DE3625852A1

DE3625852A1 - Verbesserte testmittel und verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE3625852A1
Application number: DE19863625852
Authority: DE
Inventors: Karl-Erwin Dr Piejko; Bruno Dr Boemer
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1986-07-31
Filing date: 1986-07-31
Publication date: 1988-02-04
Also published as: AU589270B2; DE3783285T2; DE3783285D1; CA1289443C; JPS6344167A; AU7599787A; EP0255708B1; US4800169A; EP0255708A3; JPH0640098B2; EP0255708A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Testmitteln zum Nachweis von Analysensubstanzen mittels Redoxreaktionen wobei als Indikatorsubstanz ein Einkomponentenindikator verwendet wird und dem Testmittel zusätzlich oxidierbare, nicht mit sich selbst kupplungsfähige aromatische Amino- oder Hydrazinoverbindungen als Entfärber zugesetzt werden.

Durch den Zusatz der Entfärber wird das Auftreten einer Blindfarbe des Testmittels verhindert. Die Zugabe von größeren Mengen der Entfärber erlaubt die genaue Einstellung der Empfindlichkeit des Testmittels.

In den letzten Jahren haben in der medizinischen Diagnostik die sogenannten "Farbteste" immer mehr an Bedeutung gewonnen. Bei den "Farbtesten" handelt es sich um Nachweisverfahren für Analysensubstanzen an denen Peroxide wie z. B. Wasserstoffperoxid oder Cumolhydroperoxid beteiligt sind. Wasserstoffperoxid entsteht z. B. bei der durch geeignete Oxidasen katalysierten Oxidation einer Analysensubstanz in Anwesenheit von Sauerstoff. Als Testmittel werden bei diesen Farbtests entweder flüssige Reagenzien oder sogenannte Teststreifen verwendet. Mögliche Analysensubstanzen sind Glucose, Glycerin, Glycerinphosphat, Sarcosin, Galaktose und Cholesterin. Als zugehörige Oxidasen sind zu nennen Glucoseoxidase, Glycerinoxidase, Glycerinphosphatoxidase, Sarcosinoxidase, Galaktoseoxidase und Cholesterinoxidase. Es sind darüber hinaus noch weitere Enzym-Substratpaare bekannt.

Das oben genannte Cumolhydroperoxid wird beim Nachweis von peroxidativ wirksamen Substanzen wie z. B. Hämoglobin eingesetzt. Auf diesem Prinzip basiert der Nachweis von okkultem Blut in Stuhlproben.

Gemeinsam haben all diese Nachweisverfahren, daß Redoxäquivalente, katalysiert durch Peroxidase oder eine peroxidativ wirksame Substanz, vom Peroxid auf einen Indikator übertragen werden. Diese Indikatoren kann man in zwei Gruppen einteilen.

1. Einkomponentenindikatoren

Bei diesen Indikatoren werden die Redoxäquivalente auf einen Indikator übertragen, und das resultierende Oxidationsprodukt ist gefärbt. Als typische Vertreter sind zu nennen Benzidin, Alkylbenzidine wie Tetramethyl-, Tetraethylbenzidin oder Tolidin usw.

2. Zweikomponentenindikatoren

Bei diesen Indikatoren wird eine Komponente durch die Übertragung der Redoxäquivalente oxidiert. Dieses ungefärbte Oxidationsprodukt ist in der Lage mit einer geeigneten Kupplungskomponente unter Ausbildung eines Farbstoffes zu reagieren. Die wohl bekannteste Reaktion dieser Art ist die sogenannte "Trinder-Reaktion" (Trinder, P. A., Ann. Clin. Biochem. 6; (1969), 24-27), bei der 4-Aminoantipyrin die oxidierbare Komponente ist, die mit einem Phenol als Kupplungskomponente unter Ausbildung eines roten Chinoniminfarbstoffs reagiert. In einem ähnlichen System kommt 3-Methyl-2-benzothizolinonhydrazon als oxidierbare Komponente zur Anwendung.

Der Vorteil der über Peroxid ablaufenden Nachweisverfahren ist deren hohe Empfindlichkeit, die den Nachweis von geringsten Mengen einer Analysensubstanz erlaubt. Die hohe Empfindlichkeit hat aber auch eine große Störanfälligkeit zur Folge. So geben die genannten Indikatoren bereits mit Spuren von oxidativ wirkenden Verunreinigungen oder mit Luftsauerstoff z. B. bei der Herstellung von Teststreifen oder bei der Durchführung von Flüssiganalysen vor Zugabe der zu analysierenden Probe deutliche Färbungen. Dies hat zur Folge, daß man vor der Durchführung einer quantitativen Analyse einen Leerwert messen muß, der vom Meßwert nach der Analyse substrahiert werden muß. Es lassen sich deshalb vor allem niedrige Konzentrationen des Analyten nur ungenau bestimmen. Um diese Blindwerte zu vermeiden, könnte man grundsätzlich nur mit hochgereinigten Reagenzien und unter Ausschluß von Luftsauerstoff arbeiten, was aber aufgrund der hohen Kosten technisch nicht durchführbar ist.

In der DE-OS 27 16 060 werden stabilisierte Schnelldiagnostika mit Oxidationsindikatoren beschrieben, denen zum Vermeiden des Auftretens einer Blindfarbe Arylsemicarbazide zugesetzt werden. Diese Arylsemicarbazide müssen jedoch in großen Mengen zugesetzt werden (Beispiele sind in den DE-OS 30 12 368 und 34 06 328 beschrieben) und sind außerdem carcinogen-verdächtig, so daß von ihrer Verwendung in Testmitteln abzuraten ist.

Versuche der Autoren dieser Patentanmeldung, die Blindfarbe von Testmitteln durch Zusatz von Ascorbinsäure zu vermeiden, führten zu nicht reproduzierbaren Ergebnissen bezüglich der Empfindlichkeit der Testmittel, wenn die Ascorbinsäure in für obengenannten Zweck ausreichenden Mengen zugesetzt wurde.

Es wurde nun gefunden, daß sich Reagenzien, Reagenzlösungen bzw. Tränklösungen zur Herstellung von Testmitteln, die einkomponentige Oxidationsindikatoren enthalten, durch Zugabe geringer Mengen von Entfärbern entfärben lassen bzw. sich die Bildung einer Blindfarbe verhindern läßt, wenn als Entfärber oxidierbare, nicht mit sich selbst kupplungsfähige aromatische Amino- oder Hydrazinoverbindungen verwendet werden.

Es wurde weiterhin gefunden, daß sich durch Zugabe größerer Mengen der Entfärber eine Verminderung der Empfindlichkeit und eine Verschiebung der Eichbeziehung (Intensität der Färbung als Funktion der Konzentration des Analyten) zu höheren Analytkonzentrationen erreichen läßt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Testmitteln zum Nachweis von Analysensubstanzen mittels Redoxreaktionen enthaltend als Indikatorsubstanz einkomponentige Oxidationsindikatoren, bei welchem oxidierbare, nicht mit sich selbst kupplungsfähige aromatische Amino- oder Hydrazinoverbindungen als Entfärber zugesetzt werden.

Die Entfärber werden zur Entfärbung der Testmittel in Konzentrationen zwischen 0,05 und 5 Gew.-%, bezogen auf den Einkomponenten-Oxidationsindikator, bevorzugt zwischen 0,1 und 1 Gew.-%, eingesetzt. Die geeignete Menge läßt sich leicht durch Titration der Verunreinigungen ermitteln. Ein geringer Überschuß beeinflußt die Eichbeziehung nicht meßbar.

Um die Empfindlichkeit des Testmittels zu erniedrigen bzw. den Abszissenabschnitt der Eichkurve zu höheren Konzentrationen zu verschieben, werden die Entfärber in Mengen zwischen 5 und 200 Gew.-%, bevorzugt zwischen 5 und 100 Gew.-%, des Oxidationsindikators verwendet.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung nicht gefärbter Tränklösungen oder Reagenzmischungen, die zur Herstellung von Teststreifen dienen und die Einkomponenten-Oxidationsindikatoren enthalten, wobei diese Lösungen bzw. Mischungen zusätzlich die Entfärber enthalten.

Die Erfindung betrifft weiterhin Testmittel enthaltend Einkomponenten-Oxidationsindikatoren und zusätzlich die Entfärber. Unter Testmittel ist zu verstehen Reagenzmischungen, Lyophylisate, Reagenzkombinationen, Flüssigreagenzien usw.

Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung der Testmittel zum Nachweis von Analysensubstanzen. Geeignete Analysensubstanzen sind z. B. Glucose, Cholesterin, Triglyceride, Galaktose usw. oder Enzyme wie Peroxidase oder auch Proteine mit peroxidativer Aktivität wie Hämoglobin bzw. Methämoglobin.

Als mögliche Probenmaterialien sind zu nennen Körperflüssigkeiten wie Blut, Plasma, Liquor, Urin oder auch Stuhlproben.

Die erfindungsgemäß zu verwendenden Entfärber werden normalerweise als oxidierbare Komponente in Zweikomponentenindikatorsystemen eingesetzt, werden aber im Rahmen der vorliegenden Erfindung ohne Kupplungskomponente verwendet.

Als Entfärber geeignet sind beispielsweise in 3-Stellung substituierte 4-Aminopyrazolinone der allgemeinen Formel

mit

R₁ =C₁-C₄-Alkyl, gegebenenfalls substituiert durch -OH, OR, OCOR, OCOOR, C₁-C₄-Alkoxy, Aryl, Aralkyl, wobei R für C₁-C₄-Alkyl steht, R₂ =H, C₁-C₄-Alkyl, R₃ =Aryl, Aralkyl, C₁-C₄-Alkyl, gegebenenfalls substituiert wie bei R₁, H,

oder 2-Benzothiazolinonhydrazone der allgemeinen Formel

mit

R₁ = H, C₁-C₄-Alkyl,
R₂ = H, SO₃H.

Bevorzugt verwendet werden 4-Aminoantipyrin (Formel I, R₁ = R₂ = Methyl, R₃ = Phenyl) oder 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon (Formel II, R₁ = Methyl, R₂ = H).

Beispiel 1

Zur Herstellung eines Glucose-Testfilms wird folgende Mischung hergestellt:

9 mgGlucoseoxidase (250 U/mg), 50 mgPeroxidase (80 U/mg) und 1 mg4-Aminoantipyrin werden in 1,7 mlCitratpuffer (1 m, pH 5,5) gelöst.

Diese Lösung wird in

3,4 mlChloroform, das 0,34 gNa-Dodecylbenzolsulfonat enthält,

durch Schütteln in Form feiner Tröpfchen verteilt. Die entstandene Dispersion wird zu einer Mischung aus
16 ml einer W/O-Dispersion mit Chloroform als Ölphase, einem W/O-Verhältnis von 1/1 und 13,1 Gew.-% Polyacrylamid (Herstellung beschrieben in der DE-OS 34 34 822, Beispiel 8) und 34 ml einer 7,5%igen Lösung von Celluloseacetobutyrat [η _rel (19%ig in Aceton: Ethanol = 9 : 1) = 200] in Chloroform und 0,6 g 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin
gegeben. Der Ansatz wird kräftig geschüttelt. Dabei tritt zunächst eine starke Grünfärbung des Ansatzes auf, die jedoch nach 30-90 sec wieder verschwindet.

Der Ansatz wird mittels eines Rakels auf Polyesterfolie aufgebracht (180 µm Naßauftrag) und durch Beblasen mit 24°C warmer Luft im Dunkeln getrocknet. Es wird ein weißer Testfilm erhalten, der in 0,5 cm breite Streifen geschnitten wird.

Zum Testen werden auf ein Testfeld der Größe 0,5 cm × 1 cm 30 µl Vollblut aufgetragen und nach 15 sec abgewischt. Die sich entsprechend dem Glucosegehalt der Blutprobe bildende Farbe wird im Reflexionsphotometer bei 640 nm vermessen und der K/S-Wert berechnet (K/S = (1 - R)²/2R; mit R = Reflexion, K = Absorptionskoeffizient und S = Streulichtkoeffizient). Die Auftragung von K/S gegen die Glucosekonzentration (Eichkurve), bestimmt mittels obiger Teststreifen, ist in Abb. 1 gezeigt. Man erkennt, daß die Kurve bei der Konzentration Null einen K/S-Wert von Null aufweist. Die von einer Blutprobe mit 20 mg/dl Glucose verursachte Färbung läßt sich visuell von der Farbe des ungetesteten Streifens unterscheiden.

Vergleichsbeispiel 1

Verfährt man wie in Beispiel 1, jedoch ohne Zusatz von 4-Aminoantipyrin, so erhält man eine grün gefärbte Mischung und hellgrün gefärbte Teststreifen. Eine mittels dieser Teststreifen erstellte Eichkurve weist bei der Glucose-Konzentration Null einen von Null verschiedenen K/S-Wert auf. Die von einer Blutprobe mit 20 mg/dl Glucose verursachte Färbung läßt sich visuell nicht von der Blindfarbe des Teststreifens unterscheiden.

Beispiel 2

Gemäß Beispiel 1 wird eine Mischung hergestellt, jedoch unter Verwendung von 2,6 ml Citratpuffer, der neben den Enzymen insgesamt 100 mg 4-Aminoantipyrin enthält. Der mit dieser Mischung wie in Beispiel 1 hergestellte Teststreifen wird mit Blutproben unterschiedlicher Glucosekonzentrationen wie in Beispiel 1 beschrieben getestet. Die dabei erhaltene Eichkurve ist in Abb. 2 gezeigt. Man erkennt eine Verschiebung des Abszissenabschnitts zu ca. 30 mg/dl Glucose und eine wesentlich geringere Steigung der Eichkurve zwischen 30 und 200 mg/dl Glucose im Vergleich zu Abb. 1, d. h. eine geringere Empfindlichkeit.

Beispiel 3

Gemäß Beispiel 1 wird eine Mischung hergestellt, jedoch unter Verwendung von 2 mg 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon-Hydrochlorid anstelle des 4-Aminoantipyrins. Wie in Beispiel 1 wird eine Entfärbung der anfänglich grünen Mischung beobachtet. Die mittels dieser Mischung hergestellten Teststreifen liefern die gleiche Eichkurve wie die Teststreifen aus Beispiel 1 (Abb. 1).

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Testmitteln zum Nachweis von Analysensubstanzen mittels Redoxreaktionen enthaltend als Indikatorsubstanz Einkomponentenindikatoren, dadurch gekennzeichnet, daß oxidierbare, nicht mit sich selbst kupplungsfähige aromatische Amino- oder Hydrazinoverbindungen zugesetzt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die oxidierbaren, nicht mit sich selbst kupplungsfähigen aromatischen Amino- oder Hydrazinoverbindungen Verbindungen aus der Gruppe der in 3-Stellung substituierten 4-Aminopyrazolinone oder Benzothiazolinonhydrazone sind.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 und 2, wobei als oxidierbare Aminoverbindung 4-Aminoantipyrin, als Hydrazinoverbindung 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon bzw. deren Salze verwendet werden.

4. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, wobei die oxidierbaren Amino- oder Hydrazinoverbindungen in Konzentrationen zwischen 0,05 und 5 Gew.-%, bezogen auf den Einkomponentenindikator, eingesetzt werden.

5. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, wobei die oxidierbaren Amino- oder Hydrazinoverbindungen in Konzentrationen zwischen 5 und 200 Gew.-%, bezogen auf den Einkomponentenindikator, eingesetzt werden.

6. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 zur Herstellung von Flüssig-Reagenzien, Reagenzkombinationen oder Reagenzmischungen.

7. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 zur Herstellung von Teststreifen.

8. Testmittel zum Nachweis von Analysensubstanzen mittels Redoxreaktionen hergestellt nach den Verfahren 1 bis 5.

9. Verwendung der Testmittel nach Anspruch 8 zum Nachweis von Analysensubstanzen.