DE2831535A1

DE2831535A1 - Neues anthracyclinantibiotikum, verfahren zu seiner herstellung und arzneimittel

Info

Publication number: DE2831535A1
Application number: DE19782831535
Authority: DE
Inventors: William T Bradner; Terrence W Doyle; Jun Donald E Nettleton
Original assignee: Bristol Myers Co
Current assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1977-07-18
Filing date: 1978-07-18
Publication date: 1979-03-08
Also published as: GB2001052A; IT7850291A0; FR2398111B1; GB2001052B; FR2398111A1; IT1105531B; CA1110562A; US4162938A; US4123608A

Description

PATENTANWÄLTE

DR.-ING. WOLFRAM BUNTE DR. WERNER KINZEBACH

BAUERSTRASSE 22. D-OOOO MÜNCHEN ΛΟ FEPNRUF ΌΟ9. 37 65 O3 ■ TELEX 52152ΟΘ ISAR D

POSTANSCHRIFT: POSTFACH 78O. D-OOOO MÜNCHEN

München, den 18. Juli 1978 M/19 163

BRISTOL-MYERS COMPANY

345, Park Avenue, New York, N.Y. 10022 U. S. A.

Neues Anthracyclinantibiotikum, Verfahren zu seiner Herstellung und Arzneimittel

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M/19 163

Die Erfindung betrifft ein neues Anthracyclinantibiotikum, ein Verfahren zu seiner Herstellung und ein Arzneimittel.

Die deutsche Patentanmeldung P 27 16 836.1 beschreibt die Fermentation von Actinosporangium sp. ATCC 31127, wobei man einen Antibiotikum-Komplex erhält, der als Bohemsäure bezeichnet wird, sowie die Auftrennung dieses Komplexes in zwei neue Anthracyclin-Antibiotika, welche als Musettamycin und Marcellomycin bezeichnet werden. Musettamycin und Marcellomycin enthalten das Aglycon £-Pyrromycinon und entsprechen den Strukturforeln

COOCH₃

Musettamycin

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und

CH.

3 OH

ο·

COOCH

CH₃CH₂. y

I N(CH₃)

0 ^0H

Marcellomycin.

Auf die gesamte Beschreibung der deutschen Patentanmeldung P 27 16 836.1 wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen.

Erfindungsgemäß wurde Rudolphomycin, ein neues Anthracyclin-Antibiotikum in im wesentlicher reiner Form entdeckt und isoliert. Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung stellten fest, daß Rudolphomycin eine biologisch aktive I-Iebenkomponente des Bohemsäure-Komplexes (bohemic acid complex) ist, die bei der Fermentation von Actinosporangium sp. ATCC 31127 produziert wird.

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Eine Anzahl von f-Pyrromycinon-Glycosiden wurde bereits in der Literatur beschrieben. Beispiele für solche Anthracycline sind:

1. Cinerubin A und Cinerubin B sind in der Britischen Patentschrift 846 130 beschrieben [vgl. auch US-PS 3 864 480 und Keller-Schierlein et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, S. 68 (1979) und Chemical Abstracts, 54, 1466i (1969].

2. Pyrromycin, ein Anthracyclin-Antibiotikum, das Rhodosamin als Glycosid-Zucker enthält, ist in Chem. Ber., 92, 1904-1909 (1959) beschrieben.

3. Galirubin A ist in Chemical Abstracts, 64, 3896g (1966) und Chemical Abstracts, 67, 90573z (1967) beschrieben.

4. Rutilantin ist in Biochem. J., 81, 101-104 (1961) beschrieben.

Trypanomycin ist in Antimicrobial Agents and Chemotherapy, J_, 385-391 (1972) beschrieben, wobei angeführt ist, daß es eine starke Antiprotozoen-Wirkung hat. Es enthält ein Agylcon ähnlich dem ^"-Pyrromycinon, ist mit diesem jedoch nicht identisch»

Das Fachbuch Antibiotics, Band 1, "Mechanism of Action", herausgegeben von David Gottlied und Paul D. Shaw, Springerverlag New York, Inc, N.Y. (1967) enthält auf den Seiten 190 bis 210 eine Zusammenfassung von A. DiMarco mit dem Titel "Daunomycin and Related Antibiotics".

Das "Information Bulletin", Nr. 10, International Center of Information of Antibiotics, bringt in Zusammenarbeit mit der WHO im Dezember 1972, Belgien, eine Zusammenfassung über Anthracycline und deren Derivate.

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Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 zeigt das IR-Absorptionsspektrum von Rudolphomycin, pelletiert in Kaliumbromid.

Figur 2 zeigt das UV-Absorptionsspektrum von Rudolphomycin in Methanol.

Figur 3 zeigt das protonen-magnetische Resonanzspektrum von Rudolphomycin in CDCl- (100 MHz).

Figur 4 zeigt das Kohlenstoff-13 magnetische Resonanzspektrum von Rudolphomycin in CDCl, (25 MHz).

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Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Anthracyclin-Antibiotikum, Rudolphomycin und ein Verfahren zu dessen Herstellung und Isolierung in reinem Zustand, frei von gleichzeitig produzierten Substanzen. Man erhält das Antibiotikum, indem man einen Rudolphomycin-produzierenden Stamm von Actinosporangium sp. mit den charakteristischen Eigenschaften von ATCC 31127 oder einen Mutanten davon, in einem wässrigen Medium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter submersen aeroben Bedingungen kultiviert, bis der Organismus eine wesentliche Menge Bohemsäurekomplex in dem Kulturmedium produziert hat, den Bohemsäure-Komplex aus dem Kulturmedium gewinnt und diejenige Fraktion des Komplexes, welche Rudolphomycin in Mischung mit Marcellomycin enthält, ζ·Β. durch Chromatographie an alkyliertem vernetztem Dextran-Adsorbens abtrennt und isoliert, und das Rudolphomycin, das frei von gleichzeitig produzierten Substanzen ist, aus dieser Mischung z.B. durch Chromatographie auf mit Säure gewaschenem Silicagel abtrennt und isoliert. Rudolphomycin und dessen pharmazeutisch verträgliche Salze zeigen sowohl antimikrobielle als auch Antitumor-Wirkung.

Wie oben bereits erwähnt, wurde gefunden, daß Rudolphomycin eine Nebenkomponente des in der deutschen Patentanmeldung P 27 16 836 beschriebenen Bohemsäure-Komplexes ist. Diese Anmeldung beschreibt die Fermentation von Actinosporangium sp. C-36,145 zur Herstellung des Bohemsäure-Komplexes und die Auftrennung dieses Komplexes in zwei biologisch aktive Komponenten, Musettamycin und Marcellomycin. In der vorstehenden Anmeldung ist jedoch nirgends das Anthracyclin-Antibiotikum Rudolphomycin beschrieben, von dem nun gefunden wurde, daß es ebenfalls bei der Fermentation des Actinosporangium sp. Stammes C-36,145 erhalten wird.

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Der oben erwähnte, Bohemsäure produzierende Organismus wurde aus einer in Ontario, Canada, entnommenen Bodenprobe erhalten. Eine Kultur des Organismus wurde ohne Beschränkung

der Zugänglichkeit in der American Type Culture Collection, V7ashington, hinterlegt und unter der Bezeichnung ATCC 31127 eingereiht,

Das erfindungsgemäße neue Antibiotikum wurde in im wesentlichen reiner Form aus dem Bohemsäure-Komplex isoliert und durch seine physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften, wie nachstehend detaillierter aufgeführt, gekennzeichnet.

Rudolphomycin ist ein Anthracyclin-Antibiotikum bestehend aus dem Aglycon £ -Pyrromycinon, dem Amino-Zucker Rhodosamin und einem oder zwei noch nicht identifizierten Zuckern. Es hat die Teilstruktur

CO₅CH-,

-Ί3 14

• 1-2 H₂O

worin X für einen noch nicht identifizierten Zuckerrest steht, dem versuchweise die Molekularformel C₁₂H₁₃NO₅ zugeschrieben wurde.

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Rudolphmycin ist ein roter Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 171-175 ⁰C (Zers.). Es besteht aus den Elementen Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff im wesentlichen mit den nachstehend aufgeführten Gewichtsprozenten.

Kohlenstoff 58,08 %

Wasserstoff 6,31 %

Stickstoff 3,05 %

Sauerstoff (durch

Differenz) 32,56 %

Die versuchsweise berechnete Summenformel ist

^C42^H52^N2°16* ¹~^{2 H}2°" (^Die Verbindung wird in Hydratform mit 1 bis 2 Molekülen Wasser pro Molekül Anthracyclin gewonnen.)

Das Infrarotabsorptionsspektrum von Rudolphomycin, in Kalium bromid pelletiert (1 mg/90 mg KBr) ist in Figur 1 der beigefügten Zeichnungen aufgeführt. Charakteristische Infrarotabsorptionsbanden zeigen sich bei folgenden Wellenlängen,
ausgedrückt in cm :

3460, 3410, 2980, 2940, 2820, 2770, 1735, 1600, 1450, 1315, 1295, 1220, 1160, 1118, 1040 und 1010.

Figur 2 der Zeichnungen stellt das UV-Absorptionsspektrum
von Rudolphomycin in Methanol (0,01795 g/Liter) dar.
Beobachtete Absorpitonsmaxima und Absorptionen:
233 πιμ, 53,01; 257 πιμ, 33,2; 280 ΐημ, 35,43; 490 ΐημ, 16,46;
Schultern bei 466, 480, 511 und 523 ΐημ.

Ein protonenmagnetisches ResonanzSpektrum von Rudolphomycin wurde mit einem Varian HA-100 Spektrometer bei 100 MHz
durch Lösen von etwa 28 mg des Antibiotikums in 0,5 ml CDCl₃ und Verwendung von Tetramethylsilan (TMS) als innerem Standard aufgenommen. Die beobachteten chemischen Verschiebungen (in ppm) und Termsymbole sind:

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7,68 (s, 1H, C-H), 7,28 (s, 2H, C₃-H + C₃H), 5,53 (bs, 1H), 5,32 (s, 1H), 5,28 (m, 1H), 5,26 (s, 1H), 5,10 (m, 2H, 1 austauschbar) (Bereich von 5,53-5,0 C₇-H + anomeren Protonen + möglichen olefinischem Proton zugeordnet), 4,56 (m, 311), 4,14 (s, 1H, C₁₀-H), 4,10 (m, 4H), 3,80 (m, 2H), 3,72 (s, 3H, CO₂CH₃), 2,20 (s, 6H, N(CH₃J₂, 2,70 bis 1,60 (m, 12H), 1,28 (m, ~12H, Dubletts und Triplett für 4CH__ Gruppen).

Ein protonenmagnetisches ResonanzSpektrum von Rudolphomycin wurde auch mit einem Varian XL-100 Spektrometer bei 100 MHZ bestimmt, indem man 15 mg des Antibiotikums in 0,5 ml deuteriertem Pyridin (Cj-D₁-N) löste und Tetramethylsilan (TMS) als inneren Standard verwendet. Es wurden folgende chemische Verschiebungen (in ppm) und Termsymbole beobachtet: 7,88 (s, 1H, C₁₁-H), 7,39 (s, 2H, C₃, C₃-H¹S), 5,88 (s, 1H), 5,82 (bs, 1H), 5,71 (s, 1H), 5,52 (Q, 1H, gekoppelt an CH₃ bei 1,71), 5,45 (m, 1H, gekoppelt an CH„ oder CH im Bereich 2,5-3,.O), 5,29 (bs, 1H), 4,84 (m, 1H, gekoppelt an CH₃ bei 1,54), 4,74 (m, 1H, gekoppelt an CK₂ oder CH im Bereich 2,5-3,0), 4,48 (s, 1H, C₁₀-H), 4,37 (m, 1H, gekoppelt an CH₃ bei 1,45), 4,23 (bs, 1H), 3,93 (bs, 1H, gekoppelt an CH₃ oder CH im Bereich 2,0-2,5), 3,72 (s, 3H, CO₂CH₃), 2,5-3,0 (m, 3H, 2,0-2,5 (m), 2,13 (s, 6H, N(CH,)_), 1,71 (d, 3H, CH,- ■ gekoppelt an CH bei 5,52), 1,54 (d, 3H, CH₃-gekoppelt an CH box 4,84), 1,45 (d, 311, CH₃ gekoppelt an CH bei 4,37), 1,39 ; (t, 311, C₁₄ Protonen). :

Ein Kohlenstoff-13 magnetisches Resonanzspektrum von \

Rudolphomycin wurde mit einem Varian XL-100 Spectrometer bei 25 MHz durchgeführt, indem an etwa 70 mg des Antibiotikums in 0,5 ml CDCl₀ auflöste und Tetramethylsilan (TMS) j

^J ' i

als inneren Standard verwendet. Dieses ResonanzSpektrum

wird durch Figur 3 der Zeichnungen dargestellt. Beobachtete j chemische Verschiebungen (in ppm bezogen auf Tetramethylsilan) ^: und Multiplizitäten für C magnetische Resonanzspektren ■ von Rudolphomycin in CDCl₃, CD₂Cl₂ und DMSO-d_ß Lösungsmittel : sind:

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Rudolphomycin ' CMR-Daten

■ Nr. ¹	CDCl	ppm CD₂Cl,	, DMSO-dg	Multiplizität DMSO-d, 6	Zuordnungen	^C10a	) ~\
1	194.1	193.7	I92.7	S	Cji"	^C6aAla
2	190.6	190.8	I88.5	S	*	J C,
3 4 5	185.6 171.2 162.3	185.0 171.3 162.4	184.1 170.4 I61.2	S S S	5 ⁰I₂ ^C15 ^C6	11 °12a Cl,
6	159.0	158.8	I61.2	S	D	4 a 1
7	158.5	158.6	157-0	S
8	157.8	158.O	156.5	B
9 10	142.6 132.8	142.9 132.9	141.8 131..3	S S	' ^CT > Cj, , C₀ ' '	C₁', C₁", C₁'
11	131.6	131.5	131.1	S	1 H d*	C₃"'
12	130.1	130.2	129.5	d
13	129.6	130.0	128.8	d
14	120.4	120.5	II8.7	d
15 16 17	114.8 112.5 112.4	114.8 II2.5 112.4	113.6 111.3 111.1	S ε S
18	101.6	IOI.9	100.4	d
19	99-5	99.6	98.3	d
20	97.1	96.9	95.6	d
21	95.1	95.8	92.9	d

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M/1	9 163	83.8	80.0	- 14 -	d
22	83.1	74.4	73.3	d
23	7^.3	72.3	70.0	S
24	72.6	71.8	69.9	d
25	71.7	70.9	68.9	d
26	70.7	68.6	67.4	t or d
27	68.4	67.0	66.5	d
28	66.8	65.8	64.6	d
29	65.6	62.0	61.1	d
30	61.7	57.6	56.4	d
31	57.3	52.6	52.2	Q
32	52.4	43.4	42.9	Q
33	43.2	34.6	33:6	t
34	34.3	34.3	33.3	t
35	34.1	32.6	31.4	t
36	32.3	29.6	28.9	t
37	29.3	18.0	17.4	Q
38	17.9	17.6	17.1	Q
39	17.4	15.9	16.2	Q
40	15.7	6.9	6.6	Q
41	6.7

^ül6 N(CH₃J₂

³13 C₆- , C₆Vc₆'" ^C14

In einem Lösungsmittelsystem bestehend aus Toluol:Methanol: Aceton (3:1:1) (Vol/Vol) zeigt Rudolphomycin bei Dünnschichtchromatographie mit Silicagel einen R_f Wert von 0,31-0,34.

Unterwirft man es unter den nachstehend aufgeführten Bedingungen einer Hochdruckflüssigkeitschromatographie, so hat Rudolphomycin eine Retentionszeit von 5,0 Minuten.

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Gerät: Waters Associates, Inc.

Modularkomponenten

Säule: 30 cm χ 4 mm a-PORASIL Säule

Mobile Phase: CH₂Cl :CH OH-.NH.OH (konz.) in einem

Verhältnis von 96:4:1 Flxeßgeschwindigkeit: 1,5 ml/Min.
Detektor: · 254 ΐημ UV Detektor (Varian Associates

Inc.)

Rudolphomycin bildet sowohl mit Säuren als auch mit Basen Salze, und die pharmazeutisch verträglichen Salze mit derartigen Säuren und Basen fallen ebenfalls unter den Rahmen der Erfindung. Beispiele für solche pharmazeutisch verträglichen Salze sind dem Fachmann aufgrund seiner Kentnis anderer Anthracyclin-Antibiotika dieses Typs bekannt. Die Salze sind einfach erhältlich, indem man Rudolphomycin in einem inerten Lösungsmittel mit der geeigneten Säure oder Base umsetzt. Beispiele für solche pharmazeutisch verträglichen Salze sind Salze mit organischen oder anorganischen Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Essigsäure oder Propionsäure, Salze mit Metallkationen, wie Alkalimetall- oder Erdalkalimetallkationen, , ■ beispielsweise, Natrium, Kalium, Calcium oder Magnesium, und Ammonium- oder organische Aminsalze, wie Äthanolamin, Äthylendiamin, Diäthanolamin, Procain oder Triäthanolamin.

Die Herstellung des erfindungsgemäßen neuen Anthracyclinantibiotikums wird nachstehend beschrieben.

Der Mikroorganismus

Der Stamm C-36,145 weist folgende morphologische Merkmale auf. Der Stamm bildet einen sporangiumartigen Körper (falsches Sporangium) an der Spitze des Sporenträgers (Sporophors), welcher eine Agglomerierung einer dicht ! verknäuelten bzw. zusammengerollten Sporenkette darstellt. : Die Sporenkette ist häufig mit den benachbarten Lufthyphen | (aerial Hyphae) verflochten und entwickelt sich zu der sporangiumartigen Struktur, die durch ein zähes Material bedeckt-ist,- Der sporangiumartige Körper und das Luftmyzel

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bilden sich an Glukose/Asparagin-Agar, Tyrosinagar, Hefeextrakt /Malz extrakt -A gar und Hafermehlagar. Außer einer grossen Zahl falscher Sporangien entstehen auch (allerdings wesentlich weniger) gewöhnliche Sporenketten, welche offene Spiralen bilden. Die Sporen im sporangiumartigen Körper besitzen eine glatte Oberfläche und ellipsoide Form und sind nicht freibeweglich. Die Sporen in der gewöhnlichen Sporenkette weisen eine ovale Form und eine glatte oder gelegentlich warzige Oberfläche auf. Das primäre Myzel ist verzweigt» nicht-septiert und nicht-fragmentiert.

Tabelle I zeigt die an verschiedenen Medien erzielten Kultureigenschaften. Der Stamm C-36,145 gedeiht an den meisten getesteten Agarmedien gut, die Bildung des Luftmycels und die Sporenbildung verlaufen jedoch etwas langsam. Die Ilassenfarbe des Luftmycels ist ein hell-grünliches Grau. Die Rückseite der Wachstumskultur ist in Glukose/Asparagin-Agar, anorganische Salze/Stärke-Agar, Hefeextrakt/Malzextrakt-Agar und Hafermehlagar rötlichorange bis rot gefärbt. In Tyrosinagar und Pepton/Hefeextrakt/ Eisen-Agar bildet sie ein melanoides Pigment.

Die physiologischen Merkmale bzw. die Kohlenhydratverwertung des Stammes C-36,145 sind aus den Tabellen II bzw. III ersichtlich. Die Kultivierungstemperatur liegt im Bereich von 20 bis 37⁰C; bei 45⁰C wird keine Proliferation beobachtet.

Der Stamm C-36,145 enthält in der Zellwand als charakteristische Aminosäurekomponenten LL-Diaminopimelinsäure (LL-DAP) und Glycin. Diagnostisches Kohlenhydrat ist nicht vorhanden.

Die morphologischen, physiologischen und Kultivierungsmerkmale des Stammes C-36,145 entsprechen jenen des Stammes Streptomyces mit Ausnahme der Bildung des sporangiumartigen Körpers. Die Zellwandzusammensetzung entspricht ebenfalls

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jener der Gruppe Typ I (Streptomyces-Typ) gemäß der Klassifikation von lechevalier and Lechavalier in "Int.J.Syst. Bacteriol. 20 (1970), Seiten 435 "bis 443. Der sporangiumartige Körper des Stammes C-36,145 unterscheidet sich anscheinend von dem durch die einwandfrei definierten sporangiumbildenden Gattungen erzeugten normalen Sporangium darin, daß

(1) die letzteren in einer frühen Wachsturnsstufe kleine Sporangien bilden, welche im Verlauf der Zeit reifen, und

(2) die gewöhnlichen Sporangien in der Regel nicht von einem viskosen Material bedeckt sind.

Krassilnikov und Tsi-Shen haben 1961 die neue Gattung Actinosporangium innerhalb der Familie Actinoplanaceae (später übertragen in die Pamilie Streptosporangiaceae) für den Mikroorganismus vorgeschlagen, der eine Sporenmasse bildet, die dem Sporangium sehr ähnlich ist; vgl. Isv. Akad. Navk. UdSSR, Ser.Biol. (1961), Seiten 113 bis 116. Später wurde gefunden, daL· der sporangiumartige Körper eine zähe, sporenbildende Masse darstellt und sich vom wirklichen Sporangium unterscheidet. Die Gattung Actinosporangium wurde aufgrund ihrer morphologischen Eigenschaften und der zur Gruppe vom Typ I gehörenden Zellwandzusammensetzung in die Familie Streptomycetaceae eingereiht .

Auf der Grundlage sämtlicher verfügbaren Merkmale ist der Stamm C-36,145 somit als eine neue Art des Genus Actinosporangium anzusehen. Es sei jedoch festgestellt, daß in der Literatur nur zwei Arten der Gattung Actinosporangium erwähnt werden und daß diese Gattung daher noch nicht voll bestätigt wurde; vgl. H.Prauser, "Die Aktinomycetalen", Int. Symposium der Systematik, 1968, Veb.

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Gu3tav Fischer Verlag, Jena (1970), Seiten 529 bis 335.

Die vorliegende Erfindung beschränkt sich nicht auf die Verwendung des speziellen Stammes C-36,145 oder auf Mikroorganismen, welche völlig mit der vorstehenden Beschreibung übereinstimmen. Insbesondere sollen andere, Rudolphornycin bildende Stämme oder Mutanten dieses Mikroorganismus miteinbezogen sein, welche aus dem beschriebenen Mikroorganismus durch verschiedene Methoden, wie Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder UV-Licht, Behandlung mit Stickstoff-Senfgasen oder Einwirkenlassen von Phagen erzeugt werden können.

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	Rohrzucker/	TABELLE I	rückseitige Farbe	36,145	diffundierbares Pigment	tv> CD
	Nitrat-Agar	Kulturmerkmale des Stammes C	gelblich-rosa	Luftmyzel	keines	CO
	Glukose/Aspara-	Wachstum		spärlich, weißlich		cn
	gin-Agar	mäßig	rötlich-orange		keines oder röt	CO
	G-lyc erin/Aspara-		bis rot	üppig, gräuliches	lich-orange	cn
	gin-Agar	gut	rosarot	Blatt	keines oder röt-
	anorganisches			mäßig, hellgrau bis	lich-rosa
α» ο	Salz/Stärke-Agar	gut	rötlich orange	blaßrosa	hellorange, teil
CD	Tyrosinagar		bis tiefrot	gering, gräuliches	weise hellgelb
CO			braun bis tief	Blatt	dunkelbraun
O	Nähragar	mäßig	pur pur-braun	gering, gräuliches
	Hefeextrakt/	gut	farblos	Blatt	keines
σ>	Malzextrakt-Agar		tiefrot	keines	hellbraun
cn		schlecht		mäßig, gräuliches
	Hafermehlagar			Blatt, teilweise
		gut	lebhaftes Röt	gräulich-rosa	lebhaftes Orange
	Pepton-Hefe-		lich-orange	mäßig, gräuliches
	extrakt/Eisen-	mäßig	schwarz	Blatt	schwarz
	Agar			keines
		mäßig

Tests

Nitratreduktion in
anorganischem Medium

Nitratreduktion in
organischem Medium

Magermilchagar

10$ige Magermilchlösung

Gelatine stich

Melaninbildung
Wachstumstemperatur

NaCl-Verträglichkeit

TABELLE II
Physiologische Eigenschaften des Stammes C-56,145

Heaktionen

stark positiv
stark positiv

üppiges Wachstum; negative Hydrolyse; tief gelblich-rotes bis tief rötlich-purpurnes Myzelpigment

bräunliche Brühenfarbe; rötlich-oranges Ringwachsturn; weder Peptonisierung noch Koagulierung

rasche und vollständige Verflüssigung

stark positiv

optimales Wachstum bei 28⁰C; mäßiges Wachstum bei 20 bis 37⁰C; langsames Wachstum bei 15⁰C; kein Wachstum bei 10⁰C bzw. 43⁰C

mäßiges Wachstum bei 0,5 bis 4 $> NaCl; kein Wachstum bei 8 % NaCl

angewendete Methoden und Materialien

Rohrzucker/Nitrat-Brühe nach Czapek

Nitratmedium; 0,5 $ Hefeextrakt» 1,0 ^ Glukose, 0,5 % KNO₂. und 0,1 f. CaCO₅ °

Leudemann-Medium [Intl.J.Syst. Bacteriol. 21 (1971). Seiten 240 bis 247]

Basalmedium: 0,4 % Hefeextrakt, 1,0 fi Malzextrakt und 0,4 i* Glukose

Tyrosinagar und Pepton/Hefeextrakt/ Eisen-Agar

Hefeextrakt/Malzextrakt-Agar

Basalmedium: 1 % Hefeextrakt, 2 °jo lösliche Stärke und 1,5 % Agar

K) OO CO

cn

CO

cn

CTv OJ

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TABELLE III

Kohlenhydratverwertung des Stammes C-36>145

D(-)-Arabinose -

L(+)-Ara"binose ++

D-XyIose ++

D-Ribose ++

L-Rhamnose ++

D-Giukose ++

D(+)-Galactose ++

D-Fructose ++

D-Mannose ++

Rohrzucker ++

Maltose ++

Milchzucker ++

D(+)-Melit)iose ++*)

Eaffinose ++*) D(+)-Melezitose

lösliche Stärke ++ Cellulose

Glycerin ++

Inosit ++

D-Mannit ++*) Sorbit
Dulcit

Basalmedium: Pridham-Gottlieb-Medium

*) reiche Bildung eines rötlich-orangen Pigments

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Herstellung des Boheinsäurekomplexes

Der Bohemsäurelcoiiiplex kann durch Kultivierung eines boheasäurebildenden Stammes von Actinosporangium sp. mit den Merkmalen von A.T.C.C. 31127 oder eines Mutanten davon unter submersen aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium erzeugt werden. Der Organismus wird in einem Nährmedium gezüchtet r das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, z.B. ein assimilierbares Kohlenhydrat, enthält. Spezielle Beispiele für geeignete Kohlenstoffquellen sind Rohrzucker, Milchzucker, Maltose, Mannose, Fructose, Glukose, Glycerin und lösliche Stärke. Das Nährmedium soll ferner eine assimilierbare Stickstoffquelle, wie Fischmehl, Pepton, Sojamehl, Erdnußmehl, Baumwollsaatmehl oder Maisquellwasser (corn steep liquor) enthalten. Man kann dem Medium auch anorganische Nährsalze einverleiben. Beispiele dafür sind beliebige der üblichen Salze, welche dazu befähigt sind, Ionen wie Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid-, Bromid-, Nitrat-, Carbonationen oder ähnliche Ionen zu liefern.

Die Herstellung des Bohemsäurekoinplexes kann bei einer beliebigen Temperatur erfolgen, weiche ein zufriedenstellendes Wachstum des Mikroorganismus gewährleistet. Man arbeitet beispielsweise bei 20 bis 37⁰G, zweckmäßig bei etwa 27⁰C.

Das Medium ist normalerweise schwach alkalisch; der genaue pH-Wert kann jedoch in Abhängigkeit vom speziellen verwendeten Medium weitgehend variiert werden.

Die Fermentation (Gärung) kann in Erlenmeyer-Kolben oder in Labor- oder Industriefermentern mit verschiedenem Fassungsvermögen durchgeführt werden. Wenn die Fermentation in einem Gärbottich erfolgen soll, stellt man zweckmäßig ein vegetatives Inokulum in einer Nährbrühe her, indem man ein geringes Volumen des Kulturmediums mit der Sporenform des Mikroorganis-

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mus beimpft. Nachdem man auf diese Weise ein aktives Inokulum erhalten hat» überträgt man es zur großtechnischen Herstellung der Antibiotika unter aseptischen Bedingungen in das Gärbotticbmedium. Das für dau vegetative Medium verwendete Inokulum kann dem für größere Fermentationen verwendeten Medium entsprechen obwohl man auch andere Medien verwenden kann.

Wie es bei aeroben Submerskulturmethoden üblich ist, wird sterile Luft durch das Kulturmedium geblasen. Das Medium kann mit Hilfe von Bewegungsvorrichtungen bzw. Rührern, wie sie in der Fermentationstechnik allgemein üblich sind, in Bewegung gehalten werden.

Eine optimale Bildung des Bohemsäurekomplexes wird im allgemeinen nach Inkubationsperioden von etwa 190 bis 210 Std. in Rührgefäß- oder Bottichfermentern erzielt. Der Verlauf der Gärung kann dadurch verfolgt werden, daß man das Gärmedium von Zeit zu Zeit gegenüber einem für den Bohemsäurekomplex empfänglichen Mikroorganismus, z.B. D.pneumoniae, St. pyogenes oder S. aureus, testet.

Der Bohemsäurekomplex kann aus dem Gärmedium durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren, organischen Lösungsmittel, beispielsweise chlorierten Kohlenwasserstoffen (z.B. Methylenchlorid, Chloroform), mit Wasser nicht mischbaren Alkoholen (z.B. n-Butanol oder Amylalkohol), Alkylestern von Fettsäuren (z.B. Äthylacetat, Butylacetat) oder Ketonen (Methylisobutylketon, Methylamylketon) isoliert werden. Bevorzugte polare organische Lösungsmittel sind n-Butanol, Methylisobutylketon oder fithylacetat, wobei Methylisobutylketon das für die Extraktion bevorzugteste Lösungsmittel ist„ Da die antibiotische Aktivität überwiegend in der Brühe festgestellt wird, kann man diese vor der Extraktion filtrieren. Nach der bevorzugten

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Methode extrahiert man jedoch die gesamte Gärbrühe mit dem organischen Lösungsmittel bei einem pH-Wert von etwa 7,5 bis 3/5. Anschließend kann man die organische Phase filtrieren und trocknen, wobei man den festen Bohemsäurekomplex erhält. Wahlweise kann der organische Extrakt eingeengt und der feste Komplex durch Verdünnen mit einem geeigneten NichtLösungsmittel, wie Skellysolve B (isomere Hexane), ausgefällt werden.

Auftrennung und Isolierung von Rudolphomycin

Der nach dem oben beschriebenen Fermentationsverfahren hergestellte Bohemsäurekomplex enthält Musettamycin und Marcellomycin als hauptsächliche biologisch aktive Bestandteile. Erfindungsgemäß wurde jedoch gefunden, daß in dem Komplex ein drittes biologisch aktives Anthracyclin, nämlich Rudolphomycin, als Nebenko/nponente enthalten ist. Diese neue Komponente kann in hochreinem Zustand, frei von gleichzeitig produzierten Substanzen aus dem Komplex abgetrennt werden und stellt sich aufgrund ihrer physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften als ein neues Anthracyclin-Antibiotikum dar.

Ein Verfahren zur Auftrennung des Bohemsäurekornplexes in Musettamycin und Marcellomycin ist in der deutschen Patentanmeldung P 27 16 836 beschrieben. Bei diesem Verfahren wird eine Lösung des Bohemsäurekomplexes in einem geeigneten Lösungsmittel (z.B. Chloroform) an einer Säule chromatographiert, welche mit einem geeigneten Adsorbens, wie einem alkylierten vernetzten Dextran (z. B. Sephadex LH-20, vertrieben von Pharmacia Fine Chemicals, Inc.), gefüllt ist. Die Marcellomycin und Musettamycin-Komponenten werden dann mit einem geeigenten organischen Lösungsmittel, wie Chloroform, aus dem Adsorbens eluiert. Man" fängt mehrerevFrafct±enen:auf j

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und bestimmt unter geeigneter Verdünnung deren Absorptionen bei 490 κιμ mit einem Kolorimeter. Man trägt die erhaltenen Werte graphisch gegen die Nummern der entsprechenden Fraktionen auf, um die Peaks für die aus der Säule eluierten Komponenten zu bestimmen. Die bei diesem Elutionsprozess gefundenen Musettamycin und Marcellomycin-Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Dabei erhält man die einzelnen Antibiotika in fester, teilweise gereinigter Form. Anschließend kann man die Feststoffe dann aus einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie Acetonitril, Methanol oder Chloroform Skellysolve B Umkristallisieren,

Bei der Durchführung des oben beschriebenen Chromatographieverfahrens stellt man vier deutliche Banden von Anthracyclinpigmenten fest, welche in Form von teilweise gereinigten Feststoffen gewonnen werden können. Die ersten zwei eluierten Banden betreffen inaktive Fraktionen. Die dritte Bande erweist sich als Musettamycin. Bande vier besteht überwiegend aus Marcellomycin aber bei Dünnschichttchromatographie (6:2:2) (Toluol!Methanol:Aceton) (Vol/Vol) zeigte sich eine zweite Komponente, welche, den gleichen R--Wert wie Musettamycin hat (0,31-0,34). Querst wurde angenommen, daß es sich um nicht abgetrenntes Musettaaiycin handele, aber sorgfältige erneute Chromatographie an. Sephadex LH-20 ergab keine zusätzlichen Mengen dieses Antibiotikums. Es wurde nur ein einzelner Peak eluiert, und wie'sicl|,-durch Dünnschichtchromatographie zeigte, war dies noch immer eine Mischung mit der gleichen Zusammensetzung wie das Ausgangsmaterial. Erfindungsgemäß wurde, nun gefunden, daß die aus der vierten Bande nach LH-20 Chromatographie des Bohemsäurekomplexes erhaltenen Feststoffe aus einer Mischung von Marcellomycin und einem neuen Anthracyclin-Antibiotikum bestehen, welches die Bezeichnung Rudolphomycin erhielt. Die Abtrennung und Isolierung des Rudolphomycins aus der oben erwähnten Mischung von Rudolphomycin und Marcellomycin kann mit Hilfe des nachfolgend beschriebenen Chromatographieverfahrens erfolgen.

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283Ί535

Man löst die Feststoffe (eine Mischung von Rudolphomycin und Marcellomycin), welche nach LH-20 Chromatographie des Bohemsäurekomplexes aus Bande 4 erhalten wurden, in einem geeigenten organischen Lösungsmittel, beispielsweise 19:1 Toluol!Methanol (Vol/Vol). Diese Lösung chromatograpiert man dann an einer Säule, welche mit mit Säure gewaschenem Silicagel gefüllt ist, das dann wiederum mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie 19:1 Toluol:Methanol (Vol/Vol) entwickelt wird. Beim Füllen der Säule suspendiert man das Silicagel in einem geeigneten Lösungsmittelsystem, wobei man vorzugsweise das gleiche System wie für die Entwicklung verwendet. Beste Ergebnisse erhält man, wenn das Silicagel vor der Entwicklung, beispielsweise durch Behandeln der Säule (Silicagel + Lösungsmittelsystem) mit genügend konzentriertem Ammoniumhydroxyd, neutralisiert, so daß man einen pH-Wert von etwa 3 erhält. Die aus der Säule auslaufenden Fraktionen warden entweder mittels Dünnschichtchromatographie oder durch ein Colorimeter (490 ΐημ} überwacht, und diejenigen Fraktionen, welche ausschließlich oder nahezu ausschließlich Rudolphomycin enthalten, werden zur Trockne eingedampft, wobei man das Antibiotikum in hochreiner Form, praktisch frei von Marcellomycin und anderen gleichzeitig produzierten Substanzen des Bohemsäurekomplexes erhält.

Gewünschtenfalls kann das Rudolphomycin mit dem in Beispiel 7 näher beschriebenen Hochduckflüssigkeitschromatographieverfahren weiter gereingit werden. Nach dieser Methode erhält man extrem reine Proben des Antibiotikums.

Biologische Aktivität

Die in vitro Mindesthemmkonzentrationen (MIC) von Rudolphomycin werden für eine Reihe von Mikroorganismen nach dem Standard-Röhrchenverdünnungsverfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend zusammengefaßt.

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Antimicrobielles Spectrum von Rudolphomycin

Test-Organismen MIC in

Bakterien:

Streptococcus pneumonlae A-9585 O.25

Streptococcus pyogenes A-96o4 O.5

Staphylococcus aureus A-9537 2

Staphylococcus aureus A-9606 8

Streptococcus^ faecalls A-20688 ^

Escherichla coil A-I5119 >63

Escherlchia coil A-203ⁱfl-l >63

KlobGIe11a pncumonlae Λ-1513Ο > 63

Proteus mlrabllls A-99OO >63

Proteus vulgaris Λ-9716 > 63

Serratla marccscens Α-20019 >63

Enterobacter cloacae Α-9^59 >6$

PsGudomonas aeruglnosa A-9843A > 63

Fungi:

Candida alblcans A-95^0 >125

Candida troplealIs Λ-15Ο51 >125

Candida krusel Λ-Ι5052 >125

Cryptococcus noοformans A-I5053 63

Trichophyton mentagrophytes A-9870 >I25

Mlcrosporum canis A-9872 >125

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Die orfindungsgemäße Verbindung wurde auch gegen transplantierbaren Mäusetumor, L 1210, lymphatische Leukämie, getestet, der auf Antxturmormittel vom Anthracyclintyp anspricht. Die angewandten Verfahren entsprachen im allgemeinen den Protokollen des National Cancer Institute (Cancer Chemotherapy Rep., Teil 3, 3^ 1-103 (1972). Die wesentlichen experimentellen Details sind nachstehend aufgeführt. Es wurden vier verschiedene Dosierungen getestet:

(1) Einzeldosis,

(2) Tag 1 + jeden dritten Tag (Tage 1, 4 und 7),

(3) täglich fünf Tage lang (QD 1—»5),

(4) täglich, 9 Tage lang (QD 1-^9J.

Es ergeben sich nur geringe Hinweise auf eine Abhängigkeit vom Verabreichungsschema, mit der Ausnahme, daß die Behandlung QD 1~>9 am wenigsten wirksam ist.

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Wirkung von Rudolphomycin auf L-1210 Leukämie

Material

Rudolphomycin

Behandlungs- Anzahl tage der

Rudolphomycin

1,4,7

Rudolphomycin

Dosis mg/kg/Inj.	MST Tage	Wirkung MST % T/C	durchschnittl. Gewichts veränderung, g	Überlebende Tage
12,8	10,0	143	-2,5	3/6
6,4	10,0	143	+ 0,3	3/6
3,2	10,0	143	+ 0,3	5/6
1,6	8,0	114	+ 0,6	6/6
0,3	8,0	114	+ 1,6	6/6
0,4	8,0	114	+ 1 ,0	6/6
6,4	9,0	129	-0,6	4/6
3,2	7,0	100	-2,4	4/6
1/6	10,0	143	+ 0,5	6/6
0,8	9,5	136	+ 1,2	6/6
0,4	8,0	114	+ 2,7	6/6
0,2	8,0	114	+ 1,7	6/6
3,2	9,0	129	-0,6	4/6
1/6	9,0	129	-0,4	5/6
0,8	10,0	143	+ 0,3	6/6
0,4	9,0	129	+ 0,9	6/6
0,2	9,0	129	f2,2	6/6
0,1	8,0	114	+ 0,8	6/6

Wirkung von Rudolphomycin auf L-1210 Leukämie

Material

Rudolphomycin

Behandlungs tage	Anzahl der Injektionen	Dosis nvg/kg/In j.	MST Tage	Wirkung IBT % T/C	durchschnittl. Gewichts veränderung, g	überlebende Ta^a
1-» 9	9	1,6	7,5	107	-0,9	6/6
		0,8	9,0	129	+0,2	6/6
		0,4	9,0	129	+1,0	6/6
		0,2	9,0	129	+1,0	6/6
		0,1	7,5	107	+2,9	6/6
		0,05	8,0	114	+3,0	6/6

Kontrolle

Kochsalzlösung

7,0

10/10

CTl LO

Tumor Inokulum: 10 Ascites-Zellen i.p. implantiert* Wirt: BDF-. weibliche Mäuse Bewertung: MST = Mittlere Uberlebenszeit (median survival time) Wirkung: % T/C = MST behandelter Tiere / MST Kontrolltiere χ

Maßstäbe: T/C % 125 wurde als signifikante Antituritorwirkung bewertet.

K) CO CO

cn

CO

cn

Wie die obigen Werte für die antimikrobielle und die Wirkung gegen Tumore bei der Maus belegen, ist Rudolphomycin und seine pharmazeutisch verträglichen Salze als Antibiotikum (beispielsweise gegen grampositive pathogene Bakterien, wie Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus faecalis und Staphylococcus aureus) und als Antitumormittel zur Inhibierung maligner Tumore, wie Leukämie L1210, bei Säugern wirksam. Die Erfindung umfaßt auch pharmazeutische Mittel, welche eine wirksame antimikrobielle oder Tumor inhibierende Menge Rudolphomycin oder eines pharamzeutisch verträglichen Salzes davon in Kombination mit einem inerten, pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel enthalten. Diese Mittel können auch weitere aktive antimikrobielle oder Antitumormittel enthalten. Diese Mittel können in beliebiger für die gewählte Verabreichungsform geeigneter Formulierung vorliegen. Beispiele hierfür sind feste Mittel zur oralen Verabreichung, wie Tabletten, Kapseln, Pillen, Pulver oder Granulate, flüssige Mittel zur oralen Verabreichung, wie Lösungen, Suspensionen, Sirupe oder Elixire, und Präparate zur parenteralen Verabreichung, wie sterile Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Sie können auch in Form steriler fester Mittel hergestellt werden, welche in sterilem Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder anderen sterilen injizierbaren Medien unmittelbar vor der Verabreichung gelöst werden können.

Verwendet man die erfindungsgemäßen Verbindungen oder deren pharmazeutisch verträgliche Salze als antimikrobielle Mittel, so werden sie derart dosiert, daß die Konzentration an aktivem Bestandteil größer ist als die minimale Hemmkonzentration gegen den speziell zu behandelnden Organismus.

Verwendet man sie als Antitumormittel bei einem Sauger,

2 so wird die Verabreichung von 2,5 bis 10 mg/M für eine

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einzelne intravenöse Injektionsbehandlung vorgeschlagen.

Die tatsächlich zu verwendende Dosis Rudolphomycin wird jedoch vom Arzt nach Berücksichtigung der Faktoren, wie Alter, Körpergewicht, Geschlecht, Diät, Verabreichungsart, Ausscheidungsmenge, Zustand des Patienten, Kombinationen von Pharmaka und den speziell zu behandelnden Körperstellen und Krankheiten, bestimmt.

Die Erfindung ermöglicht die therapeutische Behandlung eines Säugers, der von einer mikrobiellen Infektion (insbesondere durch gram-positive Bakterien) oder einem malignen Tumor (beispielsweise einem festen oder ascitischen Tumor, wie Ll210 Leukämie) befallen ist, wobei man dem Wirt eine wirksame, antimikrobielle oder Tumor-inhibierende Dosis Rudolphomycin oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon verabreicht.

Die nachstehenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie jedoch einzuschränken. Sephadex LH-20 : ist die Handelsbezeichnung der Pharmacia Fine Chemicals, Inc. für ein alkyliertes, vernetztes Dextran, das bei der Adsorptionsund Gelfiltrations-Chromatographie verwendet wird. , Quanta/Gram LQDF ist die Handelsbezeichnung für eine Silicagel-Dünnschichtchromatographie-Placte, welche von Quantum Industries, Fairfield, New Jersey, hergestellt wird. ι μ PORASIL ist ein völlig poröses Silica-Adsorbens, das bei der Flüssigkeitschromatographie verwendet und von Waters Associates Inc., Milford, Massachusetts, hergestellt wird. Skellysolve B ist ein im Handel erhältliches Petroleumlösungsmittel (Skelly Oil Co.), bestehend aus isomeren ι Hexanen mit einem Kp. von 60 bis 68 ⁰C. Wenn nicht anders angegeben, sind alle Temperaturen in ⁰C ; gemessen.

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Beispiel

Herstellung des Bohemsäure-Komplexes

A) Fermentation im Schüttelkolben

Der Mikroorganismus Actinosporangium sp. Stamm C-36,145 (A.T.C.C. 31127)- wird an einem Schrägagarmedium gezüchtet, das aus 2 g D-Glukose, 20 g Hafermehl, 2 g Sojapepton und 2 g Agar (aufgefüllt auf 1 Ltr. mit destilliertem Wasser) besteht. Nach mindestens 6 Tagen Wachstum bei 27 C werden die gebildeten Sporen in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben übertragen, der 1000 ml eines sterilen Mediums aus 30 g D-Glukose, 10 g Sojabohnenmehl, 10 g Pharwamedia (Traders Oil Mill Co., Fort Worth, Texas ) und 3 g CaCO₃ (aufgefüllt auf 1 Ltr. mit destilliertem Wasser) enthält. Diese vegetative Kultur wird

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bei 27⁰C an einem Kreisel-Reihenschüttelapparat (Modell New Brunswick Scientific Co., Inc.)» der auf 210 Upm eingestellt ist und einen Kreis mit 5>1 cm Durchmesser beschreibt, inkubiert. Nach 4& Std. überträgt man 4 ml der Kultur in einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben, der 100 ml eines sterilen Produktionsmediums aus 50 g Glycerin, 20 g Sojabohnenmehl, 10 g Erdnußmehl und 10 g CaCO, (aufgefüllt auf 1 Ltr. mit destilliertem Wasser) enthält. Die Kultur wird 144 Std. bei 27⁰C an einem auf 230 Upm eingestellten Schüttelapparat inkubiert. Anschließend wird im KuIturfiltrat und Myzel antibiotische Aktivität festgestellt, die auf den Bohemsäurekomplex zurückzuführen ist.

B) Fermentation im Rührgefäß

Der Bohemsäurekomplex wird in Rührgefäß-Permentern unter Verwendung einer 4& Std. alten vegetativen Kultur (wie in Beiapielia beschrieben) hergestellt. Kan überträgt 400 ml der Kultur in 10 ltr. des in Beispiel 1 beschriebenen sterilen Produktionsnediums, das 0,01 $ eines Silikon-Schauminhibitors (Hodag F1; Hodag Chemical Corp., Skokie, 111., V.St.A.) enthält und sich in einem 14 Ltr.-Rührgefäß befindet. Das Rührgefäß ist in eine Fermenter-Antriebseinrichtung (Modell ES-614» Hew Brunswick Scientific Co., Inc., New Brunswick, n.J., V.St.A.) eingefügt. Die Temperatur wird bei 27⁰C gehalten. Die Geschwindigkeit des Luftstroms beträgt 6 Ltr./ Mn. und der Rührer wird auf 300 Upm eingestellt. Der Schauminhibitor (Hodag F1) wird nach Bedarf zur Schaumregelung automatisch zugeführt, liach etwa 210 Std. ist die Inkubierung beendet. Im KuIturfiltrat und Myzel wird der Bohemsäurekomplex festgestellt.

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C) Fermentation im Gärbottich

37,8 Ltr. eines in einem Gärbottich vorgelegten, sterilen Produktionsmediums (wie in Beispiel 1a) v/erden mit 1,89 Ltr. einer vegetativen Kultur (hergestellt gemäß Beispiel 1n) beimpft, mit einem Impellerrührer bei 500 Upm gerührt und mit einem Durchsatz von 85 Ltr./Min. belüftet. Die Inkubierung erfolgt während 190 Std. bei 27⁰C Anschließend wird im KuIturfiltrat und Myzel der Bohemsäurekomplex festgestellt.

D) Fermentation im Gärbottich

3028 ltr. eines in einem Gärbottich vorgelegten Produktionsmediums (wie in Beispiel 1a) werden mit 152 Ltr. einer vegetativen Kultur (hergestellt gemäß Beispiel 1a) beimpft, mit einem Impellerrührer 155 Upm gerührt, mit einem Durchsatz von 141»6 Ltr./Min. belüftet und 190 Std. bei 27⁰C inkubiert, Anschließend ist das Vorhandensein des Bohemsäurekomplexes im KuIturfiltrat und Myzel feststellbar.

Beispiel

A) Isolierung des Bohemsäurekomplexes

Die gesamte Gärbrühe (7Ltr.) wird beimErnte-pH 3,1 20 bis 30 Min. mit etwa dem gleichen Volumen Methylisobutylketon verrührt. Anschließend setzt man eine große Menge Diatomeenerde -Filterhilfe zu und mischt diese durch gründliches Rühren ein. Danach filtriert man das Gemisch unter Absaugen auf eine Filterhilfe. Das Filtrat trennt sich in zwei Phasen

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Ά/V) K)J - 3G -

auf, von denen man die untere (wäßrige) Phase verwirft. Die organische Phase wird im Vakuum stark eingeengt (bis auf 50 bis 100 ml) und mit Skellysolve B (Skelly Oil Co.; Warenbezeichnung für eine Petrolätherfraktion vom Kp. 60 bis 68°C, welche im wesentlichen aus η-Hexan besteht) verdünnt. Dabei fällt ein dunkelroter Feststoff aus, der im Vakuum getrocknet wird und 1,9 g Bohemsäurekomplex liefert.

B) Isolierung des Bohemsäurekomplexes im großtechnischen Maßstab

Die gesamte Gärbrühe (3 000 Ltr.) wird bei einem pK-V/ert von 8,0 bis 8,5 auf 25⁰C abgekühlt und 30 Min. bei 20 bis 30⁰C kräftig mit 3 000 Ltr. Methylisobutylketon verrührt. Dann versetzt man die Emulsion mit 360 kg Filterhilfe und rührt das Gemisch eine weitere Stunde gründlich. Nach etwa 30 Min. langem Absitzenlassen dekantiert man 2 300 bis 2 500 Ltr. organische Phase und kühlt sie auf 0 bis 10⁰C ab. Das Gemisch wird 20 Min. mit weiteren 800 Ltr. Methylisobutylketon verrührt. Nach 30 Min. langem Absitzenlassen dekantiert man die organische Phase neuerlich und versetzt sie mit der gekühlten ersten Fraktion, so daß man ein Gesamtextraktvolumen von 3 300 bis 3 400 Ltr. erhält. Nach Klarfiltration erhält man schließlich 3 100 bis 3 200 Ltr. von Feststoffen und unlöslicher wäßriger Phase freien Methylisobutylketonextrakt. Der organische Extrakt wird im Vakuum bei 0 bis 10⁰C auf ein Endvolumen von 6 Ltr. eingeengt. Man fügt 60 Ltr. Skellysolve B bei 20 bis 25⁰C unter Rühren zu, filtriert die ausgefallenen Feststoffe an einer Nutsche ab und wäscht mit 10 Ltr. Skellysolve B. Durch Trockensaugen erhält man 900 bis 1 000 g eines etwas öligen, dunkelroten, amorphen Produkts. Man verrührt dieses mit überschüssigem Äther, filtriert durch einen Büchner-Trichter und spült mit weiterem

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Äther. Nach Trockensaugen und Vakuumtrocknung erhält man 351 g amorphen, dunkelroten Bohemsäurekomplex.

Beispiel

Fraktionierung des Bohemsäure-Komplexes und Abtrennung der Rudolphomycin-Marcellomycin in Mischung enthaltenden Fraktion

68 Std. mit Chloroform getränkte Sephadex LH-20 wird als Aufschlämmung in eine Pharmacia SR 25/100-Säule (25 mm Innendurchmesser, 100 cm Höhe), die an den Enden jeweils mit einstellbaren Teflonplättchen ausgestattet ist, gegeben. Die Säule wird so gepackt, daß sie von Plättchen (tip) zu Plättchen vollständig gefüllt ist und eine effektive 3etthÖhe von 90 bis 95 cm aufweist. Man löst 500 mg Bohemsäurekomplex in 10 ml Chloroform und gibt die Lösung auf die Säule auf. Anschliessend entwickelt man im Abwärtsstrom mit Chloroform bei einer Abflußgeschwindigkeit von 1 nl/Min. Das Eluat wird in 6 ml-Anteilen in einem Fraktionssammler aufgefangen. Die in den Röhrchen mit geraden Nummern aufgefangenen Proben werden mit Chloroform auf das 80fache verdünnt und in einem Bausch and Lomb Spektronik 20-Colorimeter bei 490 πΐμ untersucht. Es werden vier ausgeprägte Banden von Anthracyclinpigmenten wie folgt festgestellt:

Röhrchen-Nr. ■ Gewichtsraenge

nach dem Verdampfen, mg

1 bis 4

5 bis 11 erste Bande 66

12 bis 14

15 bis 21 zweite Bande 36

22 bis 35

36 bis 44 dritte Bande 18

46 bis 57 vierte Bande 48

58 ff.

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Die erhaltenen Feststoffe werden an Brinkmann 60F254-Silicagel -Dünnschichtplatten unter Verwendung von Toluol/Methanol (80:20) als lösungsmittelsystem chromatographxert. Die erste eluierte Bande erweist sich bei der Dünnschichtchromatographie als komplexes, inaktives Gemisch. Die zweite Bande ergibt eine chrakteristische rosarote Zone bei einem E„-Wort von etwa 0,75. Diese Fraktion ist ebenfalls inaktiv; es wird festgestellt, daß sie hauptsächlich q-Pyrromycinon enthält. Die dritte eluierte Fraktion ergibt eine einzelne Zone mit einem R ,,-Wert von ~0,3. Es wird festgestellt, daß es sich um Musettamycin handelt, das höchst wirksam ist, wenn es gegen beide Leukämiesysteme bei der Maus, L1210 und P388 getestet wird.Die letzte zu eluierende Bande ergibt eine Zone bei einem R_,--Wert von etwa 0,3 und besteht hauptsächlich aus Marcellomycin, zu einem kleineren Teil jedoch auch aus Rudolphomycin. Diese Komponente zeigte beim Versuch gegen L1210 und P388 Leukämiesysteitio an Mäusen große Wirksamkeit.

Beispiel 4

Fraktionierung in großtechnischem Maßstab zur Herstellung der Rudolphomycin-Marcellomycin-Mischung

Eine Glassäule mit einem Durchmesser von 15,24 cm (6 in.) und einer Höhe von 195,6 cm (77 in.) wird an der Basis mit einem "Neva-Clog" Filter (Multimetal Wire Cloth Corp., Tappan, N.Y.) ausgestattet, auf welchen eine Glaswolleschicht und anschließend eine kreisförmige Polyäthylenfritte aufgelegt werden. Die Fritte wird auf einen Durchmesser von 14,92 cm (5 7/8 in.) zugeschnitten, um eine Quellung in Chloroform zu ermöglichen. Man rührt 8,73 kg Sephadex LH-20 3 Std. in Chloroform, filtriert, schlämmt den festen Rückstand neuerlich in Chloroform auf und läßt die Aufschläm-

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mung 16 Std. stehen. Dann wird das Gemisch 15 Min. gerührt und danach auf die Säule aufgegeben. Eine 30 g-Probe des gemäß Beispiel 2B hergestellten Bohemsäurekomplexes wird

15 Min. mit 1,5 Ltr. Chloroform erhitzt und anschließend

16 Std. gerührt. Durch Filtration werden 7»5 g ungelöstes Material mit einer gewissen Aktivität abgetrennt (bei späteren Versuchen wird festgestellt, daß sich die Probe in 30 bis 40^igem Methanol vollständig löst; die Ergebnisse der Chromatographie sind gleich wie bei diesem Versuch). Man gibt das Piltrat auf die Säule auf und beginnt mit der Entwicklung mit Chloroform in Abwärtsstrom. Während des gesamten Versuchs wird am Ablaß eine Pließgeschwindigkeit von 16 ml/Min, aufrechterhalten. Anfänglich fällt ein Eluatvolumen von 1,445 ml an, bevor die Farbe den Boden des Gelbettes erreicht. Wenn dies der Fall ist, wird das Auffangen von 100 ml-Praktionen begonnen und so lange fortgesetzt, bis die Flüssigkeit wieder relativ hell wird (nach insgesamt 906 Fraktionen) . Aliquote Anteile jeder fünfter Fraktion werden verdünnt und analysiert, wie in Beispiel 3 beschrieben ist. Es zeigt sich, daß die folgende Auftrennung von vier Komponenten stattgefunden hat:

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M/19 163

Fraktion

bis 20

bis 44

bis 53

bis 70

bis 75

Beschreibung

erste Komponente, Gemisch*, inaktiv

zweite Komponente, Gemisch, inaktiv **

verworfen

dritte Komponente, einzelne Verbindung (Musettamycin), aktiv

verworfen

bis 110 vierte Komponente, Mischung, bestehend hauptsächlich aus Marcellomycin, zu einem kleineren Teil auch aus Rudolphomycin, aktiv

bis 200 Nachlauf

Gewichtsmenge nach dem Eindampfen

6,74 g

4,18	g
385	mg
1,45	g
198	mg
4,03	g
1,72	g

bestimmt durch Dünnschichtchromatographie hauptsächlich \ -Pyrromycinon

Beispiel

Abtrennung und Isolierung von Rudolphomycin aus der Rudolphomycin-Marcellomycin-Mischung

Man wäscht Silicagel (Grace Davison, grade 62) mit 6n HCl bei 100°t, spült bis zur Neutralität mit entionisiertem Wasser und trocknet über Nacht bei 110 ⁰C. Von dem so erhaltenen Adsorbens schlämmt man 770 g in einer 8:2 Mischung (Vol/Vol) von : Toluol:Methanol auf. Zu der gerührten Mischung gibt man dann ■ tropfenweise Ammoniumhydroxyd, bis ein pH 8 erreicht ist. Man \ benötigt etwa 12 ml konz. NH₄OH. Das neutralisierte Silicagel wird dann aufgeschlämmt auf eine Fisher-Porter Glassäule ;

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mit einem Druchmesser von 50 mm und 120 cm Höhe gegeben, wobei man ein Säulenverlängerunasstück aufsetzt, um die Säule vollständig zu füllen» Wenn sich das Bett gut abgesetzt hat, wird das Verlängerungsstück mit dem überschüssigen Silicagel entfernt, wobei dann eine effektive Betthöhe von 119 cm verbleibt. Dann wird die Säule oben verschlossen und mit einem Einlaufrohr aus einem Lösungsmittelreservoir versehen»

Eine Probe der Feststoffe, erhalten durch Eindampfen des als vierter Peak bei Sephadex LH-20 Chromatographie des Bohemsäure-Komplexes (vgl. Beispiele 3 und 4) anfallenden Materials, 1,02 g, rührt man in etwa 30 ml einer 19:1 Mischung von Toluol:Methanol (Vol/Vol). Gibt man weitere 3 ml Methanol zu, so erreicht man, daß sich die Feststoffe vollstän lösen, und die so erhaltene Lösung gibt man dann vorsichtig oben auf die Säule auf. Man beginnt die Säule mit 19:1 Toluol:Methanol (Vol/Vol) bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,9 ml/Min, zu entwickeln. Das Eluat wird verworfen, bis die Farbgrenze nahezu den Boden der Säule erreicht hat. Dann beginnt man, Fraktionen von 20 ml zu sammeln. Anteile (von 20 μΐ) jeder Fraktion werden auf Quanta/Gram LQDF Dünnschxchtchromatographieplatten auf getüpfelt und diese dann in einem 6:2:2 Toluol:Methanol:Aceton System (Vol/Vol) entwickelt. Man vereinigt Fraktionen entsprechend den Ergebnissen der Dünnschichtchromatographie und engt diese zur Trockne ein. Die Ergebnisse sind nachstehend aufgeführt. Die Fraktionen 21-120 mit einem R_f-Wert von 0,3 2 bestehen praktisch aus reinem Rudolphomycin.

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M/19 163	1	Fraktionen	- 42 -	r	2831535
:>ctini tt	2	Nr.	Gewicht	0,76	Bestandteile
Nr.	3	Vorlauf ^l1}		0,76
4	l bis 20	160 mg	0,32	Oi -Pyrromycinon
5	21 bis 120	7 mg	,32; 0	It
	121 bis 160	161 mg	0,29	Rudolphomycin
161 bis 238	19 mg 0	,29 Mischung ^l '
278 mg	Marcellomycin

(1) Eine leichte Färbung wurde in 4 1 vor Schnitt 2 beobachtet,

(2) Rudolphomycin und Marcellomycin

Die Säule wird dann mit reinem Methanol gespült, wobei man dann weitere 240 mg einer pigmentierten Mischung geringer biologischer Aktivität erhält.

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Beispiel 6

Fraktionierung der Marcellomycin-Rudolphomycin-Mischung in großtechnischem Maßstab

Man präpariert Silicagel und äquilibriert wie in Beispiel 5 beschrieben mit 19:1 Toluol:Methanol (Vol/Vol), wobei man etwa 7,5 kg Siliciumdioxyd verwendet. Dann füllt man -^s auf eine Glassäule mit einem Durchmesser von 15,24 cm (6 in.). Man löst eine Probe von 10 g des (bei der Sephadex LII-20 Chromatographie des Bohemsäure-Komplexes) am vierten Peak erhaltenen Materials wie in Beispiel 5 beschrieben in dem Lösungsmittel system, gibt gleichmäßig oben auf das Bett auf und läßt nach unten durchlaufen. Dann beginnt man mit 19:1 Toluol/Methanol (Vol/Vol) zu entwickeln. In diesem Fall erschien das Siliciumdioxyd aktiver, da die Eluierung bedeutend langsamer war. Deshalb wurde nach drei Tagen der Methanolgehalt (von ursprünglich 5 %) pro Tag um 1 % auf 10 % erhöht.

Es wurden Fraktionen von 200 ml gesammelt und auf sichtbare Adsorption bei 490 nm mit Hilfe eines Brinkmann PC/600 Proben Colorimeters untersucht, wobei auf die kürzeste verwendbare Weglänge abgestellt wurde. In den ersten 240 Fraktionen war relativ wenig Farbe enthalten. In den späteren Fraktionen bildete sich oft nach Konzentration ein Niederschlag, der dann getrennt gesammelt wurde. Die Ergebnisse sind nachstehend aufgeführt. Praktisch reines Rudolphomycin wurde in Schnitt 3 (Fraktionen 258 bis 283) erhalten.

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	Schnitt Nr.	Fraktion Nr.	Gewicht	mg mg	Zustand ^v''	Nd.⁽³⁾ Nd.	R_f (2) »"'	Bestandteil(e)	(4)	M/1SJ
	Vorlauf 1	1-240	104 545	mg	krist. krist.		0,7, Tailing 0,7, Tailing		(4)	I 163
	1	Il	150	mg	amorph		(0,31), (0,51), (0,53),	nr\ -Pyrromycinon (4) (4)	(4)
	2	241-257	108	mg	amorph	Nd.	(0,31), 0,7	o,7 Mischung (4)	und
	3	258-283	352	mg	krist.		(0,31), 0,7	Mischung (4)
	3	Il	218,5	mg	krist.		(0,27), 0,31, 0,7	Rudolphomycin
	4	284-314	929	mg	amorph	Nd.	(0,27), 0,31, (0,7)	Rudolphomyc in
606	5	315-339	663	mg	amorph		0,27, 0,31	Rudolphomycin
OO	5	Il	1125	mg	amorph	Nd.	0,27, (0,31)	Rudolphomyc in Marcellomycin		I
O	6	340-365	1330	mg	amorph		0,27, (0,31)	Il
O	6	Il	237	mg	amorph	Nd.	0,27, (0,31)	Marcellomycin		I
*CTf* cn	7	366-440	1512	mg	amorph		0,27, (0,31)	Il
	7	ti	192	mg	amorph	Nd.	0,27, (0,31)	Marcellomycin
	Nachlauf	Il	1735	mg	amorph		0,12-0,26⁽⁵⁾	Marcellomycin
	Nachlauf		1600	amorph	Il	unbekannt
Il

(1) Die Niederschläge (Nd.) sind Bestandteile, welche während der Konzentration aus der Lösung ausfielen und durch Filtrieren gesammelt wurden. Die anderen aufgeführten Materialien wurden durch Eindampfen der Flüssigkeit oder der Mutterlaugen zur Trockne oder nahezu zur Trockne und Verdünnen mit Skellysolve B zur Ausfällung eines Feststoffs erhalten.

(2) Die in Klammern angegebenen R,-Werte stehen für schwache oder sehr schwache Zonen.

(3) Eindampfen der Mutterlaugen dieser Fraktionen ergab so wenig Material, daß es für eine Bestimmung nicht ausreichte.

(4) Λ\ -Pyrromycinon erscheint im Vorlauf und in:· den ersten vier Schnitten in zunehmend geringeren Mengen. Mit Ausnahme des Vorlaufs und Schnitt 1 ist relativ wenig davon enthalten.

(5) Die in den Nachläufen enthaltenen Feststoffe führten

bei Dünnschichtchromatographie zu einem Verschmieren der Zonen.

(6) R_-Werte bestimmt durch Dünnschichtchromatographie mit (6:2:2) Toluol .-Methanol: Aceton (VoI/VoI):

R_f = 0,7 97-Pyrromycinon = 0,31 Rudolphomycin = 0,27 Marcellomycin.

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Beispiel 7
Reinigung von Rudolphomycin

Eine einzelne Silicagel-Säule (Waters Associates Prep PAK-500/ Silica) wird mit einer Lösungsmittelmischung bestehend aus 12 % Methanol in Methylenchlorid in der Waters Associates Prep LC/500 Hochdruckflüssigkeitschromatographie-Vorrichtung äquilibriert. Man vereinigt Fraktionen, welche nach der großtechnischen Silicagel-Chromatographie der Rudolphomycin-Marcellomycin-Mischung (Beispiel 6) hauptsächlich Rudolphomycin enthalten, und chromatographiert 1,16 g eines solchen Materials in zwei Teilen. Man löst die Probe in etwa 10 ml der Lösungsmittelmischung und injiziert sie dann auf die Säule. Die Säule wird mit einer Fließgeschwindigkeit von 500 ml/Min nach einem Vorlauf (bestehend hauptsächlich aus Lösungsmittel und T, -Pyrromycinon) entwickelt und man sammelt die vier nachstehend aufgeführten Schnitte:

*
Schnitt Nr. Gewicht R_f Bestandteile

Vorlauf — — />> -Pyrromycinon

1 244 mg 0,34 Rudolphomycin

2 110 mg 0,34 Rudolphomycin

3 190 mg 0,34 Rudolphomycin

4 310 mg 0,34 Rudolphomycin

Lösungsmittelsystem: Toluol:Methanol:Aceton (3:1:1) (Vol/Vol)

auf vorbeschichteten TLC-Silicagel-Platten (60F-254).

Durch Dünnschichtchromatographie und protonenmagnetische Resonanzspektroskopie zeigte sich, daß die oben aufgeführten Rudolphomycin-Fraktionen im wesentlichen aus reinem Rudolphomycin bestehen.

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Leerseite

Claims

M/19 163 -X- Patentansprüche

1.

yAnthracyclinantibiotikum Rudolphomycin, sowie dessen pharmazeutisch verträgliche Salze, das im wesentlichen frei von gleichzeitig produzierten Substanzen ist und die nachfolgenden charakteristischen Eigenschaften aufweist:

(a) es liegt als roter Feststoff mit der Teilstruktur:

OH 0

• 1-2

vor, worin X für eine nicht identifizierte Zuckereinheit steht;

(b) es besitzt einem Schmelzpunkt von 171 - 175 °C (Zers.),

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ORIGINAL INSPECTED

(c) in hydratisierter Form enthält es die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff im wesentlichen in den nachfolgenden mittleren prozentualen Gewichtsmengen: Kohlenstoff 58,08; Wasserstoff 6,31; Stickstoff 3,05 und Sauerstoff (durch Differenz) 32,56;

(d) in Kaliumbromid pelletiert weist es ein Infrarotspektrum auf,, das im wesentlichen der Figur 1 entspricht;

(e) gelöst in Methanol besitzt es bei einer Konzentration von 0,01795 g/Liter ein Ultraviolettabsorptionsspektrum, das im wesentlichen der Figur 2 entspricht;

(f) in CDCl- aufgelöst besitzt es bei einer Konzentration von 56 mg/ml ein protonenmagnetisches ResonanzSpektrum, das in wesentlichen der Figur 3 entspricht;

(g) in CDCl- gelöst besitzt es bei einer Konzentration von ungefähr 70 mg/ml ein Kohlenstoff-13 magnetisches Resonanzspektrum, das im wesentlichen der Figur 4 entspricht.

2. Verfahren zur Herstellung von Rudolphomycin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Actinosporangium sp. ATCC 31127 in einem wässrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter submersen aeroben Bedingungen kultiviert, bis der Organismus eine wesentliche Menge Rudolphomycin produziert hat und das Rudolphomycin in einer im wesentlichen von gleichzeitig produzierten Substanzen freien Form aus dem Kulturmedium !

i isoliert. !

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3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man nacheinander

(1) Actinosporangium sp. ATCC 31127 in einem wässrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter submersen aeroben Bedingungen kultiviert, bis der Organismus im Kulturmedium eine wesentliche Menge an Bohemsäurekomplex produziert hat;

(2) den Bohemsäurekomplex aus dem Kulturmedium gewinnt;

(3) eine Mischung aus Rudolphomycin und Marcellomycin durch Chromatographie an einem alkylierten, vernetzten Dextranadsorbens auftrennt; und

(4) das Rudolphomycin in einer im wesentlichen von gleichzeitig gebildeten Substanzen freien Form durch Chromatographie auf mit Säure gewaschenem Silicagel aus der Mischung abtrennt und isoliert.

4. Arzneimittel, enthaltend mindestens eine Verbindung nach Anspruch 1 in einem üblichen Träger.

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