JP2005516897A - 改善された粘膜のワクチン及びその使用方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、亢進された粘膜の免疫応答をインビボにおいて刺激するための組成物及び方法に関する。特別には、本発明は亢進された粘膜の免疫応答を哺乳動物において刺激するための脂質−核酸(「LNA」)製剤及びその使用方法に関する。より特別には、本発明は、LNA製剤に結合した標的抗原を含む、改善された粘膜のワクチン及び哺乳動物において抗原特異的な免疫応答を刺激する、その使用方法に関する。
Description
本発明は、哺乳動物における亢進された粘膜の免疫応答を刺激するための方法及び組成物を提供する。特別には、本発明は着目の標的抗原に結合した免疫刺激性の脂質−核酸製剤を含む、改善された粘膜のワクチン及びそのような組成物の使用方法を提供する。
関連出願
本出願は、米国特許法第119条(e)項により、2001年11月7日に出願された米国仮出願第60/337,522号、及び2002年5月10日に出願された米国仮出願第60/379,343号に基づく優先権を主張する。
本出願は、米国特許法第119条(e)項により、2001年11月7日に出願された米国仮出願第60/337,522号、及び2002年5月10日に出願された米国仮出願第60/379,343号に基づく優先権を主張する。
免疫系は、おおまかに骨髄、脾臓、及びリンパ節を含む全身性の免疫系並びに外分泌腺に関連したリンパ組織及び粘膜表面を含む粘膜免疫機構を含む(例えば、Staats et al., Curr. Opin. Immunol. 6:572-583(1994)を参照のこと)。ほとんどの感染性の病気の主要な伝播部位は粘膜である。したがって、粘膜の免疫を誘導又は亢進することのできるワクチンの開発は非常に望ましい(総説としては、例えば、McCluskie et al., Microbes and Infection 1:685-698(1999)を参照のこと)。
粘膜表面の保護バリアによって、伝統的なワクチンは、特別な粘膜アジュバントと同時投与されない限りほとんど効果がなかった。さらに、多くの伝統的なワクチンは特に免疫無防備状態の個体中で、野生型へ復帰する危険性のある生きた弱毒化病原体から成る。さらに、多くの病原体が弱毒化されることができないため、弱毒化病原体に基づくワクチンは限られている。
組換え抗原及び合成抗原は弱毒化又は不活性化された微生物から成る伝統的なワクチンよりも安全であると考えられる。しかしながら、組換え抗原及び合成抗原は、しばしば免疫原性が弱く、したがって特別的な免疫原による免疫を亢進又は誘導するためにアジュバントの同時投与をも必要とする。動物モデルにおいて使用される最も共通のアジュバントは、コレラ毒素(「CT」)及び大腸菌易熱性エンテロトキシン(「LT」)であり、これらはヒトに対して毒性を有する(例えば、Wu and Russell, Infect. Immun., 61;314-322(1993); Staats et al., J. Immunol., 1:462-472(1996); Gallichan and Rosenthal. Vaccine, 13:1589-1595(1995);及びKuklin et al., J. Virol., 21:3138-3145(1997)を参照のこと)。
全身的な免疫応答を効果的に誘導するためのDNAワクチンの能力は、ヒトを含む多くの種において実証されている(Donelly et al., Annu. Rev. Immunol. 617-648, 15(1997); Davis et al., Microbes Infect. 7-23, 1(1999))。しかしながら、DNAワクチンの大部分は、非経口的にデリバリーされ(例えば、筋肉内投与又は皮内投与によって)、粘膜の免疫応答を誘導しない。したがって、全身的な免疫を提供することのできる全身的な免疫化は粘膜の免疫を提供することができず、結局、粘膜感染に対して防御することができない(Lehner et al., Nature Med., 2:767-775(1996))。
動物に対して全身的に又は粘膜へ投与されてきたDNAワクチンは、レポータータンパク質及びウイルス抗原を発現するアデノウイルス構築物を含む。しかしながら、これらの構築物は、投与後10〜14日で上記動物からのアデノウイルス感染細胞の除去を引き起こすアデノウイルス構築物のレポータータンパク質及びウイルス抗原の両方に対して反応性であるCD8+T細胞を誘導する(Yang et al., J. Virol., 69:2004-2015(1995); Yang et al., Gene Therapy, 3:137-144(1995))。これらのアデノウイルス組換え構築物はまた、抗体応答の活性化を促進し、それよって第2のアデノウイルスワクチン投与による有効な再感染を防ぐ、CD4+ヘルパーT細胞(主にTh1型)を刺激する。したがって、アデノウイルスワクチン自体への強力な免疫応答は、ブースター投与に続いて組換えワクチンによって発現される、必要とされる抗原への二次応答を低下させる。
アデノウイルス組換えワクチンへの制約に対処するために、プラスミドベクターに基づいた遺伝子ワクチンが、動物において防御的免疫応答を誘導するそれらの能力について試験された。全身的な投与によって、プラスミドに基づくワクチンが、全身的な免疫系にタンパク質又は組換えウイルスのような伝統的な抗原による第二の全身的な免疫化の準備をさせることをいくつかの研究が実証した(Xiang et al., Springer Semin. Immunol., 19;257-268(1997); J. Schneider et al, Nature Med., 4:397(1998); M. Sedeguh et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A.; 95:7648(1998))。しかしながら、CTと同時投与するプラスミドに基づくワクチンを用いて、低レベルの生殖器のIgA分泌が刺激されたのみであった(Kuklin et al., J. Virol., 71:3138-3145(1997))。したがって、全身性の免疫応答の誘導に有用なプラスミドに基づくワクチンは、防御的な粘膜の免疫応答を誘導するのには適切でないかも知れない。
1980年代中頃から、核酸が他の高分子同様に生物学的応答の修飾因子として作用し、哺乳動物においてインビボ投与に対する免疫応答を誘導することができることが知られていた(Tokunaga et al., 1984; Shimada et al., 1985; Mashiba et al., 1988; Yamamoto et al., 1988; Phipps et al., 1988)。1990年代初めにおいて、免疫応答の刺激が、採用された核酸の特徴、例えば、パリンドローム2次構造(Yamamoto 1992a);DNAが細菌由来か又は哺乳動物由来かに依存する、Cヌクレオチドのメチル化状態(Messina et al., 1991; Yamamoto 1992a);ヌクレオチド間の結合化学、例えば、ホスホロチオエート(Pisetsky and Reich 1993);及び特異的ヌクレオチド配列、例えば、ポリdG及びCpGジヌクレオチドモチーフ(Tokunaga et al. 1992; Yamamoto et al. 1992b; Mclntyre, KW et al. 1993; Pesetsky and Reich, 1993; Yamamoto et al. 1994; Kreig et al. 1995)に依存することができるということが確立された。免疫応答を刺激するそのような核酸配列は免疫刺激性配列と呼ばれる(「ISS」)。
粘膜のアジュバントを形成するために、ISSを有する核酸と量を減らしたCTを混合することが試みられた(例えば、McCluskie and Davis, J. Immunol. (1998) 161(9):4463-4466)を参照のこと)。しかしながら、CTの量を減らしても、そのようなアジュバントはなお、それらを薬理学的作用物質としての使用に実用的でないものとする毒性及び副作用と結びついていた。さらに、核酸又は他の治療剤の粘膜表面(例えば、尿生殖器の、消化管の、及び気道)へのデリバリーは、酵素による分解及びこれらの成分の有効でない取り込みによって問題があった。例えば、遊離の核酸は典型的には、それらをより分解されにくくするためにホスホロチオエート(「PS」)骨格を取り込むように修飾される。しかしながら、そのようなPS修飾は、遊離の核酸の免疫刺激活性を妨害、又はある場合には完全に失わせることができる(例えば、Hartmann and Krieg, J. Immunol. (2000) 164:944-952を参照のこと)。したがって、免疫刺激性の組成物、例えば核酸、の取り込みを増加させ、分解を制限することによるより有効なデリバリーのために、これらの組成物を製剤する必要性がある。
上記のことを考慮すると、毒性を伴なわずに粘膜及び全身性の強力な免疫応答を刺激することのできる、新しく且つ改善された免疫刺激性の組成物及び方法に対する大きな必要性がある。さらに、インビボで分解から保護され、有効に粘膜表面にデリバリーされる、核酸又は他の治療剤を含む改善されたワクチン製剤が必要である。したがって、本発明の目的は、哺乳動物において亢進された抗原特異的な粘膜の免疫応答を刺激するために、安全且つ有効な免疫刺激性の組成物及びそのような組成物の使用方法を提供することである。
発明の要約
上記の目的にしたがって、本発明は哺乳動物において亢進された粘膜の免疫応答を刺激するための組成物及び方法を提供する。本発明は、遊離の又は封入されない形態の核酸に比べて、核酸及び脂質の併用がインビボにおける亢進された粘膜の免疫応答の刺激に相乗的に作用し得るという発見に基づく。さらに本発明は、標的抗原に結合したそのような脂質−核酸(「LNA」)製剤が、標的抗原単独或いは遊離の又は封入されない形態の核酸に比べて、インビボにおいて標的抗原に対する亢進された粘膜の免疫応答を刺激するという発見に基づく。
上記の目的にしたがって、本発明は哺乳動物において亢進された粘膜の免疫応答を刺激するための組成物及び方法を提供する。本発明は、遊離の又は封入されない形態の核酸に比べて、核酸及び脂質の併用がインビボにおける亢進された粘膜の免疫応答の刺激に相乗的に作用し得るという発見に基づく。さらに本発明は、標的抗原に結合したそのような脂質−核酸(「LNA」)製剤が、標的抗原単独或いは遊離の又は封入されない形態の核酸に比べて、インビボにおいて標的抗原に対する亢進された粘膜の免疫応答を刺激するという発見に基づく。
1の実施態様において、本発明のLNA製剤は脂質混合物を含む脂質成分及び少なくとも1のオリゴヌクレオチド、好ましくはオリゴデオキシヌクレオチド(「ODN」)を含む。1の側面においては、遊離の又は封入されない形態の核酸或いは他の治療剤に比べて、減少された量の核酸又は他の治療剤が、亢進された粘膜の免疫応答を刺激するために本発明の組成物中で使用されることができる。他の側面においては、従来技術に比べてより量の多い核酸又は他の治療剤がさらに応答を刺激するために使用されることができる。
好ましい実施態様において、本発明は少なくとも1の抗原とともにLNA製剤を含む免疫刺激性の組成物の有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において亢進された粘膜の免疫応答を刺激する方法を提供する。そして、上記LNA製剤は以下の:a)少なくとも1の脂質を含む脂質成分;及びb)少なくとも1のオリゴヌクレオチドを含み、ここで、上記免疫刺激性の組成物が、上記オリゴヌクレオチドの遊離の形態に比べて増加したIgA産生をインビボにおいて刺激する。特別に好ましい実施態様においては、LNA製剤は少なくとも1の抗原と結合する。
さらなる実施態様においては、哺乳動物において粘膜組織中でIgA産生を刺激する改善された方法が提供され、該方法は該哺乳動物に本発明によるLNA製剤を投与することを含む。好ましくは、上記LNA製剤は少なくとも1の着目の抗原とともに投与され、より好ましくは、上記LNA製剤は着目の1又は複数の抗原に結合している。1の側面において、上記投与は鼻腔内デリバリーによる。他の側面においては、上記投与は経皮的又は皮下的デリバリーによる。追加の側面においては、上記投与はエクスビボのデリバリーによる。
他の好ましい実施態様においては、本発明はLNA製剤を含む改善された粘膜アジュバントを提供し、該LNA製剤は以下の:a)少なくとも1の脂質を含む脂質成分;及びb)少なくとも1のオリゴヌクレオチドを含む核酸成分を含み、ここで、該核酸成分が該脂質成分によって封入され、該脂質成分及び核酸成分が哺乳動物におけるイムノグロブリンA(IgA)産生を相乗的に刺激する。1の側面において、目的のLNA製剤は、従来技術において利用された遊離の核酸を使用して得られたよりも少なくとも1倍、より好ましくは少なくとも2倍、そして最も好ましくは3倍又は4倍高いIgA応答を引き出すことができる。
さらなる好ましい実施態様において、本発明は少なくとも1の抗原に関連するLNA製剤を含む改ざんされた粘膜のワクチン組成物を提供し、そして該LNA製剤は以下の:a)少なくとも1の脂質を含む脂質成分;及びb)少なくとも1のオリゴヌクレオチドを含む核酸成分を含み、ここで、核酸成分が脂質成分によって封入され、そして脂質成分と核酸成分が相乗的に作用して哺乳動物において抗原特異的なIgA産生を刺激する。特別に好ましい実施態様において、少なくとも1の抗原がLNA製剤に結合し、又はこれによって封入される。1の側面において、本明細書中に記載の改善された粘膜のワクチン組成物を使用して得られる抗原特異的なIgA産生は、抗原と混合された遊離の核酸又はLNA製剤のいずれかを投与することによって達成されるよりも、少なくとも1倍又は2倍高く、より好ましくは少なくとも3倍又は4倍高い。
1の実施態様において、LNA製剤の脂質成分は陽イオン性脂質を含む。さらなる実施態様において、陽イオン性脂質は以下の:DDAB、DODAC、DOTAP、DMRIE、DOSPA、DMDMA、DC-Chol、DOGS、DODMA、及びDODAPから成る陽イオン性脂質の群から選ばれる。
さらなる実施態様において、LNA製剤の脂質成分は中性脂質を含む。さらなる実施態様において、該中性脂質は以下の:DOPE、DSPC、POPC、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、及びセレブロシドから成る中性脂質の群から選ばれる。
好ましい実施態様において、LNA製剤の脂質成分は、DSPC、DODMA、Chol、及びPEG-DMGを含み、そしてDSPC対DODMA対Chol対PEG-DMGの比率は、モル対モルでおよそ20:25:45:10である。1の側面において、本発明の組成物及び方法によるLNA製剤の脂質成分対核酸成分の比率は、重量/重量でおよそ0.01〜0.25である。他の側面においては、本発明の組成物及び方法によるLNA製剤の脂質成分は上記オリゴヌクレオチドを封入した脂質膜を含む。
1の実施態様において、LNA製剤の核酸成分はオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)である少なくとも1のオリゴヌクレオチドを含む。好ましい実施態様において、ODNは少なくとも1のCpGジヌクレオチドを含む。1の側面において、CpGジヌクレオチドはメチル化されているか又はメチル化されていない。特別に好ましい実施態様において、ODNはODN#1、ODN#2、ODN#3、ODN#4、ODN#5、ODN#6、ODN#7、ODN#8及びODN#9から成るODNの群から選ばれる。追加の側面において、ODNはホスホロチオエート骨格を含む(ODN PS)。
さらなる側面において、本発明の組成物及び方法のLNA製剤はさらに抗原を含む。さらなる側面において、抗原はLNAに結合される。さらなる側面において、本発明の組成物及び方法のLNA製剤は。外側部分及び内側部分を有する脂質膜を含む、そして抗原は上記脂質膜の上記外側部分に結合される。
詳細な説明
本発明は、哺乳動物において亢進された粘膜の免疫応答を刺激するための組成物及び方法を提供する。特別には本発明は、遊離の又は封入されない形態の核酸に比べて相乗的に作用して、亢進された粘膜の免疫応答を刺激する核酸及び脂質を含む組成物を提供する。さらに、これらの脂質−核酸(「LNA」)製剤は、インビボにおいて標的抗原に対する強力な粘膜の応答を刺激するために標的抗原と結合させられることができる。さらに、亢進された粘膜の免疫応答は、知られた免疫刺激性の組成物に比べて、減少された量の免疫応答性のLNA組成物中の核酸又は他の治療剤を用いて刺激されることができる。或いは、本発明の組成物及び方法を使用して、知られた免疫応答性の組成物に比べてより多量の核酸又は他の治療剤が投与されることができる。
本発明は、哺乳動物において亢進された粘膜の免疫応答を刺激するための組成物及び方法を提供する。特別には本発明は、遊離の又は封入されない形態の核酸に比べて相乗的に作用して、亢進された粘膜の免疫応答を刺激する核酸及び脂質を含む組成物を提供する。さらに、これらの脂質−核酸(「LNA」)製剤は、インビボにおいて標的抗原に対する強力な粘膜の応答を刺激するために標的抗原と結合させられることができる。さらに、亢進された粘膜の免疫応答は、知られた免疫刺激性の組成物に比べて、減少された量の免疫応答性のLNA組成物中の核酸又は他の治療剤を用いて刺激されることができる。或いは、本発明の組成物及び方法を使用して、知られた免疫応答性の組成物に比べてより多量の核酸又は他の治療剤が投与されることができる。
有効な粘膜アジュバント又はワクチンであることは、粘膜表皮細胞中又はそれに隣接する病原体を中和するイムノグロブリンA(「IgA」)の産生を刺激するアジュバントの能力により証明される(例えば、Lamm et al., Vaccine Res. (1992) 1:169を参照のこと)。活性化されたIgA細胞前駆体は他の粘膜部位に移動し、IgA(分泌型IgA又はS-IgA)を分泌するプラズマ細胞に分化する(例えば、McGhee et al., Vaccine (1992) 10:75を参照のこと)。したがって局所的及び免疫化の部位に対して遠位の部位における抗原特異的なIgA抗体の強力な産生は、有効且つ持続的な粘膜の免疫応答にとって望ましい。
本発明は、核酸と脂質の組み合わせが相乗的に作用して、インビボにおいて亢進された免疫応答を刺激し、結果として、遊離の又は封入されない形態の核酸に比べて顕著にIgA力価を増加させることに基づく。したがって、インビボにおいて亢進された免疫応答を刺激するために、遊離の又は封入されない形態の核酸に比べて減少された量の核酸が本発明のLNA製剤中で使用されることができる。さらに、遊離の核酸を含む、知られた免疫刺激性の組成物に比べて高濃度の本発明のLNA製剤が投与されることができる。なぜなら、そのような知られた免疫応答性の組成物中では、遊離の核酸は高濃度で毒性を示し、又は遊離の核酸濃度の増加にともなって、容量応答曲線中のプラトーを示すことができる。
さらに、本発明は、着目の標的抗原を本発明のLNA製剤とともに投与することによって、抗原特異的なIgA産生の顕著な改善が得られるという発見に基づく。好ましい実施態様において、着目の標的抗原と結合したLNA製剤を含むワクチン組成物を使用して、亢進された抗原特異的な粘膜の免疫応答を刺激するための方法が提供される。
本発明の粘膜のワクチン組成物は、抗原及びアジュバントがリポソーム粒子を介して直接的に着目の免疫細胞、例えばマクロファージ、に同時にデリバリーされ得るという利点を有する。従来技術に開示されたような、いくつかの免疫原のみによって又はアジュバントと免疫原を単に混合することによって与えられる弱い免疫原性の応答に比べて、応答の性質を亢進することを含む、標的抗原に対する粘膜の免疫応答の顕著な刺激は実現されることができる。例えば、PCT国際特許出願公開第WO98/40100号;米国特許第6,406,705号;McCluskie and Davis (1998);Gallichan et al., J. Immunol. 3451-3457(2001)を参照のこと。したがって、本発明のワクチン組成物は、伝統的又は既知のワクチンに比べてより強力な粘膜のワクチンを提供する。
本明細書中に記載されるLNA製剤は知られた免疫応答性の組成物にさらなる利点を提供する。例えば、遊離の核酸の製剤に比べて本発明のLNA製剤は、インビボにおいて顕著に改善された免疫応答を刺激する。さらに、ホスホロチオエート骨格を有するODN(ODN PS)を含むLNA製剤は、遊離の形態のホスホジエステルオリゴヌクレオチドに比べて、インビボにおいて亢進された免疫応答を刺激するための本発明の方法中で使用されることができる。さらに、有効に免疫刺激的でないか又は非免疫刺激的である遊離の核酸は、本発明のLNA製剤中に製剤された場合、免疫刺激効果を提供する。
追加のそして代わりの実施態様において、本発明の方法は相乗的な免疫応答及び標的のアンチセンス活性を刺激するアンチセンス核酸を含むLNA製剤を使用する。また、本発明の方法中におけるLNA製剤及び細胞毒性物質(例えば、ドキソルビシン)の同時投与は、相乗的な免疫応答及び標的とされる細胞毒性活性を刺激する。
略語及び定義
以下の略語は本明細書中で使用される:RBC、赤血球;DDAB、N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムブロマイド;DODAC、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロライド;DOPE、1,2-sn-ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン;DOSPA、2,3-ジオレイロキシ-N-(2(スペルミンカルボキサミド)エチル)-N,N-ジメチル-1-プロパニウムトリフルオロアセテート;DOTAP、1,2-ジオレオイロキシ-3-(N,N,N-トリメチルアミノ)プロパンクロライド;DOTMA、1,2-ジオレイロキシ-3-(N,N,N-トリメチルアミノ)プロパンクロライド;OSDAC、N-オレイル-N-ステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムクロライド;RT、室温;HEPES、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸;FBS、ウシ胎児血清;DMEM、ダルベッコ改変イーグルス培地;PEG-Cer-C.sub.14、1-O-(2’-(オメガ-メトキシポリエチレングリコール)サクシノイル)-2-N-ミリストイル-スフィンゴシン;PEG-Cer-C.sub.20、1-O-(2’オメガ-メトキシポリエチレングリコール)サクシノイル)-2-N-アラキドイル-スフィンゴシン;PBS、リン酸緩衝生理食塩水;THF、テトラヒドロフラン;EGTA、エチレンビス(オキシエチレンニトリロ)-テトラ酢酸;SF-DMEM、血清除去DMEM;及びNP40、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール。
以下の略語は本明細書中で使用される:RBC、赤血球;DDAB、N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムブロマイド;DODAC、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロライド;DOPE、1,2-sn-ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン;DOSPA、2,3-ジオレイロキシ-N-(2(スペルミンカルボキサミド)エチル)-N,N-ジメチル-1-プロパニウムトリフルオロアセテート;DOTAP、1,2-ジオレオイロキシ-3-(N,N,N-トリメチルアミノ)プロパンクロライド;DOTMA、1,2-ジオレイロキシ-3-(N,N,N-トリメチルアミノ)プロパンクロライド;OSDAC、N-オレイル-N-ステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムクロライド;RT、室温;HEPES、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸;FBS、ウシ胎児血清;DMEM、ダルベッコ改変イーグルス培地;PEG-Cer-C.sub.14、1-O-(2’-(オメガ-メトキシポリエチレングリコール)サクシノイル)-2-N-ミリストイル-スフィンゴシン;PEG-Cer-C.sub.20、1-O-(2’オメガ-メトキシポリエチレングリコール)サクシノイル)-2-N-アラキドイル-スフィンゴシン;PBS、リン酸緩衝生理食塩水;THF、テトラヒドロフラン;EGTA、エチレンビス(オキシエチレンニトリロ)-テトラ酢酸;SF-DMEM、血清除去DMEM;及びNP40、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール。
本明細書中で使用される技術的及び科学的用語は、特記されない限り、本発明が属する分野の当業者に普通に理解される意味を有する。本明細書中で、当業者に知られた多様な方法論について言及される。言及されるそのような知られた方法論を説明する刊行物及び他の物はそっくりそのまま本明細書中に参考文献として援用されている。組換えDNA技術について説明している標準的な参考文献は、以下の:Sambrook, J., et al Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Planview, N.Y. (1989); Mcpharson, M,J., Ed., Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford(1991); Jones, J., Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford Science Publications, Oxford (1992); Austen, B. M. and Westwood, O.M.R., Protein Targeting and Secretion, IRL Press, Osford (1991)を含む。当業者に知られたいずれかの好適な材料及び/又は方法が本発明を実施するのに使用されることができるが、好ましい材料及び/又は方法が記載される。以下の記載及び実施例において言及される材料、試薬等は、特記されない限り商業的な供給源から入手可能である。当業者は本明細書の記載に基づいて本発明を最も完全に利用できる。本出願全体に記載される参考文献すべての全体の内容(参考文献、公報に記載の特許、公報に記載の特許出願、及び同時継続特許出願)は参考文献として明白に援用されている。
本発明の方法中で使用される免疫刺激性の組成物は、一般的には、少なくとも1の脂質成分及び少なくとも1の治療剤を含み、インビボにおいて治療剤単独よりも大きな免疫刺激性の活性を有する脂質−治療剤(「LTA」)製剤である。本明細書中で使用される「治療剤」又は「治療化合物」又は「薬物」は相互に交換可能に使用されることができ、対象の医療処置において有益な効果を提供するいずれかの合成の、組換えの、又は天然の分子を意味する。治療剤の例は、核酸、ペプチド、及び化学物質を含むが、これらに限定されない。
本明細書中に記載される好ましい実施態様において、治療剤はLNA製剤中に少なくとも1の核酸、より好ましくは少なくとも1のオリゴヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも1のオリゴデオキシヌクレオチド(「ODN」)を含む。特別に好ましい実施態様において、ODNは免疫刺激性の配列(「ISS]」)を含む。本明細書中で使用される「ISS」は、インビボ投与されることによって、哺乳動物における免疫応答を刺激することのできる核酸配列を意味する(Tokunaga et al., 1984; Shimada et al., 1985; Mashiba et al., 1988; Yamamoto et al., 1988; Phipps et al. 1988)。好ましい実施態様において、ISSはCpGモチーフ(Tokunaga et al. 1992; Yamamoto et al. 1992b; Mclntyre, KW et al. 1993; Pisetsky and Reich, 1993; Yamamoto et al. 1994; Krieg et al. 1995)を含む。他の好ましい実施態様において、ODNは少なくとも1のCpGモチーフを含む。メチル化又は非メチル化CpGモチーフはどちらも本発明の組成物及び方法において有用である。
本明細書中で使用される「対象」は、免疫系を有する雄性又は雌性の生物、好ましくは動物、より好ましくは脊椎動物、さらにより好ましくは哺乳動物、なおより好ましくはげっ歯類、最も好ましくはヒトを意味する。対象のさらなる例は、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ウサギ及びラットを含むがこれらに限定されない。本明細書中で使用される「患者」は、健康に問題のある状態(例えば、病気又は障害)の治療を必要とする対象を意味する。
本明細書中で使用される「インビボ」は、生物において、好ましくは哺乳動物において、より好ましくはげっ歯類において、最も好ましくはヒトにおいてということを意味する。
本明細書中で使用される「免疫刺激性の」又は「免疫応答を刺激する」又はそれらの文法的な同義語は、免疫応答を誘導、増加、亢進、又は調節する、或いは他の方法で免疫応答に関して有益な効果を提供することを意味する。本明細書中で使用されるとおり、「免疫応答」は、全身的な及び/又は粘膜の免疫応答を意味する。
本明細書中で交換可能に使用される「粘膜の免疫応答」又は「粘膜の免疫」という用語は、体液性の(すなわち、B細胞)及び/又は細胞性の(すなわち、T細胞)応答の誘導を意味し、当業者に周知の方法によって評価されることができる。例えば、体液性の粘膜免疫応答は、宿主中への所望の抗体の導入に応答して粘膜洗液中に存在する抗原特異的な抗体を測定することによって評価されることができる。また例えば、粘膜の免疫応答は免疫化された哺乳動物の膣洗液中の抗原特異的な抗体の力価及びアイソタイププロフィールを測定することによって評価されることができる。好ましい実施態様において、(粘膜の免疫応答の)抗体の応答は、おもに、イムノグロブリンA(「IgA」)抗体、より好ましくは分泌IgA(「S-IgA」)を含む。また例えば、細胞性の粘膜免疫応答は粘膜区域(例えば、膣又は消化管)から単離されたリンパ細胞又は粘膜区域(例えば、生殖域又は胃腸域)につながるリンパ節からのT細胞応答を測定することによって評価されることができる。本発明はいずれかの性及び多様な種の哺乳動物の多様な粘膜の免疫応答を含むように構築されるべきである。
本発明によって得られた亢進された粘膜の免疫応答は、例えば、粘膜組織中における高レベルのサイトカイン及び/又はイムノグロブリンの産生を含む、多様な方法によって実証され、決定されることができる。また例えば、本発明の組成物及び方法の免疫刺激活性のレベルは知られたアジュバント及びワクチンの免疫刺激活性と比較されることができる。好ましい実施態様において、抗原を含む本発明のLNA製剤の免疫刺激活性は核酸成分単独(例えば、遊離の核酸)、抗原と混合された核酸成分、又は抗原単独の場合の免疫刺激活性と比較されることができる。
好ましい実施態様において、本発明のLNA組成物及び方法は、核酸単独の場合に比べてイムノグロブリンA(「IgA」)力価の生成を少なくとも2倍、より好ましくは少なくとも3倍高く刺激する。他の好ましい実施態様において、本発明のワクチン組成物及び方法は、知られた粘膜のワクチンに比べて抗原特異的なIgA力価の生成を少なくとも2倍、より好ましくは3倍高く刺激する。
本明細書中で使用される「標的抗原」は、免疫応答がそれに方向づけられ又は刺激される、着目の抗原を意味する。標的抗原に対する免疫応答を刺激するための本発明の組成物中で使用されるその標的抗原は、合成の、天然の、又は単離された分子又はそのフラグメントであることができ、1又は複数のエピトープを含むことができる。したがって、本発明の組成物は、抗原の1又は複数のエピトープに対する免疫応答を刺激することができる。好ましい実施態様において、標的抗原は本発明のLNA製剤に結合されている。「結合して」、「と結合されて」又はそれらの文法的な同義語は、抗原(又は標的抗原)に関して本明細書中で使用される場合、他の成分に結合又は封入された抗原を意味する。本発明の脂質粒子又はリポソームに関して、抗原は例えば、脂質粒子の穴又はラメラ内スペースに封入され;脂質膜内に配置若しくは結合され、又は部分的に配置若しくは結合され、或いは脂質粒子に結合(例えば、共有結合又はイオン結合)されることができる。抗原は脂質粒子の内側に結合されることができ、又はより好ましくは抗原は脂質粒子の外側に結合されることができる。
本発明の組成物及び方法において有用な抗原の例は、ペプチド又はタンパク質、細胞、細胞抽出物、ポリサッカライド、ポリサッカライド結合体、脂質、糖脂質、糖タンパク質、及び炭水化物を含むが、これらに限定されない。1の実施態様において、抗原はペプチド又はタンパク抗原の形態にある。他の実施態様において、抗原は対象中での発現及びその対象の免疫系への提示に好適な形態のペプチド又はタンパク質をコードする核酸である。好ましい実施態様において、本発明の方法中で使用される組成物は、哺乳動物において標的抗原への免疫応答を刺激するペプチド又はタンパク質である標的抗原を含む。好ましくは標的抗原は、哺乳動物に感染することのできる病原体(標的病原体)であり、例えば、哺乳動物種に感染することのできる細菌、ウイルス、カビ、酵母、寄生体及び他の微生物を含む。
「抗原」という用語はさらに、上記のような知られた又は野生型の抗原のペプチド又はタンパク質アナログを含むことを意図する。アナログは野生型抗原よりもより溶解性でより安定であることができ、また抗原を免疫的により活性なものとする突然変異又は修飾を含むことができる。所望の抗原のアミノ酸配列に相同性のあるアミノ酸配列を有するペプチド又はタンパク質もまた、本発明の組成物及び方法中で有用であり、ここで、相同性のある抗原はそれぞれの病原体への免疫応答を誘導する。
本明細書中で使用される「相同な」は、例えば、2の核酸分子(例えば、2のDNA分子又は2のRNA分子)或いは2のポリペプチド分子である、2のポリマー分子間のサブユニット配列類似性を意味する。両分子中のサブユニット位置が同一のモノマー分子、例えば、仮に2のDNAのそれぞれの中の位置がアデニンで占められる場合、それらはその位置において相同である。2の配列間の相同性は、マッチする位置又は相同な位置の数の直接的な関数であり、例えば、仮に2の化合物配列中の半分の位置(例えば、10サブユニット長のポリマー中の5の位置)が相同であれば、その2の配列は50%相同であり、仮に位置の90%、例えば10のうちの9がマッチするか相同であれば、その2の配列は90%の相同性を共有する。例として、DNA配列5'-CCGTTA-3'と5'-GCGTAT-3'は50%の相同性を共有する。本明細書中で使用される「実質的に相同」という用語によって、所望の核酸に対して約50%相同な、好ましくは約70%相同な、さらに好ましくは約80%相同な、そして最も好ましくは約90%相同なDNA又はRNAが意味される。所望の抗原をコードする配列に相同な遺伝子は、それらが所望の抗原に実質的に類似した生理活性を有するタンパク質又はポリペプチドであるという条件で本発明の範囲に含まれると解釈されるべきである。本明細書において、タンパク質及び/又はDNA配列は、同定された配列に対するそれらの相同性パーセント又は同一性パーセントによって定義され、ホモロジーパーセント又は同一性パーセントの計算に使用されるアルゴリズムは以下の:Smith-Watermanアルゴリズム(J.F. Collins et al, Comput. Appl. Biosci., (1988) 4:67-72; J.F. Collins et al, Molecular Sequence Comparison and Alignment, (M.J. Bishop et al, eds.)In Practical Approach Series: Nuclesic Acid and Protein Sequence Analysis XVIII, IRL Press: Oxford, England, UK(1987)417)並びにBLSAT及びFASTAプログラム(E.g.Shpaer et al, 1996, Genomics, 38:179-191)を含む。これらの出典は、本明細書中に参考文献として援用されている。
本明細書中に記載された抗原のアナログは、保存的アミノ酸配列の違い又は配列に影響を及ぼさない修飾のいずれか又は両方によって天然のタンパク質又はペプチドと相違する。例えば、保存的アミノ酸配列の変更は行われることができ、そしてそれらがタンパク質又はペプチドの一次配列を変更させるにもかかわらず、通常はその機能を変化させない。(通常は一次配列を変更しない)修飾は、ポリペプチドのインビボ又はインビトロの化学的誘導体化、例えばアセチル化又はカルボキシル化を含む。抗原としては、例えば、その合成中及びプロセシング中に、又はさらなるプロセシングステップ中で、例えば、哺乳動物のグリコシル化又は脱グリコシル化酵素のようなグリコシル化に影響する酵素にポリペプチドを露出することによって、ポリペプチドのグリコシル化パターンを改変することによって作られる、グリコシル化によって修飾されたタンパク質をも意図する。アミノ酸配列であって、例えばホスホチロシン、ホスホセリン、又はホスホスレオニンのようなリン酸化されたアミノ酸残基を有するものも抗原として意図される。ポリペプチドであって、タンパク分解に対するそれらの耐性を向上させるように、又は溶解性を最適化するように通常の分子生物学の技術を用いて修飾されたものも抗原として意図される。そのようなポリペプチドのアナログは天然のL-アミノ酸以外の残基、例えば、D-アミノ酸又は非天然の合成アミノ酸を含有するものを含む。
本発明の抗原は、本明細書中に列挙された特異的な例示的プロセスの産物に限定されない。本発明において有用な抗原は、実質的に完全な長さのポリペプチドに加えて、ポリペプチドの免疫的に活性のあるフラグメントを含む。抗原は例えば、治療に関連する少なくとも1のエピトープを含む完全な抗原のフラグメントであることができる。本明細書中で使用される「治療に関連するエピトープ」は、エピトープに対する免疫応答を対象に加えることがその対象に治療的な利益を提供するエピトープを意味する。好ましい実施態様において、高度に免疫原性であるが、完全な抗原又は抗原の供給源(例えば、微生物)に対する免疫応答を生じない(完全な抗原の)フラグメントは「治療に関連するエピトープ」ではない。同じ標的抗原からの複数のエピトープ、又は2以上の異なる標的抗原からのエピトープを含むコンビネーション抗原(すなわち、ポリトープワクチン)も本発明の組成物及び方法において有用である。例えば、コンビネーション抗原は、例えば、ペプチド−ペプチド抗原、糖脂質−ペプチド抗原又は糖脂質−糖脂質抗原のような同じ又は異なるタイプであることができる。
ポリペプチド又は抗原は、それが標的抗原又は病原に対する免疫応答を誘導する場合、「免疫的に活性」である。本明細書中で使用される「ワクチン」は、標的抗原を含み、標的抗原に対する特異的免疫応答を刺激する組成物を意味する。
本明細書中で使用される「アジュバント」は、免疫応答、好ましくは粘膜の免疫応答を刺激することのできるいずれかの物質を意味する。いくつかのアジュバントは免疫系の細胞を活性化することができ、例えば、アジュバントは免疫細胞にサイトカインを産生させ、そして分泌させることができる。免疫系の細胞の活性化を引き起こすことのできるアジュバントの例は、Q.サポナリア(Q. saponaria tree)の樹皮から精製されたサポニン、例えばQS21(HPLC分画の21番目のピーク中に溶出する糖脂質;Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Worcester, Mass.);ポリ(ジ(カルボキシラートフェノキシ)ホスファゼン(PCPPポリマー;Virus Research Institute, USA);モノホスホリルリピッドA(MPL; Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Mont.)のようなリポポリサッカライド誘導体、ムラミルジペプチド(MDP; Ribi)及びトレオニル−ムラミルジペプチド(t-MDP; Ribi);OM-174(リピッドAに関連したグルコサミンジサッカライド;OM Pharma SA, Meyrin, Switzerland);及びレイシュマニア伸長因子(精製レイシュマニアタンパク質;Corixa Corporation, Seattle, Wash.)を含むが、これらに限定されない。伝統的なアジュバントは本分野において知られており、例えばリン酸アルミニウム又はヒドロキシド塩(「ミョウバン」)を含む。本発明は、知られたアジュバントに比べて改善されたアジュバントであって、相乗的に亢進された免疫応答を刺激する脂質及び核酸の組み合わせを含むものを提供する。好ましい実施態様において、本発明のそのようなLNA製剤は核酸成分及び脂質成分を含む。好ましくは、核酸成分は少なくとも1のオリゴヌクレオチド、より好ましくは少なくとも1のODN、そして最も好ましくは少なくとも1のCpGモチーフを含む少なくとも1のODNを含む。
好ましい実施態様において、本発明の方法中で使用される免疫刺激性の組成物は、治療剤を封入する脂質膜を含む脂質成分を含む。本明細書中で使用される「リポソーム」、「脂質ビヒクル」及び「リポソームビヒクル」又はそれらの文法的同義語は交換可能に使用され、水性の内容物を入れるか、封入する脂質含有膜を含む構造、粒子、複合体、又は製剤を意味する。好ましい実施態様において、リポソームは核酸のような治療剤を入れるか、又は封入している。リポソームは1以上の脂質膜を有することができる。好ましい実施態様において、リポソームは1の膜を有する。1の脂質含有膜を有するリポソームは、本明細書中で「単一層」と呼ばれる。複数の脂質含有膜を有するリポソームは、本明細書中で「多重層」と呼ばれる。本明細書中で使用される「脂質二重層」は、2の層を有する、脂質含有膜を意味する。
脂質−核酸製剤を含む、粘膜のアジュバント
本発明の方法中で使用される免疫刺激性の組成物は一般的にLNA製剤を含み、該LNA製剤はアジュバントとして単独又は標的抗原とともにワクチン組成物中に含まれることができる。上記のように、LNA製剤は典型的には少なくとも1の脂質成分及び少なくとも1の核酸成分を含む。
本発明の方法中で使用される免疫刺激性の組成物は一般的にLNA製剤を含み、該LNA製剤はアジュバントとして単独又は標的抗原とともにワクチン組成物中に含まれることができる。上記のように、LNA製剤は典型的には少なくとも1の脂質成分及び少なくとも1の核酸成分を含む。
核酸
本発明のLNA製剤中における使用に好適な核酸は、例えば、DNA又はRNAを含む。好ましくは、核酸はオリゴヌクレオチド、より好ましくはODN、そしてより好ましくはISSを含むODN(「ISS ODN」)である。
本発明のLNA製剤中における使用に好適な核酸は、例えば、DNA又はRNAを含む。好ましくは、核酸はオリゴヌクレオチド、より好ましくはODN、そしてより好ましくはISSを含むODN(「ISS ODN」)である。
本明細書中で使用される「核酸」は、複数のヌクレオチド(すなわち、リン酸基及び交換可能な有機塩基に結合した糖(例えば、リボース又はデオキシリボース)である置換ピリミジン(例えば、シトシン(C)、チミン(T)又はウラシル(U))又は置換プリン(例えば、アデニン(A)又はグアニン(G)))を含む分子)を意味する。核酸は、例えば、DNA又はRNAであることができる。好ましくは、核酸はオリゴリボヌクレオチドであり、より好ましくはODNである。核酸は、ポリヌクレオシド、すなわち、ポリヌクレオチドからリン酸塩を除いたもの、及び他のいずれかの有機塩基を含むポリマーであることもできる。好ましい実施態様において、本発明のLNA製剤は核酸成分を含む。本明細書中で本発明のLNA製剤に関して使用される「核酸成分」は、核酸を含む成分を意味する。
好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは一本鎖であり、6〜50ヌクレオチド(「nt」)の範囲の長さである。しかしながら、例えば、500〜50,000塩基対(「bp」)の範囲の大きな二本鎖プラスミドDNAを含むいずれかのオリゴヌクレオチドが使用されることができる。
本発明の組成物及び方法において有用な核酸は、本分野において周知の方法を用いて知られた供給源から得ることができ、また単離することができる。核酸はまた、同様に本分野において周知の組換え方法又は合成方法によって調製されることもできる。そのような核酸はその後、LNA製剤中に調製され、得られた組成物は本明細書中に記載された本発明の方法を用いて免疫刺激活性について試験される。
本発明の組成物及び方法中で有用なオリゴヌクレオチドは、修飾された骨格を有するが、上記のとおり、そのような修飾は従来技術では必要とされないものである。修飾オリゴヌクレオチドはホスホジエステル修飾されたオリゴヌクレオチド、ホスホジエステル(「PO」)とホスホロチオエート(「PS」)オリゴヌクレオチドの組み合わせ、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、及びこれらの組み合わせを含む。さらに、他の修飾オリゴヌクレオチドは以下の:アルキル−及びアリールリン酸塩(その中の荷電したホスホネートの酸素がアルキル又はアリール基で置換されている)のような非イオン性DNAアナログ、ホスホジエステル及びその中の荷電した酸素部分がアルキル化されているアルキルホスホトリエステルを含む。
塩基、糖又は結合部分への他の多くの化学的修飾もまた有用である。塩基はメチル化又は非メチル化されることができる。本発明の組成物及び方法中で有用なヌクレオチド配列は、アンチセンスオリゴヌクレオチドのように患者/対象のmRNAに相補的なものであることができ、或いはそれらは外来又は非相補的なもの(例えば、該ヌクレオチド配列は患者/対象のゲノムに特異的にハイブリダイズしない。)であることができる。ヌクレオチド配列は発現されることができ、得られた発現産物はRNA及び/又はタンパク質であることができる。さらに、そのようなヌクレオチド配列は適切なプロモーター及び発現要素に連結されることができ、発現ベクターに含まれることができる。本発明の組成物及び方法中で有用なヌクレオチド配列は、ヘアピン二次構造(Yamamoto S., et al. (1992) J. Immunol. 148:4072-4076を参照のこと)、又はCpGモチーフ、或いは(例えば、マルチGドメイン、PCT国際特許出願公開第WO96/11266号を参照のこと)他の知られたISSの特徴へ導く一定のパリンドロームのようなISSであることができる。
本発明の核酸は、本分野において知られた多数の方法のいずれかを用いてデノボ合成されることができる。例えば、b−シアノエチルホスホラミダイト法(Beaucage, S.L., and Caruthers, M.H. Tet. Let. 22:1859, 1981);ヌクレオシドH-ホスホネート法(Garegg et al., Tet. Let. 27:4051-4054, 1986; Froehler et al., Nucl. Acid. Res. 14:5399-5407, 1986,; Garegg et al., Tet. Let. 27:4055-4058, 1986,Gaffney et al., Tet. Let. 29:2619-2622, 1988)である。これらの化学は、市場で入手可能な多様な自動化されたオリゴヌクレオチド合成装置によって実施されることができる。また、CpGジヌクレオチドもプラスミド中で大量に産生されることができる(Sambrook, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, New York, 1989を参照のこと)。そのようなプラスミドはまた、DNAワクチンの場合の抗原をコードする遺伝子のように、発現される他の遺伝子をコードすることもできる。オリゴヌクレオチドは制限酵素、エキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼを採用するもののような知られた技術を用いて、存在する核酸配列(例えば、ゲノムの又はcDNA)から調製されることもできる。
インビボでの投与のためには、核酸は好ましくは(例えば、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼを介した)分解に対して比較的耐性である。ステムループのような二次構造は核酸を分解に対して安定化させることができる。或いは、核酸の安定化はリン酸塩骨格の修飾によって達成されることができる。好ましい安定化された核酸は、少なくとも部分的にホウホロチオエート修飾された骨格を有する。ホスホロチオエートはホスホラミデート又はH-ホスホネートの化学作用のいずれかを採用する自動化された技術を用いて合成されることができる。例えば、米国特許第4,469,863号中に記載のようにアリール−及びアルキル−ホスホネートは生成されることができ;そして(米国特許第5,023,243号及びヨーロッパ特許第092,574号に記載のとおり、荷電した酸素部分がアルキル化された)アルキルホスホトリエステルは商業的に入手可能な試薬を用いて自動化された固相合成によって調製されることができる。他のDNA骨格の修飾方法及び置換方法は記載されている(Uhlmann, E. and Peyman, A., Chem. Rev. 90:544, 1990; Goodchild, J., Bioconjugate Chem. 1:165, 1990)。
インビボでの投与のためには、その成分、例えば脂質成分又は核酸成分、を含む本発明の組成物は標的細胞(例えば、B細胞、単核球細胞及びナチュラルキラー(NK)細胞)表面へのより高い親和性を有し、及び/又は標的細胞による細胞取り込みが増加することとなる分子に結合されることができる。その成分を含む本発明の組成物は、本分野において周知の技術を用いて所望の分子にイオン結合又は共有結合されることができる。プロテインA、カルボジイミド、及びN-サクシニミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)などの多様なカップリング剤又は架橋剤が使用されることができる。
生物中における核酸配列の免疫刺激活性は、問題の配列を他の免疫刺激剤、例えば、他のアジュバント又はISSを比較することにより;又は問題の配列の免疫刺激活性を検出又は測定、例えば宿主の防御機構の活性化又は免疫系成分の活性化を測定することによる単純な実験によって決定されることができる。そのようなアッセイは本分野において周知である。また、当業者は、本明細書中に記載され、及び/又は本分野において知られた日常のアッセイを使用する、着目の特定の哺乳動物種に対して有用な最適のオリゴヌクレオチドの同定方法を知っているであろう。
本発明の組成物及び方法中で使用するのに好適なODNの核酸配列は、本明細書中に参考文献として援用されている、米国特許出願第60/379,343号、同第09/649,527号、PCT国際特許出願公開第WO02/069369号、同第WO01/15726号、米国特許第6,406,705号及びRaney et al., Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 298:1185-1192(2001)に記載されている。ODNの例示的配列は表1に示された核酸配列を含むが、これらに限定されない。好ましい実施態様において、本発明の組成物及び方法中で使用されるODNはホスホジエステル(「PO」)骨格又はホスホロチオエート(「PS」)骨格を有する。
脂質及び他の成分
脂質製剤及びデリバリービヒクルとしてのリポソームの調製方法は本分野において知られている。好ましい脂質製剤は本明細書中に記載されており、より充分には例えば米国特許第5,785,992号、同第6,287,591号、同第6,287,591B1号、同時継続の米国特許出願第60/379,343号および同時継続の米国特許出願第09/649,527号に記載されており、そのすべてが参考文献として本明細書中に援用されている。
脂質製剤及びデリバリービヒクルとしてのリポソームの調製方法は本分野において知られている。好ましい脂質製剤は本明細書中に記載されており、より充分には例えば米国特許第5,785,992号、同第6,287,591号、同第6,287,591B1号、同時継続の米国特許出願第60/379,343号および同時継続の米国特許出願第09/649,527号に記載されており、そのすべてが参考文献として本明細書中に援用されている。
1の好ましい実施態様において、好ましい脂質製剤は、DSPC、DODMA、Chol、及びPEG-DMGを20:25:45:10モル/モルの比率で有する。本明細書中で使用されるとおり、脂質製剤中の各脂質のモル量は脂質が列挙されたのと同じ順番で割り当てられる(例えば、DSPC対DODMA対Chol対PEG-DMGの比率は20DSPC:25DODMA:45Chol:10PEG-DMG又は20:25:45:10である)。
「脂質」という用語は、水に不溶であるが多くの有機溶媒には溶解性であることに特徴を有する、脂肪酸エステルである有機化合物の群を意味する。それらは通常は少なくとも以下の3のクラス:(1)脂肪及び油並びにワックスを含む「単純脂質」;(2)リン脂質及び糖脂質を含む「複合脂質」;及び(3)ステロイド及び脂質を操作することによって得られる誘導体化合物のような「脂質誘導体」に分けられる。広く多様な脂質が本発明とともに使用され、そのうちのいくつかが以下に記載される。
「荷電された脂質」という用語は、陽性の電荷又は陰性の電荷を有する脂質種又は純粋な中性に荷電されていない、一般的にその脂質が見出される溶液のpHへの言及を必要とする双性イオンである脂質種を意味する。
生理的pHにおいて陽性に荷電された脂質は、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロライド(「DODAC」);N-(2,3-ジオレイロキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライド(「DOTMA」);N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムブロマイド(「DDAB」);N-(2,3-ジオレイロキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライド(「DOTAP」);3b-(N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル)コレステロール(「DC-Chol」)及びN-(1,2-ジミリスチロキシプロプ-3-イル)-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド(「DMRIE」)を含むが、これらに限定されない。さらに、本発明において使用されることのできる多くの陽イオン性脂質の調製物が商業的に入手可能である。これらは、例えば、(GIBCO/BRL、Grand Island, New York, U.S.A.からの、DOTMA及び1,2-ジオレオイル-sn-3-ホスホエタノラミン(「DOPE」)を含む商業的に入手可能な陽イオン性リポソームである)リポフェクチン(商標)(Lipofectin);(GIBCO/BRLからの、N-(1-(2,3-ジオレイロキシ)プロピル)-N-(2-(スペルミンカルボキサミド)エチル)-N,N-ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート(「DOSPA」)及びDOPEを含む商業的に入手可能な陽イオン性リポソームである)リポフェクタミン(商標)(Lipofectamine);及び(Promega Corp., Madison, Wisconsin, U.S.A.からの、エタノール中ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン(「DOGS」)を含む商業的に入手可能な陽イオン性脂質である)トランスフェクタム(商標)(Transfectam)を含む。
いくつかの陽性に荷電された脂質が滴定可能であり、すなわち、それらは生理的pHに近いpKaを有し、本発明の重要な結論としてそれらは弱酸性条件下で強力に陽イオン性であり、生理的pHにおいて弱い陽イオン性であるか、又は陽イオン性でない。そのような陽性に荷電された脂質は、N-(2,3-ジオレイロキシ)プロピル)−N,N-ジメチルアンモニウムクロライド(「DODMA」)及び1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(「DODAP」)を含むが、これらに限定されない。DMDMAもまた、有用な滴定可能な陽イオン性脂質である。
生理的pHにおいて陰イオン性に荷電された脂質は、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ジホスファチジルグリセロール、ポリ(エチレングリコール)−ホスファチジルエタノラミン、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウリロイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアリロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルリン酸、ジパルミトイルリン酸、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、脳ホスファチジルセリン等を含むがこれらに限定されない。
いくつかの陰イオン性に荷電された脂質が滴定可能であり、すなわち、それらは生理的pH又はそれに近いpKaを有し、本発明の重要な結論としてそれらは弱い塩基性条件下で強力に陰イオン性であり、生理的pHにおいて弱い陰イオン性又は陰イオン性でない。そのような陰イオン性に荷電された脂質は本明細書中に開示された原理に基づいて当業者によって同定されることができる。
「中性脂質」という用語は、生理的pHにおいて荷電されない形態又は中性の双性イオン形態のいずれかで存在する多くの脂質種のいずれかを意味する。そのような脂質は、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノラミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシド及びジアシルグリセロールを含む。
本発明において使用されるある好ましい脂質製剤は、PEG−脂質又は(ATTA-脂質のような)ポリアミドオリゴマー脂質、及び他の立体障壁(steric barrier)又は「ステルス」脂質、界面活性剤などのような凝集防止化合物を含む。そのような脂質は、米国特許第4,320,121号、同第5,820,873号、同第5,885,613号、PCT国際特許出願公開第WO98/51278号、及びポリアミドオリゴマーに関する米国特許出願第09/218,988号中に記載され、これらはすべて参考文献として本明細書中に援用されている。これらの脂質及び界面活性化合物は、反対に荷電された脂質及び治療剤を含む製剤の沈殿及び凝集を防止する。これらの脂質はまた、インビボにおける循環中の存在時間を改善するために採用されることもでき(Klibanov et al.(1990) FEBS Letters, 268(1): 235-237を参照のこと)、又はそれらはインビボにおける製剤からの迅速な交換のために選択されることができる(本明細書中に参考文献として援用されている米国特許第5,885,613号を参照のこと)。
本発明の好ましい実施態様は、(そのすべてが本発明の承継人に承継され、参考文献として本明細書中に援用されている、米国特許第5,820,873号、同第5,885,613号及び米国特許出願第09/094540及び米国特許第6,320,017号中に記載された)交換可能な立体障壁脂質を採用する。PEG2000-CerC14及びATTA8-CerC14のような交換可能な立体障壁脂質は対象/患者に投与することによって急速に脂質粒子の外側の一重膜から交換する立体障壁脂質である。そのような各脂質は、アシル鎖の長さ、飽和度、立体障壁部分のサイズ、膜組成物及び血清組成物などに依存して粒子から交換する速度に特徴を有する。そのような脂質は、粒子形成の間の凝集を防止し、それらの粒子からの促進された離脱は上記の特許出願書類中に記載されたように、プログラム可能な膜融合性及び粒子不安定化活性のような利益を提供する。
いくつかの脂質粒子製剤が、一定の標的細胞又は標的組織におけるリポソームの局在化を促進するように設計されたターゲティング部分を採用することができる。ターゲティング部分は製剤中又は製剤後に脂質粒子の外側の二重膜に結合されることができる(すなわち、直接的な結合、親水性の相互作用などによって)。これらの方法は本分野において周知である。さらに、いくつかの脂質粒子製剤がPEAA、ヘマグルチニン、他のリポペプチド(そのすべてが参考文献として本明細書中に援用されている、米国特許第6,417,326号及び米国特許出願第09/674,191号を参照のこと)及びインビボのデリバリー及び/又は細胞内デリバリーに有用な他の形の膜融合性ポリマーを採用することができる。
他の好ましい実施態様において、本発明のLNA製剤の脂質成分はスフィンゴミエリン及びコレステロールを含む(「スフィンゴソーム」)。好ましい実施態様において、本発明の組成物及び方法中で使用されるLNA製剤はスフィンゴミエリン及びコレステロールを含み、酸性のリポソーム内pHを有する。スフィンゴミエリン及びコレステロールを含むLNA製剤は、他の製剤と比較していくつかの利点を有する。スフィンゴミエリン/コレステロールの組み合わせは、試験した他のリポソーム製剤よりも延長された循環中の存在時間を有するリポソームであって、酸による加水分解に対して大いに安定であり、顕著に良好な薬物保持特性を有し、腫瘍等への良好な負荷特性を有し、顕著に良好な抗腫瘍効力を示すリポソームを生成する。
好ましい実施態様において、コレステロールに対するスフィンゴミエリンの比率は、約75/25モル%/モル%〜30/50モル%/モル%のスフィンゴミエリン/コレステロールの範囲、より好ましくは約70/30モル%/モル%〜40/45モル%/モル%スフィンゴミエリン/コレステロールの範囲、最も好ましくは約55/45モル%/モル%スフィンゴミエリン/コレステロールである。他の脂質は、脂質酸化の防止又はリポソーム表面へのリガンドの結合などの必要に応じて製剤中に存在することができる。
好ましい実施態様において、本発明のLNA製剤は以下の式I:
{式中、
R1及びR2はそれぞれ独立してC1〜C3アルキルであり;
Y及びZはアルキル鎖又はアルケニル鎖であって、Y及びZが両方とも-CH2CH2CH2CH2CH2-でないという条件で、それぞれ独立して以下の:-CH2CH2CH2CH2CH2-、-CH=CHCH2CH2CH2-、-CH2CH=CHCH2CH2-、-CH2CH2CH=CHCH2-、-CH2CH2CH2CH=CH-、-CH=CHCH=CHCH2-、-CH=CHCH2CH=CH-又は-CH2CH=CHCH=CH-であり;
n+m及びq+pがそれぞれ10〜14の間の整数であるという条件で、n及びqという文字は3〜7の間の整数を表し、m及びpという文字は4〜9の間の整数を表し;
シンボルX-は薬剤として許容可能な陰イオンを表し;
二重結合の配向性はシス又はトランスのいずれでもよいが、シスアイソマーが一般的に好ましい。}
により表される陽イオン性化合物、及び少なくとも1の以下の(そして本明細書中に参考文献として援用されている米国特許第5,785,992号中に完全に記載された)中性脂質を含む。
R1及びR2はそれぞれ独立してC1〜C3アルキルであり;
Y及びZはアルキル鎖又はアルケニル鎖であって、Y及びZが両方とも-CH2CH2CH2CH2CH2-でないという条件で、それぞれ独立して以下の:-CH2CH2CH2CH2CH2-、-CH=CHCH2CH2CH2-、-CH2CH=CHCH2CH2-、-CH2CH2CH=CHCH2-、-CH2CH2CH2CH=CH-、-CH=CHCH=CHCH2-、-CH=CHCH2CH=CH-又は-CH2CH=CHCH=CH-であり;
n+m及びq+pがそれぞれ10〜14の間の整数であるという条件で、n及びqという文字は3〜7の間の整数を表し、m及びpという文字は4〜9の間の整数を表し;
シンボルX-は薬剤として許容可能な陰イオンを表し;
二重結合の配向性はシス又はトランスのいずれでもよいが、シスアイソマーが一般的に好ましい。}
により表される陽イオン性化合物、及び少なくとも1の以下の(そして本明細書中に参考文献として援用されている米国特許第5,785,992号中に完全に記載された)中性脂質を含む。
他の好ましい実施態様において、陽イオン性化合物は上記の式I:
{式中、
R1及びR2はメチルであり;
Y及びZはそれぞれ独立して以下の:-CH=CHCH2CH2CH2-、-CH2CH=CHCH2CH2-、-CH2CH2CH=CHCH2-又は-CH2CH2CH2CH=CH-である。}により表される。より好ましい実施態様において、R1及びR2はメチルであり;Y及びZはそれぞれ-CH=CHCH2CH2CH2-であり;n及びqは両方とも7であり;m及びpは両方とも5である。他の好ましい実施態様において、陽イオン性の化合物はDODAC(N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロライド)である。DODACは本分野において知られており、界面活性剤及びシャンプー中に添加剤として広く使用される化合物である。DODAもまた、他の界面活性剤と共にリポソーム組成物中の共存脂質として使用される(Takahashi, et al., GB2147243を参照のこと)。
{式中、
R1及びR2はメチルであり;
Y及びZはそれぞれ独立して以下の:-CH=CHCH2CH2CH2-、-CH2CH=CHCH2CH2-、-CH2CH2CH=CHCH2-又は-CH2CH2CH2CH=CH-である。}により表される。より好ましい実施態様において、R1及びR2はメチルであり;Y及びZはそれぞれ-CH=CHCH2CH2CH2-であり;n及びqは両方とも7であり;m及びpは両方とも5である。他の好ましい実施態様において、陽イオン性の化合物はDODAC(N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロライド)である。DODACは本分野において知られており、界面活性剤及びシャンプー中に添加剤として広く使用される化合物である。DODAもまた、他の界面活性剤と共にリポソーム組成物中の共存脂質として使用される(Takahashi, et al., GB2147243を参照のこと)。
本発明のLNA製剤中の中性脂質は、典型的には界面活性剤中で使用され、或いはミセル又はリポソームの形成のために使用される多様な中性脂質のいずれかであることができる。本発明の組成物において有用な中性脂質の例は、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノラミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、及びセレブロシドであるが、これらに限定されない。好ましい実施態様において、本発明の組成物はジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノラミン、セラミド又はスフィンゴミエリンである中性脂質の1以上を含む。これらの中性脂質中のアシル基は好ましくはC10〜C24の炭素鎖を有する脂肪酸に由来するアシル基である。より好ましくは、アシル基はラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、又はオイレオイルである。特別に好ましい実施態様においては、中性脂質は1,2-sn-ジオレオイルホスファチジルエタノラミンである。
陰イオンX31は、同様に多様な薬剤として許容可能な陰イオンのいずれかであることができる。これらの陰イオンは、例えばBr-、Cl-、F-、I-、硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、硝酸塩、ベンゾエート、クエン酸塩、グルタミン酸塩、及び乳酸塩を含む、有機又は無機の陰イオンであることができる。好ましい実施態様において、X-はCl-又はAcO-である。
本明細書中に記載された他の成分に加えて、本発明の組成物は薬剤として許容可能な担体を含むことができる。薬剤として許容可能な担体は本分野において周知である。担体の選択は投与される特別な組成物並びにその組成物の投与に使用される特別な方法により部分的に決定される。好ましくは、薬剤担体は水又は生理食塩水の溶液である。
本発明の組成物において、陽イオン性化合物の中性脂質に対する比率は、好ましくは約25:75(陽イオン性化合物:中性脂質)から好ましくは約75:25(陽イオン性化合物:中性脂質)の範囲内にあり、又は好ましくは約50:50である。
本発明の組成物中で使用される陽イオン性化合物は、標準的な合成反応(本明細書中に参考文献として援用されているMarch, Advanced Organic Chemistry, 4th Ed., Wiley-Interscience, NY,N.Y.(1992)を参照のこと)を用いて当業者に知られた方法によって調製されることができる。例えば、OSDACの合成は、最初にアミンの還元的アルキル化となる条件下でホルムアルデヒドとシアノボロハイドライドナトリウムでオレイルアミンを処理することによって実施されることができる。このアプローチは、対応するアンモニウム塩を形成するためにその後ステアリルブロマイドでアルキル化されるジメチルオレイルアミンを提供する。陰イオン交換によりOSDACが形成される。ジメチルオレイルアミンはまた、大過剰のジメチルアミンによってオレイルブロマイドを処理し、さらに上記のように誘導体化されることによっても合成されることができる。
両方の脂肪酸鎖が不飽和である陽イオン性化合物(すなわち、DODAC)については、以下の一般的な手順が使用されることができる。不飽和脂肪酸(すなわち、オレイン酸)は、オキサリルクロライド、チオニルクロライド、PCl3又はPCl5のような試薬によってそれに対応するアシルクロライドに変換されることができる。アシルクロライドは不飽和アミン(すなわち、オレイルアミン)で処理されて対応するアミドを提供することができる。例えば、リチウムアルミナムハイドライドによるアミドの還元は、両方のアルキル基が不飽和長鎖アルキル基である二級アミンを提供する。二級アミンはその後、メチルヨーダイドのようなアルキルハライドで処理されて四級アンモニウム化合物を提供することができる。その後、陰イオン交換が所望の薬剤として許容可能な陰イオンを有する陽イオン性化合物を提供するために実施されることができる。アルキルアミン前駆体は、同様のやり方で合成されることができる。例えば、アルキルハライドを大過剰のアンモニアのメタノール溶液で処理することは精製後に必要なアミンを産生するだろう。或いは、適当なカルボキシル酸をオキサリルクロライドで処理することによって生成されたアシルクロライドはアンモニアと反応させられてアミドを産生する。LiAlH4によるアミドの還元は必要なアルキルアミンを提供するだろう。
好ましい実施態様において、本発明の医薬組成物はミセル又はリポソームとして製剤される。陽イオン性化合物及び本発明の中性脂質を含むミセルは本分野において周知の方法によって調製されることができる。本発明の組成物のミセル製剤に加えて、本発明はリソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノラミン、リソホスファチジルセリン、リソホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノラミン−ポリオキシエチレン結合体、セラミド−ポリオキシエチレン結合体又はホスファチジン酸−ポリオキシエチレン結合体のような他の種を含むミセル製剤をも提供する。
本発明の組成物において使用されるポリオキシエチレン結合体は結合基(すなわち、ホスファチジン酸又はホスファチジルエタノラミン)と適当に官能化されたポリオキシエチレン誘導体と結合させることによって調製されることができる。例えば、ホスファチジルエタノラミンはオメガ−メトキシポリエチレングリコールコハク酸塩と結合されてホスファチジルエタノラミン−ポリオキシエチレン結合体を提供することができる(例えば、本明細書中に参考文献として援用されているParr et al., Biochim. Biophys. Acta. 1195:21-30(1994)を参照のこと)。
本発明の組成物及び方法中で使用されるための中性脂質は一般的に例えば、リポソームサイズ及び血流中でのリポソームの安定性などを考慮することによって導かれることができる。上記のように、リポソーム中の中性脂質成分は2のアシル基を有する脂質(すなわち、ジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジル−エタノラミン)である。多様な長さおよび飽和度を有する多様なアシル鎖を有する脂質は入手可能であり、又は周知の技術によって単離又は合成されることができる。一般的に、濾過滅菌のためにリポソームが約0.3ミクロン未満の一定の大きさに作られなければならない場合には特別に、より飽和度の低い脂質はより容易に大きさを定められることができる。1の群の実施態様において、飽和脂肪酸を含む脂質であって炭素鎖の長さがC14〜C22の範囲であるものが好ましい。実施態様の他の群においては、炭素鎖の長さがC14〜C22の範囲のモノ又はジ不飽和脂肪酸が使用される。さらに、飽和及び不飽和脂肪酸鎖の混合物を有する脂質が使用されることができる。
本発明の組成物及び方法中で有用なリポソームはまた、スフィンゴミエリン、又はセリン及びイノシトールのような他の頭部を有するリン脂質を含むこともできる。本発明において有用なさらに他のリポソームはコレステロール、ジグリセリド、セラミド、ホスファチジルエタノラミン−ポリオキシエチレン結合体、ホスファチジン酸−ポリオキシエチレン結合体、又はポリエチレングリコール−セラミド結合体(例えば、PEG-Cer-C14又はPEG-Cer-C20)を含むだろう。リポソームの大きさをそろえること及び濾過滅菌において使用される方法は以下に検討される。
リポソームの多様な調製方法が本分野において知られている(例えば、そのすべてが参考文献として本明細書中に援用されている、Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467(1980) 、米国特許第4,235,871号、同第4,501,728号、同第4,837,028号、テキスト Liposome, Marc J. Ostro編., Marcel Dekker, Inc. New York, 1983, Chapter 1,、及びHope, et al., Chem Phys. Lip. 40:89 (1986)を参照のこと)。1の知られた方法は、不均質なサイズの多重層ビヒクルを産生する。この方法において、ビヒクルを形成する脂質は好適な有機溶媒又は溶媒系に溶解され、真空下又は不活性ガス中で脂質の薄膜を形成するように乾燥される。所望により、該膜はtert-ブタノールのような好適な溶媒に再溶解され、その後、より容易に水和される粉状形態である、より均一な脂質混合物を形成するように凍結乾燥されることができる。この膜は水性の緩衝溶液で覆われ、典型的には15〜60分の間振とうすることによって水和される。得られた多重層ビヒクルのサイズ分布は、より激しい振とう条件下又はデオキシコール酸塩のような溶解度を高める界面活性剤を添加することによって、より小さいサイズへシフトされることができる。
リポソームの調製に続いて、リポソームは所望のサイズ範囲及び比較的狭いリポソームサイズ分布を達成するような寸法に作られることができる。約0.2〜0.4ミクロンのサイズ範囲はリポソーム懸濁液が慣用のフィルター、典型的には0.22ミクロンフィルターを通す濾過によって滅菌されることを可能とする。仮にリポソームが約0.2〜0.4ミクロンにサイズが小さくなっていれば、濾過滅菌法はハイスループットに基づいて実施されることができる。
所望の寸法にリポソームの大きさを作るためのいくつかの技術がある。1のサイジング法は本明細書中に参考文献として援用されている米国特許第4,737,323号中に記載されている。浴又はプローブソニケーションによるリポソーム懸濁液のソニケーションは、約0.05ミクロン未満のサイズの小さな単一層ビヒクルへ革新的に寸法を減少させる。ホモジェナイズは、大きなリポソームからより小さいリポソームへ細分化するための剪断エネルギーに依存する別の方法である。典型的なホモジェナイズ方法においては、多重層ビヒクルは標準的なエマルジョンホモジェナイザーを介して、選ばれたリポソームサイズ、典型的には約0.1〜0.5ミクロンの間であることが観察されるまで再循環される。両方法において、粒子のサイズ分布は、慣用のレーザービームによる粒子サイズの識別によってモニターされることができる。
小孔ポリカーボネート膜又は非対称のセラミック膜を通してリポソームを押し出すことも、比較的良好に定義されたサイズ分布にリポソームサイズを減少させる有効な方法である。典型的には、懸濁液は所望のリポソームサイズ分布が達成されるまで、1回以上膜を通して循環させられる。リポソームは、リポソームサイズを徐々に減少させるために、より孔の小さい膜をうまく通して押し出されることができる。本発明における使用のために、約0.05ミクロン〜約0.15ミクロンのサイズを有するリポソームが好ましい。
以下においてさらに記載されるように、本発明の組成物は知られた投与ルートのいずれかによって対象に投与されることができる。いったん細胞に吸収されると、(先に記載された複合体を含む)リポソームは細胞のある部分によってエンドサイトーシスされ、細胞膜と脂質を交換し、又は細胞と融合することができる。複合体のポリアニオン性部分の転位又は取り込みは、これらの経路のいずれかを介して行われることができる。特別には、融合が起こる場合、リポソーム膜は細胞膜に統合され、リポソームの内容物が細胞内液と結合することができる。
以下に詳細に記載されるように、治療剤であることもできる追加の成分が、本発明のLNA製剤を特定の細胞を標的とさせるために、加えられることができる。例えば、全身投与に続いてリポソームを標的に向かわせる手段を提供することによって、リポソームは癌関連抗原のような特定のタイプの細胞上にのみ存在するエピトープに結合するモノクローナル抗体又はそれらの結合フラゲメントに結合されることができる。或いは、標的の細胞タイプの表面受容体に結合するリガンドもまた、リポソームに結合されることができる。リポソームを標的に向かわせる他の手段もまた、本発明中で採用されることができる。
リポソームを含む媒質から遊離の薬物を除去するために必要であることのできる分離ステップに続いて、患者又は宿主の細胞へ投与するための薬剤として許容可能な担体中のリポソーム懸濁液が所望の濃度とされる。多くの薬剤として許容可能な担体が本発明の組成物及び方法中で採用されることができる。例えば、水、緩衝化された水、0.4%生理食塩水、0.3%グリシン、などの多様な水性の担体が使用されることができ、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンのような、安定性を高めるための糖たんぱく質を含むことができる。一般的には、通常の緩衝生理食塩水(135〜150mMのNaCl)が薬剤として許容可能な担体として採用されるが、他の好適な担体でも十分である。これらの組成物は濾過のような慣用のリポソーム滅菌技術によって滅菌されることができる。組成物は生理学的状態を近似するために必要とされる、薬剤として許容可能な補助物質、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどのpH調節剤及び緩衝剤、毒性調節剤などを含むことができる。これらの組成物は上記の技術によって滅菌されることができ、又は滅菌条件下で製造されることができる。得られた水性の溶液は使用のために包装され、又は無菌状態で濾過されそして凍結乾燥され、凍結乾燥調製物は滅菌水性溶液と投与の前に併合されることができる。
担体中のリポソーム濃度は可変であることができる。好ましい実施態様において、リポソームの濃度は約0.1〜200mg/mlである。当業者は、異なるリポソーム成分を用いる治療又は特別な患者のための治療を最適化するためにこれらの濃度をいかに変化させるかを知っているだろう。例えば、治療に関連した流体負荷を減らすために上記濃度は増加されることができる。
対象の細胞は、通常はインビボ又はエクスビボの投与によって、本発明のLNA製剤に露出されている。本明細書中に記載された好ましい実施態様において、本発明の組成物は鼻腔内に、又は気管内に投与される。気管内投与は、液体、好ましくはエアロゾルとして提供されることができる。例えば、一滴の直径が70〜100μmのエアロゾルを作り出すためにネブライザーが使用されることができる。一滴のサイズは一般的にリポソームのサイズよりも大きくあるべきであるということは理解されるであろう。
患者への多数の投与方法が考察された。治療の用量計画は、病気及び患者の状態によって決定されるであろう。本分野において周知である、免疫刺激性の組成物(例えば、ワクチン)を含む治療化合物による標準的な治療は、治療化合物を含むリポソームによる治療への指針としての役割を果たす。治療の持続時間とスケジュールは当業者に周知の方法によって変更されることができるが、増加された循環時間と減らされたリポソームの漏出は用量が一般的には先に採用されたよりも低く調整されることを可能とするだろう。本発明のリポソームは臨床状態及び治療を受ける動物又は患者の大きさに依存して変化することができる。治療化合物の標準的な用量は、封入されていない場合、リポソームに封入された化合物の用量への指針としての役割を果たすことができるだろう。上記用量は典型的には、治療の過程にわたって一定であるだろうが、いくつかの場合には上記用量は変化することができる。標準的な生理学的パラメーターは、治療の間に評価されることができ、それは本発明のリポソームの用量を変更するために使用されることができる。
他の薬物成分
本発明の好ましい実施態様は例えば、薬物又は生物活性剤のような他の治療剤をさらに含む。これらのさらなる成分はさらなる直接的な治療的利益又はさらなる免疫刺激性の利益を提供することができる。広く多様な治療化合物が本発明の組成物及び方法によってデリバリーされることができる。治療化合物の例は、核酸、たんぱく質、ペプチド、腫瘍細胞崩壊剤、抗感染剤、抗不安薬、向精神薬、免疫調節剤、イオノトロープ(ionotrope)、ゲロニンのような毒素及び真核生物のたんぱく合成の阻害剤などを含むがこれらに限定されない。本発明のリポソーム中に閉じ込められる好ましい治療化合物は、脂肪親和性の陽イオンである。これらの中には、リポソームの脂質二重層を仕切ることができ、したがって膜の形態のリポソームと結合することのできる脂肪親和性の分子のクラスに属する治療剤がある。治療化合物の更なる例は、プロスタグランジン、アンフォテリシンB、メトトレキセート、シスプラチン及び誘導体、プロゲステロン、テストステロン、エストラジオール、ドキソルビシン、エピルビシン、ベクロメタゾン及びエステル、ビタミンE、コルチゾン、デキサメタゾン及びエステル、ベタメタゾン吉草酸塩及び他のステロイド、フッ化キノロン抗菌剤シプロフロキサシン及びその誘導体、並びにアルカロイド化合物及びそれらの誘導体を含むがこれらに限定されない。アルカロイド誘導体の中には、スワインソニン及びビンカアルカロイドのメンバー並びにビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、エトポシド、エトポシドリン酸塩及びテニポシドのようなそれらの半合成誘導体がある。この群の中では、ビンブラスチン及びビンクリスチン、並びにスワインソニンが特別に好ましい。スワインソニン(Creaven and Mihich, Semin. Oncol. 4:147(1977))は骨髄の増殖を刺激する能力を有する(White and Olden, Cancer Commun. 3:83(1991))。スワインソニンはまた、IL-1、IL-2、TNF、GM-CSF及びインターフェロンを含む複数のサイトカインの産生をも刺激する(Newton, Cancer Commun. 1:373(1989);Olden, K., J. Natl. Cancer Inst., 83:1149(1991))。さらに、スワインソニンがインビトロにおいてB及びT細胞性免疫、ナチュラルキラーT細胞及びマクロファージによって誘導された腫瘍細胞の崩壊を誘導すること、及びインターフェロンと併用された場合には、インビボにおいて結腸癌及びメラノーマ癌に対する抗腫瘍活性を有することが報告された(Dennis, J., Cancer Res, 50:1867(1990; Olden, K., Pharm. Ther. 44:85(1989); White and Olden, Anticancer Res., 10:1515 (1990)))。本発明の組成物及び方法において有用な他のアルカロイドはパクリタキセル(タキソール)、及びその合成誘導体を含むが、これらに限定されない。さらなる薬物成分は、脂質粒子内へ取り込まれることのできる本分野において知られたいずれかの生物活性剤を含むがこれらに限定されない。
本発明の好ましい実施態様は例えば、薬物又は生物活性剤のような他の治療剤をさらに含む。これらのさらなる成分はさらなる直接的な治療的利益又はさらなる免疫刺激性の利益を提供することができる。広く多様な治療化合物が本発明の組成物及び方法によってデリバリーされることができる。治療化合物の例は、核酸、たんぱく質、ペプチド、腫瘍細胞崩壊剤、抗感染剤、抗不安薬、向精神薬、免疫調節剤、イオノトロープ(ionotrope)、ゲロニンのような毒素及び真核生物のたんぱく合成の阻害剤などを含むがこれらに限定されない。本発明のリポソーム中に閉じ込められる好ましい治療化合物は、脂肪親和性の陽イオンである。これらの中には、リポソームの脂質二重層を仕切ることができ、したがって膜の形態のリポソームと結合することのできる脂肪親和性の分子のクラスに属する治療剤がある。治療化合物の更なる例は、プロスタグランジン、アンフォテリシンB、メトトレキセート、シスプラチン及び誘導体、プロゲステロン、テストステロン、エストラジオール、ドキソルビシン、エピルビシン、ベクロメタゾン及びエステル、ビタミンE、コルチゾン、デキサメタゾン及びエステル、ベタメタゾン吉草酸塩及び他のステロイド、フッ化キノロン抗菌剤シプロフロキサシン及びその誘導体、並びにアルカロイド化合物及びそれらの誘導体を含むがこれらに限定されない。アルカロイド誘導体の中には、スワインソニン及びビンカアルカロイドのメンバー並びにビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、エトポシド、エトポシドリン酸塩及びテニポシドのようなそれらの半合成誘導体がある。この群の中では、ビンブラスチン及びビンクリスチン、並びにスワインソニンが特別に好ましい。スワインソニン(Creaven and Mihich, Semin. Oncol. 4:147(1977))は骨髄の増殖を刺激する能力を有する(White and Olden, Cancer Commun. 3:83(1991))。スワインソニンはまた、IL-1、IL-2、TNF、GM-CSF及びインターフェロンを含む複数のサイトカインの産生をも刺激する(Newton, Cancer Commun. 1:373(1989);Olden, K., J. Natl. Cancer Inst., 83:1149(1991))。さらに、スワインソニンがインビトロにおいてB及びT細胞性免疫、ナチュラルキラーT細胞及びマクロファージによって誘導された腫瘍細胞の崩壊を誘導すること、及びインターフェロンと併用された場合には、インビボにおいて結腸癌及びメラノーマ癌に対する抗腫瘍活性を有することが報告された(Dennis, J., Cancer Res, 50:1867(1990; Olden, K., Pharm. Ther. 44:85(1989); White and Olden, Anticancer Res., 10:1515 (1990)))。本発明の組成物及び方法において有用な他のアルカロイドはパクリタキセル(タキソール)、及びその合成誘導体を含むが、これらに限定されない。さらなる薬物成分は、脂質粒子内へ取り込まれることのできる本分野において知られたいずれかの生物活性剤を含むがこれらに限定されない。
これらの追加の薬物成分は、本明細書中に記載されたLNA製剤中に封入されるか又は他の方法でこれに結合されることができる。或いは、本発明の組成物は、脂質−核酸粒子に結合されない薬物又は生物活性剤を含むことができる。そのような薬物又は生物活性剤は別の脂質担体中にあるか又は同時投与されることができる。
粘膜のワクチン成分
本明細書中に記載されるとおり、本発明の改善された粘膜のワクチン組成物は、1以上の標的抗原に結合した本明細書中に記載のLNA製剤を含む。本発明の組成物及び方法中で有用な抗原は、本質的に免疫原性又は非免疫原性であり、或いはわずかに免疫原性であることができる。抗原のさらなる例は、HBA-B型肝炎抗原(組換え又はそれ以外);他の肝炎ペプチド;HIVたんぱく質GP120及びGP160;マイコプラズマ細胞壁脂質;いずれかの腫瘍関連抗原;癌胎児抗原(CEA);腫瘍特異的抗原として発現される他の胎児ペプチド;細菌細胞壁糖脂質;ガングリオシド(GM2、GM3);ミコバクテリウム糖脂質;PGL-1;Ag85B;TBGL;ナイセリア・ゴノロエエ(Neisseria gonorrhoeae)からの淋菌の脂質−オリゴサッカライドエピトープ2C7;ルイス(y);及びグロボ−H;Tn;TF;STn;PorA;TspAまたはウイルス糖脂質/糖たんぱく質および表面たんぱく質を含むがこれらに限定されない。
本明細書中に記載されるとおり、本発明の改善された粘膜のワクチン組成物は、1以上の標的抗原に結合した本明細書中に記載のLNA製剤を含む。本発明の組成物及び方法中で有用な抗原は、本質的に免疫原性又は非免疫原性であり、或いはわずかに免疫原性であることができる。抗原のさらなる例は、HBA-B型肝炎抗原(組換え又はそれ以外);他の肝炎ペプチド;HIVたんぱく質GP120及びGP160;マイコプラズマ細胞壁脂質;いずれかの腫瘍関連抗原;癌胎児抗原(CEA);腫瘍特異的抗原として発現される他の胎児ペプチド;細菌細胞壁糖脂質;ガングリオシド(GM2、GM3);ミコバクテリウム糖脂質;PGL-1;Ag85B;TBGL;ナイセリア・ゴノロエエ(Neisseria gonorrhoeae)からの淋菌の脂質−オリゴサッカライドエピトープ2C7;ルイス(y);及びグロボ−H;Tn;TF;STn;PorA;TspAまたはウイルス糖脂質/糖たんぱく質および表面たんぱく質を含むがこれらに限定されない。
抗原はペプチド抗原の形態であることができ、又は対象における発現に好適かつ免疫化された対象の免疫系への提示に好適な形態で抗原ペプチドをコードする核酸であることができる。抗原はまた、糖脂質又は糖ペプチドであることもできる。さらに、抗原は完全な抗原又は少なくとも1の治療に関係するエピトープを含む、完全な抗原のフラグメントであることもできる。抗原に関して本明細書中で言及される「組み合わせ抗原」は、同じ標的抗原からの複数のエピトープ又は同じ型の標的抗原(例えば、両方の抗原がペプチド又は両方の抗原が糖脂質)又は異なる型の標的抗原(例えば、糖脂質抗原及びペプチド抗原)に由来する2又は3の異なる標的抗原からの複数のエピトープ(ポリトープワクチン)有する抗原を意味する。
本発明のワクチン組成物は、いずれかの知られた投与経路で投与されることができる。好ましくは、本発明の組成物は気管を介して投与、例えば気管内点滴注入法又は鼻腔内吸入される。1の実施態様において、本発明の組成物は筋肉内又は皮下注射によって投与され、この方法では大きなサイズの(150〜300nm)脂質粒子が使用されることができる。結局、高価な排出ステップの必要性が減らされ又は除かれることができ、粒子が循環する必要がないため、より安価な材料に都合のよいように脂質成分を偏って選択することができる。例えば、Chol 量が減少されることができ、DSPCがなんらかのより柔軟なもの(例えば、DOPC又はDMPC)に置換されることができ、そしてPEG−脂質がより安価なPEG−アシル鎖に置換されることができる。
投薬の準備、促進、及び維持のための免疫療法又はワクチン接種プロトコールは本分野において周知であり、以下においてさらに詳細に記載される。
組成物の製造
本発明の組成物の製造はいずれかの技術によって達成されることができるが、最も好ましくはエタノール透析又界面活性剤透析法であって、本明細書中に参考文献として援用される以下の刊行物、特許、及び特許出願中に詳述されている:米国特許第5,705,385;同第5,976,567号;米国特許出願第09/140,476号;米国特許第5,981,501号;同第6,287,591号;PCT国際特許出願公開第WO96/40964号;及び同第WO98/51278号。これらの製造方法は、脂質粒子に封入された治療剤、好ましくは脂質−核酸粒子を含む免疫刺激性化合物の小規模及び大規模の製造を提供する。該方法はまた、優れた薬剤特性を有するそのような粒子を作り出す。
本発明の組成物の製造はいずれかの技術によって達成されることができるが、最も好ましくはエタノール透析又界面活性剤透析法であって、本明細書中に参考文献として援用される以下の刊行物、特許、及び特許出願中に詳述されている:米国特許第5,705,385;同第5,976,567号;米国特許出願第09/140,476号;米国特許第5,981,501号;同第6,287,591号;PCT国際特許出願公開第WO96/40964号;及び同第WO98/51278号。これらの製造方法は、脂質粒子に封入された治療剤、好ましくは脂質−核酸粒子を含む免疫刺激性化合物の小規模及び大規模の製造を提供する。該方法はまた、優れた薬剤特性を有するそのような粒子を作り出す。
本発明のワクチン組成物は(それに対する免疫応答が望まれる)標的抗原を加えることによって調製されることができる。抗原の混和手段は本分野において周知であり、例えば以下のステップ:1)製剤プロセス中における抗原の受動的封入(例えば、抗原はODNを含有する溶液中に添加されることができる);2)本明細書中で記載されるエタノールに基づくプロトコールによって製剤されたエタノール脂質混合物中への糖脂質及び他の抗原性脂質の添加;3)脂質ビヒクル中への挿入(例えば、抗原−脂質は形成された脂質ビヒクル中へビヒクルと抗原−脂質ミセルをインキュベートすることによって添加されることができる);4)抗原は製剤後に添加されることができる(例えば、リンカー部分を有する脂質が製剤された粒子中に含まれ、そして製剤後に望ましい抗原と結合するためにリンカーが活性化される)を含む。標準的結合及び架橋方法は本分野において周知である。他の調製法では核酸を含まない脂質粒子中へ抗原を混和し、これらの粒子は対象への投与の前に脂質−核酸粒子と混合される。
本発明の方法中で使用される組成物の特徴付け
本発明の方法中で使用される組成物の好ましい特徴は以下のとおりである。
本発明の方法中で使用される組成物の好ましい特徴は以下のとおりである。
本発明の脂質−核酸粒子は、内部空間を完全に封入する脂質膜の(一般的にはりん脂質二重層)外側部分を含む。時には本明細書中で脂質膜ビヒクルと呼ばれるこれらの粒子は、平均直径50〜200nm、好ましくは60〜130nmの小粒子である。静脈内投与に最も好ましいのは、粒子の95%が平均で30nm以内である、比較的均一なサイズの粒子である。核酸及び他の生物活性剤は内部空間に含まれ、又は封入している膜の内部表面に結合している。
本明細書中で使用される「完全に封入された」とは、粒子を血清又は遊離のDNAを顕著に分解するヌクレアーゼアッセイに露出した後に、粒子内の核酸が顕著に分解されていないということを意味する。完全に封入された系においては、普通は遊離の核酸の100%を分解する処置において、好ましくは25%未満の核酸粒子が分解され、より好ましくは10%未満、最も好ましくは5%未満の核酸粒子が分解される。或いは、完全な封入はOligreen(商標)アッセイによって決定されることができる。完全に封入とは、粒子が血清に対して安定である、すなわちそれらがインビボの投与において急速にそれらの成分部分に分解しないということも示唆する。
本発明の組成物のこれらの特徴は本発明の重要な粒子をDOTMA/DOPE(リポフェクチン(LIPOFECTIN)(商標))製剤のような(陽イオン性複合体又はリポプレキシスとしても知られる)脂質−核酸凝集物から識別する。これらの凝集物は一般的には直径がもっと大きく(250nmより大きい)、ヌクレアーゼ消化に完全には耐えられず、一般的にインビボ投与によって分解する。上記の陽イオン性の脂質−核酸凝集物と弱い抗原との製剤は、筋肉内、腹腔内及びくも膜下投与、より好ましくは鼻腔内投与のような局所的な適用に好適なワクチンを提供することができる。
本発明の粒子は広い範囲の薬物:脂質比率で製剤されることができる。本明細書中で使用される「薬物対脂質の比率」は、定義された調製物の容量中の治療的な核酸の量(すなわち、封入され、血液への露出によって急速に分解されない核酸の量)÷同容量中の脂質量を意味する。これはモル/モル又は重量/重量、或いは重量/モルに基づいて決定される。薬物の脂質に対する比率は、核酸の所定の用量に結合する脂質用量を決定することができる。好ましい実施態様において、本発明の組成物は約0.01〜0.25(重量/重量)の範囲の薬物:脂質比率を有する。
本発明の組成物及び方法の使用
本発明は免疫刺激性の組成物及びそのような組成物を哺乳動物における免疫応答を刺激するために使用する方法を提供する。特別には、本発明は免疫刺激性の脂質−核酸(「LNA」)製剤及びそのような製剤を哺乳動物の免疫応答、特別には粘膜の免疫応答を刺激するために使用する方法を提供する。本発明はさらに、抗原を含むLNA製剤及び哺乳動物において標的抗原または病原体に対する粘膜の免疫応答を刺激するためにそのような製剤を使用する方法を提供する。本発明のLNA製剤はさらに、患者における病気又は障害の治療に有用な追加の治療剤を含むことができる。
本発明は免疫刺激性の組成物及びそのような組成物を哺乳動物における免疫応答を刺激するために使用する方法を提供する。特別には、本発明は免疫刺激性の脂質−核酸(「LNA」)製剤及びそのような製剤を哺乳動物の免疫応答、特別には粘膜の免疫応答を刺激するために使用する方法を提供する。本発明はさらに、抗原を含むLNA製剤及び哺乳動物において標的抗原または病原体に対する粘膜の免疫応答を刺激するためにそのような製剤を使用する方法を提供する。本発明のLNA製剤はさらに、患者における病気又は障害の治療に有用な追加の治療剤を含むことができる。
好ましい実施態様において、本発明のワクチン組成物は病原体にたいする免疫応答を刺激する。そのような病原体の例は、HIV、HPV、HSV−1、HSV-2、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhea)、クラミジア(Chlamydia)、及びトレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)であるがこれらに限定されない。そのような病原体は、抗原又は本発明の方法中で使用される抗原をコードするDNAを提供する。したがって、本発明における使用に好適な追加の抗原は、中でもHPVのL1タンパク質、HPVのL2タンパク質、HPVのE6タンパク質、HPVのE7タンパク質、HIVのgp41タンパク質、HIVのgagタンパク質、HIVのtetタンパク質、及びHIVのgp120糖タンパク質であるが。これらに限定されない。本発明のそのようなワクチン及びワクチンプロトコールが有用である他の病原体は、トリコモニアシス(trichomoniasis)、カンジダ(candidiasis)、肝炎(hepatitis)、疥癬及び梅毒を引き起こす病原体を含むが、これらに限定されない。さらに、粘膜を介して侵入する病原体は、呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザ、他の呼吸器上部の状態、並びに腸の感染の原因であるものを含むがこれらに限定されない。本明細書中に提供される粘膜の免疫の刺激方法は粘膜の免疫がそれに対して有効ないずれかの病原体に対するワクチン又はワクチンプロトコールに容易に適用可能である。さらには、本発明は、それに対して粘膜の免疫が望まれる、広範囲のヒト病原体に由来する抗原の発現を包含する。したがって、本発明は特別な抗原と同一のものに限定されない。
上記のように、免疫応答の刺激は介入に対する免疫系の細胞又は成分の直接的又は間接的応答として広く特徴付けられることができる。これらの応答は、免疫系の細胞(例えば、B細胞、T細胞、樹状細胞、APCs、マクロファージ、NK細胞、NKT細胞など)の活性化、増殖、又は分化;アップレギュレーション又はダウンレギュレーションされたマーカーの発現;サイトカイン;インターフェロン;IgA、IgM、又はIgG力価の刺激;(脾臓細胞の増加を含む)脾腫;多様な器官におけるzncの過形成及び細胞浸潤混合物を含む多くの方法で測定されることができる。免疫刺激に関して評価可能な免疫系の他の応答、細胞及び成分は本分野において知られている。さらに、刺激又は応答は免疫系の生得的な細胞又は免疫系の獲得性の細胞について行われることができる(例えば、通常は弱い抗原を含むワクチンによって)。
好ましい実施態様において、本発明の組成物及び方法はサイトカインレベルを調節するのに使用されることができる。本明細書中でサイトカインに関して使用される「調節」は、低レベルが望まれる場合には特別なサイトカインの発現の抑制、より高いレベルが望まれる場合には特別なサイトカインの発現の増強を意味する。特別なサイトカインの調節は、局所的又は全身的に起こることができる。好ましい実施態様において、本発明の組成物及び方法は、サイトカインを分泌するマクロファージ及び樹状細胞を活性化するために使用されることができる。サイトカインプロフィールが免疫応答におけるT細胞制御機能及びエフェクター機能を決定することは知られている。一般的には、Th-1型サイトカインは誘導されることができ、したがって本発明の免疫応答性の組成物が、細胞障害性T細胞を含むTh-1型抗原特異的な免疫応答を促進することができる。
サイトカインはまた、T細胞応答を導く役割を果たす。ヘルパー(CD4+)T細胞は、B細胞及びT細胞を含む免疫系の他の細胞に作用する可溶性の因子の産生を通して、哺乳動物の免疫応答を調整する。ほとんどの成熟CD4.sup.+ヘルパーT細胞は以下の2のサイトカインプロフィールのうちの1を発現することができる:Th1又はTh2。Th1細胞はIL-2、IL-3、IFN-γ、GM-CSF、及び高レベルのTNF-αを分泌し、Th2細胞はIL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、GM-CSF及び低レベルのTNF-αを分泌することができる。Th1サブセットは、細胞性免疫及びマウスにおいてIgG2aにスイッチするイムノグロブリンクラスに特徴を有する体液性免疫の両方を促進する。Th1応答はまた、遅延型過敏症及び自己免疫疾患に関連している。Th2サブセットはおもに体液性免疫を誘導し、IgG1及びIgEへのクラススイッチを誘導する。Th1応答に関連する抗体アイソタイプは、Th2応答に関連するものがよりアレルギー反応に関連するにもかかわらず、一般的に良好な中和及びオプソニン効果を有する。
いくつかの因子がTh1又はTh2プロフィールに由来する影響を示した。最も特徴づけされた制御因子はサイトカインである。IL-12及びIFN-γはTh1の正の制御因子、Th2の負の制御因子である。IL-12はIFN-γ産生を促進し、IFN-γはIL-12に正のフィードバックを提供する。IL-4及びIL-10はTh2サイトカインプロフィールの確立に必要であり、Th1サイトカイン産生をダウンレギュレートすることが明らかであり;IL4の効果はいくつかの場合においてIL-12の効果に比べて優勢である。IL-13は、LPS誘導された単球によってIL-4に類似の方法でIL-12及びTNF-αを含む炎症性サイトカインの発現を阻害することが示された。IL-12p40ホモダイマーはIL-12受容体に結合し、IL-12の生理活性に拮抗し;したがって、いくつかの動物においてIL-12のプロTh1効果をブロックする。
好ましい実施態様において、本発明の方法は、対象に本発明の免疫刺激性の組成物の有効量を投与することによって対象におけるTヘルパー1細胞(「Th1」)免疫応答を刺激することを含む。好ましくは免疫刺激性の組成物はODNを含むLNA製剤である。好ましい実施態様において、本発明の方法は、対象に本発明の免疫刺激性の組成物の有効量を投与することによって対象におけるTヘルパー2細胞(「Th2」)免疫応答を刺激することを含む。好ましくは免疫刺激性の組成物はODNを含むLNA製剤である。上記のように、Th2プロフィールはIL-4およびIL-10の産生に特徴を有する。Th2又は弱いTh1応答を誘導する非核酸アジュバントはアルム(alum)、サポニン、水中の油及び他のエマルジョン製剤並びにSB-As4を含むがこれらに限定されない。Th1応答を誘導するアジュバントはMPL、MDP、ISCOMS、IL-12、IFN-γ及びSB-AS2を含むがこれらに限定されない。
抗原は本発明の組成物及び方法中で、粗製の、精製された、合成の、単離された、又は組換え形態で使用されることができる。(例えば、ポリサッカライドのペプチド擬態である抗原を含む)核酸によってコードされたポリペプチド又はペプチド抗原もまた、本発明の組成物及び方法において使用されることができる。抗原という用語は、宿主の免疫系によって外来であると認識されるいずれかの型の分子を広く含む。抗原は、癌抗原、微生物抗原、及びアレルゲンを含むがこれらに限定されない。
本明細書中において「癌抗原」は、MHC分子との関係で抗原提示細胞の表面上に提示された場合に免疫応答を引き起こすことのできる、腫瘍又は癌細胞表面に結合した化合物(例えばペプチド)を意味する。癌抗原は本分野において知られた方法で調製されることができる。例えば、癌抗原は癌細胞の粗抽出物を調製すること(例えば、Cohen, et al., 1994, Cancer Research, 54:1055に記載されたように)、抗原を部分的に精製すること、又は知られた抗原のデノボ合成によって癌細胞から調製されることができる。癌抗原の例は、腫瘍又は癌全体の免疫原性の部分である抗原を含むがこれに限定されない。そのような抗原は単離され、組換えにより又は本分野において知られたいずれかの他の方法によって調製されることができる。
本明細書中で使用される「微生物抗原」は、微生物の抗原及び感染性ウイルス、感染性細菌、感染性寄生生物及び感染性のカビを含むがこれらに限定されない。微生物抗原の例は、完全な微生物、及びそれらの天然の単離物、フラグメント、又は誘導体、天然の微生物抗原と同一又はこれに類似の合成化合物を含むがこれらに限定されるものではなく、好ましくは(天然の微生物抗原がそれに由来する)対応する微生物に特異的な免疫応答を誘導する。好ましい実施態様において、ある化合物が(体液性及び/又は細胞性の)免疫応答を天然の微生物抗原に対して誘導した場合、それは天然の微生物抗原に類似している。天然の微生物抗原に類似する化合物又は抗原は当業者に周知である。天然の微生物抗原に類似する化合物の制限のない例はポリサッカライド抗原のペプチド擬態である。
病原体の例は、哺乳動物、より特別にはヒトに感染する感染性のウイルスを含むがこれに限定されない。感染性のウイルスの例は以下の:レトロウイルス(例えば、HIV-1(HTLV-III、LAV又はHTLV-III/LAV又はHIV-IIIとも呼ばれる)のようなヒト免疫不全症ウイルス;及びHIV-LPのような他の単離物;ピコルナウイルス(例えば、ポリオウイルス、A型肝炎ウイルス;エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス);カルシウイルス属(例えば、胃腸炎を引き起こす株);トガウイルス属(例えば、ウマの脳炎ウイルス、ルベラウイルス);フラウイルス属(例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス);コロノウイルス属(例えば、コロナウイルス);ラブドウイルス属(例えば、水泡性口炎ウイルス、ラビスウイルス(rabies viruses))コロナウイルス属(例えば、コロナウイルス);フィロウイルス属(例えば、エボラウイルス);パラミクソウイルス属(例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、はしかウイルス、呼吸器合胞体ウイルス);オルトミクソウイルス属(例えば、インフルエンザウイルス);ブンガウイルス属(例えば、ハンタウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルス及びナイロウイルス);アレナウイルス属(出血熱ウイルス);レオウイルス属(例えば、レオウイルス、オルビウイルス及びロタウイルス);ビルナウイルス属(Birnaviridae);ヘパドナウイルス属(B型肝炎ウイルス);パルボウイルス属(パルボウイルス);パポバウイルス属(パピローマウイルス、ポリオーマウイルス);アデノウイルス属(ほとんどのアデノウイルス);ヘルペスウイルス属(単純ヘルペスウイルス(HSV)1及び2、バリセラゾスターウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、ヘルペスウイルス);ポックスウイルス属(バリオラウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス);及びイリドウイルス属(例えば、アフリカブタ熱ウイルス);並びに分類されないウイルス(例えば、海綿状脳症の病因作用物質、デルタ肝炎の作用物質(B型肝炎ウイルスの欠損サテライトと考えられている)、非A型及び非B型肝炎の作用物質(クラス1は内部へ伝達され;クラス2は透過性に伝達される(すなわち、C型肝炎);ノーウオーク及び関連するウイルス、及びアストロウイルス)を含むが、これらに限定されない。
グラム陰性及びグラム陽性細菌もまた、脊椎動物において抗原となる。そのようなグラム陽性細菌は、パスツレラ種、スタフィロコッシ種、及びストレプトコッカス種を含むが、これらに限定されない。グラム陰性細菌は、大腸菌、シュードモナス種及びサルモネラ種を含むがこれらに限定されない。感染性の細菌の特異的な例は、ヘリコバクターピロリ、ボレリアブルグドフェリ、レジオネラ・ニューモフィラ、マイコバクテリア種(例えば、M.ツベルクローシス、M.アビウム、M.イントラセルラーレ、M.カンサイ、M.ゴロドナエ)、スタフィロコッカス・アウレウス、ナイセリア・ゴロノエエ、ナイセリア・メニンギチジス、リステリア・モノサイトゲンス、ストレプトコッカス・ピオゲネス(ストレプトコッカスA群)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(ストレプトコッカスB群)、ストレプトコッカス(ビリダンス群)、ストレプトコッカスフェーカリス、ストレプトコッカス・ボビス、ストレプトコッカス(嫌気性種)、ストレプトコッカス・ニューモニエ、病原性カンピロバクター種、エンテロコッカス種、ヘモフィラス・インフルエンゼ、バシラス・アントラシス、コリネバクテリウム・ジフテリエ、コリネバクテリウム種、丹毒菌、クロストリジウム・パーフリンジェス、クロストリジウム・テタニ、エンテロバクター・アエロゲンス、クレブシエラ・ニューモニエ、パスツレラ・マルトシダ、バクテロイデス種、フソバクテリウム・ヌクレアタム、ストレプトバシラス・モニリフォルミス、トレポネーマ・パリジウム、トレポネーマ・パーテニュエ、レプトスピラ、リケッチア、及びアクチノミセス・イスラエリを含むが、これらに限定されない。
病原体の例は、哺乳動物、より特別にはヒトに感染する感染性のカビを含むが、これに限定されない。感染性のカビの例は以下の:クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラズマ・カプスラタム、コッシジオイデス・イミティス、ブラストミセス・デルマチチジス、クラミジア・トラコマティス、カンジダ・アルビカンスを含むがこれらに限定されない。感染性の寄生生物はプラスモジウム・ファルシパラム、プラスモジウム・マラリエ、プラスモジウム・オバレ、及びプラスモジウム・ビバックスのようなプラスモジウムを含む。他の感染性生物は(すなわち、原生生物)はトキソプラズマ・ゴンジイを含む。
他の医学に関連する、哺乳動物、より特別にはヒトにおいて抗原となる微生物は以下の文献中で広く記載される。:例えば、その内容すべてが本明細書中に参考文献として援用される、C.G.A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983を参照のこと。感染性のヒトの病気の治療に加えて、本発明の組成物及び方法は、非ヒト哺乳動物の感染の治療に有効である。
好ましい実施態様において、本明細書中で感染性の病原体について使用される「治療」「治療する」「治療すること」は、対象の病原体による感染への耐性を増加させ、又は対象が病原体に感染する可能性を減少させ;及び/又は対象が感染した後に感染と戦うために、例えば、感染を減少又は除去し、又はより悪化することを防止する予防的治療を意味する。非ヒト哺乳動物の治療のためのワクチンが以下の:Bennett, K. Compendium of Veterinary Products 3rd ed. North American Compendiums, Inc., 1995に開示されている。上で検討したとおり、抗原は、ウイルス、細菌、寄生生物、及びカビ及び自然の供給源または合成によって誘導されたそれらのフラグメントのような感染性の微生物を含む。ヒト及び非ヒト哺乳動物の両方の感染性のウイルスはレトロウイルス、RNAウイルス、及びDNAウイルスを含む。レトロウイルスのこの群は、単純レトロウイルス、及び複合レトロウイルスの両方を含む。単純レトロウイルスはレトロウイルスB型、レトロウイルスC型、及びレトロウイルスD型の亜群を含む。レトロウイルスB型の例は、マウス乳癌ウイルス(「MMTV」)である。レトロウイルスC型は(ラウス・サルコーマウイルス(「RSV」)、鳥白血病ウイルス(「ALV」)、及び鳥ミエロブラストーマウイルス(「AMV」)を含むA群C型、及び(マウス白血病ウイルス(「MLV」)、ネコ白血病ウイルス(「FeLV」)、マウスサルコーマウイルス、(「MSV」)、ギボンサル白血病ウイルス(「GALV」)、ブタネクローシスウイルス(「SNV」)、レティキュロエンドセリオシス・ウイルス(「RV」)およびシミアンサルコーマウイルス(「SSV」))を含むB群C型を含む。レトロウイルスD型は、Mason-Pfizerサルウイルス(「MPMV」)、及びシミアンレトロウイルス1型(「SRV-1」)を含む。複合レトロウイルスは、レンチウイルスの亜群、T細胞白血病ウイルス及び泡沫状ウイルスを含む。レンチウイルスは、HIV-1を含むが、HIV-2、SIV、ビスナウイルス、ネコ免疫不全ウイルス(「FIV」)、及びウマ感染性アネミアウイルス(「EIAV」)をも含む。T細胞白血病ウイルスは、HTLV-I、HTLV-II、シミアンT細胞白血病ウイルス(「STLV」)及びウシ白血病ウイルス(「BLV」)を含む。泡沫状ウイルスは、ヒト泡沫状ウイルス(「HFV」)、シミアン泡沫状ウイルス(「SFV」)及びウシ泡沫状ウイルス(「BFV」)を含む。
脊椎動物における抗原である他のRNAウイルスは、以下の:オルトレオウイルス属(哺乳動物及びトリレトロウイルスの両方の複数の血清型)を含むレオウイルス属のメンバー、オルビウイルス属(ブルートングウイルス、ユージナンギーウイルス、ケメロボウイルス、アフリカウマ病ウイルス、及びコロラドチック熱ウイルス)、ロタウイルス属(ヒトロタウイルス、ネブラスカウシ下痢ウイルス、マウスロタウイルス、シミアンロタウイルス、ウシ又はヒツジロタウイルス、トリロタウイルス);エンテロウイルス属(ポリオウイルス、コクサッキーウイルスA及びB、腸管細胞変性ヒトオーファン(「ECHO」)ウイルス、A型肝炎ウイルス、シミアンエンテロウイルス、マウス脳脊髄炎(「ME」)ウイルス、ポリオウイルス・ムリス、ウシエンテロウイルス、ブタエンテロウイルス)を含むピコルナウイルス属、カルジオウイルス属(脳心筋炎ウイルス(「EMC」)、メンゴウイルス)、リノウイルス属(少なくとも113の亜型を含むヒトリノウイルス;他のリノウイルス)、アプトウイルス(***(「FMDV」);ブタ小水泡性発疹ウイルス、サンミグエルアシカウイルス、ネコピコルナウイルス及びノーウオークウイルスを含むカルシウイルス属;アルファウイルス(イースタンウマ脳脊髄炎ウイルス、セムリキフォレストウイルス、シンドビスウイルス、チクングニャウイルス、オニョングーニョングウイルス、ロスリバーウイルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス、ウエスタンウマ脳脊髄炎ウイルス)を含むトガウイルス属、フラビウイルス属(モスキートボーン黄熱病ウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マレーバレー脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、クンジンウイルス、中央ヨーロッパチックボーンウイルス、極東チックボーンウイルス、キャサヌアフォレストウイルス、ループリングIIIウイルス、ポワサンウイルス、オムスク出血熱ウイルス)、ルビウイルス(ルベラウイルス)、ペスチウイルス属(粘膜病ウイルス、ホッグコレラウイルス、ボーダー病ウイルス);バンヤウイルス属(バンヤムウェラ及び関連ウイルス、カリフォルニア脳炎群ウイルス)、フレボウイルス属(サンドフライ熱シシリアンウイルス、リフトバレー熱ウイルス)、ナイロウイルス属(クリミアン−コンゴ出血熱ウイルス、ナイロビヒツジ病ウイルス)、及びウウクウイルス属(Uukuvirus)(ウウクニエミ(Uukuniemi)及び関連ウイルス);インフルエンザウイルス属(インフルエンザウイルスA型、多くのヒトサブタイプ);ブタインフルエンザウイルス、及びトリ及びウマインフルエンザウイルス;インフルエンザB型(多くのヒトサブタイプ)及びインフルエンザC型(可能性のある別の属)を含むオルトミクソウイルス属ファミリー;パラミクソウイルス属(パラインフルエンザウイルス1型、センダイウイルス、血球吸着ウイルス、パラインフルエンザウイルス2型〜5型、ニューカッスル病ウイルス、ムンプスウイルス)を含むパラミクロウイルス属ファミリー、麻しんウイルス属(はしかウイルス、亜急性硬化性全脳炎ウイルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス)、ニューモウイルス属(呼吸器合胞体ウイルス(「RSV」)、ウシ呼吸器合胞体ウイルス及びマウスのニューモニアウイルス);フォレストウイルス、シンドビスウイルス、チクングニャウイルス、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、フラビウイルス属(モスキートボーン黄熱病ウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マレーバレー脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、クンジンウイルス、中央ヨーロッパチックボーンウイルス、極東チックボーンウイルス、キャサヌアフォレストウイルス、ルーピングIIIウイルス、ポワサンウイルス、オムスク出血熱ウイルス)、ルビウイルス属(ルベラウイルス)、ペスチウイルス属(粘膜病ウイルス、ホッグコレラウイルス、ボーダー病ウイルス);バンヤウイルス属(バンヤムウェラ及び関連ウイルス、カリフォルニア脳炎群ウイルス)を含むバンヤウイルスファミリー、フレボウイルス属(サンドフライ熱シシリアンウイルス、リフトバレー熱ウイルス)、ナイロビウイルス属(クリミアン−コンゴ出血熱ウイルス、ナイロビヒツジ病ウイルス)、及びウウクーウイルス属(ウウクニエミ及び関連ウイルス);インフルエンザウイルス(インフルエンザウイルスA型、多くのヒトサブタイプ)を含むオルトミクソウイルス属ファミリー;ブタインフルエンザウイルス、及びトリ及びウマインフルエンザウイルス;インフルエンザB型(多くのヒトサブタイプ)及びインフルエンザC型(可能性のある別の属);パラミクソウイルス属(パラインフルエンザウイルス1型、センダイウイルス、血球吸着ウイルス、パラインフルエンザウイルス2型〜5型、ニューカッスル病ウイルス、ムンプスウイルス)を含むパラミクロウイルス属ファミリー、麻しんウイルス属(はしかウイルス、亜急性硬化性全脳炎ウイルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス)、ニューモウイルス属(呼吸器合胞体ウイルス(「RSV」)、ウシ呼吸器合胞体ウイルス及びマウスのニューモニアウイルス);ベシクロウイルス属(「VSV」)、チャンジプラウイルス(Chandipura virus)、フランダース−ハートパークウイルスを含むラブドウイルスファミリー、リサウイルス(ラビスウイルス)、魚ラブドウイルス、及び2の可能性のあるラブドウイルス(マルブルグウイルス及びエボラウイルス);リンパ細胞性コリオメニンギチスウイルス(「LCM」)、タカリベウイルス、(「IBV」)、マウス肝炎ウイルス、ヒト腸管コロナウイルス、及びネコ感染性腹膜炎(ネココロナウイルス)を含むアレナウイルスファミリーを含むがこれらに限定されない。
脊椎動物の抗原である例示的なDNAウイルスは、以下の:オルトポックスウイルス属(バリオラメジャー、バリオラマイナー、サルポックスワクシニア、ウシポックス、バッファローポックス、ウサギポックス、エクトロメリア)を含むポックスウイルス属、レポリポックスウイルス属(ミキソーマ、フィブローマ)、アビポックスウイルス属(ニワトリポックス、他のトリポックスウイルス)、カプリポックスウイルス属(ヒツジポックス、ヤギポックス)、スイポックスウイルス属(ブタポックス)、パラポックスウイルス属(伝染性***性皮膚炎ウイルス、シュードウシポックス、ウシ丘疹性胃炎ウイルス);イリドウイルスファミリー(アフリカブタ熱ウイルス、カエルウイルス2及び3、魚のリンパ嚢腫ウイルス);α―ヘルペスウイルス(単純ヘルペス1型及び2型、バリセラーゾスター、ウマ流産ウイルス、ウマヘルペスウイルス2型及び3型、シュードラビスウイルス、感染性ウシ角結膜炎ウイルス、感染性ウシ鼻気管炎ウイルス、ネコ鼻気管炎ウイルス、感染性咽頭気管炎ウイルス)を含むヘルペスウイルス属ファミリー、ベータヘルペスウイルス(ヒトサイトメガロウイルス、及びブタ、サル及びげっ歯類のサイトメガロウイルス);ガンマ‐ヘルペスウイルス(エプシュタイン‐バールウイルス(「EBV」)、マレック病ウイルス、ヘルペスサイミリ、ペルペスウイルスアテレス、ヘルペスウイルスシルビラガス、モルモットヘルペスウイルス、リュッケ腫瘍ウイルス);マスタデノウイルス(ヒトA、B、C、D、E亜群及び群わけされないもの;シミアンアデノウイルス(少なくとも23血清型)、感染性のイヌ肝炎、及びウシ、ブタ、ヒツジ、カエル及び他の多くの種のアデノウイルス、アビアデノウイルス属(トリアデノウイルス);及び培養不能のアデノウイルス)を含むアデノウイルス属ファミリー;パピローマウイルス属(ヒトパピローマウイルス、ウシパピローマウイルス、ショープウサギパピローマウイルス及び他の種の多様なパピローマウイルス)を含む、パポウイルス属ファミリー、ポリオーマウイルス属(ポリオーマウイルス、シミアン空胞化剤(SV-40)、ウサギ空胞化剤(「RKV」)、Kウイルス、BKウイルス、JCウイルス及びリンパ栄養性パピローマウイルスのような他の原始的なポリオーマウイルス);アデノ関連ウイルス、パルボウイルス属(ネコ汎白血球減少症ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、アリューシアンミンク病ウイルス)を含むパルボウイルス属ファミリーを含むがこれらに限定されない。最後に、DNAウイルスはクールー及びクロイツフェルトヤコブ病ウイルス及び慢性的な感染性の神経学的作用物質(CHINAウイルス)のようなファミリーに当てはまるウイルスを含むことができる。
哺乳動物において抗原特異的免疫応答を刺激するための核酸及び非核酸アジュバントの使用に加えて、好ましい実施態様の方法が、他の脊椎動物、例えば雌鳥、鶏、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ウズラ、及びキジのようなトリの治療に特に良好に好適である。トリは感染性病原体の多くの型の主要な標的である。
ニワトリにおいてよくある感染の例は、ニワトリ感染性貧血ウイルス(「CIAV」)である。CIAVは、1979年に日本においてマレック病ワクチン接種の中断中に初めて単離された(Yuasa et al., 1979, Avian Dis. 23:366-385)。その時から、CIAVは家禽を生産するすべての主要な国において商業的な家禽に検出されている(van Bulow et al., 1991, pp.690-699)in Diseases of Poultry, 9th edition, Iowa State University Press)。
CIAV感染は若い感受性のあるニワトリにおける貧血、出血及び免疫抑制を特徴とする臨床疾患を引き起こす。胸腺及び骨髄の萎縮並びにCIAV感染ニワトリに一貫した病変もまた、CIAV感染の特徴である。胸腺中、及び場合によってはファブリキウス嚢中のリンパ細胞の枯渇は免疫抑制及び病気の過程を複雑にする二次的なウイルス、細菌又はカビによる感染の可能性の増加を引き起こす。免疫抑制は1以上のマレック病ウイルス(「MDV」)、感染性嚢疾患ウイルス、細網組織症ウイルス、アデノウイルス、又はレオウイルスの感染後に、病気をさらに悪化させることができる。MDVの病原はCIAVによって増強されることが報告された(DeBoer et al., 1989, p.28 In Proceedings of the 38 th Western Poultry Diseases Conference, Tempe, Ariz.)。さらに、CIAVが感染性嚢疾患の症状を悪化されることが報告された(Rosenberger et al., 1989, Avian Dis. 33:707-713)。実験的に誘発したCIAVによる病気に対してニワトリが年齢による耐性を発生させる、それは基本的に2週齢で完成するが、より高齢のトリはなお感染を受け易い(上記のYuasa, N. et al., 1979 ;Yuasa, N. et al., Avian Diseases 24 202-209,1980)。しかしながら、ニワトリがCIAV及び免疫抑制剤(IBDV、MDV等)で二重に感染させられた場合、年齢による病気への耐性は遅延する(上記のYuasa, N. et al., 1979及び1980;Bulow von V. et al., J. Veterinary Medicine 33, 93-116, 1986)。病気の伝播を強めるCIAVの特徴は、例えば環境による不活性化及びいくつかの普通の殺菌消毒薬への高い抵抗性を含む。
他の脊椎動物と同様にトリへのワクチン接種はいかなる年齢においても実施することができる。ワクチン接種は通常、生菌については12週齢までに、そして不活化された微生物又は他の型のワクチンについては14〜18週の間に実施される。卵へのワクチン接種については、ワクチン接種は胚発生の最後の4分の1の間に実施されることができる。ワクチンは皮下に、スプレーによって、経口で、眼内に、気管内に、鼻腔内に、卵内に又は本明細書中に記載の他の方法によって投与されることができる。したがって、本発明の組成物は、トリ及び他の非ヒト脊椎動物へ日常のワクチン接種スケジュールによって投与されることができ、抗原は本明細書中に記載の適切な期間の後に投与されることができる。
家畜もまた感染を受け易い。これらの動物、特に中でもウシに感染する病気は重大な経済損失を生じさせる。本発明の方法は、例えばウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、及びヤギのような家畜を感染から防御することができる。本発明の組成物はまた、長期に持続する抗原特異的な防御のために抗原とともに、又は船積熱を含む広く多様な病気に対する短期の防御のために抗原を伴わずに投与されることができる。
ウシは例えば、ウシウイルスに感染することができる。ウシウイルス性下痢ウイルス(「BVDV」)はエンベロープを有する小さな正のストランドのRNAウイルスであって、ホッグコレラウイルス(「HOCV」)及びヒツジボーダー病(「BDV」)とともペスチウイルス属に分類される。しかしながら、ペスチウイルスは以前はトガウイルス属ファミリーに分類されており、いくつかの研究はそれらをフラビウイルス及びC型肝炎ウイルス(「HCV」)群とともにフラビウイルス属ファミリーに再分類することを提案している(Francki et al., 1991)。
ウシの重要な病原体であるBVDVは、細胞培養分析に基づいて細胞変性(「CP」)及び非細胞変性(「NCP」)生物型に識別されることができる。妊娠した雌牛がNCP株に感染した場合、その雌牛は一貫してその生存期間中にウイルスを伝播する、感染した、特別には免疫寛容の子牛を生むことができる。一貫して感染した家畜は粘膜の病気で死に、どちらの生物型もその後動物から単離されることができる。臨床的に現れるものは流産、奇形発生及び呼吸器の問題、粘膜の病気及び弱い下痢を含むことができる。さらに、群れの伝染に関連した重篤な血小板減少症は動物を死に至らしめることが記載されており、この病気に関連した株は従来のBVDVよりもより有毒であると見られる。
ウマヘルペスウイルス(「EHV」)は準臨床的なものから致死的な病気までの範囲の多様な感染をウマにもたらす、血管形成において特徴的な生物学的作用物質の群を含む。これらはウマにおける偏在的な病原体であるウマヘルペスウイルス‐1(「EHV-1」)を含む。EHV-1は流産、気管の病気及び中枢神経系の障害を流行させる。若い馬の気管上部への最初の感染は8から10日続く熱病を起こす。免疫化されている雌馬は病気が現れることなく気管を介して再感染し、普通は前触れもなく流産が起こる。神経症は呼吸器疾患又は流産と関連しており、いずれの性別のいずれの年齢の動物にも起こり、共調不能、虚弱、及び下肢完全麻痺に至る(Telford, E. A. R. et al., Virology 189, 304-316,1992)。他のEHVはEHV-2又はウマサイトメガロウイルス、EHV-3、ウマ皮質発疹ウイルス、及び以前にはEHV-1サブタイプ2として分類されたEHV−4を含む。
ヒツジ及びヤギはビスナ−マエディ(visna-maedi)を含む多様な危険な微生物に感染することができる。
サル、類人猿、及びマカクのような霊長類はシミアン免疫不全ウイルス(「SIV」)に感染することができる。SIVに感染した霊長類はいくつかのワクチンに応答性であることが知られている(Stott et al. (1990) Lancet 36:1538-1541; Desrosiers et al. PNAS USA(1989) 86:6353-6357; Murphey-Corb et al. (1989) Science 246:1293-1297; Carlson et al.(1990) AIDS Res. Human Retroviruses 6: 1239-1246; Berman et al. (1990) Nature 345:622-625)。
飼いネコ及び野生のネコは両方とも多様な微生物に感染し易い。例えば、ネコ感染性腹膜炎は、ライオン、レパード、チータ及びジャガーのような飼いネコ及び野生のネコのどちらにも起こる病気である。このそして他の型の病原体のネコへの感染を防ぐことが望ましい場合、本発明の方法はネコにワクチン接種し、感染から防御するのに使用されることができる。
飼いネコは、ネコ白血病ウイルス(FeLV)、ネコサルコーマウイルス(FeSV)、内因性C型オンコルナウイルス(RD-114)、及びネコシンチア形成ウイルス(FeSFV)のようなしかしこれらに限定されないくつかのレトロウイルスに感染することができる。これらの中で、FeLVが最も重要な病原体であり、リンパ細網及び骨髄の腫瘍、貧血、免疫を介した障害、及びヒト後天性免疫不全症候群(AIDS)に似た免疫不全症候群を含む、多様な症状をもたらす。最近、FeLV-AIDSと名づけられた特別な複製不全FeLV突然変異体は、より特異的に免疫抑制的性質を関連している。
(ネコ免疫不全とも呼ばれる)ネコT-リンパ趨向性レンチウイルスの発見は最初にPedersen et al. (1987) Science 235:790-793により報告された。FIVの特徴は、Yamamoto et al. (1988) Leukemia, December Supplement 2:204S-215S; Yamamoto et al. (1988) Am. J. Vet. Res. 49:1246-1258;及びAcky et al.(1990) J. Virol. 64:5652-5655において報告された。FIVのクローニング及び配列解析はOlmsted et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2448-2452及び86:4355-4360中で報告された。
ネコ感染性腹膜炎(FIP)は飼いならされた及び野生のネコ属の両方に突然おこる散発性の病気である。FIPが主に飼いネコの病気である一方、それはライオン、マウンテンライオン、レパード、チータ、及びジャガーにおいて診断された。FIPに感染したより小さい野性のネコには、リンクス及びカラカル、サンドキャット、及びパラスキャットが含まれる。飼いネコにおいては、該病気は圧倒的に若い動物に発生したが、すべての年齢のネコが感受性を有する。発病率のピークは6及び12週齢の間にある。発病率は5〜13年齢で減少し、次いで14〜15年齢のネコで増加する。
魚、甲殻類及び他の水生生物におけるウイルス性、細菌性及び寄生性の病気は栽培漁業に深刻な問題を与える。孵化タンク又は閉鎖海洋養殖区域中の高い動物密度によって、感染性の病気は、例えば魚、甲殻類、又は他の水生生物の設備中の飼育動物の大部分を根絶することができる。いったん病気が進行すると、介入よりも病気の予防が魚に対するこれらの脅威へのより望ましい療法である。魚へのワクチン接種は、免疫を通じた長期の防御を提供することのできる唯一の予防法である。近年、魚は多様な細菌性感染に対して、オイルアジュバント及び完全な死菌ワクチンによって防御されているが、ウイルス性の病気に対する魚のためのワクチンは1つしか認可されていない。核酸に基づくワクチン接種がDavisに対して付与された米国特許第5,780,448号中に記載され、これらは少なくとも2の異なるウイルス性の病気に対して防御することが示された。
魚の免疫系は哺乳動物の免疫系に類似した、B細胞、T細胞、リンパ細胞、補体及びイムノグロブリンの存在のような多くの特徴を有する。魚は、多くの面で哺乳動物のB及びT細胞に類似する役割を有するリンパ細胞のサブクラスを有する。ワクチンは経口で、又は浸漬或いは注射によって投与されることができる。
水産養殖種は魚及び他の水生動物を含むがこれらに限定されない。魚はすべての骨又は軟骨を有する脊椎魚、例えばサケ科の魚、コイ科の魚、ナマズ科の魚、黄色の尾を持つ魚、タイ科の魚、及びハタ科の魚、を含む。サケ科の魚は(ニジマスを含む)マス、サケ、及びアルプスイワナを含む魚のファミリーである。水産養殖のウイルス性病原体のポリペプチドは、ウイルス性出血性敗血症ウイルス(「VHSV」)の糖タンパク質(「Gタンパク質」)又は核たんぱく質(「Nたんぱく質」);感染性造血性壊死ウイルス(「IHNV」)のG又はNタンパク質;感染性すい臓壊死ウイルス(「IPNV」)のVP1、VP2、VP3又はN構造タンパク質;コイのスプリングウイルス血症(「SVC」)のGタンパク質;及び膜結合型タンパク質である、チャンネルキャットフィッシュウイルス(「CCV」)のテグミン又はキャプシドタンパク質或いは糖タンパク質を含むが、これらに限定されない。
細菌性病原体のポリペプチドは、鉄により調節される外膜タンパク質(「IROMP」)、外膜たんぱく質(「OMP」)、及びフルンケル症を起こすアエロモニス・サルモニシダ(Aeromonis salmonicida)のAタンパク質;細菌性腎臓病(「BKD」)を起こすレニバクテリウム・サルモニナラム(Renibacterium salmoninarum)のp57タンパク質、エルシニオシス(Yersiniosis)の主要表面結合抗原(「msa」)、表面提示サイトトキシン(「mpr」)、表面提示ヘモライシン(「ish」)、及びべん毛抗原;パスツレローシス(Pasteurellosis)の細胞外たんぱく質(「ECP」)、鉄により調節される外膜タンパク質(「IRPMP」)、および構造タンパク質;ビブローシス・アンギラルム(Vibrosis anguillarum)及びV.オルダリイ(V. ordalii)のOMP及びべん毛タンパク質;エドワードシエローシス・イクタルリ(Edwardsiellosis ictaluri)及びE.タルダ(E. tarda)のべん毛タンパク質、OMPタンパク質、アロA,及びプルA(purA);イクチオフチリウス(Ichthyophthirius)の表面抗原;及びサイトファーガ・コルムナリ(Cytophaga columnari)の構造タンパク質及び調節タンパク質;並びにリケッチアの構造及び調節たんぱく質を含むが、これらに限定されない。
寄生性病原体のポリペプチドはイクチオフチリウスの表面抗原を含むが、これに限定されない。
「アレルゲン」は、アレルギー性または喘息性の応答を感受性のある対象において誘導することのできる物質(抗原)をさす。アレルゲンのリストは膨大であり、花粉、昆虫の毒液、動物のふけ、カビの胞子、及び薬物(例えば、ペニシリン)を含むことができる。自然の動物性または植物性のアレルゲンは、以下の属:イヌ属(犬);表皮らん属(例えば、デルマトファゴイデス・ファリネ(Dermatophagoides farine));ネコ属(猫);ブタクサ(アンブロシア・アルテミスフォリア(Ambrosia artemiisfolia));ホソムギ(例えば、ロリウム・ペレネ(Lolium perenne)又はロリウム・マルチフロラム(Lolium multiflorum));スギ(クリプトメリア・ジャポニカ(Cryptomeria Japonica));アルテルナリア(アルテルナリア・アルテナータ(Alternaria alternata));カバノキ科ハンノキ(アルナス・グルチノアサ(Alnus gulcinoasa));マカンバ属(ベツラ・ベルコサ(Betula verrucosa));コナラ属(ケルカス・アルバ(Quercus alba));油(オレア・エウロパ(Olea europa));ヨモギ属(アルテミシア・バルガリス(Altemisia vulgaris));オオバコ属(例えば、プランタゴ・ランセオラータ(Plantago lanceolata));ヒカゲミズ(例えば、パリエタリア・オフィシナリス(Parietaria officinalis)又はパリエタリア・ジュダイカ(Parietaria judaica));ブラテラ(例えば、ブラテラ・ゲルマニカ(Blattella germanica));ミツバチ属(例えば、アピス・マルチフロラム(Apis multiflorum));ヒノキ(例えば、クプレッサス・センペルビレンス(Cupressus sempervirens)、クプレッサス・アリゾニカ(Cupressus arizonica)及びクプレッサス・マクロカルパ(Cupressus macrocarpa));ネズノミ(例えば、ジュニペラス・サビノイデス(Juniperus sabinoides)、ジュニペラス・ビルギニアナ(Juniperus virginiana)、ジュニペラス・コムニス(Juniperus communis)及びジュニペラス・アシェイ(Juniperus ashei));ツーヤ(例えば、ツーヤ・オリエンタリス(Thuya orientalis));マツ科(例えば、カミシパリス・オブツサ(Chamaecyparis obtusa));アブラムシの一属(例えば、ペリプラネタ・アメリカーナ(Periplaneta americana));カモジグサ(例えば、アグロピロン・レペンス(Agropyron repens));ライムギ属(例えば、シカール・セレアレ(Secale cereale));コムギ属(例えば、トリチカム・アエスチバム(Triticum aestivum));環虫(例えば、ダクチリス・グロメラータ(Dactylis glomerata));オオウシノケグサ(例えば、フェスツカ・エラチオル(Festuca elatior));ナガハグサ(例えば、ポア・プラテンシス(Poa pratensis)又はポア・コムプレッサ(Poa compressa));カラスムギ(例えば、アベナ・サチバ(Avena sativa));モロコシ(例えば、ホルカス・イアナタス(Holcus Ianatus));アントキサンタム(例えば、アントキサンタム・オドラツム(Anthoxanthum odoratum));アレナタルム(例えば、パレナタルム・エラチウス(PArrhenatherum elatius));アグロスチス(例えば、(アグロスチス・アルバ(Agrostis alba));栗環属(例えば、フレナム・プラテンス(Phlenum pratense));ファラリス(Phalaris)(例えば、ファラリス・アルンジナセア(Phalaris arundinacea));キビ(例えば、パスパラム・ノタツム(Paspalum notatum));ソルガム(例えば、ソルガム・ハレペンシス(Sorghum halepensis));及びブロマス(Bromus)(例えば、ブロマス・イネルミス(Bromus inermis)),に特異的なタンパク質を含むが、これらに限定されない。
本発明の組成物及び方法は、細胞を介した免疫を幼児において誘導するための本発明の組成物の有効量を幼児に投与することによって幼児を免疫化するために使用されることができる。いくつかの実施態様において、該幼児は少なくとも1の上記の非核酸アジュバントをも投与される。本明細書中で使用される、細胞を介した免疫は、抗原特異的なT細胞の反応を含む免疫応答を意味する。細胞を介した免疫は、Th1サイトカイン(例えば、IFN-ガンマ、IL-12)及び抗原特異的細胞障害性T細胞リンパ細胞(CTL)の誘導によって直接的に判定することができる。細胞を介した免疫は、誘導された抗原特異的抗体のアイソタイプ(例えば、マウスのIgG2a、IgG1)によって間接的に示されることもできる。したがって、Th1サイトカイン又はCTL又はTH2様抗体が誘導された場合、本発明による細胞を介した免疫が誘導される。上記の検討のとおり、Th1サイトカインはIL-12及びIFN−ガンマを含むが、これらに限定されない。
HBVの地方病を有する領域に誕生した新生児及び乳児(3ヶ月齢のヒトを含み、以後本明細書中で乳児と称される)は、若年における感染から生ずる高率の慢性によって、特別に迅速に強いHBV特異的免疫を誘導する必要がある。HBsAg及び「e」抗原(HBeAg)のどちらにも陽性である母親から生まれた乳児の70〜90%が感染し、そのほとんどが慢性のキャリアーである(Stevens et al., 1987)。誕生の日に開始して4用量の投与計画でHBVサブユニットワクチンでワクチン接種された場合でも、そのような乳児の20%は慢性の感染をし、これは彼らがHBV-特異的イムノグロブリン(Chen et al.1996)を投与されたとしても15%にしか低下しない。HBVの慢性化率は青年期又は成人が感染した場合には10〜15%の個体におこるが、乳児が(平行に又は垂直に)感染した場合には90〜95%である。本発明の組成物はHBe抗原で調製されることができ、本発明の方法において使用され、その抗HB抗体のより迅速な出現とより高い力価及び子宮内で感染した赤ちゃんの肝臓からウイルスを除去することを助け、そして乳児のワクチン接種の失敗のほとんどの原因であると考えられる、HBV特異的CTLの誘導によってそのような慢性の感染を減少させる。
適応症、投与及び用量
本発明の組成物及び方法は免疫系の刺激を必要とするいずれかの患者又は生物における使用を意図したものである。そのような必要性は、腫瘍学、炎症、関節炎及びリューマチ、免疫不全障害のようなほとんどの医学分野を包含するが、これらに限定されない。当業者は、本明細書の開示に基づいて有効性を試験するために適切な適応症を選択することができる。好ましい実施態様において、本発明の組成物及び方法は以下の実施例に記載の腫瘍のような腫瘍(病理学的又は潜在的に病理学的ないずれかの腫瘍細胞の増殖)を治療するために使用される。
本発明の組成物及び方法は免疫系の刺激を必要とするいずれかの患者又は生物における使用を意図したものである。そのような必要性は、腫瘍学、炎症、関節炎及びリューマチ、免疫不全障害のようなほとんどの医学分野を包含するが、これらに限定されない。当業者は、本明細書の開示に基づいて有効性を試験するために適切な適応症を選択することができる。好ましい実施態様において、本発明の組成物及び方法は以下の実施例に記載の腫瘍のような腫瘍(病理学的又は潜在的に病理学的ないずれかの腫瘍細胞の増殖)を治療するために使用される。
対象への本発明の組成物の投与はインビボ又はエクスビボの方法を含むいずれかの方法によることができる。インビボの方法は局所的、部分的又は全身的適用を含む。好ましい実施態様において、該組成物は粒子が患者のB細胞、マクロファージ又は脾臓細胞に到達できるように、及び/又は粒子がリンパ細胞を刺激し、該患者においてIL-6、IL-12、IFNg及び/又はIgMが分泌されるように静脈内投与される。
当業者は、例えば、補体の活性化、凝集、腎毒性、肝臓の酵素のアッセイなどの製剤の可能性のある毒性の同定方法を認識するだろう。そのような毒性は生物によって異なる。
組成物の医薬調製物は通常、デリバリー様式を改善又は補助する追加の担体を採用する。典型的には、本発明の組成物は普通の生理食塩水又は標準的な医薬の実施にしたがって選択されたリン酸緩衝液のような生理学的に許容可能な担体中で投与されるだろう。他の好適な担体は水、0.9%生理食塩水、0.3%グリシン、などを含み、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどのような安定性の向上のための糖タンパク質を含む。
脂質―核酸製剤の用量は所望の脂質用量、所望の核酸用量、及び組成物の薬物:脂質の比率に依存する。当業者は本明細書中に提供された情報に基づいて適切な用量を選択することができる。
本明細書中で使用される「有効量」は、所望の生物学的効果を実現するために必要又は十分な量を意味する。好ましい実施態様において、生物学的効果は免疫応答の刺激、そしてより好ましくは免疫応答である。制限のない例として、免疫的障害を治療するためのISS ODNを含むLNA製剤又はLNA製剤−Agの有効量は、微生物への露出による抗原特異的免疫応答の発生を引き起こし、それによって対象中の微生物量を減少させ、好ましくは微生物を根絶するのに必要な量である。特別な適用のための有効量は、例えば、治療される病気、障害、又は状態、投与される特別なISS ODN又は治療剤、対象の体重、又は病気、障害、又は状態の重篤度に依存して変化することができる。当業者は過度の実験を必要とせずにいかに特別なアジュバント及び抗原の有効量を経験的に決定するかを認識するであろう。
投薬の準備、促進、及び維持のためのワクチン接種プロトコールは当業者に周知であり、さらに以下で記載される。特別には、当業者は対象、特別には哺乳動物、及びより特別にはヒトへの投与量を本明細書中に記載の投与量に基づいていかに計算するかを認識するであろう。1の動物から他の動物へ(例えば、マウスからヒトへ)投与量を変更するための変換因子は本分野において周知であり、例えば、本明細書中に援用されているFood and Drug Administration Web siteであるwww.fda.gov/cder/cancer/animalframe.htm(の腫瘍学ツールセクション中で)完全に記載されている。遊離の核酸を含む知られた免疫刺激性の化合物に比べて、本発明の免疫刺激性の組成物及び方法は、より少ない量の核酸を亢進された粘膜の免疫応答をインビボにおいて刺激するために利用することができる。
いくつかの実施態様において、本発明のLNA製剤中の核酸の量は約0.001〜60mg/kg(マウスの体重1kgあたりの核酸のmg)である。好ましい実施態様において、本発明の組成物及び方法は、約10mg/kg(マウスの体重1kgあたりの核酸のmg)未満、より好ましくは約1mg/kg(マウスの体重1kgあたりの核酸のmg)未満、最も好ましくは約0.1mg/kg(マウスの体重1kgあたりの核酸のmg)未満、そして最適には約0.01mg/kg(マウスの体重1kgあたりの核酸のmg)未満を利用する。好ましい実施態様において、本発明のLNA製剤中の核酸の量は約0.001〜10mg/kg(マウスの体重1kgあたりの核酸のmg)、より好ましくは0.001〜1mg/kg(マウスの体重1kgあたりの核酸のmg)、より好ましくは0.001〜0.1mg/kg(マウスの体重1kgあたりの核酸のmg)、より好ましくは0.001〜0.01mg/kg(マウスの体重1kgあたりの核酸のmg)である。いくつかの実施態様において、本発明のLNA製剤に結合した抗原の量は約0.004〜40mg/kg(マウスの体重1kgあたりの抗原のmg)である。より好ましい実施態様において、本発明のLNA製剤と結合する抗原の量は約0.004〜4mg/kg(マウスの体重1kgあたりの抗原のmg)である。上記のように、当業者は上記において定義された周知の変換因子及びさらなる経験的な試験に基づいて、本明細書中に記載された投与量から他の哺乳動物のために好適な用量を容易に決定することができる。
本発明の製剤は薬剤として許容可能な溶液であって、日常的に薬剤として許容可能な濃度の塩、緩衝物質、保存剤、融和性の担体、アジュバント、及び場合により他の治療的成分を含む溶液中で投与される。
治療における使用のために、本発明の免疫刺激性の組成物の有効量が、適切な標的細胞による取り込みを可能とするいずれかの様式で対象に投与されることができる。本発明の免疫刺激性の組成物の「投与」は当業者に知られたいずれかの手段によって達成されることができる。好ましい投与経路は、粘膜の、鼻腔内、気管内、吸入、及び眼内、膣内;又は経口、経皮(例えば、パッチを介して)、非経口的注入、(皮下、皮内、静脈内、腸管、腹腔内、くも膜下等)を含むが、これらに限定されない。注入はボーラス又は持続的輸注であることができる。
例えば、本発明の免疫刺激性の組成物は、筋肉内又は皮内注射、又は他の非経口的手段によって、或いは微粒子銃である「遺伝子銃」を表皮に適用することによって投与されることができる。本発明の免疫刺激性の組成物は、例えば、吸入、局所的、静脈内、経口、移植、直腸内、又は膣内に投与されることもできる。好適な液体又は固体の医薬調製物の形態は、例えば、注射又は吸入のための水溶液又は生理食塩水溶液、顕微鏡的な金粒子上へエンコキレート(encochleated)され、被覆され、及び霧状にされたものである。薬物デリバリーのための本方法の簡単な総説として、本明細書中に参考文献として援用されている、Langer, Science 249:1527-1533, 1990を参照のこと。
医薬組成物は好ましくは用量単位で調製され、そして投与される。液体の用量単位は注射又は他の非経口投与のためのバイアル又はアンプルである。固体の用量単位は、錠剤、カプセル及び座剤である。患者の治療のためには、化合物の活性、投与方法、免疫化の目的(すなわち、予防的又は治療的)、障害の性質及び重篤度、患者の年齢、体重に依存して異なる用量が必要である。所定の用量の投与は、個別の用量単位の形態での単回投与又はその他のいくつかのより小さい用量単位のどちらで実施されることもできる。何週か又は何ヶ月かの特別な間隔を置いた複数回の用量投与が抗原特異的応答を増強するために普通である。
本発明の免疫刺激性の組成物はそのまま(生で)又は薬剤として許容可能な塩の形態で投与されることができる。薬物中で使用される場合、塩は薬剤として許容可能でなくてはならないが、薬剤として許容不可能な塩は薬剤として許容可能なその塩を調製するために便利に使用されることができる。そのような塩は、以下の酸から調製されるものを含むがこれらに限定されない:塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、燐酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、p-トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、蟻酸、マロン酸、スクシニル酸、ナフタレン‐2‐スルホン酸、及びベンゼンスルホン酸。そのような塩は、カルボキシル酸群のナトリウム、カリウム又はカルシウム塩のようなアルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩として調製されることもできる。
好適な緩衝剤は以下の:酢酸及び塩(1-2%重量/容量);クエン酸及び塩(1-3%重量/容量);ホウ酸及び塩(0.5-2.5%重量/容量)並びにリン酸及び塩(0.8-2%重量/容量)を含む。好適な保存剤は塩化ベンザルコニウム(0.003-0.03%重量/容量);塩化ブタノール(0.3-0.9%重量/容量);パラベン(0.01-0.25%重量/容量)及びチメロサール(0.004-0.02%重量/容量)を含む。
好ましい実施態様において、本発明の免疫刺激性の組成物は、アジュバントと抗原の組み合わせの有効量を場合により薬剤として許容可能な担体中で含む。本明細書中で使用される「薬剤として許容可能な担体」は、ヒト又は他の哺乳動物への投与に好適な、1以上の融和性の固体又は液体の充填剤、希釈剤又は封入剤を意味する。本明細書中で使用される「担体」は、それによって活性成分が適用を容易にするように併合される、天然又は合成の有機成分又は無機成分を意味する。本発明の免疫刺激性の組成物の成分は、実質的に所望の薬効を損なうような相互作用のない方法で本発明の組成物と混合されることもできる。
非経口投与に好適な組成物は、受容者の血液と等張であることができる滅菌水性調製物を便利に含む。許容可能なビヒクル及び溶液には、水、リンガー溶液、リン酸緩衝生理食塩水及び等張の塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌された固定油が溶媒又は懸濁溶液として便利に採用されることができる。この目的のために、合成のモノ‐オルディ‐グリセライドを含むいずれかのブランドの固定鉱油又は非鉱油が採用されることができる。さらに、オレイン酸のような脂肪酸は、注射剤の調製において使用される。皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内などの投与に好適な担体製剤がRemington’s Phrmaceutical Sciences, Mark Publishing Company, Easton, Pa.中で見出される。
本発明において有用なアジュバント又は抗原は2以上のアジュバント又は抗原の混合物としてデリバリーされる。混合物は、アジュバントまたはいくつかの抗原の相乗的な組み合わせに加えていくつかのアジュバントから成ることができる。
多様な投与経路が可能である。選択される特別な様式は、もちろん選択された特別なアジュバント又は抗原、対象の年齢及び一般的な健康状態、治療される特別な状態及び治療効果のために必要な用量に依存するだろう。本発明の方法は一般的に、医学的に許容可能ないずれかの投与様式を使用して実施されることができ、それは臨床的に許容不可能な副作用なしに有効なレベルの免疫応答を生じさせるいずれかの様式を意味する。好ましい投与様式は上記のとおりである。
組成物は単位用量形態で便利に与えられることができ、薬剤術の分野において周知の方法のいずれかによって調製されることができる。すべての方法は、化合物を1以上の付属成分から成る担体と共同させるステップを含む。一般的い、組成物は化合物を液体の担体、細かく分割された固体の担体、又はその両方と共同させ、そして所望により生成物を成形することによって均一にそして完全に調製される。
他のデリバリーシステムは除放性の、遅延性の又は持続性の放出のデリバリーシステムを含むことができる。そのようなシステムは化合物の繰り返し投与を回避することができ、対象及び医師の便宜を向上させることができる。多くの型の除放性デリバリーシステムが入手可能であり、当業者に知られている。それらは、ポリ(ラクチド‐グリコリド)、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステラミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシブチル酸、及びポリアンハイドライドを含む。
薬物を含有する先のポリマーのマイクロカプセルが例えば、米国特許第5,075,109号中に記載される。デリバリーシステムは、以下の非ポリマーシステム:コレステロール、コレステロールエステルのようなステロイド及び脂肪酸又はモノ‐ジ‐及びトリ‐グリセリドのような中性脂肪を含む脂質;ヒドロゲル放出システム;シラスティックシステム;ペプチドに基づくシステム;ワックスコーティング;慣用の結合剤及び賦型剤を使用した圧縮タブレット;部分的に融合したインプラントなどである。特別な例は以下の:(a)米国特許第4,452775号、同第4,675,189号及び同第5,736,152号に記載されたような、本発明の作用物質がマトリックス内の形態で含まれる侵食型システム及び(b)米国特許第3,854,480号、同第5,133,974号及び同第5,407,686号中に記載されたような、活性成分が制御された速度でポリマーから浸透する拡散性システムを含むがこれらに限定されない。さらに、ポンプに基づくハードウエアデリバリーシステムが使用されることができ、そのうちのいくつかはインプラントに適応させられる。
以下の実施例は開示された化合物及び方法を例示し、本発明の範囲を制限することを意図しない。本発明の精神及び特許請求の範囲から離れることのない、本発明の多様な変更及び改変は当業者に明らかであり、本発明の多様な使用及び条件に適応するように行われることができる。したがって、他の実施態様も包含される。
実施例1
LNA製剤を使用した抗原特異的な粘膜の免疫応答の刺激
この実施例は、標的抗原、ニワトリオブアルブミン(「OVA」)を含む脂質‐核酸(LNA)製剤を含むINA製剤へのIgA及びIgG免疫応答の刺激を説明する。
LNA製剤を使用した抗原特異的な粘膜の免疫応答の刺激
この実施例は、標的抗原、ニワトリオブアルブミン(「OVA」)を含む脂質‐核酸(LNA)製剤を含むINA製剤へのIgA及びIgG免疫応答の刺激を説明する。
オリゴヌクレオチド
本研究中で使用したオリゴデオキシヌクレオチド(「ODNs」)をホスホロチオエート(「PS」)骨格とともに合成した。各ODNの配列は以下のとおりである:
ODN #1 配列番号:1 5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’
ODN #2 配列番号:2 5’-TAACGTTGAGGGGKAT-3’
ODN #3 配列番号:3 5’-TAAGCATACGGGGTGT-3’
本研究中で使用したオリゴデオキシヌクレオチド(「ODNs」)をホスホロチオエート(「PS」)骨格とともに合成した。各ODNの配列は以下のとおりである:
ODN #1 配列番号:1 5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’
ODN #2 配列番号:2 5’-TAACGTTGAGGGGKAT-3’
ODN #3 配列番号:3 5’-TAAGCATACGGGGTGT-3’
LNA製剤の調製
LNA製剤はODN#1PS、ODN#2PS、又はODN#3PS及び標的抗原としてのOVAを使用して調製した。特別には、LNA製剤は、本明細書中に参考文献として援用されている米国特許出願第6,287,591号中に記載のエタノールに基づく手順を用いて、ODNを脂質混合物DODAP:DSPC:CH:PEG-C14(25:20:45:10モル%)とともに製剤することによって調製した。それによって、ODN#1PS、ODN#2PS、又はODN#3PSを封入したリポソームを調製した。得られたリポソームの粒子サイズは100〜140nmであった。
LNA製剤はODN#1PS、ODN#2PS、又はODN#3PS及び標的抗原としてのOVAを使用して調製した。特別には、LNA製剤は、本明細書中に参考文献として援用されている米国特許出願第6,287,591号中に記載のエタノールに基づく手順を用いて、ODNを脂質混合物DODAP:DSPC:CH:PEG-C14(25:20:45:10モル%)とともに製剤することによって調製した。それによって、ODN#1PS、ODN#2PS、又はODN#3PSを封入したリポソームを調製した。得られたリポソームの粒子サイズは100〜140nmであった。
オリゴヌクレオチドODN#1PS、ODN#2PS、又はODN#3PSそれぞれを、エタノール透析手順及び先に記載のイオン化可能なアミノリピッド(例えば、Semple et al., Methods Enzymol. (2003)313:322-341; Semple et al., Biochem. Biophys. Acta. (2001) 1510(1-2):152-166を参照のこと)を使用して、脂質粒子内に封入した。ODNをその後300mMのクエン酸緩衝液(pH4.0)中で水素化し、5分間80℃まで、モノマーODNの存在を確認するための製剤の前にあらかじめあたためた。脂質製剤は、20/45/25/10のモル比率のDSPC/CH/DODAP/PEG-CerC14から構成された。ゆっくりとエタノール中に溶解した脂質混合物をODNのクエン酸溶液にゆっくりと、最終エタノール濃度が40%(容量/容量)となるまで添加することによって各ODNを別々に封入した。最初のODN対脂質の比率(ODN重量対総脂質重量)は0.25であった。サーモバレル・エクストルーダー(Lipex Biomembranes, Vancouver, BC Canada)を使用し、約65℃に維持して、ODN−脂質混合物を二重の100nmポリカーボネートフィルター(Osmonics, Livermore, CA)に10回通した。そして、HBS(10mM Hepes, 145mM NaCl, pH7.5)に対する一夜の透析、続いてDEAE-セファロースCL-6B陰イオン交換クロマトグラフィーの前に、最初の1時間の300mMクエン酸緩衝液、pH4.0に対する透析によって封入されないODNを製剤から除去した。製剤のODN濃度を分光光度計で260nmで分析することによって決定した。LNA粒子の平均直径及びサイズ分布をNICOMPモデル370サブミクロン粒子サイザーを使用して決定し、平均直径は典型的には110±30nmであった、
免疫化及びサンプルの単離
C57BL/6マウス(6週齢)を、20μlの以下の試験製剤を、最初の免疫化の第0日(最初の免疫化)及び第7日、及び第14日に鼻腔内投与することによって免疫化した。
C57BL/6マウス(6週齢)を、20μlの以下の試験製剤を、最初の免疫化の第0日(最初の免疫化)及び第7日、及び第14日に鼻腔内投与することによって免疫化した。
図1~3について:
OVA単独:
OVAと10μgCT(”OVA+CT”)を同時投与
OVAとODN#1を同時投与(”OVA+ODN#1”)
OVAとODN#2を同時投与(”OVA+ODN#2”)
OVAとODN#3を同時投与(”OVA+ODN#3”)
OVAとODN#1を含むLNAを同時投与(”OVA+LNA-ODN#1)
OVAとODN#2を含むLNAを同時投与(”OVA+LNA-ODN#2)
OVAとODN#3を含むLNAを同時投与(”OVA+LNA-ODN#3)
ODN#2を含むLNA(”LNA-ODN#2”)
マウスに免疫化1回あたり75μgの用量でOVAタンパク質を与えた。遊離又は封入されたODNを1、10、及び100μgの用量で投与した。
OVA単独:
OVAと10μgCT(”OVA+CT”)を同時投与
OVAとODN#1を同時投与(”OVA+ODN#1”)
OVAとODN#2を同時投与(”OVA+ODN#2”)
OVAとODN#3を同時投与(”OVA+ODN#3”)
OVAとODN#1を含むLNAを同時投与(”OVA+LNA-ODN#1)
OVAとODN#2を含むLNAを同時投与(”OVA+LNA-ODN#2)
OVAとODN#3を含むLNAを同時投与(”OVA+LNA-ODN#3)
ODN#2を含むLNA(”LNA-ODN#2”)
マウスに免疫化1回あたり75μgの用量でOVAタンパク質を与えた。遊離又は封入されたODNを1、10、及び100μgの用量で投与した。
図6及び7について
PBS単独
OVAと10μgCTを同時投与("OVA+CT")
ODN#2を含むLNA("LNA-ODN#2")
OVAとODN#1を同時投与(”OVA+ODN#1”)
OVAとODN#1を含むLNAを同時投与(”OVA+LNA-ODN#1)
OVAとODN#2を同時投与(”OVA+ODN#2”)
OVAとODN#2を含むLNAを同時投与(”OVA+LNA-ODN#2)
OVAとODN#3を同時投与(”OVA+ODN#3”)
OVAとODN#3を含むLNAを同時投与(”OVA+LNA-ODN#3)
マウスに免疫化1回あたり75μgの用量でOVAタンパク質を与えた。遊離又は封入されたODNを100μgの用量で投与した。
PBS単独
OVAと10μgCTを同時投与("OVA+CT")
ODN#2を含むLNA("LNA-ODN#2")
OVAとODN#1を同時投与(”OVA+ODN#1”)
OVAとODN#1を含むLNAを同時投与(”OVA+LNA-ODN#1)
OVAとODN#2を同時投与(”OVA+ODN#2”)
OVAとODN#2を含むLNAを同時投与(”OVA+LNA-ODN#2)
OVAとODN#3を同時投与(”OVA+ODN#3”)
OVAとODN#3を含むLNAを同時投与(”OVA+LNA-ODN#3)
マウスに免疫化1回あたり75μgの用量でOVAタンパク質を与えた。遊離又は封入されたODNを100μgの用量で投与した。
完全に吸入させるためにワクチンを外部鼻孔に滴下して適用する前に、各処置群(n=5)をハロタンで麻酔した。最初の免疫化後の第28日に、血漿を麻酔したマウスから心臓穿刺によって集め、血清チューブに入れた。50μlのPBS(リン酸緩衝生理食塩水)を各マウスの膣にピペットを用いて入れ、そして出すことによって膣洗液を得た。全部で150μlの洗液が集まるまでこの手順を3回繰り返した。その後、マウスを頚椎脱臼によって殺し、チューブを気管に挿入し、1mLのPBSをピペッティングによって入れ、そして出すことによって肺洗液を得た。この手順についての容量回収率は、一般的に70〜80%であった。4℃において10,000rpm(1分あたりの回転数)で5分間の遠心分離の前に、血餅形成のために血清チューブを30分室温に置いた。そして集められた上清のアリコートを分析まで−20℃で貯蔵した。血清のアリコートもまた、分析まで−20℃で貯蔵した。
免疫応答のELISAによる評価
血清、肺洗液、及び膣洗液中のOVA特異的IgG及びIgA抗体を、ELISA(酵素結合免疫測定法)によって測定した。マイクロタイタープレート(96穴)をPBS(50μl)で希釈したOVAの5μlで、4℃で一夜コーティングした。マイクロタイタープレートをその後0.5%Tween20を含むPBS(PBST)で洗浄し、200μlのPBST中1%ウシ血清アルブミン(BSA)を用いて37℃で1時間、BSA-PBSTで希釈した50μlのHRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)結合ヤギ抗マウスIgG(1:4000)又はHRP結合ヤギ抗マウスIgA(1:10)とともに37℃で1時間ブロッキングした。プレートをTMB(3,3',5,5'-テトラメチルベンチジン)(100μl)とともに室温で30分インキュベートすることによって発色させ、反応を50μlの0.5MH2SO4で停止した。450〜570nmの吸光度をELISAプレートリーダーで測定した。
血清、肺洗液、及び膣洗液中のOVA特異的IgG及びIgA抗体を、ELISA(酵素結合免疫測定法)によって測定した。マイクロタイタープレート(96穴)をPBS(50μl)で希釈したOVAの5μlで、4℃で一夜コーティングした。マイクロタイタープレートをその後0.5%Tween20を含むPBS(PBST)で洗浄し、200μlのPBST中1%ウシ血清アルブミン(BSA)を用いて37℃で1時間、BSA-PBSTで希釈した50μlのHRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)結合ヤギ抗マウスIgG(1:4000)又はHRP結合ヤギ抗マウスIgA(1:10)とともに37℃で1時間ブロッキングした。プレートをTMB(3,3',5,5'-テトラメチルベンチジン)(100μl)とともに室温で30分インキュベートすることによって発色させ、反応を50μlの0.5MH2SO4で停止した。450〜570nmの吸光度をELISAプレートリーダーで測定した。
結果
血清、肺洗液、及び膣洗液中の抗体力価を表す図1〜3に結果を示す。
血清、肺洗液、及び膣洗液中の抗体力価を表す図1〜3に結果を示す。
図1〜3(b)は、LNA製剤と同時投与したOVAを用いた試験製剤においては、OVA特異的IgA抗体レベルが、局所及び離れた粘膜部位の両方で、ODNと同時投与したOVA、CTと同時投与したOVA、OVA単独、又はLNA-ODN#2に比べて数桁増加したことを示す。図1〜3(a)は、LNA製剤と同時投与したOVAを用いた試験製剤においては、OVA特異的IgG抗体レベルが、局所及び離れた粘膜部位の両方で、ODNと同時投与したOVA、CTと同時投与したOVA、OVA単独、又はLNA-ODN#2に比べて数桁増加したことを示す。図1及び2(c)は、本発明のLNA製剤中のリポソーム封入されたODNが、ODNと同時投与したOVA、CTと同時投与したOVA、OVA単独、又はLNA-ODN#2に比べて抗OVA IgM力価を数桁増加させることを示す。この応答は用量依存的であった。
図6及び7は、膣洗液及び肺洗液中の抗体力価を表す。これらの図は、ODN#1、ODN#2、及びODN#3を含むLNA製剤と同時投与したOVAを用いた試験製剤においては、OVA特異的IgA抗体レベルが、局所及び離れた粘膜部位の両方で、ODN#1、ODN#2、及びODN#3と同時投与したOVA、LNA-ODN#2単独、CTと同時投与したOVA及びPBS単独に比べて数桁増加したことを示す。
実施例2
LNA製剤に結合したOVAを使用した抗原特異的な粘膜の免疫応答の刺激
この実施例は、免疫刺激性のCpGモチーフ(「ISS ODNs」)を有する合成オリゴデオキシヌクレオチドを含む脂質-核酸(「LNA」)製剤を使用し、及び標的抗原としてのオボアルブミン(「OVA」)を同時投与することによる、標的抗原への粘膜の免疫応答の刺激を表す。
LNA製剤に結合したOVAを使用した抗原特異的な粘膜の免疫応答の刺激
この実施例は、免疫刺激性のCpGモチーフ(「ISS ODNs」)を有する合成オリゴデオキシヌクレオチドを含む脂質-核酸(「LNA」)製剤を使用し、及び標的抗原としてのオボアルブミン(「OVA」)を同時投与することによる、標的抗原への粘膜の免疫応答の刺激を表す。
オリゴヌクレオチド
1のCpGモチーフを有するISS ODN#1及びODN#2をこの実施例中で使用し、そしてホスホロチオエート(「PS」)骨格とともに合成した(それぞれ、「ODN#1PS」及び「ODN#2PS」)。各ODNの配列を上記の実施例1に提供する。
1のCpGモチーフを有するISS ODN#1及びODN#2をこの実施例中で使用し、そしてホスホロチオエート(「PS」)骨格とともに合成した(それぞれ、「ODN#1PS」及び「ODN#2PS」)。各ODNの配列を上記の実施例1に提供する。
LNA製剤の調製
ODN#1PS又はODN#2PSを含むLNA製剤を、本明細書中に参考文献として援用されている米国特許第6,287,591号中に完全に記載されたエタノールに基づく手順用いて、ODNと脂質混合物DODAP:DSPC:CH:PEG-C14(25:20:45:10モル比)を製剤することによって調製した。それによって、ODN#1(「LNA-ODN#1PS」)又はODN#2(「LNA-ODN#2PS」)を調製した。異なる量のODN、10μg及び100μgを、LNA製剤の調製に使用した。得られたリポソームの粒子サイズは100〜140nmであった。
ODN#1PS又はODN#2PSを含むLNA製剤を、本明細書中に参考文献として援用されている米国特許第6,287,591号中に完全に記載されたエタノールに基づく手順用いて、ODNと脂質混合物DODAP:DSPC:CH:PEG-C14(25:20:45:10モル比)を製剤することによって調製した。それによって、ODN#1(「LNA-ODN#1PS」)又はODN#2(「LNA-ODN#2PS」)を調製した。異なる量のODN、10μg及び100μgを、LNA製剤の調製に使用した。得られたリポソームの粒子サイズは100〜140nmであった。
CTと同時投与したOVAを対照として使用した。
OVAを結合したLNA製剤の調製
上記製剤を調製するために2の方法を使用した。どちらの方法もチオール付加手順によって活性化されたOVAによった。活性化されたタンパク質を、例えばDSPE-PEG-MPBである活性化脂質種に標準的なスルフヒドリル反応によって直接的に化学結合させた(例えば、Harasym et al., Bioconjugate Chemistry(1995)6:187; Hermanson et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press(1996)230-232; Ansell et al., Antibody conjugation methods for active targeting of liposomes pages 51-68 in Drug targeting: strategies, principles and applications, Methods in Molecular Medicine, Vol25, Francis, GE. 及びDelgado C編、Human Press Inc., Totwa, New Jerseyを参照のこと)。
上記製剤を調製するために2の方法を使用した。どちらの方法もチオール付加手順によって活性化されたOVAによった。活性化されたタンパク質を、例えばDSPE-PEG-MPBである活性化脂質種に標準的なスルフヒドリル反応によって直接的に化学結合させた(例えば、Harasym et al., Bioconjugate Chemistry(1995)6:187; Hermanson et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press(1996)230-232; Ansell et al., Antibody conjugation methods for active targeting of liposomes pages 51-68 in Drug targeting: strategies, principles and applications, Methods in Molecular Medicine, Vol25, Francis, GE. 及びDelgado C編、Human Press Inc., Totwa, New Jerseyを参照のこと)。
反応性の脂質をLNA製剤中へ挿入する2の方法がある。
1)上記のエタノール手順の間にLNA製剤の他のすべての脂質成分が併合される時に、反応性の脂質を添加する。脂質を製剤中に加えた後、OVAを脂質に結合させる。これを能動的カップリングといい、以下に詳述する。
2)第二の方法は、脂質が最初にOVAタンパク質と結合することを必要とする。そして、この結合構造を準備したLNA製剤中に挿入する。これ受動的カップリングといい、これも以下に詳述する。
1)上記のエタノール手順の間にLNA製剤の他のすべての脂質成分が併合される時に、反応性の脂質を添加する。脂質を製剤中に加えた後、OVAを脂質に結合させる。これを能動的カップリングといい、以下に詳述する。
2)第二の方法は、脂質が最初にOVAタンパク質と結合することを必要とする。そして、この結合構造を準備したLNA製剤中に挿入する。これ受動的カップリングといい、これも以下に詳述する。
SPDPによるOVAタンパク質のチオール付加
HBS(1モル;25mMhepes、150mM NaCl、pH7.4)にOVA(40mg)を溶解する。SPDP(3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸N-ヒドロキシサクシニミドエステル)の原液をエタノール中で調製し(28.8:1エタノール/mgSPDP)、ボルテックスしながらアリコート(40:1)をOVA溶液に加える。溶液を室温で30分間攪拌し、セファデックスG-50カラム(15ミリリッター、SAS(酢酸ナトリウム生理食塩水)pH4.4)に通した。16滴落ちた後に分画を集め、分光光度計で280nmで分析し、A280が1.0より高い分画を併合した。典型的には、2.5〜3mlの保護されたチオール基付加たんぱく質がこの方法によって生成する。DTT(ジチオスレイトール、3.8mg/ml溶液)をその後固体として直接加え、溶液を15分間攪拌した。溶液をセファデックスG-50カラム(HBS中50ml、pH7.4)を通して20〜24滴の分画を集めた。分画をその後280nmで分光光度計で分析し、A280が1.0より高い分画を併合した。そして、併合した分画のアリコートをHBS(Hepes緩衝生理食塩水)で10倍希釈し、HBSを対照として280nmで分析した。吸光度を濃度(mg/ml)に変換するために1.8の因子を適用することによって、タンパク質含量を決定した。
HBS(1モル;25mMhepes、150mM NaCl、pH7.4)にOVA(40mg)を溶解する。SPDP(3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸N-ヒドロキシサクシニミドエステル)の原液をエタノール中で調製し(28.8:1エタノール/mgSPDP)、ボルテックスしながらアリコート(40:1)をOVA溶液に加える。溶液を室温で30分間攪拌し、セファデックスG-50カラム(15ミリリッター、SAS(酢酸ナトリウム生理食塩水)pH4.4)に通した。16滴落ちた後に分画を集め、分光光度計で280nmで分析し、A280が1.0より高い分画を併合した。典型的には、2.5〜3mlの保護されたチオール基付加たんぱく質がこの方法によって生成する。DTT(ジチオスレイトール、3.8mg/ml溶液)をその後固体として直接加え、溶液を15分間攪拌した。溶液をセファデックスG-50カラム(HBS中50ml、pH7.4)を通して20〜24滴の分画を集めた。分画をその後280nmで分光光度計で分析し、A280が1.0より高い分画を併合した。そして、併合した分画のアリコートをHBS(Hepes緩衝生理食塩水)で10倍希釈し、HBSを対照として280nmで分析した。吸光度を濃度(mg/ml)に変換するために1.8の因子を適用することによって、タンパク質含量を決定した。
能動的カップリングを用いたLNA-タンパク質結合体の調製
能動的カップリング技術は、活性化されたタンパク質が脂質粒子に取り込まれた反応性の脂質に直接的に化学的結合されるプロトコールを意味する。
能動的カップリング技術は、活性化されたタンパク質が脂質粒子に取り込まれた反応性の脂質に直接的に化学的結合されるプロトコールを意味する。
エタノール中DSPC/chol/MePEGS-2000-DMG/DODAP/DSPE-ATTA2-MPA(32:45:2:20:1モル/モル)(1.2ml)を60℃に加温し、ゆっくりとあらかじめ同様に60℃に加温しておいたODN#2溶液(pH4.0の300mMクエン酸塩1.8ml中12mg)に添加した。加える間、溶液を激しく攪拌した。この粗製LNAをその後65℃に設定した押し出し機を用いて2の100nmのフィルターに10回通した。得られたサイズにより分けられた粗製LNAをセファデックスG-50カラム(50ml;HBS)に通し、すぐに使用した。およその脂質濃度を、ほとんどの脂質がカラムから回収されたとして見積もった。
その後、チオール付加されたOVAを活性化LNA粒子に、最初のタンパク質対脂質の比率150g/mlにおいて添加し、室温で16時間攪拌した。得られたLNA-タンパク質(又はLNA-OVA)結合体を未反応のタンパク質からセファロースCl-4Bカラム(25ml;HBS、カラムあたり1m以下のサンプル)を用いて分離した。
受動的カップリングを用いたLNA-タンパク質結合体の調製
受動的カップリング技術は、最終的な脂質粒子には間接的に、活性化されたタンパク質が反応性の脂質に結合し、そしてなんらかの方法、あらかじめ形成された粒子中へ交換されること又は粒子の形成中に取り込まれることのいずれかによって粒子にとりこまれる、プロトコールを意味する。
受動的カップリング技術は、最終的な脂質粒子には間接的に、活性化されたタンパク質が反応性の脂質に結合し、そしてなんらかの方法、あらかじめ形成された粒子中へ交換されること又は粒子の形成中に取り込まれることのいずれかによって粒子にとりこまれる、プロトコールを意味する。
LNA粒子を上記のように調製した。DSPE-ATTA2-MPA/DSPE-ATTA4-MBOC(1:4)のミセル溶液を、脂質を最小量のエタノールに溶解し、最終脂質濃度10mMとなるまでゆっくりとHBSを加えた。そして、この溶液のアリコートを上記のチオール付加されたOVAに3000gOVA/モル脂質の割合でくわえ、室温で一夜攪拌した。150gOVA/モルLNA中の脂質にあたるこの溶液のアリコートをLNAのサンプルに加え、60℃の水浴中で1時間インキュベートした。この溶液をセファロースCL-4Bカラム(25ml;HBS;カラムあたり1ml以下のサンプル)を用いて分離した。
免疫化及びサンプルの単離
C57BL/6マウス(6週齢)を、最初の免疫化の0日(最初の免疫化)、7日、及び14日後に鼻腔内投与によって20μlの以下の試験製剤で免疫化した。
C57BL/6マウス(6週齢)を、最初の免疫化の0日(最初の免疫化)、7日、及び14日後に鼻腔内投与によって20μlの以下の試験製剤で免疫化した。
図4及び5について:
10μgの用量の、ODN#2PSと同時投与するOVA("OVA+ODN#2PS")
100μgの用量の、ODN#2PSと同時投与するOVA("OVA+ODN#2PS")
10μgの用量の、ODN#2PSを含むLNAと同時投与するOVA("OVA+LNA-ODN#2PS")
100μgの用量の、ODN#2PSを含むLNAと同時投与するOVA("OVA+LNA-ODN#2PS")
10μgの用量の、ODN#2PSを含むLNAに結合したOVA("OVA/LNA-ODN#2PS")
100μgの用量の、ODN#2PSを含むLNAに結合したOVA("OVA/LNA-ODN#2PS")
10μgのCTと同時投与するOVA("OVA+CT")
10μgの用量の、ODN#1を含むLNAと同時投与するOVA(#OVA/LNA-ODN#1PS")
マウスに免疫化1回あたり75μgの用量でOVAタンパク質を与えた。
10μgの用量の、ODN#2PSと同時投与するOVA("OVA+ODN#2PS")
100μgの用量の、ODN#2PSと同時投与するOVA("OVA+ODN#2PS")
10μgの用量の、ODN#2PSを含むLNAと同時投与するOVA("OVA+LNA-ODN#2PS")
100μgの用量の、ODN#2PSを含むLNAと同時投与するOVA("OVA+LNA-ODN#2PS")
10μgの用量の、ODN#2PSを含むLNAに結合したOVA("OVA/LNA-ODN#2PS")
100μgの用量の、ODN#2PSを含むLNAに結合したOVA("OVA/LNA-ODN#2PS")
10μgのCTと同時投与するOVA("OVA+CT")
10μgの用量の、ODN#1を含むLNAと同時投与するOVA(#OVA/LNA-ODN#1PS")
マウスに免疫化1回あたり75μgの用量でOVAタンパク質を与えた。
図8〜10について:
100μgの用量の、ODN#2を含むLNAに結合したOVA("OVA/LNA-ODN#2PS")
10μgの用量の、ODN#2を含むLNAに結合したOVA("OVA/LNA-ODN#2PS")
100μgの用量の、ODN#2を含むLNAと同時投与されるOVA("OVA+LNA#2PS")
10μgの用量の、ODN#2を含むLNAと同時投与されるOVA("OVA+LNA#2PS")
100μgの用量の、ODN#2と同時投与されるOVA("OVA+ODN#2PS")
10μgの用量の、ODN#2と同時投与されるOVA("OVA+ODN#2PS")
10μgのCTと同時投与されるOVA("OVA+CT")
PBS単独
マウスに免疫化1回あたり75μgの用量でOVAタンパク質を与えた。
100μgの用量の、ODN#2を含むLNAに結合したOVA("OVA/LNA-ODN#2PS")
10μgの用量の、ODN#2を含むLNAに結合したOVA("OVA/LNA-ODN#2PS")
100μgの用量の、ODN#2を含むLNAと同時投与されるOVA("OVA+LNA#2PS")
10μgの用量の、ODN#2を含むLNAと同時投与されるOVA("OVA+LNA#2PS")
100μgの用量の、ODN#2と同時投与されるOVA("OVA+ODN#2PS")
10μgの用量の、ODN#2と同時投与されるOVA("OVA+ODN#2PS")
10μgのCTと同時投与されるOVA("OVA+CT")
PBS単独
マウスに免疫化1回あたり75μgの用量でOVAタンパク質を与えた。
完全に吸入させるためにワクチンを外部鼻孔に滴下して適用する前に、各処置群(n=5)をハロタンで麻酔した。最初の免疫化後の第28日に、血漿を麻酔したマウスから心臓穿刺によって集め、血清チューブに入れた。50μlのPBS(リン酸緩衝生理食塩水)を各マウスの膣にピペットを用いて入れ、そして出すことによって膣洗液を得た。全部で150μlの洗液が集まるまでこの手順を3回繰り返した。その後、マウスを頚椎脱臼によって殺し、チューブを気管に挿入し、1mLのPBSをピペッティングによって入れ、そして出すことによって肺洗液を得た。この手順についての容量回収率は、一般的に70〜80%であった。4℃において10,000rpm(1分あたりの回転数)で5分間の遠心分離の前に、血餅形成のために血清チューブを30分室温に置いた。そして集められた上清のアリコートを分析まで−20℃で貯蔵した。血清のアリコートもまた、分析まで−20℃で貯蔵した。
免疫応答のELISAによる評価
血清、肺洗液、及び膣洗液中のOVA特異的IgG及びIgA抗体を、ELISA(酵素結合免疫測定法)によって測定した。マイクロタイタープレート(96穴)をPBS(50μl)で希釈したOVAの5μlで、4℃で一夜コーティングした。マイクロタイタープレートをその後0.5%Tween20を含むPBS(PBST)で洗浄し、200μlのPBST中1%ウシ血清アルブミン(BSA)を用いて37℃で1時間、BSA-PBSTで希釈した50μlのHRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)結合ヤギ抗マウスIgG(1:4000)又はHRP結合ヤギ抗マウスIgA(1:10)とともに37℃で1時間ブロッキングした。プレートをTMB(100μl)とともに室温で30分インキュベートすることによって発色させ、反応を50μlの0.5MH2SO4で停止した。450〜570nmの吸光度をELISAプレートリーダーで測定した。
血清、肺洗液、及び膣洗液中のOVA特異的IgG及びIgA抗体を、ELISA(酵素結合免疫測定法)によって測定した。マイクロタイタープレート(96穴)をPBS(50μl)で希釈したOVAの5μlで、4℃で一夜コーティングした。マイクロタイタープレートをその後0.5%Tween20を含むPBS(PBST)で洗浄し、200μlのPBST中1%ウシ血清アルブミン(BSA)を用いて37℃で1時間、BSA-PBSTで希釈した50μlのHRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)結合ヤギ抗マウスIgG(1:4000)又はHRP結合ヤギ抗マウスIgA(1:10)とともに37℃で1時間ブロッキングした。プレートをTMB(100μl)とともに室温で30分インキュベートすることによって発色させ、反応を50μlの0.5MH2SO4で停止した。450〜570nmの吸光度をELISAプレートリーダーで測定した。
結果
血清、肺洗液、及び膣洗液中の抗体力価を表す図4及び5、膣洗液及び肺洗液中の抗体力価を表す図8及び9並びに血清中の抗体力価を表す図10に結果を示す。
血清、肺洗液、及び膣洗液中の抗体力価を表す図4及び5、膣洗液及び肺洗液中の抗体力価を表す図8及び9並びに血清中の抗体力価を表す図10に結果を示す。
図5は、ODN#2を含むLNA製剤に結合したOVAを使用する試験製剤においては、OVA特異的IgA抗体レベルが、局所及び離れた粘膜部位の両方で、ODN#2又はODN#1を含むLNA製剤と同時投与したOVA、ODN#2と同時投与したOVA及びCTと同時投与したOVAに比べて数桁増加したことを示す。
図4は、ODN#2を含むLNA製剤に結合したOVAを使用する試験製剤においては、OVA特異的IgG抗体レベルが、局所及び離れた粘膜部位の両方で、ODN#2又はODN#1を含むLNA製剤と同時投与したOVA、ODN#2と同時投与したOVA及びCTと同時投与したOVAに比べて数桁増加したことを示す。
図8は、ODN#2を含むLNA製剤に結合したOVAを使用する試験製剤においては、OVA特異的IgA抗体レベルが、局所及び離れた粘膜部位の両方で、ODN#2を含むLNA製剤と同時投与したOVA、ODN#2と同時投与したOVA、CTと同時投与したOVA、PBS単独に比べて数桁増加したことを示す。
図9及び10は、ODN#2を含むLNA製剤に結合したOVAを使用する試験製剤においては、OVA特異的IgG抗体レベルが、局所及び離れた粘膜部位の両方で、ODN#2を含むLNA製剤と同時投与したOVA、ODN#2と同時投与したOVA、CTと同時投与したOVA、PBS単独に比べて数桁増加したことを示す。
要約するとこのデータは、LNA製剤と結合したOVAを使用した場合にIgA及びIgG応答が大きく亢進されることを実証する。例えば、本発明のODN#2を含むLNA製剤に結合したOVAで免疫化されたマウスは、遊離又は封入されたODN#2を混合されたOVAで免疫化されたマウスと比較して、分析された体液全部においてより大きなIgA力価を示した(図5及び8を参照のこと)。より多量のODNのマウスへの投与がより多量のIgA抗体の産生を引き起こしたように、LNA製剤に結合したOVAについて用量依存性も観察された。このデータは、LNA製剤へのOVAの結合が、粘膜の免疫性に重要な関係を有するIgA抗体を産生するLNA粒子の能力を増加されることができることを実証する。さらに、本発明のODN#2を含むLNA製剤に結合したOVAで免疫化したマウスは、遊離又は封入されたODN#2を混合されたOVAで免疫化されたマウスと比較して、分析された体液全部においてより大きなIgG力価を示した(図4,9及び10を参照のこと)。より多量のODNのマウスへの投与がより多量のIgG抗体の産生を引き起こしたように、LNA製剤に結合したOVAについて用量依存性も観察された。このデータは、LNA製剤へのOVAの結合が、IgG抗体を産生するLNA粒子の能力を増加されることができることを実証する。
Claims (22)
- 哺乳動物において亢進された粘膜の免疫応答を刺激する方法であって、以下のステップ:
前記哺乳動物に、少なくとも1の抗原と結合した脂質−核酸(LNA)製剤を含む免疫刺激性の組成物の有効量を投与するステップを含み、
ここで、前記LNA製剤が以下の:
a)少なくとも1の脂質を含む脂質成分;及び
b)少なくとも1のオリゴヌクレオチドを含む核酸成分;
を含み、
ここで、前記免疫刺激性の組成物が、遊離の形態の前記少なくとも1のオリゴヌクレオチドにくらべて、インビボにおいてIgAの増加した産生を刺激する、前記方法。 - 前記IgA産生が、前記抗原と混合された遊離の形態の前記少なくとも1のオリゴヌクレオチドにくらべて、インビボにおいて少なくとも2倍大きい、請求項1に記載の方法。
- 前記脂質成分が陽イオン性の脂質を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記陽イオン性の脂質がDDAB、DODAC、DOTAP、DMRIE、DOSPA、DMDMA、DC-Chol、DOGS、DODMA及びDODAPから成る陽イオン性の脂質の群から選ばれる、請求項3に記載の方法。
- 前記脂質成分が、DOPE、DSPC、POPC、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノラミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン及びセレブロシドから成る群から選ばれる中性脂質をさらに含む、請求項3に記載の方法。
- 前記脂質成分が、DSPC、DODMA、Chol、及びPEG-DMGを含み、前記DSPC対前記DODMA対前記Chol対前記PEG-DMGの比率が約20:25:45:10モル/モルである、請求項5に記載の方法。
- 前記脂質成分の前記核酸成分に対する比率が約0.01〜0.25重量/重量である、請求項6に記載の方法。
- 前記脂質成分が前記オリゴヌクレオチドを封入する脂質膜を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1のオリゴヌクレオチドがオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)である、請求項1に記載の方法。
- 前記オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)が少なくとも1のCpGジヌクレオチドを含む、請求項9に記載の方法。
- 前記CpGジヌクレオチドがメチル化されているか、又はメチル化されていない、請求項10に記載の方法。
- 前記オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)がODN#1、ODN#2、ODN#3、ODN#4、ODN#5、ODN#6、ODN#7、ODN#8及びODN#9から成るODN群から選ばれる、請求項11に記載の方法。
- 前記オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)がホスホチオエート骨格を有する(ODN PS)、請求項12に記載の方法。
- 前記脂質−核酸(LNA)製剤が抗原をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記抗原が前記脂質−核酸(LNA)製剤に結合している、請求項14に記載の方法。
- 前記脂質成分が外側部分及び内側部分を有する脂質膜を含み、ここで、前記抗原が前記脂質膜の前記外側部分に結合している、請求項15に記載の方法。
- 前記投与が鼻腔内デリバリーによる、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記投与が皮内デリバリー又は皮下デリバリーによる、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記投与がエクスビボのデリバリーによる、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 脂質−核酸(LNA)製剤を含む、改善された粘膜のアジュバントであって、ここで前記LNA製剤が以下の:
a)少なくとも1の脂質を含む脂質成分;及び
b)少なくとも1のオリゴヌクレオチドを含む核酸成分;を含み、
ここで、前記核酸成分が前記脂質成分によって封入されており、且つ前記脂質成分及び前記核酸成分が相乗的に作用して、哺乳動物におけるイムノグロブリンA(IgA)産生を刺激する、前記アジュバント。 - 哺乳動物において抗原特異的なIgA産生を刺激するための、少なくとも1の抗原と併用する、請求項20に記載の改善された粘膜のアジュバントの使用。
- 少なくとも1の抗原と結合した脂質−核酸(LNA)製剤を含む、改善された粘膜のワクチン組成物であって、ここで、前記LNA製剤が以下の:
a)少なくとも1の脂質を含む脂質成分;及び
b)少なくとも1のオリゴヌクレオチドを含む核酸成分;を含み、
ここで、前記核酸成分が前記脂質成分によって封入されており、且つ前記脂質成分及び前記核酸成分が相乗的に作用して、哺乳動物におけるイムノグロブリンA(IgA)産生を刺激する、前記組成物。
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