse en seres humanos. Los resultados del alivio de la obstruccion urinaria secundaria a la HBP por metodos quirurgicos actualmente en uso son buenos. Los metodos no quirurgicos, para ser aceptables, deben proporcionar resultados igualmente eficaces y estar libres de efectos secundarios adversos. Los ensayos clmicos correctamente construidos son esenciales y diffciles de realizar en una poblacion de edad avanzada debido a las limitaciones en el seguimiento del curso de la enfermedad y su respuesta a la terapia durante largos penodos de tiempo. Los estudios clmicos que evaluan el tratamiento deben incluir mediciones doble ciego controladas con placebo que continuen durante al menos tres anos despues del tratamiento. Los efectos del tratamiento pueden variar con la proporcion de componentes estromales y epiteliales o con la dosis y duracion del tratamiento. Con el fin de seleccionar de forma mas objetiva a los candidatos para el tratamiento con el metodo no quirurgico de terapia y para verificar con mayor precision los efectos de la composicion descrita, los criterios necesarios para que los hombres con HBP se clasifiquen como candidatos para la terapia farmacologica debenan incluir smtomas de moderados a severos con caudales urinarios maximos inferiores a 15 mL/segundo. Los pacientes que se deben excluir son aquellos con prostatectoirna previa, retencion urinaria aguda, infeccion, vejiga neurogenica, estenosis uretral, carcinoma de la prostata u otra enfermedad potencialmente mortal.

Los estudios clmicos que involucran sujetos humanos pueden implicar uno o mas de los siguientes parametros con el fin de establecer el modo optimo de terapia para el tratamiento de la HBP. Se escruta la poblacion prospectiva de pacientes que presentan smtomas obstructivos cuantitativos debidos a HBP y se seleccionan candidatos adecuados para la terapia. Los pacientes seleccionados se someten a pruebas cutaneas para detectar reacciones alergicas mediante la inyeccion intradermica de 0,1 cc de una solucion farmaceuticamente aceptable de los agentes terapeuticos. Se realizan inyecciones prostaticas intralesionales con diversas combinaciones y concentraciones de agentes. Las cantidades adecuadas y eficaces de los agentes terapeuticos se pueden determinar a partir de estudios que vanan en terminos de: concentracion, combinacion, formulacion de los agentes terapeuticos, volumen de inyeccion, localizacion y numero de inyecciones requeridas para el alivio de los smtomas obstructivos. La terapia experimental debe terminarse cuando se consiga la reduccion deseada del tejido prostatico o cuando no se observe ninguna mejora adicional de los smtomas entre los tratamientos.

2. Procedimientos in vitro

Los estudios in vitro incluyeron la inyeccion de tejido prostatico en chips de tejido prostatico disponibles comercialmente, obtenidos de muestras organos enteros, extirpados quirurgicamente, de cobaya, canido, y ser humano de prostatas de cobaya y canido

Los espedmenes de tejido prostatico humano de individuos que presentan HBP (que pueden obtenerse de autopsias, donantes de trasplante de organos de cadaveres, o pacientes sometidos a prostatectom^a) tambien se pueden inyectar con agentes terapeuticos. Las muestras tratadas pueden evaluarse mediante microscopia convencional de campo claro, epifluorescente y de contraste de fase.

Se han desarrollado procedimientos para la preparacion de secciones de tejido congeladas tenidas con hematoxilina y eosina con el fin de comparar y evaluar los cambios histologicos microscopicos en tejido prostatico causados por la inyeccion intraprostatica de diversos agentes terapeuticos. Para el examen histologico, la prostata se divide en serie en secciones transversales de aproximadamente 0,5 cm. Es importante que estas secciones atraviesen la porcion media de la prostata e incluyan porciones de la uretra prostatica. Todas las secciones deben incluir la mucosa uretral y el margen externo de la capsula prostatica. Las secciones transversales de tejido se congelan a -20°C, se montan en un mandril de criostato preenfriado y se preparan secciones congeladas finas de 8 pl en un criostato a -40°C. Las secciones finas se descongelan en portaobjetos de microscopio, se fijan inmediatamente en etanol al 95%, se tinen con hematoxilina y eosina y se recubren con cubreobjetos Permount (Fisher, Pittsburgh, PA). Alternativamente, las secciones transversales de los tejidos se pueden fijar inmediatamente en formalina del 4 al 10% a pH 7,2, embeber en parafina, cortar en secciones finas en serie, montar y tenir con hematoxilina y eosina. Se obtienen secciones de tejido fino cada 100 lm con un total de al menos 20 secciones finas examinadas microscopicamente para cada prostata. El tejido prostatico se corta transversalmente con un bistun y se congela para cortar secciones finas en un

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

criostato. Las secciones transversales de los tejidos se pueden congelar a -20°C o congelar instantaneamente a - 80°C por immersion en soluciones de hielo seco/acetona. Si se debe retrasar el corte en secciones finas, el tejido se puede almacenar en un recipiente sellado durante varios dfas a -20°C. Antes del corte en secciones finas, las secciones transversales de tejido congelado se llevan a la temperatura de corte (-30 a -40°C) colocandolas en el criostato durante al menos una hora. Las laminas de microscopio se limpian sumergiendolas en etanol del 70% al 95%. Se preparan secciones finas congeladas adecuadas para tincion con H & E (6 a 8 lm de espesor) en un criostato. La temperatura de corte, el angulo y el filo de la cuchilla y la humedad ambiental influyen en la calidad de las secciones finas. Si la temperatura es demasiado baja, el tejido tiende a fracturarse y fragmentarse. Si la temperatura es demasiado alta, las secciones tienden a enrollarse y pegarse a la cuchilla. La baja humedad parece impedir el curvado de las secciones sobre la cuchilla, lo que produce una menor distorsion de la morfologfa del tejido. A medida que las secciones de tejido se desprenden de la hoja de la cuchilla, pueden ser ayudadas en el portaobjetos del microscopio con un pincel pequeno de pelo de camello para artistas. El almacenamiento de los portaobjetos limpios a temperatura ambiente tambien ayuda a separar las secciones de tejido de la hoja de la cuchilla y en la fusion de la seccion al portaobjetos. Las laminas preparadas se fijan inmediatamente en etanol del 95% a 22°C y se someten al protocolo para la tincion con H & E de secciones congeladas.

El procedimiento de tincion con Hematoxilina y Eosina (H y E) para secciones congeladas se puede realizar de la siguiente manera utilizando soluciones de hematoxilina Harris (James Phillips Co., Minneapolis, MN), Lerner Eosin Y (Baxter, McGaw Park, IL), carbonatode litio al 1% (Sigma) y Americlear (Baxter). Las secciones de tejido congelado (8 lm) se fijan en etanol del 95% durante 1 a 30 minutos. Las portaobjetos setratan mediante las siguientes etapas:

Aclarado en H2O desionizada durante 30 segundos;

Tincion en hematoxilina durante 1 minuto; lavado en H2O del grifo caliente durante 15 segundos;

Inmersion en U2CO3 diluido, 2-4 inmersiones (Li2CO3 al 50 11 1% en 50 mL de H2O desionizada);

Lavado en H2O desionizada durante 15 segundos;

Inmersion en eosina Y, 10 inmersiones; inmersion en etanol del 70%, 5 inmersiones;

Inmersion en etanol del 95%, 5 inmersiones; inmersion en etanol del 100%, 10 inmersiones;

Inmersion nuevamente en etanol del 100%, 10 inmersiones;

Inmersion en Americlear, 10 inmersiones;

Inmersion nuevamente en Americlear, 10 inmersiones; y Recubrimiento inmediato con cubreobjetos Permount.

H. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen solo con fines ilustrativos y se no pretende que limiten el alcance de la invencion.

Ejemplo 1

Expresion de acido hialuronico en el tejido HBP humano

En este ejemplo, se analizo la expresion de acido hialuronico (HA) en muestras humanas de tejido de prostata tanto normales como con hiperplasia benigna de prostata (HBP) mediante tincion histologica con protema de union a HA (HABP) y sustrato de peroxidasa de 3,3'-diaminobenzidina (DAB).

Se obtuvieron secciones histologicas pre-cortadas de tejido incluido en parafina (FFPE) de US BioMax Inc (Num. de Cat. PR804, PR806 y PR808, Rockville, MD). En resumen, la HBP y los tejidos prostaticos normales se fijaron en formalina tamponada neutra al 10% en PBS durante 24 horas, se deshidrataron con un gradiente de etanol, se aclararon con xileno y se embebieron en parafina. Las secciones de tejido se desparafinaron, se rehidrataron y a continuacion se incubaron con albumina de suero bovino (BSA) al 3% a 37°C durante 30 minutos. Despues de enjuagar con solucion salina tamponada con fosfato libre de calcio y magnesio (PBS-CMF), se anadieron 0,3 mL de protema biotinilada de union a hA (bHABP, Num. de Cat. 400763-1A, Associates of Cape Cod, MA) diluida 1:100 en tampon HABP (tampon de fosfato de sodio 0,25 M, pH 7,0, que contema NaCl 1,5 M, guanidina-HCl 0,3 M, BSA al 0,08% y azida de sodio al 0,02%, pH 7,0). Las placas se incubaron despues a 4°C durante una noche. A continuacion, las laminas se aclararon en PBS-CMF y se transfirieron a H2O2 al 0,6% en metanol a temperatura ambiente. Despues de enjuagar en PBS-CMF, se anadio estreptavidina-HRP (1 mg/mL, Num. de Cat. SA5004, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) a las secciones y se desarrollaron con tetrahidrocloruro de diaminobencidina (DAB, Num. de Cat. D3939, Sigma) y se contratineron en hematoxilina de Mayer (Num. de Cat. S3309, Dako, Carpenteria, CA).

Se analizaron un total de 67 muestras de tejido HBP y 19 de tejido prostatico normal. En el conjunto de muestras, la edad media de los donantes de tejido HBP y tejido normal de prostata fue de 69,7 ± 7,9 anos y de 36,7 ± 5,4 anos, respectivamente. Los resultados para la tincion de HA del tejido de HBP se muestran en la Tabla 4 a continuacion. La expresion de HA se puntuo de acuerdo con los siguientes criterios:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

HA Alto - Tincion en celulas/Area del estroma (>70 - 80%) de la Seccion de Tejido HA Moderado - Tincion en > 40% a 70% de las Celulas/Area del estroma de la seccion de tejido HA Bajo - Tincion en <40% de las Celulas/Area Estromal de la Seccion de Tejido HA negativo - No se observo tincion

En la region del estroma, la tincion de HA fue de moderada a alta en 85% (57/67) de las muestras de HBP en comparacion con 31,6% (6/19) en las muestras normales de prostata. En las celulas basales, 40% de las muestras de HBP eran ricas en HA, como se evidencio por tincion alta de HA en comparacion con 0% en muestras normales de prostata. La tincion de HA en celulas epiteliales fue negativa en mas de la mitad (38/67) de las muestras de HBP.

Tabla 4. Puntuacion de HBP Humana

Alto Moderado Bajo negativo

HBP Normal HBP Normal HBP Normal HBP Normal

Celulas basales

27 (40%) 0 33 (49%) 1 (5,3%) 6 (9%) 8 (42,1%) 1 (1,5%) 10 (52,6%)

Celulas estromales

18 (27%) 0 30 (45%) 1 (5,3%) 16 (24%) 11 (57,9%) 3 (4%) 7 (36,8%)

Estroma

26 0 31 6 10 9 0 4

(39%) (46%) (31,6%) (15%) (47,4%) (21,1%)

Celulas epiteliales

1 (1,5%) 0 14 (21%) 0 14 (21%) 0 38 (56,5%) 0

Ejemplo 2

Modelo de Rata de Hiperplasia Prostatica Inducida por Enantato de Testosterona

En este ejemplo, se examino la capacidad del enantato de testosterona (TE) para inducir hiperplasia prostatica en la prostata de rata. Brevemente, a dos ratas Sprague-Dawley (Harlan, EE.UU.) macho de veinticinco (25) semanas de edad se les administraron dosis mediante inyeccion intramuscular de 25 mg de TE (Num. de Lote 80G010A, Abraxis Bioscience, Phoenix, AZ) por rata, una vez a la semana, los dfas 0, 7, 14 y 21. Se sacrificaron cinco (5) de 25 ratas antes del tratamiento con TE y 5 de las 20 ratas restantes se sacrificaron semanalmente. Los lobulos ventrales de las prostatas se cosecharon para su analisis. El tratamiento con TE dio como resultado el crecimiento de la prostata, con un aumento de tamano aproximado de 3 veces despues del tratamiento una vez por semana durante un mes. Adicionalmente, el aumento en el peso prostatico de rata estaba relacionado linealmente con la exposicion sostenida a TE. La semivida de TE en la sangre de rata fue de aproximadamente 10,5 dfas (Anderson RA, J Clin Endocrinol Metab., (1996) 81(3):896-901).

Ejemplo 3

Efecto de PEGPH20 sobre la prostata normal de rata y la hiperplasia prostatica de rata inducida por TE

En este ejemplo, se examino PH20 pegilada (PEGPH20) para determinar su efecto sobre el tejido normal de prostata de rata y sobre el tejido prostatico hiperplasico inducido por TE (modelo HBP de rata descrito en el Ejemplo 2 anterior).

A. Efecto de PEGPH20 sobre la Prostata Normal de Rata

En este ejemplo, se examino el efecto de PEGPH20 sobre el tejido prostatico normal. A cinco ratas Sprague-Dawley (Harlan, Ee.UU.) macho de 8 semanas de edad se les administraron dosis por via intravenosa de PEGPH20 (diluido en solucion salina normal) a 0,82 mg/kg cada Lunes, Miercoles y Viernes durante 2 semanas. Cinco (5) ratas no tratadas sirvieron como grupo de control. El dfa 12 despues del tratamiento con PEGPH20, se sacrificaron las ratas y se recogieron los lobulos ventrales de las prostatas para su analisis. El peso de la prostata se midio utilizando una balanza electronica. La administracion de PEGPH20 no causo un cambio significativo en el peso prostatico de la prostata normal de rata en comparacion con el tratamiento con vehfculo solo (P = 0,18).

B. Efecto de PEGPH20 en el HA Estromal Prostatico

En este ejemplo, se analizo el efecto de PEGPH20 sobre el estroma prostatico y el HA estromal de ratas con hiperplasia prostatica normal y inducida por TE mediante histologfa prostatica, incluyendo tincion con hematoxilina y eosina y tincion con IHC. La proliferacion estromal se determino comparando visualmente el tamano del estroma. Las ratas Sprague-Dawley macho de ocho semanas de edad se dividieron en 4 grupos que se trataron como se indica en la Tabla 5 a continuacion. Se administro enantato de testosterona por medio de inyeccion intramuscular y

5

10

15

20

25

30

35

40

PEGPH20 (diluida en solucion salina normal) y el control se administraron por via intravenosa. Despues del tratamiento, los animales se sacrificaron y los lobulos ventrales de las prostatas se cosecharon para su analisis.

Tabla 5. Regimen de dosificacion

Grupo

Num. de Ratas tratadas TE PEGPH20 Vehfculo Dia de sacrificio

Dosis

Dias Dosis Dias

1

5 --- --- --- --- Ninguno 12

2

5 --- --- 0,82 mg/kg 12 --- 12

3

4 25 mg/rata 0 y 8 --- --- Solucion Salina 18

4

5 25 mg/rata 0 y 8 0,82 mg/kg 10 --- 18

Los tejidos de prostata se fijaron en formalina tamponada neutra al 10% en PBS durante 24 horas, se deshidrataron con etanol en gradiente, se aclararon con xileno y se embebieron en parafina. El bloque de parafina se corto a secciones de 5 pm. Las secciones de tejido se desparafinaron, se rehidrataron y se procesaron mediante tincion convencional de hematoxilina y eosina (H y E). La localizacion histoqmmica de Ha se llevo a cabo utilizando una sonda HABP biotinilada (bHABp, Num. de Cat. 400763 - 1A, Associates of Cape Cod, MA). Las secciones se desparafinaron en xileno, 2x5 min, se hidrataron en etanol del 100%, durante 2x3 min y en etanol del 95% durante 1 min, a continuacion se aclararon en agua destilada, se incubaron a 37°C durante 20 min en una solucion de tripsina, y se aclararon en PBS durante 2x2 min. Despues de la incubacion en suero de cabra al 2% y BSA al 1% en PBS durante 30 min, las secciones se incubaron con solucion de bloques de avidina y biotina (Num. de Cat. MB- 1220, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) y se lavaron con PBS; las secciones se incubaron con 4 pg/mL de bHABP en BSA al 1% en PBS a 37°C durante 1 hora. Despues de enjuagar en PBS-Tween 20 al 0,05% durante 3 x 3 min, las secciones se incubaron en FITC-estreptavidina (Num. de Cat. CB4741954, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, diluido 1:500 en PBS) a RT durante 30 min, se montaron en medio de montaje DAPI (Num. de Cat. H-1200, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) y se sellaron con esmalte de unas transparente. Los portaobjetos fueron observados de forma ciega por un investigador bajo un microscopio fluorescente Axioskop equipado con el filtro apropiado. Se tomaron micrograffas de cada seccion con un escaner con camara y un programa de imagen avanzado SPOT (DIAGNOSTIC Instrument, Inc.).

Los resultados se exponen en la Tabla 6 a continuacion. El tratamiento del tejido prostatico normal con PEGPH20 degrado el acido hialuronico en el estroma. El tratamiento del tejido prostatico normal con TE dio como resultado un aumento de la proliferacion estromal asf como un aumento de los niveles de HA en el estroma. El tratamiento con TE para inducir la hiperplasia prostatica seguido por tratamiento con PEGPH20 dio como resultado la disminucion de los niveles de acido hialuronico en el estroma y la disminucion de la proliferacion estromal de tal manera que el estroma fue comparable en tamano al del control.

Tabla 6. Efectos de PEGPH20, TE y TE + PEGPH20 sobre el estroma de prostata de rata

Grupo

Efecto sobre HA Efecto sobre el estroma

1 Control

Ninguno Ninguno

2 PEGPH20

Completamente degradado Ninguno

3 TE

Aumento Mayor proliferacion

4 TE + PEGPH20

Completamente degradado Disminucion de la proliferacion (en comparacion con el tratado con TE)

C. Efecto de PEGPH20 sobre el peso de la prostata en el modelo de hiperplasia prostatica de rata inducida por TE

En este ejemplo, se administro PEGPH20 a ratas con hiperplasia prostatica inducida por TE para evaluar su efecto sobre el peso de la prostata. Las ratas Sprague-Dawley macho de ocho semanas de edad se dividieron en 2 grupos que se trataron como se indica en la Tabla 7 a continuacion. Se administro enantato de testosterona por medio de inyeccion intramuscular y se administro PEGPH20 (diluida en solucion salina normal) por via intravenosa. Despues del tratamiento, los animales se sacrificaron y los lobulos ventrales de las prostatas se cosecharon para su analisis. El peso de la prostata se midio utilizando una balanza electronica.

Tabla 7. Regimen de dosificacion

Grupo

Num. de Ratas tratadas TE PEGPH20 Dia sacrificado

Dosis

Dias Dosis Dias

1

5 25 mg/rata 0 --- — 7

2

4 25 mg/rata 0,7 y 14 Solucion Salina 18

3

5 25 mg/rata 0 y 7 0,82 mg/kg 7, 9, 11 12

4

5 25 mg/rata 0,7 y 14 0,82 mg/kg 7, 9, 11, 13 14

5

5

25 mg/rata 0.7 y 14 0,82 mg/kg 7, 9, 11, 13, 15 16

6

5 25 mg/rata 0,7 y 14 0,82 mg/kg 7, 9, 11, 13, 15, 17 18

7

5 — — 0,82 mg/kg QOD, dfas 0-11 12

8

5 — — Solucion Salina 12

QOD - administrado cada dos dfas.

El peso de la prostata aumento en 18,9% y 85,7% el dfa 7 y el dfa 18, respectivamente, despues de la exposicion a TE. El tratamiento de ratas a las que se administro TE con PEGPH20, a partir del dfa 7, inhibio el aumento del peso prostatico en 26,5% (P <0,001). Ademas, el aumento de peso de la prostata causado por TE se detuvo despues de 5 aproximadamente 5 dfas de la dosificacion de PEGPH20 y con la dosificacion continua no se observo aumento en el tamano de la prostata.

D. Evaluacion de la duracion de la dosificacion de PEGPH20

10 En este ejemplo, se evaluo el efecto de la duracion del tratamiento con PEGPH20 administrando TE y PEGPH20 durante diferentes lapsos. Se administro TE durante 2, 3 64 semanas y se administro PEGPH20 durante 1 semana o 2 semanas.

Las ratas macho de ocho semanas de edad se dividieron en 8 grupos que se trataron como se indica en la Tabla 8 a 15 continuacion. Se administro enantato de testosterona por medio de inyeccion intramuscular y se administro PEGPH20 (diluida en solucion salina normal) por via intravenosa. Despues del tratamiento, los animales se sacrificaron y los lobulos ventrales de las prostatas se cosecharon para su analisis. El peso de la prostata se midio utilizando una balanza electronica.

Tabla 8. Regimen de dosificacion

Grupo

Num. de Ratas tratadas TE PEGPH20 Dia de sacrificio

Dosis

Dias Dosis Dias

1

4 25 mg/rata 0, 7 --- --- 28

2

8 25 mg/rata 0, 7 0,82 mg/kg QOD, dfas 7-20 21

3

4 25 mg/rata 0, 7, 14, 21 --- --- 28

4

8 25 mg/rata 0, 7, 14, 21 0,82 mg/kg QOD, dfas 7-20 28

5

4 25 mg/rata 0, 7 --- --- 21

6

8 25 mg/rata 0, 7 0,82 mg/kg QOD, dfas 7-20 21

7

4 25 mg/rata 0, 7, 14 -- --- 21

8

8

25 mg/rata 0, 7, 14 0,82 mg/kg QOD, dfas 7-20 21

QOD - administrado cada dos dfas.

20

Los resultados se exponen en la Tabla 9 a continuacion. Los resultados muestran que el tratamiento con PEGPH20 es a la vez dependiente de la dosificacion y del tiempo.

Tabla 9. Efectos de varios regimenes de dosificacion de TE y PEGPH20

1 Vs 2 3 Vs 4 5 Vs 6 7 Vs 8

Tratamiento

2 Wk TE, 1 semana PEGPH20, Sac Dfa 21 y 28 4 semanas TE, 1 semana PEGPH20, Sac Dfa 28 2 semanas TE, 2 semanas PEGPH20, Sac Dfa 21 3 semanas TE, 2 semanas PEGPH20, Sac Dfa 21

Valor P

0,01 0,76 <0,01 0,03

% de inhibicion

15,4 11,4 30 14,8

Termino del tratamiento

TE mas corto, PEGPH20 mas corto, sac mas temprano TE mas largo, PEGPH20 mas corto, sac mas tardfo TE mas corto, PEGPH20 mas largo, sac mas temprano TE mas largo, PEGPH20 mas largo, sac mas temprano

E. Evaluacion del tiempo de la primera administracion

En este ejemplo, se evaluo la dependencia temporal del tratamiento de HBP de rata con PEGPH20 administrando 5 PEGPH20 en diversos puntos de tiempo. En resumen, las ratas Sprague-Dawley macho de 8 semanas de edad se dividieron en 8 grupos que se trataron como se indica en la Tabla 10 a continuacion. Se administro enantato de testosterona por medio de inyeccion intramuscular y se administro PEGPH20 (diluida en solucion salina normal) por via intravenosa. Despues del tratamiento, los animales se sacrificaron y los lobulos ventrales de las prostatas se cosecharon para su analisis. El peso de la prostata se midio utilizando una balanza electronica.

10

Tabla 10. Regimen de dosificacion

Grupo

Num. de Ratas tratadas TE PEGPH20 Dia de sacrificio

Dosis

Dias Dosis Dias

1

4 25 mg/rata 0, 7 --- --- 28

2

4 25 mg/rata 0, 7, 14, 21 --- --- 28

3

4 25 mg/rata 0, 7 --- --- 21

4

4

25 mg/rata 0, 7, 14 --- --- 21

5

8 25 mg/rata 0, 7 0,82 mg/kg QOD, dfas 7-14 21

6

8 25 mg/rata 0, 7 0,82 mg/kg QOD, dfas 7-20 21

7

8 25 mg/rata 0, 7, 14, 21 0,82 mg/kg QOD, dfas 7-14 28

8

8

25 mg/rata 0, 7, 14 0,82 mg/kg QOD, dfas 7-20 21

QOD - administrado cada dos dfas.

Los resultados se exponen en la Tabla 11 a continuacion. Cuatro semanas de induccion de HBP con TE (grupo 2) dieron como resultado el mayor peso prostatico. En todos los grupos, el tratamiento con PEGPH20 redujo el peso prostatico promedio en comparacion con el tratamiento con TE solo. La co-administracion de PEGPH20 con Te, a 15 partir del dfa 7, dio como resultado la mayor disminucion del peso prostatico medio. Por lo tanto, se observa una mejor eficacia con una administracion mas larga de PEGPH20.

El peso del agua prostatica se midio pesando la prostata en un tubo seguido de congelacion rapida en nitrogeno lfquido. Los tubos se colocaron en un liofilizador durante 7 dfas y la prostata en el tubo se peso de nuevo despues 20 de secarla completamente. El contenido de agua de la prostata se calculo a partir del peso humedo y del peso seco. Se encontro que el contenido de agua prostatica de cada grupo era el mismo para todos los grupos (~ 80%). Por lo tanto, el cambio en el peso de la prostata no se puede atribuir a la disminucion del agua de los tejidos.

Tabla 11. Efecto del tiempo de la primera administracion

Grupo

Peso Prostatico (g) Media ± DT

1

1,49 ± 0,47

2

1,76 ± 0,18

3

1,57 ± 0,09

5

10

15

20

25

30

35

Tabla 11. Efecto del tiempo de la primera administracion

Grupo

Peso Prostatico (g) Media ± DT

4

1,54 ± 0,07

5

1,26 ± 0,14

6

1,10 ± 0,14

7

1,55 ± 0,12

8

1,31 ± 0,17

Ejemplo 4

Efectos de PEGPH20 y Finasterida sobre la hiperplasia prostatica de rata inducida por TE

En este ejemplo, se compararon los efectos del tratamiento de la hiperplasia prostatica de rata inducida por TE con PEGPH20 con el tratamiento con finasterida, un antiandrogeno que es un inhibidor de la 5a-reductasa que se usa para tratar la HBP. Ademas, se evaluo la terapia combinada con PEGPH20 y finasterida.

A. Comparacion del tratamiento con PEGPH20 frente a Finasterida

En este ejemplo, se comparo el efecto del tratamiento con PEGPH20 con el tratamiento con finasterida utilizando el modelo de hiperplasia prostatica por TE en rata. Las ratas macho de ocho semanas de edad se dividieron en 3 grupos que se trataron como se indica en la Tabla 12 a continuacion. Se administro enantato de testosterona por medio de inyeccion intramuscular, se administro PEGPH20 (diluida en solucion salina normal) por via intravenosa y se administro finasterida por via intraperitoneal. El dfa 21 se sacrificaron los animales y se recogieron los lobulos ventrales de las prostatas para su analisis. El peso de la prostata se midio utilizando una balanza electronica.

Tabla 12. Regimen de dosificacion

Grupo

Num. de Ratas tratadas TE PEGPH20 Finasterida

Dosis

Dias Dosis Dias Dosis Dias

1

4 25 mg/rata 0, 7 --- — — —

2

8 25 mg/rata 0, 7 0,82 mg/kg QOD, dfas 7-20

3

8 25 mg/rata 0, 7 — --- 25 mg/kg Diariamente, dfas 7-20

QOD, cada dos dfas.

Los resultados muestran que la administracion de PEGPH20 produce aproximadamente 30% de inhibicion del crecimiento de la prostata, mientras que el tratamiento con finasterida da como resultado aproximadamente una inhibicion de 37% del crecimiento de la prostata. La disminucion del peso prostatico de ambos grupos tratados, en comparacion con el grupo 1 que fue tratado con TE solo, es estadfsticamente significativa (P <0,01 para ambos). El contenido de agua prostatica de cada grupo se calculo a partir del peso humedo y el peso seco y se encontro que era el mismo para todos los grupos (~80%). Por lo tanto, el cambio en el peso de la prostata no se puede atribuir a la disminucion del agua de los tejidos.

B. Co-administracion de PEGPH20 y finasterida

En este ejemplo, se evaluo el efecto de la terapia combinada con PEGPH20 y finasterida. Se administro PEGPH20 a una dosis de 0,82 mg/kg (dosis baja) o 2 mg/kg (dosis alta). En resumen, las ratas Sprague-Dawley macho de 8 semanas de edad se dividieron en 6 grupos que se trataron como se indica en la Tabla 13 a continuacion. Se administro enantato de testosterona por medio de inyeccion intramuscular, se administro PEGPH20 (diluida en solucion salina normal) por via intravenosa y se administro finasterida por via intraperitoneal. El dfa 21 se sacrificaron los animales y se recogieron los lobulos ventrales de las prostatas para su analisis. El peso de la prostata se midio utilizando una balanza electronica.

Tabla 13. Regimen de dosificacion

Grupo

Num. de Ratas tratadas TE PEGPH20 Finasterida

Dosis Dias

Dosis Dias

Dosis Dias

5

10

15

20

25

Tabla 13. Regimen de dosificacion

Grupo

Num. de Ratas tratadas TE PEGPH20 Finasterida

Dosis

Dias Dosis Dias Dosis Dias

1

8 25 mg/rata 0, 7, 14 --- — — —

2

8 25 mg/rata 0, 7, 14 0,82 mg/kg QOD, comenzando el dfa 7 — —

3

8 25 mg/rata 0, 7, 14 2 mg/kg QOD, comenzando el dfa 7 — —

4

8 25 mg/rata 0, 7, 14 — — 25 mg/kg Diariamente, a partir del dfa 7

5

8 25 mg/rata 0, 7, 14 0,82 mg/kg QOD, comenzando el dfa 7 25 mg/kg Diariamente, a partir del dfa 7

6

8 25 mg/rata 0, 7, 14 2 mg/kg QOD, comenzando el dfa 7 25 mg/kg Diariamente, a partir del dfa 7

QOD, cada dos dfas.

Los resultados se exponen en la Tabla 14 a continuacion. El porcentaje (%) de inhibicion se determino de acuerdo con la formula: ((Control-tratado)/Control) x 100. El tratamiento con una dosis baja de PEGPH20, finasterida sola o terapia combinada con una dosis baja de PEGPH20 + finasterida dio como resultado aproximadamente 25% de inhibicion del crecimiento de la prostata. La terapia combinada de una dosis alta de PEGPH20 (2 mg/kg) + finasterida dio como resultado la mayor inhibicion del crecimiento de la prostata (41%, P <0,001). El contenido de agua prostatica de cada grupo se calculo a partir del peso humedo y el peso seco y se encontro que era el mismo para todos los grupos (~ 80%). Por lo tanto, el cambio en el peso de la prostata no se puede atribuir a la disminucion del agua de los tejidos.

Tabla 14. Tratamiento combinado con PEGPH20 y Finasterida

1 2 3 4 5 6

Tratamiento

3 semanas TE 3 semanas TE PEGPH20 Baja (2 semanas) 3 semanas TE PEGPH20 Alta (2 semanas) 3 semanas TE finasterida (2 semanas) 3 semanas TE PEGPH20 Baja + finasterida (2 semanas) 3 semanas TE PEGPH20 Alta + finasterida (2 semanas)

Peso Prostatico (g) Media ± DT

1,33 ± 0,23 0,98 ± 0,17 1,08 ± 0,21 1,00± 0,19 0,99 ± 0,14 0,79 ± 0,17

Valor P

N/A 0,003 0,038 0,007 0,003 <0,001

% Inhibicion

N/A 26,6 19 25,2 25,9 41

Ejemplo 5

Apoptosis de celulas estromales despues de la eliminacion de HA en una hiperplasia prostatica de rata inducida por TE

En este ejemplo, se analizo la capacidad de PEGPH20 para causar la apoptosis de celulas estromales. La deteccion in situ de la apoptosis celular mediante analisis TUNEL se baso en una reaccion para marcaje de final de corte de UTP biotinilada mediada por desoxinucleotidil-transferasa (TdT) terminal in situ (TUNEL). Esto se realizo esencialmente utilizando el ADN FragEL (Num. de Cat. QIA39-1EA, Calbiochem, Gibbstown, NJ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, las secciones de tejido desparafinizado se trataron con proteinasa K (0,02 mg/mL, Num. de Cat. 25530, Invitrogen, Carlsbad, CA). Los portaobjetos se lavaron a continuacion en solucion salina tamponada con Tris (TBS) y la peroxidasa endogena se bloqueo durante 5 min en H2O2 al 3% diluido en metanol. Despues de lavados en TBS, las secciones se trataron con tampon de equilibrado de TdT 1 vez a temperatura ambiente durante 30 min y posteriormente se incubaron con una mezcla de reaccion de marcaje TdT (57 mL de tampon de equilibrado mas 3 mL de enzima TdT) durante 1,5 h a 37°C. Los portaobjetos se enjuagaron en TBS y se montaron utilizando medios de montaje Fluorein-FragEL, a continuacion se sellaron con esmalte de unas. El numero de celulas positivas para TUNEL se conto en cada seccion a 200 aumentos bajo un microscopio

optico.

La tincion inmunohistoqmmica revelo que la apoptosis era inducida unicamente en las celulas del estroma. En la Tabla 15 a continuacion se expone el regimen de tratamiento, el numero medio de celulas apoptoticas por seccion y 5 el valor P, en comparacion con TE 7d mas TE 18d. La PEGPH20 no indujo la apoptosis del estroma en la prostata no tratada con testosterona. El tratamiento con PEGPH20 de ratas con hiperplasia prostatica inducida por TE produjo una apoptosis significativa en las celulas estromales de la prostata.

Tabla 15. Apoptosis de las celulas del estroma

Grupo

Celulas apoptoticas/seccion Media ± DT Q_ i_ O ns >

No tratado

0 N/A

PEGPH20 12d

0,8 ± 1,79 N/A

TE 7d

4,6 ±2,51 N/A

TE 18d

1,75 ± 1,71 N/A

TE 12d, PEGPH20 5d

25,6 ±20,16 0,006

TE 14d, PEGPH20 7d

36,8 ±21,99 0,001

TE 16d, PEGPH20 9d

13,4 ± 5,73 0,001

TE 18d, PEGPH20 1d

7,8 ±2,71 0,010

10 Ejemplo6

Efectos de Depo-PH20 sobre la hiperplasia prostatica inducida por TE

En este ejemplo, se examino Depo-PH20 para determinar su capacidad para tratar la hiperplasia prostatica de rata 15 inducida por Te, en comparacion con el tratamiento con PEGPH20. Depo-PH20 contiene PH20 y un gel fosfolipidico en un portador fluido.

Las ratas Sprague-Dawley macho de ocho semanas de edad se dividieron en 5 grupos que se trataron como se indica en la Tabla 16 a continuacion. Se administro enantato de testosterona por medio de inyeccion intramuscular, 20 se administro PEGPH20 por via intravenosa o por medio de inyeccion intraprostatica y se administro vehfculo DepoGel o DepoPH20 por medio de inyeccion intraprostatica. El dfa 21 se sacrificaron los animales y se recogieron los lobulos ventrales de las prostatas para su analisis. El peso de la prostata se midio utilizando una balanza electronica.

Tabla 16. Regimen de dosificacion

Grupo

Num. de Ratas tratadas TE PEGPH20 DepoGel DepoPH20 (0,095 mg/mL)

Dosis

Dias Iv Inyeccion intraprostatica (3,3 mg/mL)

1

10 25 mg/rata 0, 7, 14 --- — — —

2

10 25 mg/rata 0. 7, 14 QOD, comenzando el dfa 7 — — —

3

10 25 mg/rata 0, 7, 14 — 100 |jL, dfas 7 y 14 — —

4

10 25 mg/rata 0, 7, 14 — — 100 jL, dfa 7 —

5

10 25 mg/rata 0, 7, 14 — — — 100 jL, dfa 7

QOD, cada dos dfas.

Los resultados se exponen en la Tabla 17 a continuacion. El tratamiento con PEGPH20, ya sea intravenosamente o

- 72 -

5

10

15

20

25

30

35

40

45

por medio de inyeccion intraprostatica, dio como resultado una prostata significativamente mas pequena, como se evidencia por una reduccion en el peso prostatico. No se observo diferencia significativa en el peso prostatico entre los grupos tratados con DepoGel (control) y Depo-PH20, y ademas, el tratamiento con Depo-PH20 no produjo una reduccion significativa del peso prostatico, en comparacion con el tratamiento con TE solo. La formulacion en gel Depo-PH20 que se administro era espesa y se observaron grumos de color blanco visibles en las prostatas de las ratas tratadas con esta formulacion. Estos grupos de color blanco tambien se observaron en las prostatas de las ratas tratadas con el Depo-Gel solo. Dado que el tamano y el peso totales de una prostata de rata es inherentemente pequeno, la presencia de estos grupos puede estar contribuyendo a la falta de efecto observado para el tratamiento con Depo-PH20.

Tabla 17. Efectos de Depo-PH20 en la hiperplasia prostatica inducida por TE

Grupo

Peso Prostatico Media ± DT (g) % de inhibicion Valor P (vs ctl) Valor P (DepoGel vs Depo - PH20)

TE 3 semanas

1,64 ± 0,12 N/A N/A N/A

TE 3 semanas, DepoGel 2 semanas

1,55 ± 0,21 5,8 0,225 N/A

TE 3 semanas, Depo-PH20 2 semanas

1,50 ± 0,24 8,7 0,107 0,64

TE 3 semanas, PEGPH20 IV 2 semanas

1,36 ± 0,16 17,3 0,0003 N/A

TE 3 semanas, PEGPH20 intraprostata 2 semanas

1,38 ± 0,17 16,0 0,0009 N/A

Ejemplo 7

Formulaciones de Liposomas Multivesiculares (LMV) de PH20

Se prepararon diversas formulaciones de liposomas multivesiculares de PH20 (LMV-PH20) de liberacion prolongada utilizando el siguiente procedimiento general. Las soluciones de lfpidos conteman mezclas de diversos lfpidos neutros, incluyendo trigliceridos (TG) triolema (Cmi), tricaprilina (C80) y colesterol, y lfpidos con cargas positivas y negativas, incluyendo fosfatidilcolinas (PC), dioleoil fosfatidilcolina (DOPC, Ci8i), dierucoyl fosfatidilcolina (DEPC, C221) y dipalmitoil fosforilglicerol (DPPG, Ci6 i). La concentracion total de PC fue de hasta 19,8 mM, la concentracion de colesterol fue de 30 mM, la concentracion de TG fue de hasta 3,9 mM y la concentracion de DPPG fue de 4,2 mM.

A. Generacion de formulaciones de LMV-PH20

Se prepararon formulaciones de LMV que conteman un porcentaje molar variable de DEPC y DOPC (0-100%) y un porcentaje en moles variable de triolema y tricaprilina (0-100%), DPPG, colesterol y 0,1, 0,25, 0,5, 1 o 2 mg/mL de PH20. En resumen, en la primera etapa, los lfpidos en cloroformo (fase oleosa) y PH20 en una primera solucion acuosa (fase acuosa) se combinaron y emulsionaron para formar una emulsion de agua en aceite, por lo que la PH20 fue encapsulada por la monocapa de fosfolipido. En la segunda etapa, se anadio una segunda solucion acuosa y se emulsiono, con lo que se formo una emulsion de agua en aceite en agua. Posteriormente, despues de la adicion de una segunda almuota de la segunda solucion acuosa, se evaporo el disolvente de cloroformo y el producto resultante que contema liposomas multivesiculares se lavo varias veces en una tercera solucion acuosa y se resuspendio hasta lipocrito de aproximadamente 50% (volumen de partfculas empaquetadas) y se almaceno a 2- 8°C.

Espedficamente, las formulaciones se prepararon utilizando un mini vortice o se prepararon a mayor escala utilizando un mezclador Omni (Omni Macro ES, Omni International, Kennesaw, GA). En el ultimo metodo con el mezclador Omni, se emulsiono la solucion lipfdica en cloroformo (6 mL) a 7000 rpm durante 8 min con un mezclador Omni con 6 mL de la primera solucion acuosa (His-HCl 10 mM, pH 6,5 con sacarosa al 5% que contema concentraciones variables de PH20) produciendo una emulsion de agua en aceite. Una emulsion subsiguiente a 4500 rpm durante 1-3 minutos con 20 mL de una segunda solucion acuosa de glucosa al 3,2% que contema lisina 40 mM, pH 10,0, dio como resultado una segunda emulsion de agua en aceite en agua. La segunda emulsion se transfirio por igual a dos matraces Erlenmeyer y se anadio otra almuota de 50 mL de la segunda solucion acuosa a ambos matraces. El cloroformo se elimino lavando con un chorro de nitrogeno la superficie de la emulsion a 35°C. Las partmulas de LMV que conteman PH20 se lavaron tres veces con 50 mL de una tercera solucion acuosa (tampon His-HCl 25 mM, pH 6,0 que contema NaCl 120 mM) anadiendo la solucion, mezclando el tubo de centnfuga por inversion y centrifugando a 3500 rpm durante 10 min a 4°C en una centnfuga de mesa refrigerada. Finalmente, las partmulas de LMV se resuspendieron en la tercera solucion acuosa para formar una formulacion de lipocrito

aproximadamente al 50% y se almacenaron refrigeradas a 2-8°C. El procedimiento de mini vortice fue similar, utilizando los parametros expuestos en la Tabla 18.

La Tabla 18 a continuacion resume la primera, segunda y tercera soluciones acuosas. La Tabla 18 tambien resume 5 los volumenes, las concentraciones de reactivos y otros parametros de cada etapa del procedimiento LMV.

Tabla 18. Formulacion y parametros del procedimiento LMV-PH20

1a Solucion acuosa

His-HCl 10 MM, pH 6,5 con sacarosa al 5%

2a Solucion acuosa

glucosa al 3,2% que contiene lisina 40 mM, pH 10,0

3a Solucion acuosa

His - HCl 25 mM, pH 6,0 que contiene NaCl 120 mM

1a Mezcla de Emulsion

Mezclador Vortex Mezclador Omni

PH20 en la ia solucion acuosa

600 |jL 6 mL

Solucion de lfpido en cloroformo

600 jL 6 mL

Volumen total

10,2 mL 12 mL

1 a Velocidad de emulsion

RPM maximas 7000 RPM

Tiempo

8 Min 8 Min

Concentracion de protema PH20 de partida (actividad)

0,25 mg/mL 0,5 mg/mL (30,000 U/ mL) (60,000 U/ mL) 0.5 mg/mL 1.0 mg/mL 2.0 mg/mL (60.000 U/mL) (120.000 U/mL) (240.000 U/mL)

PC

15,8-19,8 mM 15,8-19,8 mM

Colesterol

30 MM 30 MM

TG

3,75-3,9 mM 3,75-3,9 mM

DPPG

4,2 mM 4,2 mM

Tipo de hoja 1

No aplicable Afilada en los lados

Tipo de hoja 2

No aplicable Afilada en los lados y en el interior

Tipo de hoja 3

No aplicable Plana portodas partes, no afilada

2a Mezcla de Emulsion

Mezclador Vortex Mezclador Omni

2Nd Solucion acuosa

2,5 mL 20 mL

Volumen total

3,7 mL 32 mL

Velocidad

RPM maximas 4500 RPM

Tiempo

15 segundos 1-3 min

Evaporacion del disolvente

Mezclador Vortex Mezclador Omni

2a Solucion acuosa

10 mL 100 mL

Volumen total

13,7 mL 132 mL

Velocidad del bano de agua agitada

100-130 RPM 100-130 RPM

Hora

11 Min 15 Min

Temperatura

35 DO 35 DO

Lavado, cambio de tampon y resuspension

Mezclador Vortex Mezclador Omni

Muestra

Muestra completa 17 mL

3a Solucion Acuosa

50 mL 50 mL

Volumen total

50 mL 200 mL

Velocidad de centrifugacion

3500 RPM 3500 RPM

Tabla 18. Formulacion y parametros del procedimiento LMV-PH20

Tiempo

10 Min 10 Min

Numero de lavados

3 3

Volumen de resuspension

0,3-0,5 mL 3-5 mL

LIPOCRIT

Mezclador Vortex Mezclador Omni

Volumen de sedimento

Vana Vana

3a Solucion acuosa

Vana Vana

Velocidad

3500 Rpm 3500 Rpm

Tiempo (min)

10 Min 10 Min

Volumen Solucion + Sedimento

Vana Vana

% Lipocrito Ajustado a

~50% ~50%

B. Resumen de las formulaciones de LMV-PH20

Se prepararon diversas formulaciones de LMV-PH20 que conteman razones molares variables de l^pidos, PH20 y 5 otros aditivos utilizando los mismos procedimientos generales que se han descrito anteriormente. Los diversos aditivos adicionales se incluyeron en la 1a solucion acuosa para mejorar y preservar la estabilidad de PH20 encapsulada. Por ejemplo, las formulaciones F68 y F69 conteman cloruro de calcio. La formulacion F82 contema 150 |jL de glicerol como una interfase que separaba la fase de cloroformo de 600 jL y la primera fase de solucion acuosa de 600 jL. La formulacion F83 contema dextrano 40.000 al 0,1% y PEG - 6000 al 0,1%. Las formulaciones

10 F85-F87 conteman oligomeros de acido hialuronico (HA). Diversas formulaciones variaron en sus procedimientos de

mezcla/emulsificacion. Por ejemplo, para la formulacion F66, se llevo a cabo la primera etapa de emulsificacion durante 4 minutos, en lugar de 8 minutos, dando como resultado sedimentos liposomales mas pequenos. La formulacion F67 se mezclo con una rueda de rotor, en lugar de un mini vortice para generar menor cizallamiento durante la mezcla.

15

La Tabla 19 a continuacion presenta varias formulaciones de LMV-PH20, incluyendo el numero de formulacion, las razones en % molar de PC (fosfatidilcolina) y TG (triglicerido) de la formulacion, la concentracion de PH20 de partida en mg/mL, el mezclador utilizado para preparar las emulsiones y aditivos cualesquiera que se incluyeran en la primera solucion acuosa.

20

Tabla 19. Formulaciones de LMV con PH20

Formulacion

% Molar de la Formulacion de PC y TG Concentracion de PH20 mg/mL de partida Mezclador Aditivos en la Primera Solucion Acuosa

F40

DEPC con Triolema 0,25 Mini Vortex N/A

F41

DEPC con Triolema 0 Mini Vortex N/A

F42

DEPC con Triolema 0,25 marcado fluorescente Mini Vortex AlexaFluor 488 con la etiqueta PH20

F53

DEPC/DOPC 25/75; Triolema/Tricap 25/75 0,25 Mini Vortex N/A

F54

DEPC/DOPC 50/50; Triolema/Tricap 50/50 0,25 Mini Vortex N/A

F55

DEPC/DOPC 75/25; Triolema/Tricap 75/25 0,25 Mini Vortex N/A

F56

DEPC/DOPC 90/10; 90/10 Triolema/Tricap 0,25 Mini Vortex N/A

F61

DEPC/DOPC 50/50; 50/50 Triolema/Tricap 0,25 Omni N/A

F66

DEPC/DOPC 50/50; Triolema/Tricap 50/50 0,25 Mini Vortex1 N/A

-9 L-

%9 |B BSO|Bl|0JJ_

jULUO 0‘ 0S/0S dBoui/Buj0|oui ‘09/09 odoa/odda 06d

%9 |B lonqjos

jULUO 0‘ 0S/0S dBoui/Buj0|oui ‘09/09 odoa/odaa 68d

t7t7‘9 Hd '|/\|lu 001. IOH - Bjv

jULUO 0‘ 0S/0S dBoui/Buj0|oui ‘09/09 odoa/odda 88d

lAirl 001. BU||OJd

jULUO 0‘ 0S/0S dBoui/Buj0|oui ‘09/09 odoa/odda Z8d

000VZ VH ~|w/6w 09

jULUO 0‘ 0S/0S dBoui/Buj0|oui ‘09/09 odoa/odda 98d

000 >Z VH iw/6w gu

jULUO 0‘ 0S/0S dBoui/Buj0|oui ‘09/09 odoa/odda l.dS8d

000>Z VH iw/6w gu

jULUO 0‘ 0S/0S dBoui/Buj0|oui ‘09/09 odoa/odda S8d

V/N

s!ULUO 0‘ 0S/0S dBoui/Buj0|oui ‘09/09 odoa/odda t?8d

%U‘0 |B 0009-03d

jULUO 0‘ 0S/0S dBoui/Buj0|oui ‘09/09 odoa/odda 88d

%U‘0 |B 000‘0t7 OUBJJX0Q

osejjajuj oujoo |OJ0oj|o ©P irl 05

X0JJOA !u||/\| s'o 0S/0S dBoui/Buj0|oui ‘09/09 odoa/odda 28d

V/N

jULUO s'o eu]0|OjJi uoo 0d3a U8d

V/N

jULUO 0‘ 0S/0S dBoui/Buj0|oui ‘09/09 odoa/odda 08d

V/N

jULUO 0‘ eu]0|OjJi uoo Odda 6Zd

V/N

jULUO 0‘ eu]0|OjJi uoo Qdda 8Zd

jULUO 0‘ 0S/0S dBoui/Buj0|oui ‘09/09 odoa/odda

V/N

jULUO 0'2 0S/0S dBoui/Buj0|oui ^os/os odoa/odda SZd

V/N

jULUO 0‘ 0S/0S dBoui/Buj0|oui ‘09/09 odoa/odda t?Zd

V/N

jULUO s'o 0S/0S dBoui/Buj0|oui ‘09/09 odoa/odda ezd

V/N

jULUO s'o 0S/0S deoui/euj0|oui ‘09/09 odoa/odda 2Zd

V/N

jULUO S3‘0 0S/0S dBoui/Buj0|oui ‘09/09 odoa/odda UZd

V/N

jULUO o'o 0S/0S dBoui/Buj0|oui ‘09/09 odoa/odda OZd

BP l/\ll/\l 01. ZIQBQ

X0;joa !u||/\| S3‘0 0S/0S dBoui/Buj0|oui ‘09/09 odoa/odda 69d

BP l/\|LU 02 ZIQBQ

X0^ioa !U||AI S3‘0 0S/0S dBoui/Buj0|oui ‘09/09 odoa/odda 89d

V/N

Jojoy |0O ep0ny S3‘0 0S/0S dBoui/Buj0|oui ‘09/09 odoa/odda Z9d

esonov uplonios Bjaiuud B| ua soajiipv

jopepz0|/\| epijjed ap ~|lu/6uj OZHd 0P UOjOBJ^UaOUOQ 91 ^ Od 3P u9|OB|nLUJOj B| 0P JB|0|/\| % upjoeinujjoj

02Hd uoo AIAH sp sauojOB|nLUJOj 61. e|qei

5

10

15

20

25

30

35

40

1Menor tiempo de mezclado de la primera emulsion (4 min)

2Se utiliza colesterol derivado de animales en lugar del colesterol derivado de plantas en la solucion de l^pidos 3Menor tiempo de mezclado de la primera emulsion (4 min) y menor tiempo de mezclado de la segunda emulsion (30 s)

Ejemplo 8

Co-Formulaciones de Liposomas Multivesiculares (LMV)

Se prepararon varios liposomas multivesiculares que conteman formulaciones combinadas de finasterida, dutasterida o PH20 utilizando el siguiente procedimiento general. Las soluciones de lfpidos conteman mezclas de diversos lfpidos neutros, incluyendo trigliceridos (TG) triolema (Ci8:i), tricaprilina (C80) y colesterol, y lfpidos con cargas positivas y negativas, incluyendo fosfatidilcolinas (PC), dioleoil fosfatidilcolina (DOPC, Ci8i), Dierucoil fosfatidilcolina (DEPC, C221) y dipalmitoil fosforilglicerol (DPPG, Ci6i). La concentracion total de PC fue de hasta 19,8 mM, la concentracion de colesterol fue 30 mM. La concentracion de TG fue de hasta 3,9 mM y la concentracion de DPPG fue de 4,2 mM. En algunas formulaciones, la concentracion total de todos los componentes lipidicos se incremento, y en algunos otros, el contenido de colesterol se redujo. Se prepararon soluciones de finasterida o dutasterida en la solucion lipidica.

A. Generacion de Formulaciones combinadas de LMV-finasterida, dutasterida o PH20

Se prepararon formulaciones de LMV que conteman concentraciones variables de finasterida o dutasterida ya sea sin PH20, o con 0,1 mg/mL de PH20 en la primera solucion acuosa. En resumen, en la primera etapa, se combinaron la finasterida o dutasterida y los lfpidos en cloroformo (fase oleosa) y PH20 en una primera solucion acuosa (fase acuosa) y se emulsionaron para formar una emulsion de agua en aceite, por lo que la PH20 fue encapsulada por la monocapa de fosfolfpidos, y la finasterida o dutasterida se incorporaron a la capa lipidica. En la segunda etapa, se anadio una segunda solucion acuosa y se emulsiono, con lo que se formo una emulsion de agua en aceite en agua. Posteriormente, despues de la adicion de una segunda almuota de la segunda solucion acuosa, se evaporo el cloroformo disolvente y el producto resultante que contema liposomas multivesiculares se lavo varias veces en una tercera solucion acuosa y se resuspendio hasta un lipocrito de aproximadamente 50% (volumen de partmulas empaquetadas) y se almaceno a 2-8°C.

Espedficamente, las formulaciones se prepararon utilizando un mini Vortex. El procedimiento con el mini Vortex fue similar al descrito en el ejemplo 7 utilizando los parametros presentados en la Tabla 18, excepto que el volumen de la primera fase de solucion acuosa fue 500 pL en lugar de 600 pL.

B. Resumen de Co-Formulaciones de LMV-finasterida, dutasterida o PH20

Se prepararon varias formulaciones combinadas que conteman LMV-finasterida, dutasterida o PH20 utilizando los mismos procedimientos generales que se han descrito anteriormente. Se prepararon formulaciones con concentraciones variables de finasterida o dutasterida. Tambien se sometieron a ensayo diversas concentraciones de lfpidos. Por ejemplo, las formulaciones F3 y F4 conteman menor concentracion de colesterol; 15 mM en lugar de 30 mM. Las formulaciones F5, F6 y F7 conteman mayores concentraciones de todos los lfpidos. La Tabla 20 a continuacion presenta varias formulaciones combinadas de LMV-finasterida, dutasterida y PH20, incluyendo el numero de formulacion, la composicion de lfpidos y las concentraciones de partida de finasterida, dutasterida o PH20 en mg/mL.

Tabla 20. Formulaciones de LMV con finasterida, o dutasterida, o PH20, y combinacion

Formulacion

Composicion de lipidos Concentracion de finasterida en solucion lipidica (mg/mL) Concentracion de dutasterida en solucion lipidica (mg/mL) Concentracion de PH20 en la primera solucion acuosa (mg/mL)

F1

DEPC 19,8 mM, Triolema 3,9 mM, DPPG 4,2 mM, colesterol 30 mM 25 N/A 0,1

F2

DEPC 19,8 mM, Triolema 3,9 mM, DPPG 4,2 mM, colesterol 30 mM 5 N/A Sin PH20

Tabla 20. Formulaciones de LMV con finasterida, o dutasterida, o PH20, y combinacion

Formulacion

Composicion de lipidos Concentracion de finasterida en solucion lipidica (mg/mL) Concentracion de dutasterida en solucion lipidica (mg/mL) Concentracion de PH20 en la primera solucion acuosa (mg/mL)

F3

DEPC 19,8 mM, 3,9 mM de Triolema, DPPG 4,2 mM, colesterol 15 mM 0 N/A Sin PH20

F4

DEPC 19,8 mM, 3,9 mM de Triolema, DPPG 4,2 mM, colesterol 15 mM 5 N/A Sin PH20

F5

52,8 mM de DEPC, 10,4 mM de Triolema, 11,2 mM de DPPG, colesterol 80 mM 5 N/A Sin PH20

F6

52,8 mM de DEPC, 10,4 mM de Triolema, 11,2 mM de DPPG, colesterol 80 mM 2,5 N/A Sin PH20

F7

52,8 mM de DEPC, 10,4 mM de Triolema, 11,2 mM de DPPG, colesterol 80 mM 1,25 N/A Sin PH20

F12

DEPC 19,8 mM, Triolema 3,9 mM, DPPG 4,2 mM, colesterol 30 mM 0,5 N/A Sin PH20

F13

DEPC 19,8 mM, Triolema 3,9 mM, DPPG 4,2 mM, colesterol 30 mM 0,5 N/A 0,1

F18

DEPC 19,8 mM, Triolema 3,9 mM, DPPG 4,2 mM, colesterol 30 mM 10 N/A Sin PH20

F19

DEPC 19,8 mM, Triolema 3,9 mM, DPPG 4,2 mM, colesterol 30 mM 10 N/A 0,1

F20

DEPC 19,8 mM, Triolema 3,9 mM, DPPG 4,2 mM, colesterol 30 mM 10 N/A 0,1

F21

DEPC 19,8 mM, Triolema 3,9 mM, DPPG 4,2 mM, colesterol 30 mM 15 N/A Sin PH20

F22

DEPC 19,8 mM, Triolema 3,9 mM, DPPG 4,2 mM, colesterol 30 mM 15 N/A 0,1

F23

DEPC 19,8 mM, Triolema 3,9 mM, DPPG 4,2 mM, colesterol 30 mM 20 N/A Sin PH20

Tabla 20. Formulaciones de LMV con finasterida, o dutasterida, o PH20, y combinacion

Formulacion

Composicion de lipidos Concentracion de finasterida en solucion lipidica (mg/mL) Concentracion de dutasterida en solucion lipidica (mg/mL) Concentracion de PH20 en la primera solucion acuosa (mg/mL)

F24

DEPC 19,8 mM, Triolema 3,9 mM, DPPG 4,2 mM, colesterol 30 mM 20 N/A 0,1

F25

DEPC 19,8 mM, Triolema 3,9 mM, DPPG 4,2 mM, colesterol 30 mM N/A N/A 0,1

F27

19,8 mM DEPC, 3,9 mM Triolema, 4,2 mM DPPC, 30 mM colesterol N/A 0,5 Sin PH20

F28

DEPC 19,8 mM, Triolema 3,9 mM, DPPG 4,2 mM, colesterol 30 mM N/A 0,5 0,1

F29

DEPC 19,8 mM, Triolema 3,9 mM, DPPG 4,2 mM, colesterol 30 mM N/A 5 Sin PH20

F30

DEPC 19,8 mM, Triolema 3,9 mM, DPPG 4,2 mM, colesterol 30 mM N/A 5 0,1

Ejemplo 9

Metodos Analiticos y Caracterizacion de Formulaciones

5

En este ejemplo, se describen varios metodos y procedimientos de ensayo analtticos para la caracterizacion de las formulaciones y co-formulaciones de LMV-PH20. Los metodos de ensayo permiten la determinacion del contenido de PH20, la actividad de PH20 y la caracterizacion de partmulas de LMV, tales como tamano de partmula, lipocrito, observacion microscopica y liberacion in vitro de PH20.

10

A. Contenido de PH20, finasterida y dutasterida por HPLC de Fase Inversa (RP)

En este ejemplo, se determino el contenido de PH20, incluyendo la concentracion de suspension y el porcentaje de concentracion de PH20 libre, mediante HPLC de fase inversa. La columna de HPLC y los parametros del metodo se 15 exponen en la Tabla 21 a continuacion. La separacion se realizo utilizando el gradiente de HPLC como se expone en la Tabla 22 a continuacion.

Tabla 21. Columna RP-HPLC y Parametros del Metodo

Columna

Columna Agilent Zorbax 300 SB-C18 (4,6 x 250 mm) (Numero de Cat. 880995-902) con un tamano de partmula de 5 micras y filtro en lmea

Volumen de inyeccion

50 |jL

Deteccion A

210 nm y 280 nm

Velocidad de flujo

1,0 mL/min

Temperatura de la columna

40°C ± 1°C

Cargador de Muestras

Ambiente

5

10

15

20

25

30

35

Tabla 21. Columna RP-HPLC y Parametros del Metodo

Disolvente A

100% Agua, acido trifluoroacetico (TFA) al 0,1%

Disolvente B

100% Acetonitrilo, TFA al 0,1%

Tiempo de Ejecucion

60 Min

Patrones de PH20

0,5, 10, 20, 40 y 80 pg/mL en SDS al 1% en primer tampon acuoso (His-HCl 10 mM, pH 6,5 con sacarosa al 5%)

Patrones de finasterida o dutasterida

0,5, 10, 20, 40 y 80 pg/mL en isopropanol al 90%/HCl 2N al 10%

Tabla 22. Gradiente de HPLC

Tiempo (min)

% Disolvente A % Disolvente B

0-15

95 5

15-15,5

75 25

15,5-25,5

50 50

25,5-26

20 80

26-39

5 95

39-40

5 95

40-60

95 5

60

95 5

1. Concentracion total de PH20 (suspension)

La concentracion en suspension de PH20 es la concentracion de PH20 en la suspension de LMV. Cuando el lipocrito se ajusta a 50%, la concentracion de formulacion de PH20 es la mitad de la carga del farmaco. Para determinar la concentracion de suspension de PH20, se llevo la formulacion de LMV a temperatura ambiente y se volvio a suspender realizando un movimiento oscilante suavemente hacia atras y hacia adelante hasta que la suspension fue homogenea, colocandola en un Mezclador de Sangre Hemavet durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se anadieron 50 pl de la suspension de LMV a 450 pl de SDS al 1% en un primer tampon acuoso (His-HCl 10 mM, pH 6,5 con sacarosa al 5%) en un tubo de microcentnfuga Eppendorf. El tubo se sometio a vortice a fondo y posteriormente se dejo reposar durante 10-15 minutos a temperatura ambiente. El material de extraccion se centrifugo a 14.000 rpm durante 2 minutos y el sobrenadante se retiro para su analisis mediante RP-HPLC, como se ha descrito anteriormente. La concentracion de PH20 se calculo frente a una curva patron determinada de acuerdo con la Tabla 20 anterior y se presento como la concentracion total. Tambien se presentaron el porcentaje de pureza del pico principal, el porcentaje de picos de oxidacion, clips y otros degradantes despues de restar los picos no proteicos del cromatograma.

2. Porcentaje de Concentracion de PH20 Libre

Porcentaje de PH20 libre es la cantidad de PH20 no encapsulada que esta en el sobrenadante, expresada como un porcentaje de la cantidad total de PH20 en la formulacion. Para determinar el porcentaje de concentracion de PH20 libre, la formulacion de LMV se llevo a temperatura ambiente y se volvio a suspender realizando un movimiento oscilante suavemente hacia atras y hacia adelante hasta que la suspension fue homogenea, colocandola en un Mezclador de Sangre Hemavet durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se anadieron 0,5 mL de la suspension de LMV a un tubo de microcentnfuga Eppendorf y se centrifugaron durante 10 min a 3.000 rpm. Se transfirieron 100 pl de sobrenadante a un inserto de viales de HPLC, asegurandose de no alterar el sedimento de liposomas. Se anadieron 100 pl de SDS al 2% en primer tampon acuoso al inserto y el contenido se mezclo completamente pipeteando y posteriormente se dejo incubando durante 10-15 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se colocaron en un cargador de muestras y a continuacion se analizaron mediante RP-HPLC a temperatura ambiente para evitar la precipitacion con SDS a temperaturas mas bajas. La concentracion de PH20 se calculo contra una curva patron y se utilizo para calcular el % de PH20 libre utilizando la siguiente ecuacion:

[PH20 en el sobrenadante] X (100 - lipocrito)

5

10

15

20

25

30

35

40

[PH20 Total]

B. Cromatografia de exclusion portamano-HPLC (SEC-HPLC)

En este ejemplo, se utilizo la SEC-HPLC para determinar las cantidades relativas de protema de alto peso molecular (HMWP), es decir, agregados unidos covalentemente, de PH20 presente en la muestra. En resumen, la formulacion de LMV se llevo a temperatura ambiente y se volvio a suspender realizando un movimiento oscilante suavemente hacia atras y hacia adelante hasta que la suspension fue homogenea, colocandola en un Mezclador de Sangre Hemavet durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se anadieron 50 pl de la suspension de LMV a 450 pl de octilglucosido al 1% en un primer tampon acuoso (His-HCl 10 mM, pH 6,5 con sacarosa al 5%) en un tubo de microcentnfuga Eppendorf y el tubo se sometio a vortice brevemente. Las muestras se agitaron a 600 rpm en un incubador a 30°C durante 30 minutos. El material extrafdo se centrifugo durante 2 min a 14.000 rpm y el sobrenadante se retiro para analisis SEC-HPLC, de acuerdo con la columna y los parametros del metodo expuestos en la Tabla 23 a continuacion. La concentracion maxima de monomero se calculo a partir de la curva patron y se informo de la concentracion. Si los agregados proteicos eran detectables a partir del analisis espectral, despues de excluir los picos de las micelas lipfdicas, se informo de la agregacion porcentual (%).

Tabla 23. Columna SEC-HPLC y Parametros del Metodo

Columna

Columna SEC TSK G3000 SWXL con tamano de particula de 5 micras con dimensiones de columna (7,8 mm X 300 mm) con un filtro en lmea

Volumen de inyeccion

100 pL

Deteccion A

210 y 280 nm

Velocidad de flujo

1,0 mL/min

Tiempo de ejecucion

24 Min

Temperatura de la columna

Ambiente

Cargador de Muestras

Ambiente

Fase Movil (Isocratica)

Disolvente A: tampon de fosfato de sodio 300 mM pH 7,4 (Na2HPO4 300 mM ajustado a pH 7,4 con acido fosforico)

Patrones de Filtracion en Gel

Mezcla de patrones de protemas de 1,2 kDa a 660 kDa de Bio-Rad o equivalente

Primer tampon acuoso

His - HCl 10 mM, pH 6,5 con sacarosa al 5%

Patrones de PH20

0,5, 10, 20, 40 y 80 pg/mL en octilglucosido al 1% en el primer tampon acuoso

C. Caracterizacion de Particulas

1. Analisis del tamano de particula

La distribucion del tamano de particula, o diametro medio de la distribucion, es la distribucion de tamano ponderada en volumen de los diametros de particula de LMV, medida por medio de un Analizador de Tamano de Particula mediante Difraccion Laser. El diametro medio de las particulas de LMV en suspension se mide utilizando un Analizador de Distribucion de Tamano de Particula mediante Dispersion laser Horiba LA-910. Brevemente, la formulacion de LMV se resuspende en un Mezclador de Sangre Hemavet durante 10 min a temperatura ambiente. Se anaden 10 mL de solucion salina normal a una celula de cuarzo de 12 mL de capacidad, seguido de la adicion de aproximadamente 10 pl de la suspension de LMV. El contenido de la cubeta se mezcla a fondo y se mide el tamano de particula.

2. Lipocrito (Volumen de Particulas Empaquetadas, PPV)

El Lipocrito es el porcentaje del volumen de particulas empaquetadas de una suspension de LMV. Los lipocritos se determinaron anadiendo 70 pl de suspension de LMV al tubo capilar de Micro-Hematocrito, taponando un extremo utilizando Crit-O-Seal o una masilla de sellado similar y centrifugando los tubos durante 10 min a 600 g. Despues de centrifugar, se midieron las longitudes de sobrenadante y de sedimento. El lipocrito se calculo tomando el cociente de la longitud del sedimento respecto a la longitud combinada de sobrenadante/sedimento x 100 para proporcionar el % de PPV o % de Lipocrito. El lipocrito objetivo es 50%.

3. Observacion microscopica de particulas de LMV

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Las pardculas de LMV se observaron utilizando microscop^a de contraste de fase. Brevemente, la suspension de LMV se resuspendio a fondo y se anadio una aKcuota de 50 pL en un tubo Eppendorf que contema 50-200 pL de solucion salina normal. La muestra se mezclo invirtiendo suavemente el tubo y se transfirieron 10 pL a un portaobjetos de microscopio. Se coloco suavemente un cubreobjetos sobre la muestra de LMV y se examino la muestra bajo un microscopio utilizando un aumento de 10X, 20X y 40X. Las imagenes fueron grabadas con una camara digital conectada al microscopio.

Las formulaciones LMV se caracterizaron mediante microscopfa optica o microscopfa fluorescente.

D. Actividad enzimatica de PH20

1. Analisis de Actividad Enzimatica de HA Biotinilada

La actividad de PH20 se evaluo utilizando un analisis enzimatico rapido de HA biotinilada, en el que se midio la actividad enzimatica utilizando un analisis de microtitulacion en el que se mide el acido hialuronico residual biotinilado despues de la incubacion con hialuronidasa (veanse p.ej. Frost y Stem (1997) Anal. Biochem. 251:263269, Publicacion de Patente de Estados Unidos Num. 20050260186). En tales analisis, los grupos carboxilo libres sobre los residuos de acido glucuronico del acido hialuronico fueron biotinilados y el sustrato de acido hialuronico biotinilado se acoplo covalentemente a una placa de microtitulacion. Despues de la incubacion con hialuronidasa, se detecto el sustrato de acido hialuronico biotinilado residual utilizando una reaccion de avidina-peroxidasa, y se comparo con el obtenido despues de la reaccion con patrones de hialuronidasa de actividad conocida.

2. Actividad de PH20 Total (Suspension)

La actividad PH20 total es una medida de la actividad de la PH20 que esta dentro y fuera del liposoma. En resumen, la formulacion de LMV se llevo a temperatura ambiente y se volvio a suspender realizando un movimiento oscilante suavemente hacia atras y hacia adelante hasta que la suspension fue homogenea, colocandola en un Mezclador de Sangre Hemavet durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se anadieron 50 pl de la suspension de LMV a 450 pl de octilglucosido al 10% en un primer tampon acuoso (His-HCl 10 mM, pH 6,5 con sacarosa al 5%) en un tubo de microcentnfuga Eppendorf y el tubo se sometio a vortice brevemente. Las muestras se agitaron a 600 rpm en un incubador a 30°C durante 30-90 minutos o durante una noche a 4°C. El material extrafdo se centrifugo durante 2 min a 14.000 rpm. Se retiraron las muestras, se diluyeron en tampon de ensayo que contema octilglucosido al 1% y se cargaron en una placa de microtitulacion. La actividad enzimatica de PH20 se determino utilizando un analisis rapido de hidrolisis de HA biotinilado (vease el Ejemplo D.1). La actividad fue referida en U/mL. La actividad espedfica se calculo de acuerdo con la siguiente ecuacion:

Actividad en U/mL

Actividad Espedfica = --------------------------------------------------------------------------------------

Concentracion total de protema en suspension en (RP-HPLC)

3. Porcentaje de Actividad de PH20 Libre

El porcentaje de actividad de PH20 libre es una medida de la actividad de PH20 que esta fuera del liposoma debido al escape/pH20 residual durante la preparacion de LMV-PH20. La formulacion de LMV se llevo a temperatura ambiente y se volvio a suspender realizando un movimiento oscilante suavemente hacia atras y hacia adelante hasta que la suspension fue homogenea, colocandola en un Mezclador de Sangre Hemavet durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se anadieron 0,5 mL de la suspension de LMV a un tubo de microcentnfuga Eppendorf y se centrifugaron durante 10 min a 3.000 rpm. Se transfirieron 100 pl de sobrenadante a un inserto de viales de HPLC, asegurandose de no alterar el sedimento de liposomas. Se anadieron 100 pl de SDS al 2% en primer tampon acuoso al inserto y el contenido se mezclo completamente pipeteando y posteriormente se dejo reposar durante 1015 minutos a temperatura ambiente. La actividad de PH20 se determino como se ha descrito en el Ejemplo D. anterior.

E. Resumen de caracterizacion de diversas preparaciones de LMV-PH20 1. Formulaciones de LMV-PH20

Se generaron diversas formulaciones de LMV-PH20 y se analizaron utilizando los metodos de ensayo descritos anteriormente. Los resultados de algunas de las formulaciones preparadas se resumen en las Tablas 24-27 a continuacion. Antes de su uso, cada formulacion que se genero se caracterizo como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, las formulaciones de LMV-PH20 preparadas con el mezclador Omni tambien se evaluaron como se ha

descrito anteriormente. Estas formulaciones exhibieron una buena encapsulacion, una actividad espedfica para PH20 de 31.000 a 55.000 U/mg en el producto lisado total. La actividad PH20 total del producto lisado se mejoro adicionalmente, aumentando los tiempos de extraccion (60-90 min) con octilglucosido, en el intervalo de 71.000 a 90.000 U/mg. La PH20 libre, filtrada del liposoma, mostro una actividad espedfica de >100.000 U/mg.

5

La Tabla 26 a continuacion describe el contenido de PH20 y la actividad en las fracciones sobrenadantes de las formulaciones de LMV-PH20. El contenido total de PH20 del producto lisado (suspension) y la actividad de las formulaciones de LMV-PH20, despues de un aumento del tiempo de extraccion con octilglucosido, se exponen en la Tabla 27. Ademas, la integridad de la PH20 se conservo durante el procedimiento de fabricacion, con una pureza 10 >90% del pico de PH20 principal del analisis mediante RP-HPLC.

Tabla 24. Caracterizacion de Diversas Preparaciones de LMV-PH20

Formulacion

F40 F53 F54 F55 F56 F61

Volumen (mL)

3,75 1,9 1,9 1,3 1,5 10

Lipocrito %

50 44 45 47 44 50

Concentracion total (suspension) de PH20 (mg/mL)

0,18 0,13 0,14 0,14 0,13 0,13

Concentracion de partfculas de PH20 empaquetadas (mg/mL)

0,36 0,3 0,31 0,3 0,3 0,26

Eficacia de la encapsulacion

64 40 44 30 32 87

Actividad Total (Suspension) de PH20 U/mL

3520 6560 6477 6587 5927 2572

RP-HPLC mg/mL (extraccion de OG al 10%),

ND ND ND ND ND 0,09

% Recuperacion de Actividad

17 42 39 39 38 17

Tabla 25. Analisis de las Formulaciones LMV

Form.

% Lipocrito Volumen (mL) Microscopia Actividad Total (Suspension) de PH20 (U/mL) [Protema Total (Suspension)] (mg/mL) Actividad Espedfica Total (Suspension) (U/mg)

F70

N/A N/A Liposoma formado N/A N/A N/A

F71

51 4 Liposoma formado 1071 0,11 9739

F72

45 4,2 Liposoma formado 2151 0,23 9352

F73

50 4 Liposoma formado 1176 0,24 4900

F74

48,8 5 Liposoma formado 10293 0,33 31191

F75

40 3,5 Liposoma formado 6292 0,29 21697

F77

42 4 Liposoma formado 4993 0,26 19202

F78

46 4 Liposoma formado 2981 0,32 9316

F79

40 4 Liposoma formado, mucha espuma despues de la 2a emulsion 938 ND NA

F80

40 4 Liposoma formado, mucha espuma despues de la 2a emulsion 930 ND NA

F81

41 4 Liposoma formado 1375 0,23 5978

F82

45 0,5 Liposoma formado 1546 0,1 15459

F83

54,237 5 Liposoma formado 4077 0,46 8863

F84

NA 200 |jL Sedimento muy pequeno ND ND NA

Tabla 25. Analisis de las Formulaciones LMV

Form.

% Lipocrito Volumen (mL) Microscopia Actividad Total (Suspension) de PH20 (U/mL) [Protema Total (Suspension)] (mg/mL) Actividad Especfica Total (Suspension) (U/mg)

F85

55 8 Liposoma formado 16116 0,363 44397

F86

51 7,5 Liposoma formado 13182,67 0,238 55389

F87

54 5,5 Liposoma formado 8346,75 0,283 29494

F88

46 9,2 Liposoma formado 14544 0,256 56813

F89

45 4,9 Liposoma formado ND ND ND

F90

50 5,95 Liposoma formado ND ND ND

NA: No aplicable ND: No determinado

Tabla 26. Analisis del sobrenadante de PH20 en Formulaciones de LMV

Form.

Actividad del Sobrenadante (U/mL) RP - HPLC Sobrenadante (mg/mL) Actividad especifica del Sobrenadante (U/mg) % PH20 libre

F85

3246 NA NA NA

F85R1

3678 0,073 50384 9,21

F86

2829 0,057 49632 11,74

F87

2617,5 0,059 44364 9,59

F88

5680,67 0,092 61746 19,41

Tabla 27. Aumento de actividad de PH20 en LMV despues de incrementar los tiempos de extraccion (60-90 min a temperatura ambiente) con octilglucosido

Form.

[PH20 Total (Suspension)] (mg/mL) Actividad Total (Suspension) de PH20 (U/mL) Actividad especifica (U/mg)

F74

0,33 23439 71027

F85

0,36 32058 88314

F88

0,26 23091 90199

5 2. Co-formulaciones de LMV-PH20

Se generaron y analizaron diversas formulaciones de LMV-finasterida, dutasterida o combinaciones que conteman tambien PH20 utilizando los metodos de ensayo descritos anteriormente. Los resultados muestran que a mayor concentracion de finasterida o dutasterida (5-25 mg/mL), se observaron estructuras microtubulares ademas de las 10 partfculas caractensticas de LMV. La distribucion relativa de las estructuras microtubulares fue mayor con el aumento de la concentracion de finasterida o dutasterida. Se formaron partfculas con una mejor morfologfa global en terminos de estructuras lisas redondeadas a una concentracion de farmaco de 5 mg/mL utilizando colesterol 30 mM; mientras que las formulaciones en las que se utilizaba colesterol 15 mM dieron como resultado una formacion de partfculas mala a esta concentracion de farmaco. A concentraciones mas bajas de finasterida o dutasterida (0,5-5 15 mg/mL), o utilizando un aumento de concentracion lipfdica total, se observo una morfologfa de partfcula mucho mejor caractenstica de la estructura de LMV y una mayor eficacia de incorporacion del farmaco. La Tabla 28 describe caractensticas de algunas de las formulaciones. La actividad de PH20 total (suspension) extrafda de formulaciones que conteman PH20, expuesta en la Tabla 28, fue <150 U/mL.

Tabla 28. Analisis de las formulaciones de LMV-finasterida y dutasterida

Descripcion de la formulacion

Concentracion de Partida de Finasterida/Dutasterida mg/mL Concentracion total (suspension) de finasterida o Dutasterida mg/mL

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Tabla 28. Analisis de las formulaciones de LMV-finasterida y dutasterida

Descripcion de la formulacion

Concentracion de Partida de Finasterida/Dutasterida mg/mL Concentracion total (suspension) de finasterida o Dutasterida mg/mL

F13 finasterida baja

0,5 0,12

F24 finasterida alta

20 8,5

F27 dutasterida baja

0,5 0,19

F29 dutasterida alta

5 4,3

Ejemplo 10

Efecto de la concentracion de PH20 en 1a fase acuosa sobre los atributos de LMV-PH20

Las formulaciones F71-F75 que conteman cantidades de PH20 iniciales de 0,25, 0,5, 1 y 2 mg/mL se generaron como se describe en el Ejemplo 7 y se compararon con la actividad enzimatica de PH20, el contenido de PH20 y el rendimiento en volumen total utilizando los metodos descritos en el Ejemplo 9 para determinar el efecto de la concentracion de partida de PH20 sobre estos atributos. Los resultados muestran que a medida que aumentaba la cantidad de PH20 de partida, aumentaban la actividad en U/mL y la actividad espedfica en U/mg aumentando ambas cinco veces y tres veces la actividad y la actividad espedfica, respectivamente, en formulaciones que conteman 1 mg/mL de PH20 de partida. La actividad y la actividad espedfica disminuyeron ligeramente en formulaciones que conteman 2 mg/mL de PH20 de partida. La concentracion total de protema aumento para todas las formulaciones, mientras que el rendimiento de volumen total en mL fue aproximadamente el mismo para todas las formulaciones.

Ejemplo 11

Liberacion de protema in vitro en tampon o plasma de rata

Las formulaciones de LMV-PH20 se evaluaron para determinar su liberacion de PH20 a lo largo del tiempo en tampon o plasma de rata. Brevemente, se anadio una almuota de 500 pl de la formulacion de LMV-PH20 a 2 mL de plasma de rata que contema azida de sodio al 0,01% o un tercer tampon acuoso y se mezclo a fondo. La mezcla se sometio a una rotacion de 12 ciclos en un agitador a 37°C. Se retiraron almuotas de 2,5 mL los dfas 0, 1, 3, 5 y 7 para su analisis. Se analizaron 200 pl de cada almuota por medio de microscopfa optica. Se anadieron 2 mL de cada almuota a 2 mL de solucion salina, se transfirieron a un tubo de 15 mL y se centrifugaron a 3500 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se retiro y se determino su actividad PH20 en presencia de octilglucosido al 1%, como se describe en el Ejemplo 9, seccion D anterior. El sedimento se lavo en solucion salina, se centrifugo y se anadieron 1000 pL de sDs al 1%. El contenido de PH20 se determino mediante HPLC.

Los resultados muestran que con el curso del tiempo, se observo una disminucion del porcentaje de PH20 en el sedimento de liposomas, que se estabilizo despues del dfa 5. Por ejemplo, en tampon, liberacion de protema in vitro fue aproximadamente 90% del contenido de protema del dfa 0 el dfa 1, aproximadamente 75% del contenido de protema del dfa 0 el dfa 3 y aproximadamente 60% del contenido de protema del dfa 0 el dfa 5. El porcentaje de PH20 en el sedimento de liposomas no disminuyo adicionalmente el dfa 7, pero se mantuvo estable. En plasma de rata, la liberacion de protema in vitro fue aproximadamente 90% del contenido de protema del dfa 0 el dfa 1, aproximadamente 80% del contenido de protema del dfa 0 el dfa 3, aproximadamente 65% del contenido de protema del dfa 0 el dfa 5, quetambien permanecio constante el dfa 7.

Los resultados tambien mostraron que la actividad de PH20 liberada al medio era mas alta en plasma de rata que en el tercer tampon acuoso. Para cada uno, se observo un incremento inicial de la actividad observada en el medio el dfa 1 con una actividad de casi 200% con respecto al plasma de rata el dfa 0 y aproximadamente 150% de actividad con respecto al tampon el dfa 0. La actividad se estabilizo despues del dfa 1 con una leve disminucion hasta el dfa 7.

Ejemplo 12

Efecto de las Formulaciones de LMV-PH20 sobre el Tejido Hiperplasico de Prostata inducido por TE

En este ejemplo, se evaluaron diversas formulaciones de LMV-PH20 para determinar su efecto sobre el tejido de prostata hiperplasico inducido porTE utilizando el modelo HBP de rata descrito en el Ejemplo 2 anterior.

A. Analisis histologico

5

10

15

20

25

30

35

40

1. Caracterizacion de las formulaciones LMV-PH20 utilizadas

Antes de los experimentos realizados en este ejemplo, las formulaciones se caracterizaron como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 8. Cada una de las formulaciones que conteman PH20 contema una cantidad de partida inicial de 0,25 mg/mL de PH20. Los resultados se exponen en la Tabla 29 a continuacion. Las formulaciones de LMV-PH20f40 y de control de velmculo tambien se analizaron por medio de microscopfa optica. Los resultados mostraron la PH20 encapsulada en los liposomas. La formulacion de AlexaFluor 488-PH20 se analizo mediante microscop^a optica y microscopfa de fluorescencia. Los resultados mostraron que PH20 marcada con AlexaFluor 488 era encapsulada en los liposomas.

Tabla 29. Caracterizacion de las preparaciones de LMV-PH20

Formulacion

Volumen (mL) % Lipocrito Encapsulacion (mg/mL) Actividad (U/mL) % Recuperacion de la Actividad

LMV-PH20f40

3,75 50 0,15 3500-5200 30

F41 Control de Velmculos

3,75 47 o <LLOQ N/A

Alexa488-PH20F42

3,0 50 0,15 1000 30

LLOQ: Lfmite inferior de cuantificacion

2. Resumen del analisis histologico de la prostata tratada

A las ratas se les administraron dosis de TE con y sin LMV-PH20 similar al Ejemplo 3.B, excepto que LMV-PH20 se administro por medio de inyeccion intraprostatica. La recoleccion, fijacion e histolog^a de tejido prostatico para la localizacion de HA tambien se realizo como se describe en el Ejemplo 3.B.

Los resultados muestran que la mayona del HA se degrado despues de la administracion de LMV-PH20f40 mediante inyeccion intraprostatica el dfa 1 y el HA se degrado parcialmente en la zona proxima a la administracion de LMV- pH20f40 el dfa 3. El HA no se degrado los dfas 5, 7 y 1o. Se observo que las ratas a las que se habfan administrado dosis de Alexa488-PH20F42 conteman un gran porcentaje de PH20 fluorescente que permaneda en el sitio de inyeccion sugiriendo un penodo inicial de liberacion seguido de muy poca liberacion. Esto se esperaba debido a los componentes lipfdicos de liberacion muy lenta que estabilizaban la membrana de esta formulacion.

B. Tratamiento con LMV-PH20f40

En un estudio separado, se sometio a ensayo el efecto de LMV-H20f40 sobre el Tejido con Hiperplasia Prostatica inducida por TE.

1. Caracterizacion de las formulaciones de LMV

Cada formulacion de LMV-PH20 sometida a ensayo contema una cantidad de partida inicial de 0,25 mg/mL de PH20 y se caracterizo como se describe en el Ejemplo 9, con los resultados expuestos en la Tabla 30 a continuacion.

Tabla 30. Caracterizacion de las preparaciones de LMV-PH20

Formulacion

Volumen (mL) % Lipocrito Encapsulacion (mg/mL) Actividad (U/mL) % Recuperacion de la Actividad

LMV-PH20f40

3 50 0,17 5098 24

F41 Control con Velmculo

2,5 52 o <LLOQ N/A

LLOQ: L^mite inferior de cuantificacion

2. Analisis del Tejido Prostatico Tratado

En este estudio, se administraron 25 mg de TE por via intravenosa a cada rata los dfas 1 y 7. Se administraron intraprostaticamente 50 pl de LMV-PH20f40 de 470o U/mL (0,18 mg/mL) y 50 pL de LMV-Velmculo el dfa 7. Las ratas fueron sacrificadas el dfa 9 para analizar la prostata [HA], dfas 8, 10 y 14 para analizar la apoptosis y el dfa 14 para analizar el peso de la prostata.

Los resultados muestran que 1 y 3 dfas despues de la administracion de LMV-PH20f40, se retiro el HA adyacente a los LMV. Siete d^as despues del tratamiento, estuvo presente el HA. Por lo tanto, se observo una reduccion del HA de la prostata hasta 3 dfas despues del tratamiento. Se analizo la apoptosis de las celulas del estroma los d^as 8, 10 y 14. No se observaron diferencias en los niveles de apoptosis entre la prostata tratada con veldculo y tratada con 5 LMV-PH20f40 al dfa 1 despues de la administracion. Al dfa 3 despues de la administracion, se observo un aumento de la apoptosis en la prostata tratada con LMV-PH20f40. El dfa 7 despues de la administracion, no se observo apoptosis inducida por PH20 en la prostata tratada con LMV-PH20f40. El efecto del tratamiento con LMV-PH20f40 sobre el peso prostatico se muestra en la Tabla 31 a continuacion. Con fines comparativos, la prostata normal de rata pesa aproximadamente 0,6 g. El tratamiento con LMV-PH20f40 dio como resultado una disminucion significativa 10 en el tamano de la prostata en comparacion con el tratamiento con LMV-control con veldculo.

Tabla 31. Comparacion del peso prostatico en el dia 14

Peso Prostatico (g) Media ± DT Valor P % Reduccion relativa al control con vehfeulo

LMV-Control con vehfculo

1,298 ± 0,125 n/a n/a

LMV-PH20f40

1,035± 0,079 < 0,0001 20,2

Prostata normal

0,6 g n/a n/a

C. Tratamiento con Formulaciones de LMV-PH20

15 Se sometieron a ensayo las formulaciones de LMV-PH20 para determinar su efecto sobre el Tejido con Hiperplasia Prostatica inducida por TE.

1. Caracterizacion de las formulaciones de LMV-PH20

20 Cada formulacion de LMV-PH20 sometida a ensayo contema una cantidad de partida inicial de 0,25 mg/mL de PH20 en la 1a solucion acuosa y se caracterizo como se describe en el Ejemplo 9, con los resultados expuestos en la Tabla 32 a continuacion.

Tabla 32. Caracterizacion de las preparaciones de LMV-PH20

Formulacion

Volumen (mL) % Lipocrito Encapsulacion (mg/mL) Actividad de PH20 (U/mL) % Actividad Recuperacion

53

1,9 44 0,13 6560 42

54

1,9 45 0,14 6477 39

55

1,3 47 0,14 6587 39

56

1,5 44 0,13 5927 38

25 2. Analisis del tejido prostatico tratado

En este estudio, se administraron 25 mg de TE por via intravenosa a cada rata los dfas 1 y 7. Se administraron intraprostaticamente 50 pL de LMV-PH20fx al lobulo derecho de la prostata y se administraron intraprostaticamente 50 pl de LMV-VehfculoFx al lobulo izquierdo de la misma prostata de rata. La notacion FX hace referencia a la 30 formulacion espedfica que se evaluo como F53, F54, F55 o F56. Las ratas se sacrificaron el dfa 14 y se analizaron para determinar el peso y la histolog^a de la prostata.

Los datos se muestran en la Tabla 33 a continuacion, que expone la formulacion, la actividad y el porcentaje de reduccion aproximada de peso de la prostata con respecto al tratamiento con el vehfculo. El tratamiento con todas 35 las formulaciones causo una reduccion en el tamano de la prostata. El tratamiento con la formulacion F54 condujo a una reduccion de 45% del tamano de la prostata.

Tabla 33. Reduccion de la Hiperplasia de la Prostata Inducida por TE

Formulacion

Actividad de PH20 (U/mL) % Reduccion Aproximada (respecto al vehiculo)

F53

6560 16

5

10

15

20

25

Tabla 33. Reduccion de la Hiperplasia de la Prostata Inducida por TE

Formulacion

Actividad de PH20 (U/mL) % Reduccion Aproximada (respecto al vehculo)

F54

6477 45

F55

6587 9

F56

5927 8

D. Tratamiento con LMV-PH20f40 y LMV-PH20f54 y Finasterida 1. Caracterizacion de las formulaciones de LMV-PH20

Cada formulacion de LMV-PH20 contema una cantidad de partida inicial de 0,25 mg/mL de PH20 en la 1a solucion acuosa y se caracterizo como se describe en el Ejemplo 9, exponiendose los resultados en la Tabla 34 a continuacion. Se pronostica que LMV-PH20f40 tenga una velocidad de liberacion de PH20 lenta y Se pronostica que LMV-PH20f54 tenga una velocidad de liberacion de PH20 media basandose en la longitud de cadena de acido graso de la composicion de PC y TG.

Tabla 34. Caracterizacion de las preparaciones de LMV-PH20

Formulacion

Volumen (mL) % Lipocrito Encapsulacion (mg/mL) Actividad de PH20 (U/mL) % Recuperacion de la Actividad

LMV-PH20f40

4 50 0,19 1320 <10

Control de vehfculos

4 47 0 <LLOQ N/A

LMV-PH20f54

3 50 0,23 3057 12

2. Analisis del Tejido Prostatico Tratado

En este estudio, se administraron por v^a intravenosa 25 mg de TE a cada rata los dfas 1 y 7. Se administraron intraprostaticamente 50 pL de LMV-PH20f40 LMV-PH20f54 a cada rata el dfa 7. Se administraron 2,5 mg/kg de Finasterida por medio de inyeccion intraperitoneal a cada rata diariamente, comenzando el dfa 7. El diseno del estudio se expone en la Tabla 35 a continuacion.

Tabla 35. Diseno del estudio

Grupo

TE 25 mg/rata/semana LMV-PH20 I-Pr dia 7 Finasterida 2,5 mg/kg ip por d^a D^a hasta sac n

1

Dfa 0, 7 - - 14 12

2

D^a 0, 7 - D^as 7-13 14 12

3

D^a 0, 7 F40, d^a 7 - 14 12

4

Dfa 0, 7 F54, d^a 7 - 14 12

5

D^a 0, 7 F40, d^a 7 Dfas 7-13 14 12

6

D^a 0, 7 F54, dfa 7 Dfas 7-13 14 10

I-Pr: intraprostaticamente

Los resultados se muestran en la Tabla 36 a continuacion. El tratamiento con finasterida condujo a una reduccion de 18,7% del tamano de la prostata con respecto al control con vehnculo. El tratamiento con la formulacion de LMV- PH20 dio como resultado una reduccion del 10-12% del tamano de la prostata. El co-tratamiento con una formulacion de LMV-PH20 y finasterida dio como resultado una reduccion del 19-20% del tamano de la prostata. Las actividades enzimaticas de PH20 de las LMV-PH20 utilizadas en este estudio fueron baja, 1320 y 3057 U/mL, respectivamente.

Tabla 36. Comparacion del peso prostatico el Dia 14

Peso Prostatico (g) Media ± DT Valor P % Reduccion (respecto al control con vehiculo)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Tabla 36. Comparacion del peso prostatico el Dia 14

Peso Prostatico (g) Media ± DT Valor P % Reduccion (respecto al control con vehculo)

Vehfculo

1,108 ± 0,090

Vehfculo + Finasterida

0,901 ± 0,096 < 0,0001 18,7

LMV-PH20f40

0,996 ± 0,146 0,034 10,1

LMV-PH20f54

0,972 ± 0,112 0,0033 12,3

LMV-PH20f40 + Finasterida

0,897 ± 0,138 0,0002 19,0

LMV-PH20f54 + Finasterida

0,882 ± 0,083 <0,0001 20,4

La invencion tambien se puede entender mediante la referencia a los siguientes apartados:

1. Liposoma multivesicular, que comprende:

un l^pido neutro; un Kpido anfipatico; y

una enzima de degradacion de hialuronano.

2. El liposoma multivesicular del apartado 1, que comprende adicionalmente acido hialuronico.

3. El liposoma multivesicular del apartado 2, en donde el acido hialuronico esta en una cantidad suficiente para aumentar la encapsulacion y la actividad enzimatica de la enzima de degradacion de hialuronano.

4. El liposoma multivesicular del apartado 2 o el apartado 3, en donde el acido hialuronico mantiene la actividad total de la enzima de al menos 40.000 U/mg.

5. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 1-4, en donde la actividad total de la enzima es de al menos 40.000 U/mg.

6. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 1-5, en donde la actividad total de la enzima es de al menos 50.000 U/mg, 60.000 U/mg, 70.000 U/mg, 80.000 U/mg, 90.000 U/mg, 100.000 U/mg, 110.000 U/mg, 120.000 U/mg, 130.000 U/mg, 140.000 U/mg o 150.000 U/mg.

7. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 1-6, en donde la enzima de degradacion de hialuronano es una hialuronidasa, una condroitinasa o una liasa.

8. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 1-7, en donde la enzima de degradacion de hialuronano es una hialuronidasa seleccionada entre una hialuronidasa de tipo mairnfero o una hialuronidasa bacteriana.

9. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 1-8, en donde la hialuronidasa es una hialuronidasa PH20.

10. El liposoma multivesicular del apartado 9, en donde la hialuronidasa PH20 se selecciona de entre PH20 ovina, de raton, mono, bovina, bacteriana y humana.

11. El liposoma multivesicular del apartado 10, en donde la PH20 es soluble o es una forma que se secreta cuando se expresa en una celula de marnffero.

12. El liposoma multivesicular del apartado 11, en donde la celula de mamffero es una celula CHO.

13. El liposoma multivesicular de cualquiera del apartado 11 o el apartado 12, en donde la PH20 soluble es una PH20 que carece de un sitio de anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI) C-terminal o una porcion del sitio de anclaje de GPI.

14. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 11-13, en donde la PH20 soluble tiene una secuencia de aminoacidos que es una forma truncada del polipeptido expuesto en el SEQ ID NO: 2, por lo que la PH20 soluble carece de toda o una porcion del sitio de anclaje de GPI C-terminal, o tiene una secuencia de aminoacidos que presenta una identidad de secuencia de al menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mas con su forma truncada.

15. El liposoma multivesicular del apartado 14, en donde la PH20 soluble se selecciona entre polipeptidos que contienen una secuencia de aminoacidos expuesta en cualquiera de los SEQ ID NO: 4-9 y 46-48, y variantes alelicas, variantes de especie y otras variantes de las mismas.

16. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 1-15, en donde la enzima de degradacion de hialuronano se denomina rHuPH20.

17. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 1-16, en donde la enzima de degradacion de hialuronano esta glicosilada.

18. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 1-17, en donde la enzima de degradacion de hialuronano se modifica por conjugacion a un polfmero.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

19. El liposoma multivesicular del apartado 18, en donde el poUmero es PEG o dextrano.

20. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 1-19, en donde la enzima de degradacion de hialuronano esta conectada, directa o indirectamente, a un marcador o radical detectable.

21. El liposoma multivesicular del apartado 20, en donde el marcador o radical detectable es una protema fluorescente.

22. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 1-21, en donde la concentracion de la enzima de degradacion de hialuronano esta entre o entre aproximadamente 0,1 mg/mL y 1 mg/mL, 0,2 mg/mL y 0,5 mg/mL, o es al menos o aproximadamente 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,7 mg/mL, 0,8 mg/mL o 0,9 mg/mL.

23. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 1-22, en donde la concentracion de acido hialuronico es de 0,05 mg/mL a 50 mg/mL, 0,75 mg/mL a 13,0 mg/mL, o de 1 mg/mL a 10 mg/mL o es de al menos de aproximadamente 0,1 mg/mL, 0,5 mg/mL o 1 mg/mL.

24. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 1-23, en donde la relacion de acido hialuronico a enzima de degradacion de hialuronano es 1:500, 1:400, 1:300, 1:200, 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 200:1, 300:1, 400:1, 500:1.

25. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 1-24, en donde el lfpido neutro es un diglicerido o un triglicerido.

26. El liposoma multivesicular del apartado 25, en donde el lfpido neutro es un triglicerido que es triolema o tricaprilina, o una mezcla de trioleina y tricaprilina.

27. El liposoma multivesicular del apartado 26, en donde la trioleina y la tricaprilina estan a una razon molar de 50:50 (1:1).

28. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 1-27, en donde el lfpido anfipatico es un fosfatidilglicerol (PG), cardiolipina (CL), fosfatidilserina (PS), acido fosfatidico (PA), fosfatidilinositol, fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), esfingomielina o diaciltrimetilamoniopropano (DITAP).

29. El liposoma multivesicular del apartado 28, en donde el lfpido anfipatico es una fosfatidilcolina que es DEPC o DOPC, o una mezcla de DePc y DOPC.

30. El liposoma multivesicular del apartado 29, en donde DEPC y DOPC estan a una razon molar que es al menos o aproximadamente al menos una razon molar 50:50 (1 DEPC:1 DOPC), 75/25 o 90/10.

31. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 1-30, que comprende adicionalmente DPPG.

32. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 1-31, que comprende adicionalmente colesterol.

33. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 1-32, que comprende un agente terapeutico.

34. El liposoma multivesicular del apartado 33, en donde el farmaco terapeutico es hidrofilo o es hidrofobo.

35. El liposoma multivesicular del apartado 33 o el apartado 34, en donde el farmaco terapeutico se selecciona entre otro agente para tratar la hiperplasia benigna de prostata.

36. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 33-35, en donde el otro agente terapeutico se selecciona de entre antiandrogenos, bloqueadores alfa, toxinas botulmicas y una enzima hidrolttica.

37. El liposoma multivesicular del apartado 36, en donde el antiandrogeno es un antiandrogeno esteroideo, un antiandrogeno no esteroideo o un inhibidor de la 5a-reductasa.

38. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 33-37, en donde el agente es finasterida o dutasterida.

39. Un liposoma multivesicular, preparado mediante un procedimiento o que puede obtenerse mediante un procedimiento que comprende las etapas de:

a) formar un primer componente acuoso que comprende una enzima de degradacion de hialuronano en una concentracion inferior a 2 mg/mL;

b) formar un componente lipfdico que comprende al menos un disolvente organico, al menos un lfpido anfifatico y al menos un lfpido neutro;

c) formar una emulsion a partir del primer componente acuoso y el componente lipfdico;

d) dispersar la emulsion a un segundo componente acuoso para formar esferulas de disolvente; y

e) separar el disolvente organico de las esferulas de disolvente para formar liposomas multivesiculares suspendidos en el segundo componente acuoso.

40. El liposoma multivesicular del apartado 39, en donde la enzima de degradacion de hialuronano esta en una concentracion de entre o de aproximadamente entre 0,1 mg/mL y 1,9 mg/mL, 0,5 mg/mL y 1,5 mg/mL o es de aproximadamente 1 mg/mL.

41. El liposoma multivesicular del apartado 39 o el apartado 40, en donde la enzima de degradacion de hialuronano es una hialuronidasa, una condroitinasa o una liasa.

42. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 39-41, en donde la enzima de degradacion de hialuronano es una hialuronidasa seleccionada entre una hialuronidasa de tipo mairnfero o una hialuronidasa bacteriana.

43. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 39-42, en donde la hialuronidasa es una hialuronidasa PH20.

44. El liposoma multivesicular del apartado 43, en donde la hialuronidasa PH20 se selecciona de entre PH20

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

ovina, de raton, mono, bovina, bacteriana y humana.

45. El liposoma multivesicular del apartado 44, en donde la PH20 es soluble o es una forma que se secreta cuando se expresa en una celula de mairnfero.

46. El liposoma multivesicular del apartado 45, en donde la celula de mamffero es una celula CHO.

47. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 45 o 46, en donde la PH20 soluble es una PH20 que carece de un sitio de anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI) C-terminal o una porcion del sitio de anclaje de GPI.

48. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 45-47, en donde la PH20 soluble tiene una secuencia de aminoacidos que es una forma truncada del polipeptido expuesto en SEQ ID NO: 2, por lo que la PH20 soluble carece de todo o de una porcion del sitio de anclaje de GPI C-terminal, o tiene una secuencia de aminoacidos que presenta una identidad de secuencia de al menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mas con su forma truncada.

49. El liposoma multivesicular del apartado 48, en donde la PH20 soluble se selecciona de entre polipeptidos que contienen una secuencia de aminoacidos expuesta en cualquiera de los SEQ ID NO: 4-9 y 46-48, y variantes alelicas, variantes de especies y otras variantes de las mismas.

50. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 39-49, en donde la enzima de degradacion de hialuronano se denomina rHuPH20.

51. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 39-50, en donde la enzima de degradacion de hialuronano esta glicosilada.

52. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 39-51, en donde la enzima de degradacion de hialuronano se modifica por conjugacion a un polfmero.

53. El liposoma multivesicular del apartado 52, en donde el polfmero es PEG o dextrano.

54. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 39-53, en donde la enzima de degradacion de hialuronano esta conectada, directa o indirectamente, a un marcador o radical detectable.

55. El liposoma multivesicular del apartado 54, en donde el marcador o radical detectable es una protema fluorescente.

56. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 39-55, en donde el primer componente acuoso comprende un agente terapeutico adicional.

57. El liposoma multivesicular del apartado 56, en donde el agente terapeutico es hidrofilo.

58. El liposoma multivesicular del apartado 57, en donde el agente terapeutico es adecuado para el tratamiento o para tratar la hiperplasia benigna de prostata.

59. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 39-58, en donde el primer componente acuoso comprende adicionalmente un excipiente seleccionado entre sacarosa, cloruro de calcio (CaCh), Glicerol, dextrano, PEG (p.ej. PEG-6000), acido hialuronico (HA), prolina, Arg-HCl, Sorbitol, trehalosa, albumina de suero humano (HSA), o una combinacion de los mismos.

60. El liposoma multivesicular del apartado 59, en donde:

el primer componente acuoso comprende CaCh entre o aproximadamente entre CaCh 1 mM y 50 mM, CaCl2 5 mM y 25 mM, CaCh 10 mM y 20 mM, o al menos o aproximadamente 10 mM, 15 mM o 20 mM; el primer componente acuoso comprende dextrano entre aproximadamente 0,01% y 1% o 0,05% y 0,5% o al menos o aproximadamente 0,1%;

el primer componente acuoso comprende PEG entre aproximadamente 0,01% y 1% o 0,05% y 0,5% o al menos o aproximadamente 0,1%;

el primer componente acuoso comprende prolina entre o aproximadamente entre prolina 1 mM y 1 M, 10 mM y 500 mM o al menos o aproximadamente o 100 mM;

el primer componente acuoso comprende arginina entre aproximadamente 1 mM y 1 M, 10 mM y 500 mM o al menos o aproximadamente o 100 mM;

el primer componente acuoso comprende sorbitol entre, o entre aproximadamente sorbitol de 1% a 20%, 5% a 15% o al menos o aproximadamente, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%; y/o

el primer componente acuoso comprende trehalosa entre aproximadamente trehalosa de 1% a 20%, 5% a 15% o al menos o aproximadamente 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%.

61. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 39-60, en donde el primer componente acuoso

comprende acido hialuronico (HA) entre aproximadamente 1 mg/mL y 100 mg/mL, 10 mg/mL y 75 mg/mL, o 15 mg/mL y 50 mg/mL, o al menos o aproximadamente o 1 mg/mL de HA, 2 mg/mL de HA, 3 mg/mL de HA, 4

mg/mL de HA, 5 mg/mL de HA, 6 mg/mL de HA, 7 mg/mL de HA, 8 mg/mL de HA, 8 mg/mL de HA, 10 mg/mL

de HA, 10 mg/mL de HA, 11 mg/mL de HA, 12 mg/mL de HA, 13 mg/mL de HA, 14 mg/mL de HA, 15 mg/mL

de HA, 16 mg/mL de HA, 17 mg/mL de HA, 18 mg/mL de HA, 19 mg/mL de HA, 20 mg/mL de HA, 25 mg/mL

de HA, 30 mg/mL de HA, 40 mg/mL HA, 50 mg/mL de HA.

62. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 39-61, en donde el primer componente acuoso comprende una razon de acido hialuronico a enzima de degradacion de hialuronano que es o es aproximadamente 1:500, 1:400, 1:300, 1:200, 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 200:1, 300:1, 400:1, 500:1.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

63. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 39-62, en donde el primer componente acuoso tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 6,0 a 7,5, 6,0 a 7,0 o 6,0 a 6,5.

64. El liposoma multivesicular del apartado 63, en donde el primer componente acuoso tiene un pH de aproximadamente 6,5 o al menos 6,5.

65. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 39-64, en donde el lfpido neutro es un diglicerido o un triglicerido.

66. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 39-65, en donde el lfpido neutro es un triglicerido que es triolema o tricaprilina o es una mezcla de trioleina y tricaprilina.

67. El liposoma multivesicular del apartado 66, en donde la trioleina y la tricaprilina se proporcionan a una razon molar de 50:50 (1:1).

68. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 39-67, en donde el lfpido anfipatico es un fosfatidilglicerol (PG), cardiolipina (CL), fosfatidilserina (PS), acido fosfatidico (PA), fosfatidilinositol, fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), esfingomielina o diaciltrimetilamoniopropano (DITAP).

69. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 39-68, en donde el lfpido anfipatico es una fosfatidilcolina que es DEPC o DOPC, o una mezcla de DEPC y DOPC.

70. El liposoma multivesicular del apartado 69, en donde DEPC y DOPC se proporcionan a una razon molar de 50:50 (1:1).

71. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 39-70, en donde el componente lipfdico comprende adicionalmente un farmaco hidrofobo.

72. El liposoma multivesicular del apartado 71, en donde el farmaco hidrofobo se selecciona entre docetaxel, prednisona, prednisolona, ibuprofeno, clotriamazol, risperidona, citrato de tamoxifeno, diazepan, insulina NPH, una benzodiazepina, clofibrato, clorfeniramina, dinitirato, digoxina, digitoxina, tartrato de ergotamina, estradiol, fenofibrato, griscofulvina, hidroclorotiazida, hidrocortisona, isosorbida, medrogestona, oxifenbutazona, politiazida, progensterona, espironolactona, tolbutamida, 10,11-dihidro-5H-dibenzo[a,d]ciclohepteno-5- carboxamida, 5H-dibenzo[a,d] ciclohepteno-5-carboxamida, y un inhibidor de la 5a-reductasa.

73. El liposoma multivesicular del apartado 71 o el apartado 72, en donde el farmaco hidrofobo es un inhibidor de la 5a-reductasa que es finasterida o dutasterida.

74. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 71-73, en donde el farmaco hidrofobo esta a una concentracion que esta entre o aproximadamente entre 0,1 mg/mL y 5 mg/mL.

75. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 39-74, en donde el componente lipfdico comprende:

un lfpido anfifatico o una mezcla de lfpidos anfifaticos en una cantidad entre o entre aproximadamente 20 mM y 100 mM o entre 30 mM y 60 mM; y

un lfpido neutro o una mezcla de lfpidos neutros en una cantidad entre o entre aproximadamente 4 mM y 20 mM o entre 5 mM y 12 mM.

76. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 39-75, en donde el componente lipfdico comprende adicionalmente DPPG.

77. El liposoma multivesicular del apartado 76, en donde la DPPG esta en una cantidad entre o cantidad entre 4 mM y 20 mM o 5 mM y 12 mM.

78. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 39 a 77, en donde el componente lipfdico comprende adicionalmente colesterol.

79. El liposoma multivesicular del apartado 78, en donde el colesterol esta en una cantidad que esta entre o aproximadamente entre 15 mM y 100 mM, 20 mM y 80 mM o 30 mM y 60 mM.

80. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 39-79, en donde el componente lipfdico comprende una mezcla 50:50 (1:1) de una primera mezcla de lfpidos que comprende aproximadamente DEPC 19,8 mM, colesterol 30 mM, trioleina 3,75 mM y una segunda mezcla de lfpidos que comprende aproximadamente DOPC 19,8 mM, colesterol 30 mM y tricaprilina 3,75 mM.

81. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 39-80, en donde el disolvente organico es cloroformo.

82. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 39-81, que comprende adicionalmente la eliminacion del segundo componente acuoso y la suspension de los liposomas multivesiculares en un tercer componente acuoso.

83. El liposoma multivesicular del apartado 82, en donde el tercer componente acuoso comprende NaCl.

84. El liposoma multivesicular del apartado 83, en donde el NaCl esta entre o entre aproximadamente 100 mM y 150 mM o es al menos o aproximadamente 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM o 150 mM.

85. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 82-84, en donde el tercer tampon acuoso comprende histidina.

86. El liposoma multivesicular del apartado 85, en donde la histidina esta entre o aproximadamente entre 1 mM a 100 mM, 5 mM a 15 mM o es al menos o aproximadamente 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 MM, 40 mM o 50 mM.

87. El liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 82-86, en donde el pH del tercer tampon acuoso esta comprendido entre 6,0 y 8,0 o 6,5 y 7,5 o es de al menos aproximadamente 6,0, 6,5, 7,0 o 7,4.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

88. Una composicion, que comprende un liposoma multivesicular de cualquiera de los apartados 1-87.

89. La composicion del apartado 88, que comprende adicionalmente un portador farmaceuticamente aceptable.

90. La composicion del apartado 88 o 89, que comprende NaCl.

91. La composicion del apartado 90, en la que el NaCl esta entre o entre aproximadamente 100 mM y 150 mM o es al menos o aproximadamente o 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM o 150 mM.

92. La composicion de cualquiera de los apartados 88-91, que comprende histidina.

93. La composicion del apartado 92, en donde la histidina esta entre o aproximadamente entre 1 mM y 100 mM, 5 mM y 15 mM o es al menos o aproximadamente 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 40 mM o 50 mM.

94. La composicion de cualquiera de los apartados 88-93, en donde el pH de la composicion esta o esta entre aproximadamente 6,0 y 8,0 o 6,5 y 7,5 o es al menos aproximadamente 6,0, 6,5, 7,0 o 7,4.

95. La composicion de cualquiera de los apartados 88-94, que comprende un agente terapeutico.

96. La composicion del apartado 95, en donde el agente terapeutico se formula separadamente del liposoma multivesicular.

97. La composicion del apartado 95 o del apartado 96, en donde el agente terapeutico es un agente adecuado para tratar la hiperplasia benigna de prostata.

98. La composicion de cualquiera de los apartados 95-97, en donde el agente terapeutico se selecciona entre antiandrogenos, bloqueadores alfa, toxinas botulmicas, y una enzima hidrolttica.

99. La composicion del apartado 98, en donde el antiandrogeno es un antiandrogeno esteroideo, un antiandrogeno no esteroideo o un inhibidor de la 5a-reductasa.

100. La composicion del apartado 97, en donde el agente terapeutico es un inhibidor de la 5a-reductasa que es finasterida o dutasterida.

101. 9. Una combinacion, que comprende:

una primera composicion que comprende una composicion de cualquiera de los apartados 88 a 94; y una segunda composicion que comprende un agente terapeutico.

102. La combinacion del apartado 101, en donde el agente terapeutico es un agente adecuado para tratar la hiperplasia benigna de prostata.

103. La combinacion del apartado 101 o el apartado 102, en donde el agente terapeutico se selecciona entre antiandrogenos, bloqueadores alfa, toxinas botulmicas y una enzima hidrolttica.

104. La combinacion del apartado 103, en donde el antiandrogeno es un antiandrogeno esteroideo, un antiandrogeno no esteroideo o un inhibidor de la 5a-reductasa.

105. La combinacion del apartado 104, en donde el agente terapeutico es un inhibidor de la 5a-reductasa que es finasterida o dutasterida.

106. 9. Una composicion, que comprende:

una enzima de degradacion de hialuronano; y

acido hialuronico, con lo que la enzima de degradacion de hialuronano conserva al menos 50% de la actividad hialuronidasa durante al menos seis meses entre 28°C y 32°C o al menos un ano entre 2°C y 8°C.

107. La composicion del apartado 106, en donde se conserva al menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o mas actividad de hialuronidasa.

108. La composicion del apartado 106 o el apartado 107 que es una composicion farmaceutica.

109. La composicion de cualquiera de los apartados 106-108 que se formula para administracion directa.

110. La composicion de cualquiera de los apartados 106-109, en donde la enzima de degradacion de hialuronano es estable durante al menos un ano o al menos dos anos.

111. La composicion de cualquiera de los apartados 106-110, en donde la enzima de degradacion de hialuronano es una hialuronidasa, una condroitinasa o una liasa.

112. La composicion de cualquiera de los apartados 106-111, en donde la enzima de degradacion de hialuronano es una hialuronidasa seleccionada entre una hialuronidasa de tipo mairnfero o una hialuronidasa bacteriana.

113. La composicion de cualquiera de los apartados 106-112, en donde la hialuronidasa es una hialuronidasa PH20.

114. La composicion del apartado 113, en donde la hialuronidasa PH20 se selecciona de entre PH20 ovina, de raton, mono, bovina, bacteriana y humana.

115. La composicion del apartado 114, en donde la PH20 es soluble o es una forma que se secreta cuando se expresa en una celula de marnffero.

116. La composicion del apartado 115, en donde la celula de mamffero es una celula CHO.

117. La composicion del apartado 115 o 116, en donde la PH20 soluble es una PH20 que esta truncada, por lo que la PH20 carece de un sitio de union de glicosilfosfatidilinositol (GPI) C-terminal o una porcion del sitio de union de GPI.

118. La composicion de cualquiera de los apartados 115-117, en donde la PH20 tiene una secuencia de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

aminoacidos que es una forma truncada del polipeptido expuesto en el SEQ ID NO: 2, en donde la PH20 soluble carece de todo o una porcion del sitio de anclaje de GPI C-terminal, o tiene una secuencia de aminoacidos que presenta al menos 91%, 92%, 93%. 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mas identidad de secuencia con su forma truncada.

119. La composicion del apartado 118, en donde la PH20 se selecciona entre polipeptidos que contienen una secuencia de aminoacidos expuesta en cualquiera de los SEQ ID NO: 4-9 y 46-48, y variantes alelicas, variantes de especie y otras variantes de las mismas que muestran actividad catalttica.

120. La composicion de cualquiera de los apartados 106-119, en donde la composicion comprende una enzima de degradacion de hialuronano que se denomina rHuPH20.

121. La composicion de cualquiera de los apartados 106-120, en donde la enzima de degradacion de hialuronano esta glicosilada.

122. La composicion de cualquiera de los apartados 106-121, en donde la enzima de degradacion de hialuronano se modifica por conjugacion a un polfmero.

123. La composicion del apartado 122, en donde el polfmero es PEG o dextrano.

124. La composicion de cualquiera de los apartados 106-123, en donde la enzima de degradacion de hialuronano y el acido hialuronico en la composicion estan a una razon molar de aproximadamente 5000:1, 4000:1, 3000:1, 2000:1, 1900:1, 1800:1, 1700:1, 1650:1, 1600:1, 1500:1, 1400:1, 1300:1, 1200:1, 1100:1, 1000:1, 900:1, 800:1, 700:1, 600:1, 500:1, 100:1, 90:1, 80:1, 70:1, 60:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 10:1, 1:1, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:500, 1:600, 1:700, 1:800, 1:900, 1:1000, 1:1100, 1:1200, 1:1300, 1:1400, 1:1500, 1:1600, 1:1700, 1:1800, 1:1900, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000.

125. La composicion de cualquiera de los apartados 106-124, en donde la concentracion de enzima de degradacion de hialuronano esta entre aproximadamente 1 U/mL y 10000 U/mL, 10 U/mL y 5000 U/mL, 100 U/mL y 1000 U/mL o es al menos o aproximadamente o 10 U/mL, 50 U/mL, 100 U/mL, 200 U/mL, 300 U/mL, 400 U/mL, 500 U/mL, 600 U/mL, 700 U/mL, 800 U/mL, 900 U/mL, 1000 U/mL o mas.

126. La composicion de cualquiera de los apartados 106-125, en donde la concentracion de acido hialuronico es de aproximadamente 1 mg/mL a 100 mg/mL, 10 mg/mL a 50 mg/mL, 1 mg/mL a 20 mg/mL o es al menos o aproximadamente o 1 mg/mL, 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg/mL, 10 mg/mL, 11 mg/mL, 12 mg/mL, 13 mg/mL, 14 mg/mL, 15 mg/mL, 16 mg/mL, 17 mg/mL, 18 mg/mL, 19 mg/mL, 20 mg/mL, 30 mg/mL, 40 mg/mL, o 50 mg/mL.

127. La composicion de cualquiera de los apartados 106-126, en donde la composicion se formula para uso unico o multiple.

128. La composicion de cualquiera de los apartados 106-127, en donde la composicion se formula en un volumen por administracion de entre aproximadamente 0,5 mL a 50 mL, 1 mLa10 mL, 1 mL a 5 mL o al menos o aproximadamente o 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL o 50 mL.

129. La composicion de cualquiera de los apartados 106-128, que comprende adicionalmente NaCl.

130. La composicion del apartado 129, en donde el NaCl esta entre o entre aproximadamente 100 mM y 150 mM o es al menos o aproximadamente 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM o 150 mM.

131. La composicion de cualquiera de los apartados 106-130, que comprende adicionalmente histidina.

132. La composicion del apartado 131, en donde la histidina esta entre o aproximadamente entre 1 mM y 100 mM, 5 mM y 15 mM o es al menos o aproximadamente 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM o 50 mM.

133. La composicion de cualquiera de los apartados 106-132, en donde el pH de la composicion es o esta entre aproximadamente 6,0 y 8,0 o 6,5 y 7,5 o es al menos o aproximadamente o 6,0, 6,5, 7,0 o 7,4.

134. La composicion de cualquiera de los apartados 106-133 que comprende liposomas, micelas u otras vesfculas lipfdicas que contienen la enzima de degradacion de la hialuronidasa.

135. La composicion del apartado 134, en donde el liposoma es unilamelar, multilamelar o multivesicular.

136. Un recipiente, que comprende una composicion de cualquiera de los apartados 88-100 y 106-135.

137. El recipiente del apartado 136 que es unajeringa.

138. El recipiente del apartado 136 o 137, que comprende adicionalmente una aguja para inyeccion.

139. El recipiente de cualquiera de los apartados 136-138, en donde la composicion en el recipiente es de uso unico.

140. El recipiente de cualquiera de los apartados 136-139, que comprende adicionalmente una composicion que comprende un agente terapeutico.

141. El recipiente del apartado 140, en donde el agente terapeutico es un agente adecuado para tratar la hiperplasia benigna de prostata.

142. El recipiente del apartado 140 o del apartado 141, en donde el agente terapeutico se selecciona entre antiandrogenos, bloqueadores alfa, toxinas botulmicas y una enzima hidrolttica.

143. El recipiente del apartado 142, en donde el antiandrogeno es un antiandrogeno esteroideo, un antiandrogeno no esteroideo o un inhibidor de la 5a-reductasa.

144. El recipiente del apartado 143, en donde el agente terapeutico es un inhibidor de la 5a-reductasa que es finasterida o dutasterida.

145. Un kit, que comprende el recipiente de cualquiera de los apartados 136-144, y que comprende adicionalmente instrucciones de uso.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

146. Un metodo para tratar una enfermedad o afeccion asociada a hialuronano, que comprende administrar a un sujeto una composicion o combinacion de cualquiera de los apartados 88-135.

147. El metodo del apartado 146, en donde la enfermedad o afeccion asociada a hialuronano es la hiperplasia benigna de prostata.

148. Un metodo de tratamiento de hiperplasia benigna de prostata, que comprende administrar a un sujeto una composicion que comprende un liposoma, micelas u otras vesfculas lipfdicas que contienen una enzima de degradacion de hialuronano.

149. El metodo del apartado 148, en donde el liposoma o vesfcula lipfdica es una vesfcula de membrana sintetica de gran diametro.

150. El metodo de cualquiera de los apartados 146-149, en donde la composicion se administra al sujeto intraprostaticamente.

151. El metodo del apartado 150, en donde la composicion se administra mediante inyeccion transrectal, transuretral o transperineal.

152. El metodo del apartado 150 o del apartado 151, en donde la composicion se administra a cada lobulo de la prostata.

153. El metodo de cualquiera de los apartados 146-152, en donde la composicion comprende un liposoma multivesicular que efectua la liberacion sostenida de una enzima de degradacion de hialuronano localmente al estroma de la prostata.

154. El metodo de cualquiera de los apartados 146-153, en donde la composicion se administra a o aproximadamente entre 0,5 mL y 50 mL, 1 mL y 10 mL, 1 mL y 2 mL o al menos o aproximadamente o 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL o 10 mL.

155. El metodo de cualquiera de los apartados 146-154, en donde la frecuencia de administracion es mensual, trimestral, semestral o anual.

156. El metodo del apartado 155, en donde la composicion se administra cada 3 a 6 meses.

157. El metodo de cualquiera de los apartados 146-156, que comprende adicionalmente administrar otro agente para tratar la hiperplasia benigna de prostata.

158. El metodo del apartado 157, en donde el otro agente se selecciona entre un antiandrogeno, alfa- bloqueante, una toxina botulmica y una enzima hidrolttica.

159. El metodo del apartado 158, en donde el antiandrogeno es un antiandrogeno esteroideo, un antiandrogeno no esteroideo o un inhibidor de la 5a-reductasa.

160. El metodo de cualquiera de los apartados 157-159, en donde el agente es finasterida o dutasterida.

161. Una composicion o combinacion de cualquiera de los apartados 88-135 para uso en el tratamiento de una enfermedad o afeccion asociada a hialuronano.

162. La composicion del apartado 161, en donde la enfermedad o afeccion asociada a hialuronano es la hiperplasia benigna de prostata.

163. La composicion del apartado 161 o el apartado 162, en donde la composicion se formula para inyeccion intraprostatica o instilacion.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Halozyme, Inc.

<120> COMPOSICION Y FORMULACION LIPfDICA DE UNA ENZIMA DE DEGRADACION DE HIALURONANO Y USO DE LA MISMA PARA EL TRATAMIENTO DE LA HIPERPLASIA BENIGNA DE PROSTATA

<130> SCB/JCP1/P122122EP01

<150> 61/462875 <151>

<160> 189

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1 <211> 509 <212> PRT <213> Homo sapiens

<220>

<223> Precursor de PH20 humana <400> 1

Claims (24)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   1. Un liposoma multivesicular (LMV) que comprende una enzima de degradacion de hialuronano, en donde el LMV comprende:

   un lfpido neutro; un Kpido anfipatico; y

   una enzima de degradacion de hialuronano, en donde la concentracion de la enzima de degradacion de hialuronano esta entre o entre aproximadamente 0,1 mg/mL y 1 mg/mL.
2. 2. El liposoma multivesicular de la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente acido hialuronico.
3. 3. Un liposoma multivesicular (LMV), que comprende:

   un lfpido neutro; un lfpido anfipatico;

   una enzima de degradacion de hialuronano; y acido hialuronico.
4. 4. El liposoma multivesicular de cualquiera de las reivindicaciones hialuronano es una hialuronidasa, una condroitinasa o una liasa.
5. 5. El liposoma multivesicular de cualquiera de las reivindicaciones hialuronano es una hialuronidasa que es una hialuronidasa PH20.
6. 6. El liposoma multivesicular de la reivindicacion 5, en donde la hialuronidasa PH20 se selecciona entre polipeptidos que contienen la secuencia de aminoacidos expuesta en cualquiera de los SEC ID NO: 4-9 y 47-48, o una secuencia de aminoacidos que presenta al menos 95% de identidad de secuencia de aminoacidos con cualquiera de los SEQ ID NO: 4-9 y 47-48.
7. 7. El liposoma multivesicular de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde:

   la enzima de degradacion de hialuronano se modifica por conjugacion con un polfmero; o

   la enzima de degradacion de hialuronano esta conectada, directa o indirectamente, a una marca o a un radical

   detectable.
8. 8. El liposoma multivesicular de cualquiera de las reivindicaciones 2-7, en donde:

   el LMV contiene acido hialuronico; y

   la concentracion de acido hialuronico es de, o esta entre, 0,05 mg/mL y 50 mg/mL.
9. 9. El liposoma multivesicular de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el lfpido neutro es un diglicerido o un triglicerido.
10. 10. El liposoma multivesicular de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde el lfpido anfipatico es un fosfatidilglicerol (PG), cardiolipina (CL), fosfatidilserina (PS), acido fosfatidico (PA), fosfatidilinositol, fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), esfingomielina o diaciltrimetilamoniopropano (DITAP).
11. 11. El liposoma multivesicular de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende adicionalmente uno o ambos de dipalmitoilfosforilglicerol (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol o DPPG) o colesterol.
12. 12. El liposoma multivesicular de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que comprende un agente terapeutico.
13. 13. Un liposoma multivesicular de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, preparado mediante un procedimiento u obtenible mediante un procedimiento que comprende las etapas de:

    a) formar un primer componente acuoso que comprende una enzima de degradacion de hialuronano a una concentracion inferior a 2 mg/mL;

    b) formar un componente lipfdico que comprende al menos un disolvente organico, al menos un lfpido anfipatico y al menos un lfpido neutro;

    c) formar una emulsion a partir del primer componente acuoso y del componente lipfdico;

    d) dispersar la emulsion en un segundo componente acuoso para formar esferulas de disolvente; y

    e) separar el disolvente organico de las esferulas de disolvente para formar liposomas multivesiculares suspendidos en el segundo componente acuoso, en donde el liposoma multivesicular resultante comprende de

    1-3, en donde la enzima de degradacion de

    1-4, en donde la enzima de degradacion de

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35

    40

    45

    50

    0,1 mg/mL a 1 mg/mL de la enzima de degradacion de hialuronano.
14. 14. El liposoma multivesicular de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde la enzima de degradacion de hialuronano esta encapsulada.
15. 15. Una composicion, que comprende un liposoma multivesicular de cualquiera de las reivindicaciones 1-14 en un portador farmaceuticamente aceptable.
16. 16. La composicion de la reivindicacion 15, que comprende un agente terapeutico.
17. 17. Una combinacion, que comprende:

    una primera composicion que comprende una composicion de la reivindicacion 15; y una segunda composicion que comprende un agente terapeutico.
18. 18. La composicion de la reivindicacion 16 o combinacion de la reivindicacion 17, en donde el agente terapeutico es un agente adecuado para tratar la hiperplasia benigna de prostata, en donde el agente se selecciona entre un antiandrogeno, un bloqueador alfa, una toxina botulmica y una enzima hidrolttica.
19. 19. Una composicion, que comprende:

    una enzima de degradacion de hialuronano, en donde:

    la concentracion de la enzima de degradacion de hialuronano es de al menos 50 U/mL; y la enzima de degradacion del hialuronano es una hialuronidasa, una condroitinasa o una liasa; y

    acido hialuronico, con lo que la enzima de degradacion de hialuronano conserva al menos 50% de la actividad hialuronidasa durante al menos seis meses entre 28°C y 32°C o al menos un ano entre 2°C y 8°C.
20. 20. La composicion de la reivindicacion 19, en donde la enzima de degradacion de hialuronano es una hialuronidasa PH20.
21. 21. La composicion de la reivindicacion 20, en donde la hialuronidasa PH20 se selecciona entre polipeptidos que contienen la secuencia de aminoacidos expuesta en cualquiera de los SEC ID NO: 4-9 y 47-48, o una secuencia de aminoacidos que presenta al menos 95% de identidad de secuencia con cualquiera de los SEQ ID NO: 4-9 y 47-48.
22. 22. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 19-21, en donde la enzima de degradacion de hialuronano se modifica mediante conjugacion con un polfmero.
23. 23. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 19-22, en donde:

    la concentracion de enzima de degradacion de hialuronano esta entre 100 U/mL y 1000 U/mL; y/o la concentracion de acido hialuronico esta entre aproximadamente 1 mg/mL y 100 mg/mL; y/o la composicion se formula en un volumen entre o aproximadamente entre 0,5 mL y 50 mL.
24. 24. Una composicion o combinacion de cualquiera de las reivindicaciones 15-23 para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afeccion asociada a hialuronano, en donde la enfermedad o afeccion es la hiperplasia benigna de prostata, el cancer, presion de disco o edema.