DE2735690A1

DE2735690A1 - Verfahren zur bestimmung von wasserstoffperoxid sowie reagenzien und analytische elemente zur durchfuehrung des verfahrens

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Publication number: DE2735690A1
Application number: DE19772735690
Authority: DE
Inventors: Barbara Jungfleisch Bruschi
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1976-08-09
Filing date: 1977-08-08
Publication date: 1978-02-16
Also published as: JPS5716697A; CA1095817A; FR2361654B1; JPS575519B2; FR2361654A1; JPS5326188A; DE2735690C2; US4089747A; GB1575947A; SE443371B; SE7708960L

Description

Dipl.-Chem. Dr. Brandes Dr.Hng.HekJ DipL-Phys. Wolff

β München 22. ThierschstraBe

„„„ _N, --ς ,c_n Tel.(089)293297

Reg. Nr. 1Z5 350 Telex 0523325 (pahvo d)

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außer samstags

15. Juli 1977 25/2

EASTMAN KODAK COMPANY, 343 State Street, Rochester, Staat New York, Vereinigte Staaten von Amerika

Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid sowie Reagenzien und analytische Elemente zur Durchführung des Verfahrens

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Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid sowie Reagenzien und analytische Elemente zur Durchführung des Verfahrens

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid in wäßrigen Flüssigkeiten, bei dem man eine Probe der zu analysierenden Flüssigkeit mit einer Substanz mit peroxidativer Aktivität und einem Farbbildner, der in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und der Substanz mit peroxiJativer Aktivität unter Erzeugung eines Farbstoffes oxidiert wird, in Kontakt bringt, Des weiteren betrifft die Erfindung analytische Elemente zur Durchführung des Verfahrens.

Die Erkennbarkeit und quantitative Bestimmbarkeit von Wasserstoffperoxid sowie Substanzen, die unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid reagieren, ist auf vielen Gebieten von großer Wichtigkeit. Genannt sei nur beispielsweise die Erkennung und Bestimmung von Wasserstoffperoxid, das bei der enzyuatischen Bestimmung von Substanzen, wie beispielsweise Glucose, Cholesterin, Harnsäure und dergleichen durch die Aktivität von Enzymen, beispielsweise Glucose-Oxidase, Cholesterin-Oxidase und Uricase in Gegenwart von Sauerstoff erzeugt wird. Die Menge oder Quantität eines in einer Probe vorhandenen Enzym-Substrates läßt sich aus der Menge an erzeugtem Wasserstoffperoxid ermitteln. Im Falle der enzymatischen Bestimmung von Harnsäure beispielsweise läuft folgende Reaktion ab:

O + 2H₇O _HJ >O + H₂O ♦ CO₇

Nl

C-O NH₂

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Bekannte Reagenzien für die Erkennung und/odor quantitative lie Stimmung von Wasserstoffperoxid, das in solchen Systemen erzeugt wird, enthalten im allgemeinen eine Substanz mit peroxidativer Aktivität, beispielsweise Peroxidase oder peroxidascartige Substanzen sowie ferner eine Substanz, die in (legenwart von Wasserstoffperoxid und der Substanz mit peroxidativer Aktivität einer erkennbaren Veränderung (im allgemeinen einer Farbveränderung) unterliegt. In der Literatur werden zahlreiche Reagenzien oder Reagenzsysteme dieses Typs beschrieben. Verwiesen wird beispielsweise auf die WS-PS 2 912 309, 2 981 606, 3 349 006, 3 092 465, 3 558 435, 3 595 755, 3 627 697, 3 627 698, 3 630 847, 3 654 179, 3 654 180 sowie 3 853 470.

Beispiele für Farbbildner oder Farbstoffe erzeugende Verbindungen, die bei der Bestimmung von Wasserstoffperoxid mit Peroxidase sowie peroxidase-artigen Substanzen, gegebenenfalls in Kombination mit einer Kupplerverbindun?, bisher verwendet wurden, sind:

(1) Monoamine, z.B. Anilin und seine Derivate, ortho-Toluidin und para-Toluidin;

(2) Diamine, z.B. ortho-Pheiiylendiamin; N,N¹ -Dimethyl-p-phenylendiamine; Ν,Ν'-Diäthylphenylendiamin; Benzidin sowie Dianisidin;

(3) Phenole, z.B. Phenol. Thymol, Ortho-, meta- und para-Kresole, α-N'aphthol- und ß-Naphthol;

(4) Polyphenole, z.B. Brenzkatechin, Guaiacol, Orcin, Pyrogallol, ρ,p-I)ihydroxydiphenyl sowie Phloroglucin;

(5) aromatische Säuren, z.B. Salicyl, Pyrobrenzkatechin- und Gallensäuren;

(6) Leucofarbstoffe, z.B. Leucomalachitgrün und Leucophenolphthalein, die zweckmäßig in alkalischem Medium verwendet werden;

(7) Farbstoffe, beispielsweise 2,6-Dichlorphenolindophenol;

(8) verschiedene biologische Substanzen wie beispielsweise iipinphrin, die Flavone, Tyrosin, Dihydroxyphenylalanin sowie Tryptophan;

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(9) andere Substanzen, wie beispielsweise Gum Guaiac, Guaiaconsäure, Kalium-, Natrium- sowie andere wasserlösliche Iodide sowie Bilirubin und

(10) spezielle Farbstoffe, wie beispielsweise 2,2'-Azin-di(3-äthyl-benzothiazolin-(6)-sulfonsäure) sowie 3,3'-Diaminobenzidin.

Es ist dabei die Kombination aus Wasserstoffperoxid, der Substanz mit peroxidativer Aktivität und dem Farbbildner, die zu der erkennbaren Farbveränderung führt. Gilt es demzufolge festzustellen, ob in einer zu analysierenden Probe eine Substanz mit peroxidativer Aktivität vorhanden ist, so wird zur Ermittlung dieser Substanz ein Reagenz mit Wasserstoffperoxid und einem Farbbildner oder einer einen Farbstoff bildenden Verbindung verwendet.

Obgleich die erwähnten bekannten Farbbildner für die Erkennung und Bestimmung von Wasserstoffperoxid (oder Substanzen mit peroxidativer Aktivität) geeignet sind, gibt es doch FHlIe, in denen die Koneentration an Wasserstoffperoxid (oder Substanzen mit peroxidativer Aktivität) zu gering ist, als das ausreichend erkennbare Farbveränderungen hervorgerufen werden, und zwar aufgrund entweder des Wasserstoffperoxid-Lieferanten, aufgrund der Notwendigkeit für eine Verdünnung oder aufgrund der Bestimmungsmethode an sich. Ein Beispiel für ein analytisches Bestimmungsverfahren, bei dem ein solches Konzentrationsproblem auftritt, ist die Bestimmung von Wasserstoffperoxid, das von vergleichsweise geringen Konzentrationen von Harnsäure in Blutserum (1 bis 15 mg/dl) erzeugt wird. Wenn es die Umstände erlauben, läßt sich dieser Nachteil dadurch beheben, daß vergleichsweise große Volumina des zu bestimmenden Produktes analysiert werden, in dem man beispielsweise den Durchmesser der Cuvette bei der Bestimmung erhöht, beispielsweise bei der Bestimmung von Harnsäure, wodurch die effektive Dichte des erzeugten Farbstoffes erhöht wird.

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.sieht alle analytischen Verfahren jedoch ermöglichen derartige Modifikationen zur I.rhöhunp, der effektiven Dichte d?s erzeugten Farbstoffes. In anderen Fällen ist die '!en;;e an erzeugten; I^:arbs to ff so gering, und zwar entweder aufgrund der vergleichsweise sehr geringen Konzentration des zu bestinnienden Stoffes oc'er aufgrund der Notujndigkeit bei hohen Verdünnungsgraden arbeiten zu müssen, um eine geeignete Lösung zu erreichen.

Derartige Probleme treten beispielsweise insbesondere dann auf, wenn das best immunesverfahren unter Verwendung eines Mehrschichtigen l-lenentes des aus der BL-PS SOi 7 12 oder der HS-PS 3 ')0: IS« bekannten Typs durchgeführt wird, wobei besonders gro^e !'rohlerie dann auftauchen, wenn die zu analysierende Substanz in j'erinp.er Konzentration vorliegt, bäspielsweise im Falle der Best immun;; von Harnsäure. In diesen FMllen kann bei Verwendung von vergleichsweise dünnen Indikator- oder Ueagenzschichten (einer (Irü'lenordnuni» von weniger als 0,025 mm) die sich in derartiqcn F.lenenten als vorteilhaft erwiesen haben, die Pichte des erzeugten Farbstoffes sehr gering sein. L>ie Erhöhung der Dicke der Schicht eines solchen lilementes mit den Farbbildner mit dem Ziel eine größere effektive Farbdichte zu erzeugen, kann unzweckmäßig sein, beispielsweise deshalb, weil die Reaktionszeiten erhöht werden, die Schichtenherstellung erschwert wird und dergleichen.

Infolgedessen besteht ein Bedürfnis nach einem Verfahren, das es ermöglicht die effektive Dichte des erzeugten Farbstoffes zu erhöhen, wenn Elemente dieses Typs für die Bestimmung von vergleichsweise geringen Konzentrationen an bestimmten Substanzen, beispielsweise Blutserum-Kompontenten, z.B. Harnsäure verwendet werden.

Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß sich vergleichsweise geringe Konzentrationen an Wasserstoffperoxid oder Substanzen mit peroxidativer Aktivität in vorteilhafter Weise unter Verwendung eines abgepufferten Reagenz oder Reagenzsystems ermitteln lassen, daü entweder Wasserstoffperoxid oder eine Substanz mit peroxidativer Aktivität und einen Farbbildner bestimmter Zusammensetzung enthält.

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Als Farbbildner lassen sich erfindungs»e:n;i!i verwenden:

(I) eine Mischung aus:

(a) einen SuIfonylhydrazon der Formel:

,-A

ι C=N-M-SO,R

oder einer SuI fony lhydraion-V'or l;iuferverbindun;» der Formel

C-W-N-SO,R"

worin bedeuten:

R einen Alkyl rest R¹ ein Wasserstoff- oder Halogenatom oder einen Alkyl-,

Alkoxy- oder Arylrest; R" einen Alkyl- oder Arylrest; Z die zur Vervollständigung eines heterocyclischen

Ringes mit 5 bis 6 Ringatomen erforderlichen Atome,

wobei <;ilt, daß der Ring gegebenenfalls Teil eines

Ringsystems sein kann, und Λ ein Anion und (b) einer Kupplerverbindung oder

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(II) ein Triarylimidazol der Formel

in der R , R "und R jeweils einen organischen Rest darstellen, wobei gilt, daß Mindestens einer der 'Jeste R , R und R ein ortho- oder nara-IIydroxy-substi t inerter Aryl rest mit bis zu 18 (!-Atomen ist und die anderen Reste oder der andere Rest derart ausgewählt sind, daP das Oxidationspotential des Imidazols, gemessen durch cyclische VoItonctrie gegenüber einer Standard-Kalomel-F.lel trode unter Verwendung einer Elektrode auf Kohlebasis zwischen -7'~> mV bis + 110 nV

liegt.

:'ic l'lcl t ro'ic V nun =1 :i*»e i aus einer iMiclicr. l<-.'.\\ vy sⁱ; t ?-\.\ ~) t ro. Ir» hcstt iien.

Gegenstand der Erfindung ist demzufolge ein Verfahren zur Bestimmung von iv'asserstoffperoxid in wäßrigen Flüssigkeiten, bei dem man eine Probe der zu analysierenden Flüssigkeit mit einer Substanz mit peroxidativer Aktivität und einem Farbbildner, der in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und der Substanz mit peroxidativer Aktivität unter Erzeugung eines Farbstoffes oxidiert wird, in kontakt bringt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Farbbildner einen Farbbildner gemäi.'· (I) oder gemäß (II) verwendet.

Gegenstand der Erfindung ist des weiteren ein Reagenz für die Bestimmung von Wasserstoffperoxid in wäßrigen Lösungen, mit einer l'uffersubstanz, einer Substanz mit peroxidativer Aktivität und einem Farbbildner, der bei Kontakt mit Wasserstoffperoxid und der Substanz mit peroxidativer Aktivität einer erkennbaren Veränderung unterliegt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es als Farbbildner einen Farbbildner gemäß (I) oder (II) enthält.

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Gegenstand ilor Lrfindunj; ist des weiterer ein Hea<>en?. oJcr ein Ueagenzsystem für die lirmi tt lun<; eines Ann Iyten mit |.i) einem Lnzyiii, das l>ei Kontakt mit der. Ar.alyten Wasserstoff/erzeugt und (b) einem Reagenz für die liestimtr.unq von '.v'asserstoffneroxid

(I) einer Substanz mit peroxidat i ver Aktivität,

(II) einer l'uffersubstanz und

(III) einen Farbbildner,

das dadurch gekennzeichnet ist, ΛηΓ, es als Farbbildner einen Farbbildner ;;eni;if.' (I) oder (II) enthält.

('■egenstand der l,rl indung sind des weiteren analytische Hlemente für die Durch führung des \'erfahrens. Gegenstand der F.rfindunp ist schließlich ein Reagenz für die analytische Best iinmunp. von Substanzen mit peroxidativer Aktivität mit (i) U'asserstoffneroxid ader einer Substanz, die unter bildung von Wasserstoffperoxid reagiert und (ii) einem Farbbildner, d.'s dadurch gekennzei chnet ist, da-?- es als Farbbildner einen Farbbildner ρ,ετ.ίϋβ (1) oder (II) enthält.

Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgeiaäßen analytischen Llemente und Reagenzien eignen sich in vorteilhafter Weise für die Hestinmung von Serumkomponenten, beisnielsweise Harnsäure. Die Erfindung eignet sich jedoch nicht nur zur Bestimmung von Serumkomponenten, sondern vielmehr ganz allgemein für die Bestimmung von Wasserstoffperoxid und Substanzen mit peroxidativer Aktivität, insbesondere in den Fällen, in denen aus den verschiedensten Gründen hoch verdünnte Lösungen zu analysieren sind.

Durch Oxidation liefern die Triarylimidazole Farbstoffe, bei denen es sich um Cyclohexadienylidenimidazolfarbstoffe mit einer Oxogruppe handelt, beispielsweise der Formel:

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273S690

Unter "Arylresten" sind hier die ühlichen bekannten Arvlreste
zu verstellen, beispielsweise Arvlreste der Phenyl- und Naphthylreihe, die gegebenenfalls substituiert sein können. Die für die Arylreste angegebenen Kohlenstoffatome-Zahlen beziehen sich auf die aromatischen Reste einschließlich gegebenenfalls vorhandener Substituenten.

Die Alkylreste, die £egebenenfalls substituiert sein können,
weisen vorzugsweise 1 bis 20, insbesondere 1 bis in C-Atome in der aliphatischen Kette auf.

12 ^
Die Reste R, R¹ sowie R" sowie R , R und R" können, falls nichts besondere angegeben ist, durch die verschiedensten Substituenten substituiert sein, beispielsweise Elektronen abziehende Reste, z.B. Hydroxyl-, Cyano- und Nitroreste oder Halogenatome.

Die Anionen A können aus den üblichen bekannten Anionen bestehen, beispielsweise p-Toluolsulfonat-, Alkylsulfat-, Sulfat-, Chlorid-, Broiuid- und Jodidanionen.

Die Erfindung ermöglicht somit die Bestimmung von Wasserstoffperoxid und Substanzen, die unter Wasserstoffperoxidbildung reagieren, wie auch die Bestimmung von Substanzen mit peroxidativer
Aktivität, z.B. Peroxidase. Dabei erfolgt eine Oxidation eines Farbbildners durch Wasserstoffperoxid in Gegenwart einer Substanz mit peroxidativer Aktivität unter Erzeugung eines Farbstoffes, dessen Dichte nach üblichen bekannten Methoden bestimmt werden kann, woraus sich die Menge an Wasserstoffperoxid oder einer
Substanz mit peroxidativer Aktivität in der analysierten Probe ergibt. Der dabei erzeugte Farbstoffe wird dabei ausgehend von einem Farbbildner gemäß (I) oder (II) erhalten.

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" ²² ' 273S69C

Die Bestimmung der F^:arbstoffdichte kann nach üblichen bekannten Methoden beispielsweise :nif optischem liege unter Verwendung eines Spektrop'iotometers erfolgen oder durch Vergleich der larhstoffdiciite i.iit Farbskalen, durch Vergleich von Lösungen oder mit Hilfe von \arbkarten.

Die ßestiwuun}; von Wasserstoffperoxid nach dem Verfahren der Erfindung eignet sich insbesondere f?ir gekoppelte (d.h. kombinierte aufeinanderfolgende) und nicht gekoppelte (d.h. direkte, einstufige) Liizyinreakt ionci, IVispielsweise eignet sich das erf indungsgeiniue Verfahren zur lies timmung von Glucose, Galactose, Aminosäuren, Cholesterin und Harnsäure durch gekoppelte Hnzymreaktionen und für die Bestimmung von Peroxiden, Hemoglobin, Peroxidase und anderen psroxidativ-aktiven Substanzen in ungekoppelten Hnzymreaktionen.

Die erfindungsgeinäßen Reagenzien eignen sich für die Best immun« von Substanzen, die unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid reagieren, und enthalten eine Puffersubstanz, eine Substanz mit peroxidativer Aktivität sowie einen Farbbildner gemäß (I) oder (II) sowie gegebenenfalls weitere Zusätze, die zum Ablauf einer Reaktion der zu analysierenden Substanz unter Urzeugung von Wasserstoffperoxid erforderlich sind.

Im Falle der Bestimmung von Substanzen mit peroxidativer Aktivität, beispielsweise Hemoglobin, enthält das erfindungsgemäß Reagenz Wasserstoffperoxid oder eine Substanz, die unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid zu reagieren vermag sowie einen Farbbildner gemäß (I) oder (II).

Die erfindungsgemäßen Reagenzien können in Form von Lösungen vorliegen, d.h. unter Verwendung geeigneter Lösungsmittel hergestellt werden, gegebenenfalls unter Zusatz üblicher Zusätze, beispielsweise oberflächenaktiver Verbindungen.

Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung verwendet man anstelle von Lösungen analytische Elemente, die in einfädler Weise beispielsweise dr.-ch Imprägnierung geeigneter Absorbierender Stoffe, beispielsweise Filterpapier mit Lösungen

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der Reagenzien hergestellt werden Können.

Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wendet i;ian die Bestimmungsreagenzfen in Form von analytischen Elementen nit verschiedenen Schiclitcn an.

Uie im Falle von diagnostischen Lösungen ist es dabei hüufig vorteilhaft die analytischen Elemente ausgehend von Lösungen herzustellen, die übliche Zusätze, v:ir beispielsweise oberflächenaktive Verbindungen enthalten.

Die erfindungsgemäßen Bestimmungsren^enzien können iedoch auch in Form von trockenen .Mischungen vorliegen, die durch Zusatz von Wasser in diagnostische Lösungen überführt werden können und die einen Farbbildner gemäf?. Formeln (I) oder (II) enthalten sowie entweder eine Substanz, die unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid reagiert oder einer Substanz mit peroxidativer Aktivität, wobei diese trockener Mischungen übliche bekannte Zusätze, wie beispielsweise oberflächenaktive Verbindungen enthalten können.

Die erfindungsgemäßen Bestimmungsreagenzien liefern Farbstoffe mit sehr hohen Extinktions-Koeffizienten und erzeugen infolgedessen vergleichsweise hohe Dichten bei nur geringen Farbstoffkonzentrationen. Dies bedeutet, daß sich das erfindungsgemiiße Verfahren insbesondere zur Erkennung und Bestimmung von vergleichsweise sehr geringen Konzentrationen an Wasserstoffperoxid, Substanzen mit peroxidativer Aktivität oder Substanzen die Wasserstoffperoxid zu erzeugen vermögen, eignet. Das erfindungsgeiräße Verfahren hat sich als besonders vorteilhaft für die Durchführung von analytischen Bestinimungsverfahren geeignet, bei denen mehrschichtige analytische Elemente des aus der US-PS 3 992 158 bekannten Typs verwendet werden.

Erfindungsgemäß ist es schließlich auch möglich Farbbildner gei.iäß (I) und gemäß (II) zu bestimmen, und zwar unter Verwendung eines Reagenzes mit Wasserstoffperoxid oder einer Substanz, die unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid zu reagieren vermag und

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einer Substanz Mit perox i <1 ;it i vor Aktivität, liine solche Bestimmung kann bcispi el sv.e i se für kont rol ] zv.'ocJ e i>ei iler Herstellung diagnostischer l.le.'iier.lc und Materialien von Bedeutung sein.

ßestimmungsrcaj:. cn ζ i on für die lies t ir:uung von Wasserstoffperoxid, insbesondere für die enzyniat i sehe Bestimmung von (Hykose, Harnsaure, (iliolcst eri η und anderen linzynisubst rat cn sind bekannt. Merurti-ge Best inmungsrea ·;οη: i cn enthalten in allgemeinen eine Substanz nit perox i da t i ver Aktivität, vorzugsweise l'eroxidase und einen Farbbildner, der in (iegenwart von Wasserstoffperoxid und der Substanz mit perox i (lat i ver Aktivität einen Farbstoff liefert oder eine Farln c ränderung lierbei führt . Der Farbbildner kann dabei beispielsweise aus einem leuco farbstoff bestehen, der einer direlton 1 arbveränderung unterliegt. Andererseits kann der Farbbildner iedocii auch aus eineii Stoff bestehen, der als Folge der Oxidation in (iegenv.art von Ii .,(U sowie einer Substanz r.ii t perox idat i ver Aktivität keiner direkten larbverändcrung unterliegt, jedocii in oxidierter lorn mit einer Kupplcrverbindunj·, unter lirzcu^unji eines erkcnnharcn oder bestimmbaren RealtionsproduVtes reaj icrt, vorzugsweise auf st öciiionetri scher üasis.

i.'ic sichau:; den. s]i;iter folgenden Beispiel 1 ergibt, liefern nicht alle VerF)indun:;en, die unter die angegebenen Formeln fallen in (iegenwart von Wasserstoffperoxid und einer Substanz mit neroxidativer Aktivität und einer !'uffersuhstanz einen "farbigen" Farbstoff. Pie Verwendbarkeit der Verbindungen läßt sich jedoch leicht durch einen einfach durchzuführenden Test, der in dem später folgenJen Beispiel 1 ermittelt wird, ermitteln. Bei diesem lest wird eine vergleicliswei se geringe Menge des Farbbildners (in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie z.B. »!ethanol, sofern die Wasserlöslichkeit ein Problem darstellt) mit der Substanz mit peroxidativer Aktivität und einer Puffersubstanz vermischt. Dann νird eine vergleichsweise geringe lenge an Wasserstoffperoxid zugegeben, worauf man feststellt, ob eine Farbbildung auftritt oder nicht. Tritt keine Farbbildung auf, so kann dies negative Krgebnis durch das Redox-I'otential des Farbbildner in den ausgewählten l'uffer bewirkt worden sein, der ausgewählt wurde, oder darauf, daf das Oxidationspotential des Farbbildners zu hoch

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war, als daß eine Oxidation in Gegenwart der Substanz l.'it perüxidativer Aktivität und 'wassers toffperox id ablaufen konnte. Dies bedeutet, daß unter Anwendung routinemäi^!i «er !,aborverfahren und verschiedener Farbbildner, Puffersuhstanzen und Substanzen i.iit ptroxidativer Aktivität lies t i"ii:iungsrea;;enzien zusammengestellt werden können, bei deren Verwendung sich Farbstoffe mit hohen lixtinkt ionskoef f izienten erzeugen lassen.

Line Peroxidase ist bekanntl ich ein hnzvm, das eine l'.enl.t ion zu katalysieren vermag, bei der ivasserstof fperox iil eine? andere Substan; oxidiert. Die Peroxidasen bestehen dabei im allgemeinen aus komplexen Proteinen mit hisennorphyrin. Peroxidasen kommen dabei beispielsweise in Meerrettich vor, Kartoffeln, Fei>en?aft sov/ie Rüben, in welcliem Falle es sich um pflanzliche Peroxidasen handelt, sowie in der Milch, in welchem Falle es sich um Lacto-Peroxidase handelt sowie in weißen Blutkörperchen, in welchem FiI Ic es sich um Verdo-Peroxidase handelt. Peroxidasen kommen des weiteren in Mikroorganismen vor und können durch Fermentationsprozesse erzeugt werden. Auch können synthetische Peroxidasen zur Verwendung in II ,0,-Bestimmungssystemen verwendet werden, beispielsweise solche synthetischen Peroxidasen, wie sie beispielsweise von I'heorell und Maehly in der Zeitschrift "Acta Cheia. Snnd", »and 1, l!T>>, Seiten 12_* bis 434, beschrieben werden. Verwendbar, wenn auch nicht besonders be^Vürzu"^te Substanzen sind ll-iiiin, '-lethemop Inh in, Oxvh.imo- ß lob in, Hämoglobin, Hämochrono^en, alkalisches liänatin, Näi'iinderivate und bestimmte andere Substanzen, die peroxidative oder peroxidasen-jileiche Aktivität enthalten. Andere Substanzen, die selbst keine Enzyme sind, jedoch peroxidative \ktivifit aufweisen sind beispielsweise liisensul focyanat, liisentannat, lerruferrocyanid, Chromisalze,(z.B. Chromisuifat), absorbiert von Silicate! und dergleichen.

Die Herstellung und Reaktionsfähigkeit von SuIfonylhydrazonen der angegebenen Formel ist bekannt, heisnielsreise aus vier Zeitschrift angewandte Chemie, Internationale Ausgabe, T_ (IDb«), Seiten 3S5 bis 344. Demzufolge lassen sich derartige SuI Pony!hydrazone beispielsweise nach einer der im folgenden angegebenen Methoden je nach den vorhandenen AuSijan^sverl«indungen herstellen:

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(a) reaktionsfähige quatcruäre Salze, z.H. der Formeln (IiI), oiler (VII) werden mit SuI fonv l'ivdr η ζoneη wie lol"t ui'H'e.sj

■»_5^

M-WII-S-) ,-Γ, il_r

(ΠΙ)

(V)

(IV)

(VI)

^N| ⁼⁽,^:"^SC|I3 Π
I

N-C = Ni-

(:_f>il₅

(VII)

(VIII)

Ar soi ic ':,--r.te >l^r Γο rri I n -;^:. aiul - ·'·: , i:. iljiii ;; i" i'.ir cir.on Alkylrest stellt, lassen ■; i t-!ι via!»ji I)JSOIiUc; rs leiclit (iiirc!· Su 1 forv/l '·.··.' rizonn-s te (.-rs j t Zen .

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(M Stehen Hydrazone zur Verfihuin.«¹., so Können diese mit Sulfonvlchlorid entsprechend der iolj-enden (iloichiinp, sul fön irrt v.erdcn

(ixj

wobei i' ein uasserstof f atom oder einen Mkvlrest darstellen \ nun

(c) 2-Ί hiazolonsul fonylhydrazone lassen sich lcsonders leicht

ausgehend von a-il3lo{»enoketonen und Benzol sul fonyl thi osrmicarbaziden nach folj'.ender I'eakt i ons<;l eichunj; synthetisieren:

R⁵-CH-C1 ,C,

H¹ O '<

(Xl) (XII)

(XIlI)

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ι.υriii hemmten:

t- i ii '. ..1SSC] stuf I a ton; oder einen AlKyI- oder \rvlrest, ein ,..1.SSCiT-1 η 1 f at o'n odor einen Mlylrest und cinrn \llvlrcsl.

lieriji'.- einer besonders vorteilhaften Uis.'jest al t hjip, der I.rfindun;¹, wird als SuI fön;] hyd ra mn-Vor 1 ^:'uf crverb i nduns: ein Salz der folgenden formel verwendet:

worin R, "' , !'." und Λ die bereits anj'.ecehene Bedeutung haben.

iiei ilirer Verwjiulun \ werden derartige Verbindungen zunächst zum Hydrazon dcprotoiii siert , das dann mit der Kupplerverbindunt) der Mischunt; Kuppel t .

Ms besonders vorteilhaft hat sicli die Verwendung von Salzen der angegebenen lori.icl erwiesen, in denen das Anion A ein p-Toluolsulfonsiiurcrest ist.

besonders vorteilhafte, erfindunpsgemäP verwendbare Hydrazon-Vorläuferverbindungen sind beispielsweise:

3-Methyl-6-nitro-2-(2-n-

to1uolsulfonylhydrazino) ■ benzothiazolium-p-toluol ·

NHN¹USO r-<' ')—CH, sulfonat

LU-

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- 2 P -

We thy 1-2-(2-ρ-toluolsu 1 fony Ihydraz i no) lenzotl; i azo 1 ium-p- toluo 1 sul l'onat

NiINHSOv

pi's

1-"ethvl-2-(2-n-toluolsul fony Ihydriz i no) eh i no 1inium-p-toluolsulfount

, ^NHNlI-SO CH

I- letliyl-2-(2-n-toluol-

su1fonylhydrazino)-pyr idiniun n-toluol-sulfonat

Die im Einzelfalle vorteilhaftesten Kombinationen vor (a) SuIfo-

nylhydrazon oder SulfonyLhydrazon-Vorläufcrverbiiulun;» iiinl (b)

Kupplerverbindung lassen sich nach dein beschr i ebenen Tor. t erhiitteln.

Die Kupplerverbindungen können dabei aus üblichen bekannten phenolischen und naphtholischen harbkupnlern oder aus aus aromatischen Aminen bestehenden Farbkupplern oder aus Farbkupplern reaktionsfähigen Methylen»ruppen bestehen.

Vorteilhafte, erfindungsgemäß verwendbare Kuppler sind b^:»ispielsweise:

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1, 2-.Na ρ lit ho 1, 5-1) i lie t hy 1 ami no- I -naplithalinsul f ons.'in re , 2, ()-Di iuetiiy !phono 1, i'henol, Dipheny lamin , 4-Ch lor-2-ni t rophenol , p-ilydroxypheny less i.jsüure, 4-Chi or-3-me thy 1 phenol, 2 ,4-1) i chi or- I naphthol und 4-Chlor- 2 ,6-clir. i tropiienol.

iiesonders vorteilhafte aus Triary 1 iini dazolen bestehende Farbbildner sind solche iler folgenden Formel:

R¹ ir

K³

worin R , Il und Il^J die angegebene Bedeutung haben. Mindestens

1 * 3

einer dor Subs ti tuenteii K , R" und \l besteht somit aus einem

Aryl rest i.iit bis zu 18 C-Atorien, der in ortho- oder para-Ste 1 lung durch einen Ilydroxy-substituenten substituiert ist. Ir vorteilhafter ..eL;e bestellt mindestens einer iler anderen Subs t i tuenten

I ⁷ 3

K , l\" und 1Γ aus einen or^rin i:;chen Kest, vorzugsweise \r^>Flrest i.iit bis zu 1;{ C-.\toi.ien, der in ortho- oder para-Ste I lun.c; einen Subs t ί tuenten aufweist, der aus einer elektronon-spendcnden (Iruppe lestcht, beispielsweise einer Mknxygruppc der ("ormel -Of.¹ oder einor iiialkylaminoj¹,ruppe der Tornieltl' )Λ> worin R jev.eils für einen Alkylrest mit I bis 8 Kohlenstoffatomen steht.

ilerstel lunj', und Reaktionsfähigkeit von geeigneten Tr inry 1 imidazo l-FarbbiIdnern sind beispielsweise aus der US-PS 3 297 710 bekannt.

nie durch Il , R und I' dargestellten lUiste der Imidazole können durch die verschiedensten Subs tituenten substituiert sein, beispielsweise lialogenatone und/oder Hydroxy-, Cyano-, ilaloalkyl-, Cyanoalkyl-, Hydroxyalkyl-, Aminoalkyl-, Aryl-, Aroxyl-, Aralkoxy-, Alkylthio-, Arylthio-, Aralkylthio-, Alkanovl-, Vroyl-, Alkyl-, Sulfonyl-, Ary lsulfony I- , Di.ilkylaiiiino- , Tr ialky lammonium-, Alkoxycarbonyl-, \ry loxycarbonyl- und Dialky laininocarbonylres te .

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Dabei weisen die Alkylreste und Alkylqruppen dieser Substituenten vorzugsweise 1 bis 5 C-Atome auf und die Arylreste bzw. Aryl.'jrunpen stehen für übliche bekannte Arvlreste, beispielsweise der Phenyl- oder N

Vorteilhafte, erf indunjjsgemäß verwendbare Triarylimidazol-Iarl>-stoffbildner sind beispielsweise:

C₂₅H₂₄N₂O₅ OCH

0-CH.

O-CH.

2-(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-4,5-bi s-(4-methoxypiienyl) imi dazol

2- (3 ,5-I)ibrom-4-liyclroxvphenyl)-4 , 5-diphenyl inidazol

C₂₄H₂₁BrN₂O₄

2-(3-Brom-5-mcthoxy-4-hydroxyphenyl) -4, 5-Ms-( 1-methoxyphenyl) iinidazol

Br

OLH

O-CH.

0-CII.

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1 , S-Hi S (4-dinet Iiγ 1 ηπ; i nophenyl) -Z- ( 4-hydroxyphenyl in.i dazo 1

ι:ιΐ-ο

4 , S -1' i s (4 - d i mc I hy 1 am i nonlicny 1) -2- (4 -!iydroxy3-i:ietliox"ni:enyl) im i dazol

ΗΊΙ.

2- (4 -!Iydroxyphenyl) - 1 , S-I)i s (4-met Ιιοχλ'ηΐιοηνΐ) ini d η ζ ο 1

K (CIl₃)

4,5-1H s(4-dimethylaminophenyl)-2-(4-hydroxy)-3,5-dimellioxyphenyl) iir.idazol

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IVeitere erfindungsgemäfi verwendbare Imidazole sind beisnielsweise aus der US-PS 3 297 710 bekannt.

Zur Herstellung erf indungsnemäi'er Best inrmii'Tsrea.ücnz ion Lnssen sich die verschiedensten üblichen bekannten Puffersubstanzen verwenden. Geeignete Puffersubstanzen sind dabei solche, die den pH-Wert des Reaktionsniediums auf einen Wert einstellen, der dem Ablauf der farbbildenden Reaktion förderlich ist und >lie Reaktion nicht inhibiert. Die beschriebene Testmethode, die in dem später folgenden Beispiel I noch näher beschrieben werden wird, eijnet sich ebenfalls zur Auswahl speziell geeigneter Puffersuhstanzen für spezielle Substanzen mit pcroxidativer Aktivität und spezielle Farbbildner.

Als besonders vorteilhafte PufCcrsubstanzen haben sich Carhonatpuffer enviesen, beispielsweise Natrium- und KnI iincarbonate, Boratpuffer, z.B. Natrium- und Kaiiumborate, Citrate, Phosphate und Glutarate sowie die bekannten l'ris-Puf fersubstanzen, beispielsweise Tris(hydroxymethyl)aminomethan. Γη vnrtei1Ί iftor Weise puffern derartige Puffersubstanzen, die crfiiuliuu'sgemäßen Bestiinmungsreagenzien auf einen pH-tYert zwischen etwa 5,0 und IU,i) ab, der sich als vorteilhafter Bereich für die Nest innunij von beispielsweise Blutserumkomponenten erwiesen !int, und zwar unter Verwendung der beschriebenen Farbbildner, beispielsweise in Kombination mit enzyinatischen Reaktionen, wie sie sicli beispielsweise für die Bestimmung von Glucose unter Verwendung von (llucoseoxidase unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid als vorteilhaft erwiesen haben. Bei der Bestimmung von Harnsäure unter Verwendung von Uricase hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, das ßestiinmungsreagenz auf einen pil-i.crt zwischen etwa 8 und etwa 9 abzupuffern.

Wie bereits dargelep.t, lassen sich die erfindunpsneuäiien Hestimmungsreagenzien in saugfähige oder absorbierende analytische Elemente bekannter Struktur einarbeiten.

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Die er f indungsgemäioen Best iminungsreagenzien lassen sich beispielsweise in Test- oder Analysen-Elementen verwenden, die aus fasrigen Filterpapieren bestehen oder aber in besonders vorteilhafter weise in mehrschichtigen analytischen Elementen, wie sie beispielsweise aus der US-PS 3 992 158 bekannt sind.

Kennzeichnend für derartige analytische Elemente ist:

(1) eine Ausbreitschicht und

(2) eine Üeagenzschicht, die bei Verwendung des Elementes mit der Uisbreitschicht in Flüssigkeit.«;- oder Ströinungskontakt steht und gegebenenfalls

(3) ein Schichtträger, auf den die beiden Schichten aufgetragen sind.

In besonders vorteilhafter Weise weisen derartige Elenente eine nicht-fasrige Ausbreitschicht auf.

Mehrschichtige analytische Elemente dieses Typs eignen sich zur Ausführung von Einzslanalysen oder Mehrfachanalysen unter Verwendung von kontinuierlich arbeitenden Analysegeräten. Die analytischen Elemente können dabei in Form von endlosen Streifen, blättern oiler diskreten Abschnitten verwendet werden. Hie Bedeutung eines "Fliissigkeitskontaktes" oder eines "Strömungskontaktes" ergibt sich aus der US-PS 3 992 ! 5ΙΪ.

Ein solcher Flüssigkeitskontakt zwischen Schichten läßt sich dadurch erreichen, daß die einzelnen Schichten der Elemente benachbart zueinander angeordnet werden oder mindestens derart, daß ein Flüssigkeitsdurchtritt oder eine Flüssigkeitspassage von Schicht zu Schicht erfolgen kann. Gegebenenfalls kann es jedoch auch zweckmäßig sein Elemente herzustellen, die Schichten aufweisen, die zunächst einander nicht benachbart sind oder nicht aneinander anstoßen und die voneinander getrennt sind, beispielsweise durch Zwischenschichten, wie es beispielsweise aus der US-PS 3 511 608 bekannt ist oder durch Verwendung eines federnden absorbierenden

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Materials oder deforriierharcr Schicht tr.M;;tr, tie sie beispielsi pise aus den US-PS 7> *> 1 7 453 und 3 P33 5⁽)4 bekannt sind, !".eisen die Llenente zunächst koino aneinander anstoßende oder benachbarte Schichten aiii, so kann es notv.e.inH ·; sein Druck anzuwenden oder andere !abnahmen zu treffen, um >.H e Schicht.cn des ! lcnentes zu.n '.i'i tpunkt seiner Verwendung in Fl iissi ijkoit skontal. t oder St r">Ti;un;'s kontakt miteinander zu bringen.

Die Ausbrei t schicht bestellt dabei aus einer ζ . !?. isotro" "o Schicht, die eine l-'lüssi ?,Vci tsprobe aufnehre.n lann, die direkt auf die Ausbrei tschicht aui";;elirnclit κ i rd oder der >ur:l>rei t schicht ms einer Schicht oder aus Schichten zuj'cfi'ihrt \.ir !, die in I 1 .'issi "Je i t sl.ontakt mit der Ausbrei tschicht stehen, uobei ii.ner- ^:Kilh der Ausbreitschicht eine Verteilun". ucs l.ösun ;sini ttei s oder Oi spersionsi'iedi uns der aufgebrachten l'robc und inirdestens einer gelösten bzw. disj'erpjerten Koiiponente erfolgt, derart, da" eine i'lei cii füriüige Konzentration der Komponente an der Obprfläche der Ausbrei t schicht , die der P.ea.",cnzsciiicht oder einer '!eaj'enzschicht des Elementes {',e^eniiberl icjjt, erzeugt wird, !'ie jileichförmi ge fvonzent ration läßt sich dabei auch als ftlci chförmi jie offensiclitliche (apparent) Konzentration bezeichnen. I-ine solclie "offensichtliche" Konzentration kann dabei riit Konzentrat ions^radient er. erreicht uerden, die durch die Dicke der Schicht verlaufen oder in anderer IVeise in der Schicht vorliegen. Derartige Konzenl ra tions- :;radienten führen jedoch zu keinerlei Schwierigkeiten bei der Ermittlung quantitativer Testerj;ebni ssc und lassen sicli unter Verwendung üMicher Jiiclimethoden ausschalten.

In vorteilhafter IVeise bestellt die Ausbrei tschicht aus einer isotrop porösen Schicht. Unter einer isotropen Porosität ist dabei gemeint, daß die Schicht praktisch nach allen l'ichti nunpen hin porös ist. Der Grad der Porosität kann dabei verschieden sein, beispielsweise lassen sich l'orengröRc und Porenvolumen verändern. Die lierstcl lunj; isotrop poröser Schichten und der l'epriff der isotropen Porosität werden näher beispielsweise in der US-¹Vi 3 9¹JZ 153 erläutert.

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!»er (!rad der Ausbreitung !längt t ri 1 weise von dem Volumen der auszubreitenden Flüssigkeit ab. Tat sich] ich iedoc'i ist dir gleich] iii iii i ge "offensichtliche" Konzentration, die bei Verwendung einrr Ausbrritschicht erreicht wird, praltisch unabhängig von dein Volume?! dor aufgebrachten Flüssigkeit und tritt unabhängig von ui-i! Ausi.ia!) der Ausbreitung auf. I r fol gedc^sen ist hei Verwendung er l'i ndungsgcr:ä"er analytischer Elemente die Anwendung, genauer Proben-Uosicrungsvcrfabren nicht erforderlich. .Jedoch kann es in Einzelfalle vorteilhaft sein, beispielsweise un· vorteilhafteAusbrei t zei tnii ru erreichen, bestimmte Volumina einer FKissigleitsnrohe zu verwenden. Da sich bei Verwendung erfirdungsgei.Kii'.er analytischer lilencnte quantitative lirgoknisse ausgehend von vergleichsweise sehr geringen Probenvolumina erzielen lassen, die von einem bestimmten vortci lhaften Bereicli der Ausbreitschicht aufgenommen werden können, beispielsweise von einen Bereich einer (Irö^e von 1 cn , besteht keine Notwendigkeit überschüssige Flüssigkeit von den l-ilc-nent nach Aufbringen der Flüssigkeitsprobe zu entfernen. Da die Ausbreitung der Flüssigkeitsprobe in der Ausbreitschicht erfolgt und die ausgebreitete χιχ Dtei&ttüMddidtök Komponente der P.cagenzschicht zugeführt wird, ohne dai> dabei ein ins ilcwicht fallender lateraler hydrostatischer Druck anzuwenden ist, tritt kein "ringing"-Problem auf, das oftmals ir.i Falle analytischer klemente des Standes der Technik zu beobachten ist, wenn lösliche Reagenzien verwendet werden.

Die Ausbreitschicht braucht lediglich eine gleichförmige Konzentration der ausgebreiteten Komponenten pro Flächeneinheit auf der Oberfläche, die der Reagenzschicht gegenüberliegt, zu erzeugen. l:iη geeignetes Testverfahren, nacli dem möglich ist zu ermitteln, ob eine spezielle Schicht als Ausbreitschicht verwendbar ist, ist beKnielswcise aus der US-PS 3 992 158 bekannt.

isotrop poröse Schichten lassen sicli ausgehend von verschiedenen Ausgangskomponenten herstellen. Beispielsweise lassen sich derartige Schichten ausgehend von teilchenförmigen Stoffen herstellen, wobei die isotrope Porosität durch die Zwischenräume zwischen den Teilchen hervorgerufen wird. Andere Verfahren zur Herstellung von isotrop porösen Polymerschichten beruhen auf der Verwendung von gasförmigen oder anderen quellbaren Bestandteilen

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zur iirzeugun·] von Poren. i)erartije Verfahren sind beispielsweise aus den US-PS 2 9f>n 728 sowie 2 9 16 f>95 bekannt. P?s v/eiteren können Ausbreitschichten aucli unter Verwendung von Ausfiliverfahren hergestellt werden, wie sie beispielsweise aus der US-PS 3 555 bekannt sind oder durch Verwendung einer, lösbaren Stoffes innerhalb einer Poly:.ierphase ,der aus dieser unter Hrzeujjiuv* von Poren herausgelöst wird, wie es beispielsweise aus der US-PS Τι Γ516 575 bekannt ist. Als besonders vorteilhaft hat sich (He Verwendung von son. "Blushed"- oder ausgefällten Polymerschichten erwiesen. )ie iierstellung von isotrop porösen Schichten dieses Typs ist hei — spielsweise aus der US-PS λ 992 153 bekannt.

Zur iierstellung der Ausbreitschichten lassen sich die verschiedensten Verbindungen verwenden. ^Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, wenn diese Aussangsverb indungen vergleichsweise quellresistent sinJ, bei Kontakt mit den Flüssigkeiten, die analysiert werden sollen. Iiine Quellunp von etva Jo bis lⁿ" , bezogen auf die nicke der trockenen Schicht wird dabei als normal betrachtet.

Als besonders vorteilhaft hat es stc'i des weiteren on ier./>n, wenn die Ausbreitschicht nicht- fasri,^r: ist. Unter "nicht-far> ri;;en" Schichten sind dabei Schichten z;i verstehen, die frei oder mindestens praktisch frei von fasri;:en Stoffen sin?!, d.h. Schichten, die keine fasrijen Komponenten enthalten oder wenigstens nicht solche Mengen an fasrir;en Komponenten, die das Ausbreiten einer Fluss ifjkeitsprobe stören könnten oder die die Bestimunj.; der erzielten analytischen tiri;ebnisse auf rad iometr ischen V.'epe beeinträchtigen könnten.

Bei den Ucaj'.enzschichten der erfindun».s".eiii;ir.en Llouente handelt es sich in vorteilhafter Weise tin permeable, vorzugsweise ;^T.leichföriiiij] periiieable und p,ef;ebenDn fal Is poröse Schichten, d.h. Schichten, die für die Komponenten, die durch die Ausbreitschicht ausgebreitet wurden, porös sind, !»er \usdruck "pormenbel" schließt dabei eine Perneabi 1 itl\t eir , die durch lic Porosität hervorgerufen wird, die Fähigkeit zur >lucllung sowie andere

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Charakter istika. Kennzeichnend für derartige Reagenzschichten ist im allgemeinen eine Matrix, in der Stoffe, die mit der zu analysierenden oder zu bestimmenden Substanz zu reagieren vermögen verteilt, d.h. gelöst oder dispergiert sind.

Die Verteilung reaktionsfähiger Stoffe, d.h. der Reagenzien lä"t sich durch Lösen oiler Dispergieren derselben in den Matrixmaterial erreichen, obgleich oftmals eine gleichförmige Verteilung der Reagenzien vorteile bietet, braucht sie nicht unbedingt erforderlich zu sein, beispielsweise dann nicht, wenn die reaktionsfähige Substanz, beispielsweise aus einer. Fnzyn, z.H. l'ricase besteht.

In vorteilhafter Weise sind die Heagenzschi eilten für dia ausgebreiteten Komponenten gleichförmig permeabel. Unter einer «leichiörmigen Permeabilität einer Schicht ist dabei eine Permeabilität zu verstellen, die derart ist, daf., wird eine homogene Flüssigkeit gleichförmig auf die Oberfläche einer Schicht gebracht und werden Konzentrationsmessungen der Flüssigkeit innerhalb der Schicht unter Verwendung der gleicher Vorrichtung und unter gleichen Bedingungen, jedoch in verschiedenen Dereichen der Oberfläche «ler Schicht durchgeführt, gleiche oiler praktisch gleiche lirr.cbnisse erhalten werden. Infolge einer gleichförmigen Permeabilität werde» unerwünschte Konzentrationsgradienten, beispielsweise einer Reagenzschicht des beschriebenen Typs vermieden.

iirfindungsgemäße analytische Llemente können des weiteren sog. Uegistrierschichten aufweisen, d.h. Schichten die unterhalb der Ausbreit- und !ieagenzschichten liegen und keine reaktionsfähigen Komponenten enthalten und lediglich dazu dienen, die Farbstoffe aufzunehmen, die in den darüberIiegenden Schichten erzeugt wurden. Derartige Schichten bestehen im allgemeinen aus Matrixschichten, Aiü für den oder die erzeugten Farbstoffe und gegebenenfalls andere Komponenten, beispielsweise Beizmittel, oberflächenaktive Verbindungen und dergleichen periii3i>bel sind. Derartige Schichten und iiire Anordnung in analytischen !!lementen sind be ispie lswe i se aus der Bii-l'S 831 (>fiO bekannt.

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Zur herstellung Jer P.ea;;cnz- und Rei'.i st ri erschi r!it cn lassen sich ti ir- verschiedenst cn Matri xniateri al ien nusi.ähl on , wobei das im Einzelfalle .",unstif.stc "ntrixiiiaterial von den angewandten Analysrnverf ahrer. und .Ien aktiven Komponenten aHi;'n;;t , die in Ins lalrixuaterial eingearbeitet werden sollen. Vorteilhafte Matrixi'Kiterialicn bestehen aus hydrophilen Stoffen natürlicher oder synthetischer Herkunft. In vorteilhafter hrise lassen siel· orgaro- ;u»ile Stoffe verwenden, z.H. Celluloseester. Hi.i die I'erueaM 1 i t.'i t der Kea«',enzschi cht zu steigern, sofern diese nicht porös ist, Van» es oftnals vorteiüiaft sein ein Matrixmaterial zu verwenden, das in den Lüsunjisni ttel- oder Di spers ionsne-J iu.n der zu analysierenden

- 1 ll>n3- ist.

Al· gesehen von ilirer Perneahi 1 i tat v.eist die Peaf^nzsclii c'it in vorteilhafter ;\eise praktisch keine lii^ensc'iaf ten oder Chnrakt rrist i ■ ka auf, die zu Störungen hei der Hrni tt.lun." eines analytischen l;r- ^chjiisses führen könnten. Zwecks weiterer lii jizelhci ten bezüglich des Aufbaues und der Eigenschaften ,^eei jjnetcr !<ea.",enr.schi eilten \\\n\ auf die US-rs 7, 9'.)2 15J5 verwiesen.

j.ei den erfindun.",s»eni;iren analytischen Elementen kann es sicli un selbsttragende Elemente !landein. Andererseits können jedoch auch die Auslirei tschicht, die Rea^enzschicht «ind gegebenenfalls vorliande- UC weitere Schichten auf einen Schichtträger aufpetra^en werden. Als Schichtträ^erüiaterialien können die üblichen bekannten Schichttraceniiaterialien verwendet werden, beispielsweise Papier und mit einem Polyolefin kaschierte Paniere, wie auch Schichtträger aus den verschiedensten üblichen bekannten polymeren Stoffen, z.H. Schichtträger aus Celluloseacetat, Polyethylenterephthalat), Polycarbonaten und Polyvinylverbindungen, z.U. aus Polystyrolen.

Der Schichtträger kann dabei aus einem opaken oder 1ichtundurchlüssigen Material bestehen oder aber er kann für Eicht oder andere Energie, je nach derjbnf.ewandten Bestinmungsmethode, durchlässig sein. Die Auswahl des Schi chtträj^ers l· inp.t dabei von dem analytischen Verfahren ab, das angewandt werden soll. Als besonders vorteil haft hat sich die Verwendung von transparenten Schichtträgern erwiesen, die elektromagnetische Strahlung einer Wellenlänge oder

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eines !'.'el 1 enlängenberei dies innerhall) eines Bereiches von etwa 200 liiii und etwa 'JOO nr.i durchzulassen vermögen. Cci'.eb?nenfal 1 s kann es des weiteren vorteilhaft sein, wenn ein Schi clitt rager verwendet wird, der für eine oder mehrere enge IVe 11 en längenbanden durchlässig ist und für benachbarte 'VcI lenl Mngenbandeii undurchlässig ist. nies läfit sich beispielsweise dadurch erreichen, daH nan den Schichtträger mit einer oder mehreren färbenden komponenten, die geeignete AbsorM ior-scharakteristika aufv-'ei sen, imprägniert oder beschichtet.

Bei Verwendung eines lilenentrs mit einen Schichtträger befindet sich die Ueagenzschicht zwischen dem Schichtträger und der Ausbrei tschicht . Besonders vorteilhaft Durchlässigkeitsbereiche für erfindunjs^emäLc iile-ucnte ergeben sich aus der Diskussion der verschiedenen, erfindungsgemäß anwendbaren Farbindikatoren.

Werden zur Herstellung der analytischen Elemente Schichtträger verwendet, so weisen diese vorzugsweise eine Stärke von etwa 0,025 bis etwa 0,25 mm auf, obgleich auch Schichtträger außerhalb dieses Bereiches verwendbar sind. Die in liinzelfalle günstigste Schichtstärke kann von verschiedenen Faktoren beeinflußt '-'erden, beispielsweise der Intensität der zur Durchführung des analytischen Verfahrens verwendeten Strahlung und der Empfindlichkeit der Bestimmungsvorrichtung.

In vorteilhafter Weise sind die crfindungsgemäßen analytischen Elemente so ausgestaltet, daß sie im Rahmen analytischer Verfahren verwendbar sind, die auf Reflexionsmessungen spectrophotometry scher Metiioden beruhen, weshalb sie in vorteilhafter Weise eine Schicht aufweisen, die die Funktion einer reflektierenden Schicht ausübt und einen geeigneten Hintergrund für spectrophotometry sehe Messungen choloriMetrischer oder anderer Indikatorreaktionen durch den Schichtträger des Elementes ermöglicht. Die reflektierende Schicht soll dabei den Durchtritt der zu analysierenden Substanz zur Reagenzschicht oder Re;;istrierschicht ermöglichen und einen wirksamen Hintergrund für r-*[lextions-spektrometrische Messungen

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liefern, hin weißer llinter-grund hat sich dabei dir diesen Zweck als besonders vorteilhaft erwiesen. In liinblick auf ihre Fi.in.Vt.ion als Hintergrund für einen Indikator der in der Reagenz- oder Registrierschicht erzeugt wurde, lie;;t die reflektierende Schicht normalerweise zwischen der Ausbreitschicht und der Reagenz- oder Re^istrierschicht. Ils ist jedoch auch ü-öflich, daß eine solche Schicht zwischen einer Reagöiizschiclit und einer ^;?e.7i str iersch icht angeordnet wird. Eine Reflex-ion läßt sich des weiteren beispielsweise durch eins Schicht erreichen, die gleichzeitig zum Beispiel als Ausbreitschicht dient oder aber die Reflexion kann durch eine zusätzliche Schicht bewirkt werden, die keine v/eitere Funktion innerhalb des Elementes hat. Zur Erzeugung von reflektierenden Schichten lassen sich in vorteilhafter Weise Pigmente, wie beispielsweise Titandioxid und Bariumsulfat verwenden. .Jedoch können auch so«. "Blush"-Polymerc zur Herstellung reflektierender Schichten verwendet werden. Reflektierende Schichten können somit beispielsweise aus pigmenthaltigen Ausbreitschichten bestehen wie auch aus blush-Polymeren aufgebaute Ausbreitschichten. Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung weisen die analytischen Elemente Blush-Polymerschichten auf, die zur Steigerung der Ausbreitung und/oder Reflektivitat ein Pigment enthalten. Die Pigmentmenge, die in einer Schicht mit einem Blush-Polymeren vorliegen kann, kann sehr verschieden sein. Als vorteilhaft hat es sich erwiesen, etwa 1 bis etwa 10 Gew.-Teile Pigment pro Gew.-Teil Blush-Polymer zu verwenden, vorzugsweise etwa 3 bis etwa 6 Gew.-Teile Pigment pro Gew.-Teil Blush-Polymer.

Gegebenenfalls können in denerfindungsgemäßen analytischen elementen auch Filterschichten vorliegen. Derartige Filterschichten sowie ihre Herstellung ist bekannt. Sie können dazu dienen Probenbestandteile abzufiItrieren, die die im Clement ablaufenden Reaktionen stören könnten oder in anderer Weise hinderlich bei der quantitativen Ermittlung der zu analysierenden Substanz sein könnten. Ira Falle der Verwendung eines mehrschichtigen analytischen Elementes für die Bestimmung von Harnsäure in Blut kann eine separate Filterschicht beispielsweise dazu dienen, rote Blutkörperchen abzufiltrieren, während das Blutserum zu der unter der Filterschicht liegenden Schicht gelangt. Bei der Analyse von ßlut-

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serum und anderen Flüssigkeiten kann eine Filterschicht des weiteren dazu dienen un unerwünschte Komponenten zu entfernen, die dan Ablauf der Bestiinmungsreaktion beeinträchtigen und zu verfälschten Analysenergebnissen führen könnten. Gegebenenfalls können auch Blush-Polyinerschichten als FiIterschichten dienen. Bei Verwendung eines analytischen Llementes für die Analyse von !Hut hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn eine Filterschicht eine Porengröße von etwa 0,5 bis 5 Mikron hat.

Un die Adhäsion einer Reagenzschicht gegenüber einer darüberliegenden Ausbreitschicht, Filterschicht und/oder reflektierenden Schicht zu verbessern, kann es in manchen Füllen vorteilhaft sein permeable Trenn- oder Zwischenschichten zu verwenden, die als flaftschichten zur Verbesserung der Haftuig der einzelnen Schichten dienen. Zur Herstellung derartiger Zwischen- oder haftverhessernden Schichten können die verschiedensten Stoffe verwendet werden, solange die Schichten für die zu analysierende Substanz nerr.ieabel sind und ermöglichen, daß die zu analysierende Substanz in die l'eagenzschicht gelangen kann und solange die zun Aufbau dieser Schichten verwendeten Stoffe nicht die Reagenzien in benachbarten Schichten inhibieren.

Zur Herstellung derartiger Zwischenschichten oder haftverbessernden Schichten geeignete Ausgangsverbindungen sind bekannt. Als besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung von polymeren filmbildenden Stoffen erwiesen, beispielsweise Poly(n-vinyl-2-pyrrolidon), Poly(n-isopropylacrylamid), Copolymere aus Vinylacetat und Vinylneodecanoat mit vorzugsweise 20 Gew.-% Vinylacetat sowie Copolymeren aus Vinylneodecanoat und n-Vinyl-2-pyrrolidon, vorzugsweise mit 10 bis 30 Gew.-$ Vinylneodecanoat.

Da die Permeabilität der Zwischenschichten gewahrt bleiben muß, sind diese Schichten notwendigerweise sehr dünn und weisen im allgemeinen eine Dicke auf, die der Dicke einer Monoschicht entspricht, bis zu Schichten einer Schichtstärke von etwa 0,025 mm. Werden derartige polymere Zwischenschichten verwendet, so entfallen

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in vorteilhafter Ueise auf cine Träncrfl.'iche von 1 tv.' etwa Pο bis 1000 «<;,, je nach den speziellen Ii ϊ genschaf ten dor Polyncr^r., beispielsweise der Dichte und der erforderlichen JVrneabi 1 i tat der herzustcl lciulcn Schichten.

(ie^ebenenfal Is können auch Oberfl Mclienhehnnulun'.cn durchgc-führt werden, weiche die Adhäsion zwischen der Schichten fördern, beispielsweise lilektronenbestrahlungen und dergleichen.

Die Herstellung der analytischen I-lenentc kann nach üblichen bekannten Methoden erfolgen. So ist es beispielsweise Möglich, die einzelnen Schichten eines erfindungs.gemäßen analytischen JiIeüientes zunächst gesondert herzustellen und die hergestel 1 ten Scliichtcn später zusammen zulani nieren oder solange als separate Schichten zu erhalten, bis sie bei Verwendung des Hlementes in Flüssigkeitskontakt r.ii teinander gelangen. Schichten, die in Form von separaten Scliichtcn hergestellt werden, lassen sich in typischer Weise ausgehend von Lösungen oder Dispersionen herstellen, die auf eine Oberfläche aufgetragen werden, von der die hergestellte Schicht dann auf physikalischem !Verc abgestreift wird, nach dein sie getrocknet ist.

liin vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung von erf indungsgeKi.^:iP>en Iilei.ienten, das die Notwendigkeit mehrfacher Abstreif- und Laminierungsstufen vermeidet, besteht darin zunächst eine erste Schicht auf eine Abstreifoberfläche oder einen Schichtträger aufzutragen, worauf auf die zunächst erzeugte Schicht eine weitere Schicht oder mehrere weitere Schichten aufgetragen werden können. Jiine solche Beschichtung kann beispielsweise von Hand erfolgen oder nach üblichen bekannten Beschichtungsmethoden, beispielsweise durch Tauchbeschichtung, Wulstbeschichtung und dergleichen. Bei einer Maschinellen Beschichtung kann es vorteilhaft sein, einander benachbarte Schichten gleichzeitig aufzutragen, beispielsweise unter Verwendung der üblichen bekannten Beschichtungsvorrichtungen, die zur Herstellung lichtempfindlicher photographischer Filme und Papiere verwendet werden und die das Auftragen mehrerer Schichten gleichzeitig gestatten. Die Haftung der Schichten untereinander läßt sich gegebenenfalls durch Oberfl richenbehand-

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langen, einschließlich der Aufbringung extrem dünner Haftscliiciiten, wie im Falle photographischer Filme verbessern.

C.e;',eb-cnenfnl Is können bestimmte Reagenzien aucli in der Ausbreitjchicht untergebracht werden. Beispielsweise lassen sich Enzyme, wie beispielsweise das Enzym üricase in einer Ausbreitschicht unterbringen, wodurch eine Wasserstoffperoxiderzeugung bewirkt werden kann, bevor die Probe die Reagenzschicht erreicht, die die Reagenzien enthält, welche mit dem IUO₂ ^unter Erzeugung einer feststellbaren Veränderung reagieren.

lirfüllt die Ausbreitschicht die Funktion einer Ausbreitschicht und einer Filterschicht, so kann die Schicht in vorteilhafter iveise dadurch hergestellt werden, daß gleichzeitig zwei Lagen eines Bindemittels, beispielsweise Celluloseacetat, gelöst in einer Mischung aus organischen Lösungsmitteln, mit dem Ziel "ßlush"-l'olymerschichten zu erzeugen, auf eine entsprechende Unterlage aufgetragen werden. L^:in solches Verfahren vereinfacht die ilerstellungsoperation dadurch, daß die Mehrfachbeschichtung zur Herstellung mehrerer Schichten auf eine Mehrfachbeschichtungsoperation vermindert wird, unter gleichzeitiger Erzeugung einer hochwirksamen Ausbreit- und Filterschicht. Gegebenenfalls kann die eine oder können beide der diskreten Schichten oder Lagen ein reflektierendes Pigment wie beispielsweise TiO₂ dispergiert enthalten.

Vorrichtungen und Verfahren, die sich zu einem gleichz-eitigen Auftrag verschiedener einzelner Schichten oder Lagen innerhalb der Ausbreitschicht und/oder Reagenzschicht eignen, sind beispielsweise aus der US-PS 2 932 855 bekannt.

Die im Einzelfalle optimale Dicke der Ausbreitschicht kann verschieden sein. Sie kann teilweise von dem Probenvolumen abhängen, das auf das analytische Element aufgebracht werden kann und das aus Gründen der Einfachheit und Sauberkeit von der Ausbreitschicht absorbiert werden sollte, sowie dem Porenvolumen der Schicht, das ebenfalls/Probemenge beeinflußt, die von der Schicht absorbiert werden kann. In vorteilhafter Weise haben die Ausbreitschich·

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ten eine Stärke von etwa 50 bis etwa 300 fülrnn, ob;; Ie ich in vorteilhafter Weise auch Schichten außerhalb dieses Bereiches verwendet werden können.

Bei Herstellung von isotrop porösen Ausbreitschichten hat es sich als zweckmäßig erwiesen, wenn das Porenvolumen dieser Schicht bei etwa 25$ des Gesamtvolumens der Schicht Liegt, vorzugsweise bei etwa 50 bis D5o des Gesamtvolumens, fn vorteilhafter Weise lassen sich durch Veränderung des Porenvolumens einer porösen Ausbreitschicht die Llement-Charakteristikn verMrdern, beispielsweise die Gesamtpermeabilität der -\ushre itschicht oder die zum Ausbreiten einer Probe erforderliche Zeitspanne. Das Porenvolumen innerhalb einer Schicht läßt sich durch Auswahl beispielsweise vier zur Herstellung der Schicht verwendeten teilchenförmigen Stoffe kontrollie ren, beispielsweise durch die Größe der verwendeten Teilchen oder durch Auswahl der Lösungsmittel oder Trockenbsdim;uni;en, sofern isotrop poröse "ßlush"-Polynere zur Herstellung der Ausbreitschicht verwendet werden. Has Porenvolumen einer solchen Schicht läßt sich nach üblichen bekannten Methoden, beisni?lswoise statischen Methoden ermitteln, wie sie beispielsweise von Chalkley in der Zeitschrift "Journal of the National Cancer Institute", £ (1043), Seite 47, beschrieben werden oder durch direktes ;Uiswie«;en und Bestimmen des Verhältnisses von tatsächlichem Cewicht der Schicht zuiii Gewicht des festen Materials, das mm Aufbau der Schicht verwendet wurde.

Die Reagenzschichten lassen sich dadurch herstellen, daß zunächst eine Lösung oder Dispersion aus dem Matrixmaterial der Schicht und den entsprechenden Reagenzien hergestellt wird, worauf die hergestellte Lösung oder Dispersion unter Anwenduni ein;··; üblichen Beschichtunjsverfahrens auf eine entsprechende Unterlage aufgetragen und unter Urzeugung einer dimensionsstabilen Schicht aufgetrocknet wird. Die Dicke deF Rea^enzschicht und ihr Perm«ab i 1 i t." ts^rad können sehr verschieden sein, je nach den; Verwendungszweck der Schicht. Als zweckmäßig hat es sich erwiesen, wenn die TrocJrendicke der Schicht bei etwa 1Π bis etwa IW Mil.ron lief,

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Des weitereii kann ein erfindungsgenfiftes analytisches Clement i.ieiirere diskrete Reagenzschichten aufweisen, von denen eine jede eine spezielle Funktion in dem analytischen Destimwungsverfahren erfüllt.

Im Falle eines analytischen Elementes für die !!fs timiuung von liarnsüure beispielsweise kann die Reagenzschicht oder das Uoagenzsystem aus zwei diskreten Schichten oder Teilschichten bestehen. Dabei kann die obere dieser Schichten die für die .'.assars tof fperoxiderzeugung aus der Harnsäure erforderlichen Reagenzien enthalten und die z'./eite Schicht eine F^rbkupplerverbindung oder ein anderes Indikatorsystem.

I:.i Falle eines analytischen Hlementes für die Be st immun t» von Harnsäure kann das Enzym Hricase in entweder der Ausbreitschicht oder der Reagenzschicht untergebracht werden, zweckmäßig in einer Konzentration von etwa 50 bis 500 Einheiten/m und vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 100 bis 300 Einheiten/m . Die l'eroxidase kann in einem derartigen Element, beispielsweise in einer Konzentration von 1000 bis 10 000 Einheiten/m und vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 2000 bis 8000 Einheiten/ m" vorliegen.

In vorteilhafter l/eise werden die einzelnen Schichten eines erfindungsgemäßen analytischen Elementes ausgehend von Beschichtungslösungen oder ßeschichtungsdispersionen hergestellt, wie sie beispielsweise in der IIS-PS 3 992 158 beschrieben werden.

Oftuals hat es sich als vorteilhaft oder notwendig erwiesen, den Beschichtun^;slüsungen oder Reschichtungsdisnersionen ein ßeschichtungsliilfsmi ttel zuzusetzen.

Verwendbar sind die verschiedensten üblichen bekannten Beschichtungshilfsmitte 1. Wesentlich ist lediglich, daß sie nicht die Aktivität der verwendeten Reagenzien, beispielsweise der Mricase inhibieren, die in den Schichten eines erfindiinesgei.uißen Elementes untergebracht werden. Als besonders vorteilhafte Geschiehtungshilfsmittel haben sich nicht-ionogene oberflächenaktive Verbin-

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en erwiesen, beispielsweise Octylnher.oxypolyäthoxyäthanole. i)erarti;',e nicht-ionogene oberflächenaktive Verbindungen sind 5 »τι Il.mJc-l erliMltlich beispielsweise unter den Hard?] shezci c'munren Tr i tor X-IOO, 102, 165, .303 und 405, das besonders vorteilhaft ist (Hersteller Rohn und Haas Company, USA). IVeit^re besonders vorteilhafte iii cht-iono^ene Bcschichtun^shi1fsmittol sind solche auf ijiisis von (p-Nonylphenoxy)^lyzerin. Derartige Beschi chtungshilfsmittel sind im Handel erhältlich, beispielsweise unter der Handelsbezeichnung Surfactant 10(1 (Hersteller 03 i η Mathieson Corp., USA). Weitere vorteilhafte ßeschichtun<>shi lfsmittsl sind solclie auf Basis von l'olyäthylenglykolen, beispielsweise solche die ii<: üandel unter der I3ezei clinun^ "Carbov.-ax-Poly^!»thylerr;lyi:cl" erhältlich sind, beispielsweise unter den Typenbezeichnunnen (liV), 154'), 4000, 6000 und 20M (Union Carbid Corp., USA). AJs besonders vorteilhaftes J>eschichtunj;shilfsmi ttel dieses Typs hat sich beispielsweise der Oleyläther von Carbowax 1540 erwiesen.

V.'eitere besonders vorteilhafte Beschiditunjjshi 1 fsni ttel sind tilyzerin und beispielsweise Triisopropylnaphthalinsulfonat, !Jatriuiisalz (im Handel erhältlich unter der Handelsbezeichnung Alkanol XC von der Firna Dul'or.t, USA).

Als zweckmäßig hat es sich erwieser derartige obcrflächenakti-

2 v^rc Verbindungen in Konzentrationen von etwa 0,5 bis etwa 4,0 g/m in der Reagenzschicht und von etwa 1,0 bis etwa 5,0 >;/m in der Ausbreitschicht zu verwenden, in welchem Falle keine oder praktisch keine inhibierenden Effekte zu beobachten sind und vorteilhafte Beschichtungs- und Probenausbreiteffekte erreicht werden.

Gegebenenfalls kann die Herstellung der einzelnen Schichten unter Verwendung von Härtungsmitteln erfolgen um ein vorteilhaftes und rasches Festwerden des Bindemittels der Schichten zu erreichen, um eine beschädigung bei der Handhabung der Elemente zu vermeiden und um ein unerwünschtes Vermischen einzelner Schichten untereinander zu vermeiden. Die Verwendung von HSrtungsmitteln zu derartigen Zwecken ist bekannt und braucht deshalb hier nicht

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näher erläutert zu werden. Verwendbar sind organische wie auch anorganische liärtungsmittel, wobei darauf zu achten ist, daß sie die übrigen in den Schichten vorhandenen Reagenzien nicht nachteilig beeinflussen. Härtungsmittel, die sich als besonders vorteilhaft erwiesen haben sind Clutaraldehyd sowie Bis(vinylsulfonylmethylJ äther.

Die Verwendung der erfindungsgemäßen Elemente kann in üblicher bekannter Weise erfolgen.

Wie es beispielsweise im folgenden anhand der Bestimmung von Harnsäure beschrieben wird, kann beispielsweise ein Tropfen der zu analysierenden Probe einer Größenordnung von etwa 5 bis etwa 50 μΐ auf die Ausbreitschicht oder äußerste Schicht des Elementes nach üblichen bekannten Methoden aufgebracht werden. Beim Durchtritt durch die Ausbreitschicht wird der Probetropfen ausgebreitet, so daß eine abgemessene Menge hiervon der darunterliegenden Reagenzschicht zugeführt wird, in der der Abbau der Harnsäure und die Erzeugung von Wasserstoffperoxid erfolgen.

Andererseits, je nach der angewandten Bestimmungsmethode kann die Erzeugung des Uasserstoffperoxides jedoch auch in der Ausbreitschicht oder einer oberen Peagenzschicht erfolgen, worauf eine bestimmte Menge des Waaserstoffperoxides der darunterliegenden Reagenzschicht zugeführt wird. In jedem Palle wird das Wasserstoffperoxid in einer Reagenzschicht unter Verwendung eines der beschriebenen Indikatorsysteme quantitativ erfaßt, so daß die Konzentration an Harnsäure ermittelt werden kann.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.

Beispiel 1

Um die Verwendbarkeit von bestimmten Indikatoren für die Wasserstoffperoxidermittlung und zur Herstellung von erfindungs'jemäßen Bestimmungsreagenzien zu ermitteln, die sich für die Bestimmung von vergleichsweise geringen Mengen an IUO₂ in Lösung eignen, wurde

809807/07U

eine Anzahl von Verbindungen ausjcwiihit, jixxxWbibfx zunächs t Lösungen der Verbindungen hergestellt wurden, iic nit entweder einem Carbonat-, Borat- oder TrisMuffer auf einen uii-tert von 8,5 bis 9,8 abjepuffert wurden.

Die lie rs te 11 uni^T, der Lösungen erfolgte durch !.rscn einer vergleichsweise geringen flenne der zu testenden Verbindun" in .Methylalkohol in einen Teströhrchen, woniuf eine v..^:iOri ;n "ufferlösung und eine kleine Menge nn Peroxilase zugesetzt wurden. Daraufhin wurde eine gerinne Menge Peroxid zugesetzt, worauf der auftretende Farbton festgestellt wurde.

Bei den in Kombination mit den getesteten Uydrazonverhindungen verwendeten Kupplerverbindungen handelte es sich ur<::

1) 2-Nuphthol,

2) 5-Dimethylamino-1-naphthai insu 1 fonsäure,

3) 2 ,6-₁)imethylph3!iol,

4) Phenol,

5) Diphenylaiiiin.

Die Lr^ebnisse der Testversuche sind in der folgenden Tabelle I zusamriengesteilt.

In uer folgenden Tabelle I bedeutet "positiv", da^ eine feststellbare .Menge an l-'arhstoff erzeugt wurde, während "negativ" bedeutet, dal?» keine feststellbare Farbstoffnenj^e erzeugt v/urde.

- so -

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Tabelle IA

Farbbildner-komponente

Kupp1erver.

auftretender
Farbton

Puffe r-Svste::i

O OO OO O

(D (2) (3) (4) (5)

pos.-dk.orar.se alle 3 Puffersubstanzen pos.-rot-braun alle 3 Puffersubstanzen ne?.

pos.-rot Tris

pos.-orange-rot Carbonat, Tris

pos.-orange alle 3 !¹Uf f ersubstanzen pos.-orange-braun alle 3 Puffersubstanzen nei.

(D (2) (3) (4) (5)

pos.-violett
pos.-rosa

alle 3 Puffersubstanzen Carbonat, Tris

Tabelle IB

Farbbildner auftretender Farbton

Puffersvstem

^C25^H24^N2°5 ^:

OCri-

C₂₄H₂₁BrN₂O₄ : Br

OCH-

CH-

O-CH.

O-CH. pos.-rosa

pos.-orange

pos .-rot

Borat, Tris

Carbonat, Tris

Fortsetzung von Tabelle IB C₂₅H₂₆N₄O:

•pos .-anua

alle 3 Puffersubstanzen

CH₃-N

OCH,

N)CH.

cn rs)

CH₃O

N(CH₃)

N(CII₃) pos.-orance-rot alle 3 Puffersubstanzen

Beispiel 2

Hs wurde ein analytisches Element mit sämtlichen notwendigen Reagenzien für die quantitative Bestimmung von Harnsäure in Blutseruni in Folgender Iv'eise hergestellt.

Zunächst wurde ein Abschnitt eines Poly (,M thy lenterenhthalat) filmschichtträgers mit einer ),18 mm dicken delatine-Haftschicht μ it einer Keagcnzschicht versehen aus: 10,3 <» Celatine/m , 2000 Einheiten Peroxidase/m" , 323 mg 2-(5-Brnm-<1-hydroxy-3-Tnethoxyphenyl) 4 , 5-bis (p-dimetliylaiiiinophenyl) ir.iidazol/in sowie 72 mg His(vinylsul fonyiiiethyl) äther und einen Carbonatpuffer zur Iünstellunn einas pU-.Vertes von 9,02.

Auf diese Ueasjenzschicht wurde dann eine Schicht aufgetragen aus 5,4 g Gelatine/m", 54 Einheiten llricase/m sowie einem Carbonatpuffer zur ti ins tellunj; eines pll-'.'.'srtes von 9,02. Auf diese Schicht

wurde dann eine Zwischenschicht aus 323 n^ Poly(n-isopropylacryl- *>

amid) pro π" auijetra^en, vorauf schließlich eine isotrop poröse

7 Ausbreitschicht aus 56,5 t; Titandiox id/in und 8,03 ρ Hlush-

Ceiluloseacetat/m aufgetragen wurde.

Des weiteren wurden ilarnsaurc-Standardlösungen nit 2,0 bis 30,0 mg Harnsäure/dl hergestellt, worauf durch Tijfelanalyse Tropfen von jeweils 10 μΐ auf Abschnitte des hergestellten lilementes aufgetragen wurden. Wach 4 Minuten bei 25°C wurde mittels eines Spektrophotometers ni t einem 6.'5O mn IF (Interferenzfilter) die Reflexionsdichte, I),,, des lilementes ernittolt. lis wurden die folgenden Ergebnisse erlialton:

Harnsäure Ii) :;un- (niü/dl)	\	I)_n 680 mn Minuten bei 25°f
0		0,07
2,0		0,28
5,0		0,49
10,0		0,63
20,0		0,74

8Q9807/07U

Beispiel 3

Zunächst wurde ein -weiteres analytisches Eleuent mit. sämtlichen Reagenzien für die quantitative Bestimmung von Harnsäure in iUutseruiii in der folgenden Weise hergestellt:

Auf einen Poly(äthylenterephtolat)filmschichtträger mit einer 0,18 iiuii starken Gelat ine-IIaf tsch icht wurde zunächst eine erste Rengenzschicht aus: 10,76 g Gelatine/m , 2152 Einheiten Peroxidase/ m", 108 mg 5,5-Dimethyl-1,3-cyclohexandion/m , 322 mg der Fnrbstof f-Vorläuferverbindung 2- (4-Ilydroxy-3-methoxyphenyl) -4 , .ΐ-b is (p-dimcthylaminonheny 1) imidazo 1/ni sowie ein Boratpuffer zur Einstellung eines pll-ivertes von 8,7 aufgetragen. Auf diese Schicht wurde dann eine zweite Reagenzschicht aus 5,15 g Gelatine/u , 54 Einheiten Uricase/r.i und ein Boratpuffer zur Einstellung eines pl!-kertcs von 8,7 aufgetragen. Auf diese Schicht wurden dann eine Zwischenschicht und eine Ausbreitschicht wie in Beispiel 2 beschrieben aufgebracht.

Gleichzeitig wurden wiederum Ilarnsiure-Standardlösungen mit 2 bis 20 ;;:g Harnsäure/dl hergestellt, worauf von diesen Lösungen 10 μ 1 Tropfen auf die Elemente aufgetüpfelt wurden. 'lach 4 Minuten bei 30 C wurden Mittels eines Spektrophotometers mit einem Interferenzfilter wie in Beispiel 2 beschrieben die Reflexionsdichten, i) , der Elemente ermittelt. Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

harnsäure lösung I),. 680 nm

(n<;/dl) . ... . , . τ_ηο_η

^v " ' 4 Minuten bei 30 (.

0,30 0,3 2 1,16

Aus den erhaltenen Ergebnissen ergibt sich das Ansprechverniügen der analytischen ülei.iente auf HarnsHure-Standardlösungen.

2	.0
10
20

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heispiel 4

hs wurde ein weiteres analytisches l'.lcment mit sämtlichen für die quantitative Bestimmung von Harnsäure in Hlutserun erforderlichen Reagenzien in der folgenden !'»'eise hergestellt:

Auf einen Poly (iithylenterephthalat) f i lmschichtträger mit einer 0,18 mm starken Gelatine-Haftschiclit wurde eine Pe.-igenzschicht

2 2

aus: 10,8 g (Jelatine/m , 0456 Einheiten Peroxidase/m , 0,54 g einer Dispersion aus 2- (4-Hydroxy-3-methoxypheiiyl-4 ,5-bis (p-dimethylaminophenyl)imidazol/m in 5,40 g Hiäthyllauramid/m und einen Puffer aus 0,11 g H₃BO₃Zm², 0,13 g KCl/m² und NaOII zur Einstellung eines pH-Wertes auf 8,8 aufgetragen. Auf die erzeugte Hcagenzschicht wurde dann eine zweite Reagenzschicht aus 5,38 g ilelatine/m ,

2 2

216 Einheiten Uricase/m und einem Puffer aus 0,06 g H,BO /m ,

2 Jj

U,07 g KCl/m und NaOiI zur Iiinstellung eines pH-Wertes auf 9,0 aufgetragen. Auf diese Schicht wurde eine Zwischenschicht aus 0,32 g

2
Poly(n-isopropylacrylamid/m aufgebracht. Auf der Zwischenschicht wurde dann eine isotrop poröse Ausbreitschicht aus einem Blush-

2 2

Polymeren aus 46,50 g Titandioxid/m , 6,62 j» CeIluloseacetat/m und 3,6 g Triton X-100/m erzeugt, in-dem auf die Zwischenschicht eine Beschichtungsmasse mit den angegebenen Bestandteilen sowie einen Mischung organischen Lösungsmittel aufgebracht wurde.

Des weiteren wurden Ilarnsäure-Standardlösungen mit 5,0 bis 20,0 mg Harnsäure/dl hergestellt, worauf 10 ij 1 große Tropfen der Lösungen auf Abschnitte des hergestellten Elementes aufgetüpfelt wurden. Nach 4 Minuten bei 25°C wurden in der beschriebenen Weise die Reflexionsdichten ermittelt. Hs wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

Harnsäurelösung Π_68Ο nm

^mß/dl 4 Minuten bei 25°C

5,0 0,69

10,0 1,03

20,0 *S 1,46

Claims

273^)690

i' Λ 1 L λ i Λ ., S )' I! i' C Il Γ

ζ 1. Verfahren :ur tfcs t i::;mir:^ \i π ■. .lasers tu Γ fperoxid in wäi.i ripen ^v ' Flüssigkeiten, bei dem ;it αΐϊ eine i'robe der zu ann b·? i c rcn.len Flüssigkeit i.iit einer Substanz viit ncrox i J:»t i\ ^r A'.tivit.it
und einen i'arM· i ldner, Jv ν ir .λ '^ein.art von ...issers toilneroxid und ler Substanz uit perox idat iver Aktivität unter iirzeugun,: eines Farbstoffes oxiücrt v.ir·!, in Kontalt >rin;:t, dadiirci) «lekenn^eichnet, Ja"> run ils I arl·!) iluner vena-ndet:

(I) eine üsciiun» aus

(;·.) eineiii :>ulfon>lhydrazon der lormel:

C=N-Ni-SO,R"

il

ouer einer Sulfonyllivdrazon-\ orlruiferverb i nuunr: !er Forme I:

R¹

ι \ α

L-A-N-SO₇R" \

R
worin bedeuten:

'< einen Alkyl rest;

R¹ ein .'iassers toff- oder Ha logenatom oder einen Alkyl-, Alkoxy- oder Aryl rost;

U" einen Alkyl- oder Aryl rest;

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BAD ORIGINAL

Λ-

JAe zur Vorvol Is täriJi^iini. eines heterocyclisciien !lindes mit 1> his (ι Rin^atOüien erforderlichen \tnno, άο^;η i [\ i 11 , Ja'. Jer ;liii^» yt?f;ebcneiifnlls !dl eines L i n»svs tenis sein kann und

Λ ein Anion und

(!■) einer i\up,»lcrverb indiinj.' odor

II) ein TH aryl inidazol Jer Ioraul

R¹

11 - Λ

in der ·' , V, jnd T jeweils einen organischen Rest darstellen, uohei jjilt, daß mindesten^ einer der Reste

ι -> 3
R , K" und R ein ortho- oder para-Ilydroxy-suhstituierter "irylrest mit bis zu 18 C-Atomen ist und die anderen I'uste oder der andere Rest derart ausgewählt sind, daß das Oxidationspotential des Imiuazols, «emessen durch cyclische Voltametrie gegenüber einer Standart-Kaloirel-lilektrode unter Verwendung einer Elektrode auf kohlebasis zwischen -70 riV bis + IU) nV

Verfaiireu nacli Anspruch 1, dadurch eekennzeichnet, daß man als Farbbildner ein Tri arvl im iJazol Jer rorinel:

verwendet, in der R , R und !' jeweils einen gegebenenfalls substituierten Arylrest mit bis zu 13 C-Atomen darstellen, wobei gilt, dai."> mindestens einer der Reste R , ¹I und P ein ortJio- oder para-Hydroxy-substituierter Arylrest ist und wobei ferner »ilt, daß mindestens ein anderer der Reste P , W" und

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ΙΓ in ortiio- oder para- Pos i t i on eine aus cine;" elektronon-Sj)endenden Subst i tuenten best e'lordo (irupjie aufweist.

Verfahren nach Anspruch 2, dadurch ,",ekcnnzei chnet, d«i:·« man ein I riary 1 imidazol der angegebenen Formel verwendet, in c'rr die aus einer.i elektrunen-spendenden Substi tuentrn l.estcliciu!t ('.ruppe aus einer Al koxynruppe der Formel - 'i¹. , einer Arvloxvgruppc oder einer !>i nlkylami nof,rup->e der Iormel:

Ii/

worin R' jeweils ein Alkylrest i.iit 1 i»is H (-Atomen ist, besteht.

4. Verfahren nach Ansnruch 1, dadurci. gekennzeichnet, <.\η'Λ i"an rl: Farbbildner eine Sulfonylhydrazon-Vorläuferverbi ndunj; Jcr fol ^enden Formel verwendet:

sf Il

R Jl H

worin bedeuten:

R einen Alkylrest;

R¹ ein Wasserstoff- oder I!aloj;enatom oder einen MV.yl-, Alkoxy- oder Arylrest;

K" einen Alkyl- oder Arylrest und

M . . .
A ein Anion.

5. Reayenz für die UestimmunR von Wasserstoffperoxid in wä;'Jrij:cn Lösungen, zur Durchführung des Verfahrens nach Ansprüchen 1 bis 4, mit einer l'uf fersubstanz; einer Substanz mit perox i !ativer Aktivität und einem Farbbildner, der bei Kontakt ;;iit Wasserstoffperoxid und der Substanz ;;iit peroxidativer Aktivität einer

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_^_ 2735890

feststellbaren Veränderung unterliegt, dadurch gekennzeichnet, daß es als Farbbildner enthält:

(I) eine Mischung aus:

(a) einem Sulfonylhydrazon der Formel: R'

,■<

Z C=N-N-SO₂R" R

oder einer Sulfonylhydrazon-Vorläuferverbindung der

Formel:

R'

Z ^ C-N-N-SO₉R" A⁹

^N-N^ H H

worin bedeuten:

R einen Alkylrest;

R' ein Wasserstoff- oder Halogenatom oder einen Alkyl-,

Alkoxy- oder Arylrest; R" einen Alkyl- oder Arylrest; Z die zur Vervollständigung eines heterocyclischen

Ringes mit 5 bis 6 Ringatomen erforderlichen Atome,

wobei gilt, daß der Ring gegebenenfalls Teil eines

Ringsystems sein kann und A ein Anion und (b) einer Kupplerverbindung oder

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2735890 -s-

(II) ein Triarylimidazol der Formel:

¹ R²

in der R , R und R jeweils einen organischen Rest darstellen, wobei gilt, daß mindestens einer der Reste

12 3 R , R und R ein ortho- oder para-Hydroxy-substituier ter Arylrest mit bis zu 18 C-Atomen ist und die anderen Reste oder der andere Rest derart ausgewählt sind, daß das Oxidationspotential des Imidazole, gemessen durch eye lische Voltometrie gegenüber einer Standard-Kalomel-Elektrode unter Verwendung einer Elektrode auf Kohlebasis zwischen -70 mV bis +110 mV liegt.

6. Reagenz nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es als Farbbildner ein Triarylimidazol der folgenden Formel enthält:

H-N

12 3

worin R , R und R jeweils für einen gegebenenfalls substituierten Arylrest mit bis zu 18 C-Atomen stehen, wobei gilt, daß mindestens einer der Reste R , R und R ein ortho- oder para-Hydroxy-substituierter Arylrest ist und mindestens ein

12 3
weiterer der Reste R , R und R in ortho- oder para-Stellung eine _auS einem elektronen-spendenden Substituenten bestehende Gruppe aufweist.

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Reagenz nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Triarylimidazol der angegebenen Formel enthält, in der die aus einem elektronen-spendenden Substituenten bestehende Gruppe besteht aus einem Alkoxyrest der Formel -OR , einem Aryloxyrest oder einem Dialkylaminorest der Formel:

N-R⁷/

worin R jeweils ein Alkylrest mit 1 bis 8 C-Atomen ist.

8. Reagenz nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es als Farbbildner eine Sulfonylhydrazon-Vorläuferverbindung der folgenden Formel enthält:

R¹

©Γ, V N-N-SO₂R'

V/^.n/ η η

worin bedeuten:

R einen Alkylrest;

R¹ ein Wasserstoff- oder Halogenatom oder einen Alkyl-,

Alkoxy- oder Arylrest; R" einen Alkyl- oder Arylrest und A ein Anxon.

9. Reagenz nach Ansprüchen 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es als (b) eine phenolische oder naphtholische Kupplerverbindung, eine Kupplerverbindung mit einer reaktionsfähigen Methylengruppe oder eine aus einem aromatischen Amin bestehende Kupplerverbindung enthält.

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10. Reagenz nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es als

(b) enthält: 1-Naphthol; 2-Naphthol; 5-Uimethylamino-i-naphtha linsulfonsäure; 2,6-Dimethylphenol; Phenol; Dinhenylamin; 4-Chlor-2-nitrophenol; p-Hydroxyphenylessigsäure; 4-Chlor-3-methylphenol; 2,4-Dichlor-1-naphthol oder 4-Chlor-2,6-dinitrophenol.

11.Reagenz nach Ansprüchen 5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es als Substanz mit peroxidativer Aktivität Peroxidase enthält.

12. Reagenz nach Ansprüchen 5 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß es auf einen pH-Wert zwischen etwa 5,0 und etwa 10,0 abgepuffert ist.

13. Reagenz nach Ansprüchen 5 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es als Puffersubstanz als Borat, Zitrat, Phosphat, Glutarat, Carbonat oder eine Tris-Puffersubstanz enthält.

14. Reagenz nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es als

(I) (a) eine der folgenden Sulfonylhydrazon-Vorläuferverbindungen enthält: 3-Methyl-6-nitro-2-(2-p-toluolsulfonylhydrazino)benzothiazolium-p-toluolsulfonat; 3-Methyl-2-(2-p-toluolsulfonylhydrazino)-benzothiazolium-p-toluolsulfonat 1-Methyl-2-(2-p-toluolsulfonylhydrazino)chinoliniura-p-toluolsulfonat oder 1-Methyl-2-(2-p-toluolsulfonylhydrazino)pyridinium-p-toluolsulfonat.

15. Reagenz nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es als

(II) enthält: 2-(-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-4,5-bis(4-methoxyphenyl)-imidazol; 2-(3,5-Dibrom-4-hydroxyphenyl)4,5-diphenylimidazol; 2-(3-Brom-5-methoxy-4-hydroxyphenyl)-4,5-bis-(4-methoxyphenyl)-imidazol; 4,5-Bis(4-dimethylarainophenyl)-2-(4-hydroxyphenyl)-imidazol; 4,5-Bis(4-dimethylaminophenyl)-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)imidazol; 2-(4-Hydroxyphenyl)-4,5-bis(4-methoxyphenyl)imidazol oder 4,5-Bis(4-dimethyltminophenyl)- 2-(4-hydroxy)-3,5-dimethoxyphenyl)imidazol.

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^ 2735890

-S -

K). Reagenz für die Untersuchung einer wäßrigen Flüssigkeit auf einen vorbestimmten Analyten, enthaltend: (a) ein Enzym, das hei Kontakt mit dem Analyten die Erzeugung von Ivasserstoffperoxiu bewirkt und (I)) ein Reagenz zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid mit:

(I) einer Substanz mit peroxidativer Aktivität;

(II) einer l'uf fersubstanz und

(ill) einem Farbbildner, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz als Farbbildner enthält:

(1) eine Mischung aus

(a) einem Sulfonylhydrazon der Formel:

\ C=N-N-SO₇R" ν / ,

oder einer Sulfonylhydrazon-Vorläuferverbin dung der Formel: R^f

7 C-N-N-SO₇R" Λ^θ

/ H H

^ H H *

worin bedeuten:

R einen Alkylrest;

R¹ ein Wasserstoff- oder Halogenatom oder einen Alkyl-, Alkoxy- oder Arylrest;

R" einen Alkyl- oder Arylrest;

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die zur Vervollständigung eines heterocyclischen Ringes mit 5 his 6 Ringatomen erforderlichen Atome, wobei ^iIt, daß der Hing gegebenenfalls Teil eines Ringsystems sein kann und

A ein Anion und

(b) einer Kupplerverbindung oder (II) ein Triarylimidazol der Formel:

1 "»

R¹

12 3 in der R , R und R jeweils einen organischen Rest

darstellen, wobei gilt, daß mindestens einer der Reste R , R und R° ein ortho- oder para-Hydroxysubstituierter Arylrest mit bis zu 18 C-Atomen ist und die anderen Reste öler der andere Rest derart ausgewählt sind, daß das Oxidationspotential des Imidazole, gemessen durch cyclische Voltometrie gegenüber einer Standard-Kalomel-Blektrode unter Verwendung einer Elektrode auf Kohlebasis zwischen -7OmV bis +110 mV liegt.

17. Reagenz nach Anspruch 16 für die Bestimmung von Harnsäure in wäßrigen Lösungen, dadurch gekennzeichnet, daß es als (a) Enzym Uricase enthält.

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- 4 Or -

18. Analytisches Llement für die Bestimmung eines Analyten in einer wäßrigen Flüssigkeit mit einer nicht-fasrigen, isotrop porösen Ausbreitschicht und einer Reagenzschicht und einem Gehalt an (a) einem Iinzym, das bei Kontakt mit dem Analyten die Urzeugung von Wasserstoffperoxid bewirkt und (b) einem Reagenz zur Ermittlung von Wasserstoffperoxid aus:

(I) einer Substanz mit peroxidativer Aktivität,

(II) einer I'uffersubstanz und

(III) einem Farbbildner,

dadurch gekennzeichnet, daß es als Farbbildner einen Farbbildner gemäß Anspruch 1 enthält.

19. Analytisches Element nach Anspruch 18, zur Bestimmung von Harnsäure in wäßrigen Flüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß es als Enzym üricase enthält.

20. Element nach Ansprüchen 18 und 19, dadurch gekennzeichnet, daß es als (I)(b) enthält: 1-Naphthol; 2-Naphthol; 5-Dimethylamino-1-naphthalinsulfonsäure; 2,6-Dimethylphenyl; Phenol; Diphenylamin; 4-Chlor-2-nitrophenol; p-Hydroxyphenylessigsäure; 4-Chlor-3-methylphenol; 2 ,4-I)ichlor-1-naphthol oder 4-Chlor-2,6-dinitrophenol.

21. Element nach Ansprüchen 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß es als Substanz mit peroxidativer Aktivität Peroxidase enthält.

22. Element nach Ansprüchen 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß es auf einen pH-Wert von 8 bis 9 abgepuffert ist.

23. Element nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Puffersubstanz, bestehend aus einem Borat, Citrat, Phosphat, Glutarat oder Carbonat oder eine Tris-Puffersubstanz enthält.

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24. Element nach Ansprüchen 18 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Sulfonylhydrazon-Vorläuferverbindung enthält, die besteht aus:

3-Methyl-6-nitro-2-(2-p-toluolsulfonylhydrazino)benzothiazoliuin-p-toluol-sulfonat; S-Methyl-2- (2-p-toluolsulfonylhydrazino)benzothiazolium-p-toluolsulfonat; 1-Methyl-2-(2-ptoluolsulfonylhydrazino)chinolinium-p-toluolsulfonat oder 1-Methyl-2-(2-p-toiuolsulfonylhydraζino)pyridinium-p-toluolsulfonat.

25. Element nach Ansprüchen 18 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß es als (II) enthält:

2-(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-4,5-bis(4-methoxyphenyl)-imidazol; 2-(3,5-Dibrom-4-hydroxyphenyl)4,5-diphenylimidazo1; 2-(3-Brom-5-methoxy-4-hydroxyphenyl)-4,5-bis(4-methoxynhenyl)■ imidazol; 4,5-Bis(4-dimethylaminophenyl)-2-(4-hydroxyphenyl)" imidazol; 4,5-Bis(4-dimethylaminophenyl)-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)imidazol; 2-(4-Hydroxyphenyl)4,5-bis(4-methoxyphenyl) imidazol oder 4,5-Bis(4-dimethylaminophenyl)-2-(4-hydroxy)-3,5-dimethoxyphenyl)imidazol.

26. SaugfMhiges Material für die Bestimmung eines Analyten mit (a) einem Enzym, das bei Kontakt mit dem Analyten die Erzeugung von Wasserstoffperoxid bewirkt und (b) einem Reagenz zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid mit :

(I) einer Substanz mit peroxidativer Aktivität;

(II) einer Puffersubstanz und

(III) einem Farbbildner,

dadurch gekennzeichnet, daß es einen Farbbildner gemäß Anspruch 1 enthält.

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27. Reagenz für die analytische Bestimmung von Substanzen mit peroxidativer Aktivität mit (i) Wasserstoffperoxid oder einer Substanz die unter Hrzeugunf. von Wasserstoffperoxid zu reagieren vermag und (ii) einem Farbbildner, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Farbbildner gemflß Anspruch 1 enthalt.

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