DE2755035C2

DE2755035C2 -

Info

Publication number: DE2755035C2
Application number: DE2755035A
Authority: DE
Inventors: Theodore Walter Webster N.Y. Us Esders; Charles Thomas Rochester N.Y. Us Goodhue; Richard Mark Spencerport N.Y. Us Schubert
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1976-12-10
Filing date: 1977-12-09
Publication date: 1988-02-04
Also published as: JPS584557B2; GB1560246A; DE2755035A1; JPS53105292A; BE861713A; FR2392384A1; US4166763A; CA1095818A; FR2392384B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Präparat und ein analytisches Element für die analytische Bestimmung von Milchsäure oder Lactat, und zwar speziell für die quantitative Bestimmung von Milchsäure oder Lactat.

Der Milchsäurespiegel des Blutes ist bekanntlich ein allgemeiner Indikator für den Zustand des Blutkreislaufes und das beste biochemische Kriterium von Kreislauffehlern, bei denen erhöhte Lactatspiegel auftreten. Auch steigen Lactat- und Pyruvatspiegel beim normalen Menschen rasch nach Verabfolgung von Glucose oder einer Insulininjektion. Dieser Anstieg wird im Falle von Diabetes mellitus verzögert oder tritt nicht auf. So läßt sich durch Bestimmungen von sowohl der Lactat- als auch Glucosekonzentrationen zwischen pancreatischer Diabetes und anderen Störungen oder Krankheiten unterscheiden, bei denen eine verminderte Glucosetoleranz auftritt.

Gegenwärtig wird Milchsäure quantitativ auf enzymatischem Wege über die Lactat-Dehydrogenase (LDH)-Reaktion bestimmt. Hierbei handelt es sich um eine Nukleotid-gebundene Methode, in der eine verminderte Nikotinamidadenindinukleotid (NADH)-Bildung entweder durch UV-Absorption oder durch Fluoreszenz bestimmt wird. Das Gleichgewicht der Reaktion jedoch begünstigt die Bildung, nicht jedoch die Nutzbarmachung von Milchsäure. Die Oxidation von Lactat zu Pyruvat (unter begleitender NADH-Bildung) wird lediglich bei pH-Werten begünstigt, die höher liegen als 8,0 sowie in Gegenwart von Verbindungen, die mit Carbonylgruppen, z. B. von Ketonen und Aldehyden, reagieren, beispielsweise Hydrazin und Phenylhydrazin. Hierdurch wird die allgemeine Anwendbarkeit der Methode naturgemäß begrenzt, abgesehen von den allgemeinen Problemen, die bei UV-Absorptionsmessungen sowie Fluoreszenzmessungen auftreten und der Instabilität von sowohl der Lactat-Dehydrogenase und dem Nukleotid-Kofaktor.

Aus dem Buch "Methods of Enzymatic Analyses", 2. englische Ausgabe, Herausgeber: H. U. Bergmeyer, Verlag Academic Press, Inc., New York und London (1970), Seiten 1472, 1475, 1483 und 1492 sind verschiedene analytische Methoden zur Bestimmung von Milchsäure unter Anwendung der Lactat-Dehydrogenasereaktion (LDH) bekannt. So wird auf Seite 1483 beispielsweise eine colorimetrische Methode für die Bestimmung von Lactat im Serum beschrieben, bei der Hefe-Lactat-Dehydrogenase und Kaliumhexacyanoferrat (III) verwendet werden. Dabei treten Störungen durch Ascorbinsäure, Glutathion, Cystein und NADH auf, die sämtlich das Hexacyanoferrat reduzieren. Auf Seite 1492 der Literaturstelle wird die Bestimmung von Milchsäure unter Verwendung von NAD⁺ und LDH beschrieben. Auf Seite 1472 der Literaturstelle ist des weiteren eine Methode zur Milchsäurebestimmung unter Verwendung von 3-Acetylpyridin-Adenindinukleotid (APAD) anstelle von NAD⁺ bekannt. Um diese analytische Methode durchzuführen zu können, müssen die Reagenzien vor ihrer Verwendung frisch hergestellt werden, und die Meßergebnisse werden im UV-Bereich des Spektrums ermittelt. Sämtliche der angegebenen Methoden weisen den weiteren Nachteil auf, daß eine Deproteinisierung der Blutprobe erforderlich ist. Im übrigen werden Nachteile der bekannten Lactat-Dehydrogenase-Verfahren zur Bestimmung von Milchsäure von Young und Mitarbeitern in der Zeitschrift "Clinical Chemistry", Band 18, 1972, Seite 1041, beschrieben.

In der Literatur werden verschiedene Lactat-Oxidasen beschrieben. Ganz allgemein jedoch katalysieren die beschriebenen Lactat-Oxidasen keine Wasserstoffperoxid erzeugende Reaktion. Beispiele für derartige Lactat-Oxidasen werden von Sutton in der Zeitschrift "Journal of Biological Chemistry", Band 226 (1957), Seite 395 und von London in der Zeitschrift "Journal of Bacteriology", Band 95, Nr. 4 (1968), Seite 1380, beschrieben. In dem "Enzyme Handbook", Band 1, von Thomas E. Barman, Springer-Verlag, New York, Inc. (1969), wird des weiteren eine Lactat-Oxidase von Mycobacterium phlei beschrieben, die angeblich die Oxidation von L-Lactat unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid katalysiert.

Eine Überprüfung der von T. E. Barman zitierten Literaturstelle zeigt jedoch, daß die angegebene Reaktionsgleichung, welche die Erzeugung von Wasserstoffperoxid anzeigt, fehlerhaft ist und daß nicht Wasserstoffperoxid, sondern vielmehr Wasser erzeugt wird.

Die einzige bekannte Literaturstelle, in der eine Lactat-Oxidase beschrieben wird, die angeblich Lactat in Pyruvat und Wasserstoffperoxid überführt, ist die Literaturstelle: Eichel und Mitarbeiter, "Respiratory Enzyme Studies in Tetrahymena pyriformis", veröffentlicht in der Zeitschrift "Journal of Biological Chemistry", Band 237, Nr. 3 (1962), Seite 940. Aufgrund der Kalase-Aktivität, von der im Zusammenhang mit der Herstellung der Lactat-Oxidase von Tetrahymena pyriformis berichtet wird, ist ein solches Lactat-Oxidase-Präparat jedoch nicht für ein Bestimmungsverfahren geeignet, und zwar insbesondere nicht für ein Bestimmungsverfahren, das auf der Bestimmung von Wasserstoffperoxid beruht, da Katalase Wasserstoffperoxid zersetzt und so eine potentielle Fehlerquelle darstellt. Andere Nachteile der Lactat-Oxidase von Tetrahymena beruhen auf ihrer nur teilweisen Löslichkeit (nur 4 bis 57% des Enzymes werden als löslich bezeichnet), der Instabilität (43 bis 60% der Aktivität sollen nach einer 24stündigen Aufbewahrung oder Dialyse bei 2°C verlorengehen) sowie einer vergleichsweise geringen spezifischen Aktivität (es wurde eine spezifische Aktivität von ungefähr 0,02 Mol Lactat pro Minute pro Milligramm Protein berechnet, bezogen auf Q_O₂ (N=162).

Aufgabe der Erfindung ist es, einen Weg aufzufinden, der die Bestimmung von Milchsäure oder Lactat auf vergleichsweise einfachem Wege ermöglicht.

Der Erfindung lag die Erkenntnis zugrunde, daß sich die gestellte Aufgabe mit einem Präparat und einem analytischen Element lösen läßt, wie sie in den Ansprüchen gekennzeichnet sind.

Erfindungsgemäß läßt sich somit der Milchsäure- oder Lactatgehalt einer flüssigen Probe mittels eines Lactat-Oxidase-Präparates und Sauerstoff durch Erzeugung von Pyruvat und Wasserstoffperoxid bestimmen. Das erzeugte Wasserstoffperoxid kann dann dazu benutzt werden, um die Konzentration an Milchsäure oder Lactat in der zu analysierenden Probe festzustellen. In vorteilhafter Weise wird das Wasserstoffperoxid durch Oxidation eines Chromogens in Gegenwart von Peroxidase bestimmt.

Bei der erfindungsgemäß verwendeten, praktisch katalasefreien Lactat-Oxidase handelt es sich um eine Lactat-Oxidase, die keine feststellbare Katalase enthält oder, falls sie Katalase enthält, nur in solch geringen Mengen, daß die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit des Bestimmungsverfahrens nicht beeinträchtigt wird.

Eine erfindungsgemäß in besonders vorteilhafter Weise verwendbare Lactat-Oxidase, die Lactat in Pyruvat und Wasserstoffperoxid überführt, ist die Lactat-Oxidase, die von Streptococcus faecalis ATCC 12755 erzeugt wird. Die Lactat-Oxidase von S. faecalis ist hoch-spezifisch für L-Lactat mit einer Michaelis-Konstante K _m von etwa 0,2 mM für Lactat. Diese Lactat-Oxidase ist des weiteren löslich, katalasefrei, im Vergleich zu der Lactat-Oxidase von Tetrahymena hochstabil und weist eine spezifische Aktivität von mindestens etwa 0,1 µMol Lactat pro Minute pro Milligramm Protein auf. Des weiteren hat sich gezeigt, daß die Lactat-Oxidase von S. faecalis stabil gegenüber Dialyse und (NH₄)₂SO₄-Fraktionierung ist und sich mindestens drei Monate lang bei -20°C aufbewahren läßt.

Wird eine Probe mit einer unbekannten Konzentration an Milchsäure oder Lactat unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Präparates mit Lactat-Oxidase analysiert, so wird Wasserstoffperoxid im Verhältnis zur Konzentration an Milchsäure oder Lactat in der Probe erzeugt. Das erzeugte Wasserstoffperoxid kann dann nach üblichen bekannten Methoden bestimmt werden, und die unbekannte Konzentration an Milchsäure oder Lactat läßt sich unter Verwendung einer Eichkurve ermitteln, die unter Verwendung von Proben mit bekannten Konzentrationen an Milchsäure oder Lactat hergestellt wurde.

Bekannte Verfahren zur Bestimmung und/oder quantitativen Ermittlung von Wasserstoffperoxid, die bei Verwendung eines erfindungsgemäßen Präparates angewandt werden können, beruhen im allgemeinen auf der Verwendung einer Substanz mit peroxidativer Aktivität, z. B. Peroxidase und peroxidase-artigen Substanzen und einem Stoff oder einer Verbindung, der bzw. die einer bestimmbaren Veränderung (im allgemeinen einer sichtbaren Veränderung) in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und der Substanz oder Verbindung mit peroxidativer Aktivität unterliegt.

Sämtliche der bisher bekannten Methoden der Wasserstoffperoxidbestimmung können hier aus Platzgründen nicht aufgeführt werden. Beispielsweise sollen jedoch die aus den folgenden US-PS 29 12 309; 29 81 606; 33 49 006; 30 02 465; 35 58 435; 35 95 755; 36 27 697; 36 27 698; 36 30 847; 36 54 179; 36 54 180 und 38 53 470 bekannten Methoden genannt werden.

Beispiele für Stoffe und Verbindungen, die zur Herbeiführung einer bestimmbaren Veränderung in Gegenwart von Wasserstoffperoxid herangezogen werden können und deren Verwendung zu diesem Zweck bereits beschrieben wurde, sind die im folgenden aufgeführten Substanzen und Verbindungen, die gegebenenfalls gemeinsam mit einem Kuppler verwendet werden können:

(1) Monoamine, z. B. Anilin sowie Anilinderivate, o-Toluidin und p-Toluidin;
(2) Diamine, z. B. o-Phenylendiamin; N,N′-Dimethyl-p-phenylendiamin; N,N′-Diäthylphenylendiamin; Benzidin sowie Dianisidin;
(3) Phenole, z. B. Phenol selbst, Thymol, o-, m- und p-Kresole, alpha-Naphthol sowie beta-Naphthol;
(4) Polyphenole, z. B. Brenzkatechin, o-Methoxyphenol, Orzin, Pyrogallol, p,p-Dihydroxydiphenyl sowie Phloroglucin;
(5) aromatische Säuren, z. B. Salicylsäure, Dihydroxybenzoesäuren sowie Trihydroxybenzoesäuren, z. B. 3,4,5-Trihydroxybenzoesäure;
(6) Leucofarbstoffe, z. B. Leucomalachitgrün und Leucophenolphthalein;
(7) Farbstoffe, wie beispielsweise 2,6-Dichlorphenolindophenol;
(8) verschiedene biologische Substanzen, z. B. Epinphrin, Flavone, Tyrosin, Dihydroxyphenylalanin sowie Tryptophan;
(9) andere Substanzen, wie beispielsweise Gumguaiac, Guaiaconsäure, Kalium-, Natrium- und andere wasserlösliche Jodide sowie Bilirubin sowie
(10) spezielle Farbstoffe, wie beispielsweise 2,2′-Azin-di(3-äthyl- benzothiazolin-(6)-sulfonsäure) sowie 3,3′-Diaminobenzidin.

Eine Peroxidase ist bekanntlich ein Enzym, das eine Reaktion katalysiert, bei der Wasserstoffperoxid eine andere Substanz oxidiert. Bei den Peroxidasen handelt es sich im allgemeinen um konjugierte Proteine mit Eisenporphyrin. Peroxidase kommt bekanntlich in Meerrettich, Kartoffeln, Feigensaft und Rüben (Pflanzen-Peroxidase); in der Milch (Lacto-Peroxidase) sowie in weißen Blutkörperchen (Verdo-Peroxidase) vor. Sie kommt des weiteren in Mikroorganismen vor und kann durch Fermentation erzeugt werden. Auch können bestimmte synthetische Peroxidasen, wie sie beispielsweise von Theorell und Maehly in der Zeitschrift Acta Chem. Scand., Band 4, Seiten 422 bis 434 (1950) beschrieben werden für die Bestimmung von H₂O₂ verwendet werden. Als weniger zufriedenstellend haben sich demgegenüber Substanzen wie Hämin, Methämoglobin, Oxyhämoglobin, Hämoglobin, Hämochromogen, alkalisches Hämatin sowie Häminderivate und bestimmte andere Verbindungen erwiesen, die peroxidative oder peroxidase-ähnliche Aktivität entfalten.

Andere Substanzen, die selbst keine Enzyme darstellen, jedoch eine peroxidative Aktivität zeigen, sind beispielsweise Eisensulfocyanat, Eisentannat, Ferroferrocyanid, Chromisalze, z. B. Kaliumchromsulfat.

Die erfindungsgemäßen Präparate und Elemente für die Bestimmung von Milchsäure und Lactaten eignen sich zur Durchführung üblicher Flüssigkeits-Bestimmungsverfahren. Das erfindungsgemäße Präparat kann in trockener oder lyophilisierter Form vorliegen und durch Zusatz von Wasser unmittelbar vor seiner Verwendung in die für die Verwendung übliche Form gebracht werden.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung liegt das analytische Präparat in einer Matrix aus einem absorbierenden Material vor. Bei diesem absorbierenden Material handelt es sich dabei um ein absorbierendes Material, das durch Imprägnierung mit einem analytischen Präparat in ein analytisches Material überführt werden kann, das sich für die Durchführung von qualitativen oder halb-quantitativen Bestimmungsverfahren für Milchsäure oder Lactate eignet. Typische derartige Materialien und Elemente, die erfindungsgemäß für die Bestimmung von Milchsäure oder Lactaten verwendet werden können, sind beispielsweise aus den folgenden US-PS 30 92 465; 34 18 099; 34 18 083; 28 93 843; 28 93 844; 29 12 309; 30 08 879; 38 02 842; 37 98 064; 32 98 739; 39 15 647; 39 17 453; 39 33 594 und 39 36 357 bekannt.

Gemäß einer weiteren, besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird die praktisch Katalase-freie, zur Erzeugung von bestimmbarem Wasserstoffperoxid befähigte Lactat-Oxidase in einem mehrschichtigen analytischen Element des Typs untergebracht, der beispielsweise aus der US-PS 39 92 158 bekannt ist.

Dies bedeutet, daß ein erfindungsgemäßes analytisches Element beispielsweise bestehen kann aus:

(1) einer Ausbreitschicht;
(2) einer Reagenzschicht in Flüssigkeitskontakt mit der Ausbreitschicht unter den Anwendungsbedingungen und
(3) gegebenenfalls einem Schichtträger.

In vorteilhafter Weise weisen derartige analytische Elemente eine nicht-fasrige Ausbreitschicht auf.

Gegebenenfalls kann ein solches mehrschichtiges analytisches Element auch eine oder mehrere Registrierschichten aufweisen, d. h. Schichten, die unterhalb der Ausbreitschicht und der Reagenzschicht angeordnet sind und die keine reaktiven Verbindungen oder Stoffe enthalten und lediglich dazu dienen, in den oberen Schichten erzeugte Farbstoffe aufzunehmen. Derartige Schichten bestehen im allgemeinen aus einer Matrix, die für den betreffenden Farbstoff permeabel ist. Des weiteren können derartige Schichten noch weitere Komponenten enthalten, beispielsweise Beizmittel, oberflächenaktive Verbindungen und dergleichen, welche die Eigenschaften der Schichten verbessern. Derartige Schichten sind beispielsweise aus der BE-PS 8 31 660 bekannt.

Das Matrix-Material der Reagenz- und Registrierschichten kann verschieden sein, und die im Einzelfall optimale Zusammensetzung des Matrix-Materials kann von dem Verwendungszweck des analytischen Elementes wie auch dem im Element unterzubringenden reaktionsfähigen Komponenten abhängen. Vorteilhafte Matrix-Materialien sind beispielsweise hydrophile Stoffe natürlichen oder synthetischen Ursprungs, beispielsweise Gelatine, Gelatinederivate, hydrophile Cellulosederivate, Polysaccharide, z. B. Dextran, Gummiarabicum, Agarose und dergleichen wie auch solche synthetischen Substanzen wie wasserlösliche Polyvinylverbindungen, z. B. Poly(vinylalkohol) und Poly(vinylpyrrolidon) sowie Acrylamidpolymere. Geeignet sind ferner organophile Stoffe, z. B. Celluloseester. Zur Verstärkung der Permeabilität der Reagenzschicht kann es oftmals zweckmäßig sein, sofern diese nicht porös ist, ein Matrix-Material zu verwenden, das im Lösungsmittel- oder Dispersionsmedium der zu analysierenden Flüssigkeit quellbar oder mindestens schwach quellbar ist.

Bei den erfindungsgemäßen analytischen Elementen kann es sich um selbsttragende analytische Elemente handeln, oder aber die Ausbreitschicht, Reagenzschicht und gegebenenfalls weiteren Schichten können auf einem Schichtträger angeordnet sein. Als Schichtträgermaterialien lassen sich die verschiedensten üblichen bekannten Schichtträgermaterialien verwenden, wie beispielsweise Papier und mit einem Polyolefin beschichtete Papiere, wie auch polymere Stoffe, z. B. Schichtträger aus Celluloseacetat, Poly(äthylenterephthalat), Polycarbonaten und Polyvinylverbindungen, beispielsweise Polystyrolen. Der Schichtträger kann opak oder lichtundurchlässig sein oder für Licht oder andere Energie durchlässig sein, je nach der angewandten Bestimmungsmethode.

Als besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung von transparenten Schichtträgern erwiesen, die für elektromagnetische Strahlung innerhalb des Wellenlängenbereiches von etwa 200 nm und etwa 900 nm durchlässig sind. Gegebenenfalls kann es auch vorteilhaft sein, einen Schichtträger zu verwenden, der nur für eine oder mehrere enge Wellenlängenbanden durchlässig ist und benachbarte Wellenlängen nicht durchläßt. Dies läßt sich beispielsweise erreichen durch Imprägnieren oder Beschichten des Schichtträgers mit einem oder mehreren Farbstoffen mit entsprechenden Absorptionscharakteristika. Weist ein erfindungsgemäßes analytisches Element einen Schichtträger auf, so befindet sich die Reagenzschicht zwischen Schichtträger und Ausbreitschicht.

Weitere Schichten

In vorteilhafter Weise können die erfindungsgemäßen analytischen Elemente derart ausgestaltet sein, daß sie im Rahmen analytischer Verfahren angewandt werden können, bei denen Reflexionstechniken spektrophotometrischer Analyseverfahren angewandt werden. Infolgedessen weisen die Elemente in vorteilhafter Weise eine Schicht auf, die die Eigenschaft einer reflektierenden Schicht hat und infolgedessen einen geeigneten Hintergrund für spektrophotometrische Messungen von colorimetrischen oder anderen Indikatorreaktionen durch die Schichtträgerseite des Elementes liefert. Die reflektierende Schicht soll dabei den Durchtritt des zu analysierenden Materials zur Reagenz- oder Registrierschicht erlauben und einen wirksamen Hintergrund für die Reflexions-Spektrophotometrie liefern. Als besonders vorteilhaft hat sich im allgemeinen ein weißer Hintergrund erwiesen. Im Hinblick auf ihre Funktion als Hintergrund für den Indikator, der in der Reagenz- oder Registrierschicht erzeugt wurde, ist die reflektierende Schicht normalerweise zwischen Ausbreit- und Reagenz- oder Registrierschicht angeordnet. Eine solche Schicht kann jedoch auch zwischen einer Reagenzschicht und einer Registrierschicht angeordnet sein, wenn eine solche Struktur vorteilhaft ist. Die Reflexion kann des weiteren durch eine Schicht hervorgerufen werden, die gleichzeitig eine weitere Funktion ausübt, beispielsweise die Funktion einer Ausbreitschicht. Des weiteren kann die Reflexion jedoch auch von einer zusätzlichen Schicht erzeugt werden, die keine weitere Funktion innerhalb des Elementes ausübt. Zur Erzeugung der reflektierenden Schicht können beispielsweise übliche bekannte Pigmente wie Titandioxid und Bariumsulfat verwendet werden. Auch können sog. Blush-Polymere ein geeignetes reflektierendes Material darstellen. Aus dem Vorstehenden ergibt sich, daß zu diesem Zwecke beispielsweise auch Pigment enthaltende Ausbreitschichten geeignet sind, wie auch aus Blush-Polymeren aufgebaute Schichten, die ebenfalls die Funktion von Ausbreitschichten ausüben können. In vorteilhafter Weise können des weiteren aus Blush-Polymeren aufgebaute Schichten auch ein Pigment enthalten, um das Ausbreiten und/oder den Reflexionsgrad zu erhöhen.

Gegebenenfalls können die erfindungsgemäßen analytischen Elemente auch Filterschichten aufweisen. Aufbau und Zusammensetzung derartiger Schichten ist bekannt. Derartige Schichten haben, sofern sie im Element vorhanden sind, die Aufgabe, von der zu analysierenden Probe Komponenten zu entfernen, welche die Anzeigereaktion stören oder in anderer Weise die quantitative Bestimmung behindern könnten. So kann beispielsweise im Falle eines mehrschichtigen analytischen Elementes für die Analyse von Milchsäure im Blut eine separate Filterschicht dazu verwendet werden, um rote Blutkörperchen zu entfernen, während die Schicht das Serum zu den unteren Schichten durchläßt. Bei der Analyse von Blutserum und anderen Flüssigkeiten können somit Filterschichten dazu dienen, unerwünschte Komponenten zu entfernen, welche die Anzeigereaktion behindern oder verfälschen könnten. Andererseits können beispielsweise auch Blush-Polymerschichten die Funktion von Filterschichten ausüben. Wird ein erfindungsgemäßes analytisches Element für die Analyse von Blut verwendet, so ist es vorteilhaft, wenn jede vorhandene Filterschicht eine Porengröße von 0,5 bis 5 Mikron aufweist.

Um die Adhäsion der Reagenzschicht gegenüber der darüber angeordneten Ausbreit-, Filter- und reflektierenden Schicht oder Schichten zu verbessern, kann es vorteilhaft sein, eine permeable Zwischenschicht anzuordnen, welche die Adhäsion zwischen den Schichten verbessert. Derartige Zwischenschichten können aus den verschiedensten Materialien aufgebaut sein, solange sie nur eine ausreichende Permeabilität für das zu analysierende Material aufweisen, so daß dieses die Reagenzschicht erreichen kann, solange das Material der Zwischenschicht nicht die Reagenzien in benachbarten Schichten inhibiert und solange die erwünschte Adhäsion erreicht wird. Zum Aufbau derartiger Schichten geeignete Stoffe sind bekannt.

In besonders vorteilhafter Weise lassen sich zur Herstellung derartiger Zwischenschichten solche filmbildenden Polymeren wie beispielsweise Poly(n-vinyl-2-pyrrolidon), Poly(n-isopropylacrylamid), Mischpolymerisate aus Vinylacetat und Vinylneodecanoat (z. B. 20 Gew.-% Vinylacetat) sowie Mischpolymerisate aus Vinylneodecanoat und n-Vinyl-2-pyrrolidon mit z. B. 10 und 30 Gew.-% Vinylneodecanoat verwenden.

Da die Permeabilität derartiger Zwischenschichten gewährleistet bleiben muß, sind derartige Schichten naturgemäß sehr dünn und weisen im allgemeinen die Dicke von Mono-Schichten bis zu Schichten von etwa 0,025 mm auf. Werden zur Herstellung der Zwischenschichten Polymere des angegebenen Typs verwendet, so werden diese im allgemeinen in Konzentrationen von etwa 90 mg/m² bis etwa 1000 mg/m² verwendet, je nach den Eigenschaften der Polymeren, beispielsweise der Dichte der Polymeren, der Permeabilität der herzustellenden Schichten und dergleichen.

Gegebenenfalls können zur Verbesserung der Adhäsion zwischen einzelnen Schichten auch Oberflächenbehandlungen durchgeführt werden, beispielsweise eine Elektronenbestrahlung.

Herstellung der analytischen Elemente

Die Herstellung der erfindungsgemäßen analytischen Elemente kann in verschiedener Weise erfolgen. So können die einzelnen Schichten zunächst in Form von separaten Schichten erzeugt und daraufhin zusammenlaminiert werden. Erfolgt eine besondere Herstellung der einzelnen Schichten, so kann die Herstellung der Schichten in der Weise erfolgen, daß auf eine geeignete Oberfläche eine Lösung oder Dispersion entsprechender Zusammensetzung aufgetragen wird, worauf die auf der Oberfläche erzeugte Schicht nach ihrer Trocknung auf physikalischem Wege abgestreift wird. Ein besonders vorteilhaftes Verfahren, bei dem die Erzeugung einzelner Schichten und das Zusammenlaminieren der Schichten vermieden wird, besteht darin, auf einen Träger, bei dem es sich um einen permanenten oder temporären Träger handeln kann, eine Schicht aufzutragen, worauf nachfolgend weitere Schichten aufgetragen werden. Eine solche Beschichtung kann nach üblichen bekannten Beschichtungsmethoden durchgeführt werden, beispielsweise durch Handbeschichtung oder durch Beschichtung mit einer üblichen Beschichtungsvorrichtung, durch Tauchbeschichtung, Wulstbeschichtung und dergleichen. Bei einer maschinellen Beschichtung eines Schichtträgers kann es auch vorteilhaft sein, gleichzeitig mehrere Schichten aufzutragen. Eine derartige Verfahrensweise ermöglichende Beschichtungsvorrichtungen sind bekannt. Sie werden beispielsweise auch zur Herstellung lichtempfindlicher photographischer Aufzeichnungsmaterialien angewandt.

Gegebenenfalls kann es vorteilhaft sein, bestimmte Reagenzien oder Teile der Reagenzien in der Ausbreitschicht unterzubringen. So kann beispielsweise das Enzym-Lactat-Oxidase in dieser Schicht untergebracht werden, um eine Wasserstoffperoxiderzeugung zu bewirken, bevor die zu analysierende Probe die Reagenzschicht erreicht, welche die Verbindungen oder Stoffe enthält, die mit H₂O₂ unter Erzeugung einer bestimmbaren Veränderung reagieren.

Im Falle einer vorteilhaften Ausgestaltung eines analytischen Elementes nach der Erfindung, bei der die Ausbreitschicht die Funktion einer Filter- und Ausbreitschicht hat, wird die Schicht in vorteilhafter Weise erzeugt durch gleichzeitiges Auftragen von zwei Lagen (Strata) eines Bindemittels wie Celluloseacetat, gelöst in einer Mischung von organischem Lösungsmittel unter Erzeugung einer "Blush"-Polymerschicht des aus der US-PS 39 91 158 bekannten Typs. Derartige Methoden vereinfachen die Herstellung der analytischen Elemente durch Verminderung der Beschichtungsstufe auf eine Mehrfach-Beschichtungsoperation unter Erzeugung einer hoch wirksamen Ausbreit- und/oder Filterschicht.

Gegebenenfalls können eine oder beide der diskreten Lagen oder Schichten ein reflektierendes Pigment, wie beispielsweise TiO₂, dispergiert enthalten.

Vorrichtungen und Verfahren zum gleichzeitigen Auftragen von verschiedenen einzelnen Schichten innerhalb entweder der Ausbreitschicht oder der Reagenzschicht sind beispielsweise aus der US-PS 29 32 855 bekannt.

Die Dicke der Ausbreitschicht kann verschieden sein. Die im Einzelfalle optimale Dicke hängt teilweise von dem verwendeten Probenvolumen ab, das aus Gründen der Zweckmäßigkeit und Sauberkeit von der Ausbreitschicht absorbiert werden sollte sowie ferner von dem Porenvolumen der Schicht, das ebenfalls die Probenmenge beeinflußt, die von der Schicht absorbiert werden kann. Ausbreitschichten einer Dicke von etwa 50 bis etwa 300 Mikron haben sich als besonders vorteilhaft erwiesen, obgleich auch Schichten einer geringeren Dicke oder größeren Dicke verwendet werden können.

Bei der Erzeugung einer isotrop-porösen Ausbreitschicht hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn das Porenvolumen mindestens etwa 25% des Gesamtvolumens der Schicht ausmacht. Porenvolumen von etwa 50 bis etwa 95% haben sich als vorteilhaft erwiesen.

Die Herstellung der Reagenzschichten kann dadurch erfolgen, daß eine Beschichtungslösung oder Beschichtungsdispersion mit der Matrix und den reaktionsfähigen Verbindungen hergestellt wird, worauf die Beschichtungsmasse in der beschriebenen Weise aufgetragen und unter Erzeugung einer dimensionsstabilen Schicht getrocknet wird. Die Dicke der Reagenzschicht und ihr Permeabilitätsgrad können verschieden sein und von der Art der Verwendung des Materials abhängen. Schichtstärken, trocken gemessen von etwa 10 Mikron bis etwa 100 Mikron haben sich als vorteilhaft erwiesen.

Gegebenenfalls kann ein erfindungsgemäßes Element mehrere diskrete Reagenzschichten aufweisen, von denen eine jede einen speziellen Zweck erfüllt.

So kann gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung das erfindungsgemäße analytische Element zwei diskrete Reagenzschichten aufweisen. Die obere dieser Schichten kann dabei die Reagenzien enthalten, die für die Wasserstoffperoxiderzeugung aus Milchsäure oder Lactat erforderlich sind, und die zweite Schicht kann die Verbindung oder Verbindungen enthalten, die der bestimmbaren Veränderung unterliegen.

In vorteilhafter Weise liegt das Enzym Lactat-Oxidase in entweder der Ausbreitschicht oder Reagenzschicht in einer Konzentration von etwa 50 bis 500 Einheiten/m² (zur Definition der Einheiten vgl. nachfolgend unter Ziffer 2) vor, vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 150 bis 350 Einheiten/m². Die Peroxidase wird vorzugsweise in einer Konzentration von 2000 bis 20 000 Einheiten/m², insbesondere in Konzentrationen von etwa 3000 bis 10 000 Einheiten/m² verwendet, je nach dem Typ der verwendeten Verbindung, die einer bestimmbaren Veränderung unterliegt. Gegebenenfalls können jedoch auch höhere oder geringere Konzentrationen an Peroxidase vorteilhaft sein. Die optimale Konzentration läßt sich im Einzelfalle leicht ermitteln.

Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung werden die einzelnen Schichten durch Beschichtung aus Lösungen oder Dispersionen erzeugt, unter Anwendung von Verfahren, wie sie beispielsweise aus der US-PS 39 92 158 bekannt sind. Gegebenenfalls kann es vorteilhaft oder erforderlich sein, bei der Beschichtung Beschichtungshilfsmittel zu verwenden, um die erwünschten Beschichtungseigenschaften zu erzielen.

Bei den Beschichtungsoperationen können die verschiedensten üblichen bekannten Beschichtungshilfsmittel verwendet werden, solange diese die Aktivität der Lactat-Oxidase oder anderen Reagenzien in den verschiedenen Reagenzschichten nicht beeinträchtigen. Besonders vorteilhafte Beschichtungshilfsmittel für diesen Zweck sind nicht-ionogene und anionische oberflächenaktive Verbindungen.

Konzentrationen an oberflächenaktiven Verbindungen in der Größenordnung von 0,5 bis etwa 4,0 g/m² in der Reagenzschicht und von etwa 1,0 bis etwa 5,0 g/m² in der Ausbreitschicht haben sich als vorteilhaft erwiesen, d. h. bei derartigen Konzentrationen werden keine oder höchstens minimale inhibierende Effekte erzielt, während verbesserte Beschichtungsergebnisse und Probenausbreit-Charakteristika erreicht werden.

Die Schichten können unter Verwendung üblicher bekannter Härtungsmittel hergestellt werden, um eine geeignete und rasche Härtung des Bindemittels zu erreichen und um eine Beschädigung der Schichten und/oder ein unerwünschtes Vermischen von einander benachbarten Schichten zu vermeiden. Verwendbar sind organische und anorganische Härtungsmittel. Wesentlich ist lediglich, daß die Härtungsmittel die anderen Reagenzien, die in den Schichten vorhanden sind, nicht negativ beeinflussen. Härtungsmittel, die sich als besonders vorteilhaft erwiesen haben, sind beispielsweise Glutaraldehyd und Bis(vinylsulfonylmethyl)äther.

Verwendung der analytischen Elemente

Die Art und Weise, in der erfindungsgemäße analytische Elemente zur Milchsäure und Lactatbestimmung verwendet werden können, ergibt sich aus den folgenden Beispielen. Demzufolge wird ein Tropfen einer zu analysierenden Probe einer Größenordnung von etwa 5 bis 50 µl auf die Ausbreitschicht oder äußerste Schicht eines Elementes aufgebracht, wozu übliche bekannte Methoden angewandt werden können, um den Tropfen aufzubringen. Beim Durchtritt durch die Ausbreitschicht wird der Probentropfen ausgebreitet, so daß eine bemessene Menge der Probe der unter der Ausbreitschicht angeordneten Reagenzschicht zugeführt wird, in der der Abbau des Lactates und die Erzeugung von Wasserstoffperoxid erfolgen.

Alternativ, je nach der angewandten Ausführungsform, kann die Erzeugung des Wasserstoffperoxids auch in der Ausbreitschicht oder einer oberen Reagenzschicht erfolgen, in welchem Falle das erzeugte Wasserstoffperoxid einer unteren Reagenzschicht zugeführt wird. In jedem Falle jedoch wird das Wasserstoffperoxid quantitativ in einer Reagenzschicht unter Verwendung eines Stoffes bestimmt, der einer feststellbaren oder bestimmbaren Veränderung unterliegt. Die Bestimmung der feststellbaren Veränderung erfolgt dabei nach üblichen bekannten Methoden. Aus der ermittelten Veränderung läßt sich dann die Gesamt-Lactatkonzentration in der aufgebrachten Probe ermitteln.

In Fig. 1 ist ein mehrschichtiges analytisches Element nach der Erfindung für die Bestimmung von Milchsäure oder Lactat im Serum schematisch dargestellt. Das analytische Element weist vier Schichten 1 bis 4 auf, die auf einem Schichtträger 5 angeordnet sind. Die erste Schicht (1) ist die Reagenzschicht, die im vorliegenden Falle sämtliche Reagenzien enthält, die zum Abbau von Milchsäure oder Lactat erforderlich sind, und um die Menge an erzeugtem Wasserstoffperoxid zu bestimmen. Die zweite Schicht (2) ist eine Gelatineschicht aus deionisierter Gelatine, die im vorliegenden Falle dazu dient zu verhindern, daß der ausgewählte Stoff, der einer bestimmbaren Veränderung unterliegt, z. B. ein Chromogen, bei dem es sich um einen in einem organischen Lösungsmittel löslichen Leucofarbstoff handeln kann, während der Herstellung des analytischen Elementes in die Ausbreitschicht wandert. Die dritte Schicht (3) ist eine Haftschicht, die die Adhäsion zwischen der Gelatineschicht und der vierten Schicht (4), bei der es sich um die Ausbreitschicht handelt, fördert.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter veranschaulichen. Sofern nichts anderes angegeben ist, wurde in den später folgenden Beispielen in der im folgenden beschriebenen Weise verfahren.

1. Herstellung der Lactat-Oxidase a. Züchtung von Streptococcus faecalis

Streptococcus faecalis wurde in einem Medium gezüchtet, das enthielt: Hefeextrakt, Glucose, Trypton, K₂HPO₄, Metallsalze sowie Vitamine. Die Zellen wurden in der mittleren logarithmischen Phase geerntet, durch Zentrifugieren abgetrennt, einmal mit einem Kaliumphosphatpuffer eines pH-Wertes von 7,0 gewaschen und im gefrorenen Zustand bis zur Verwendung aufbewahrt.

b. Extraktion und Reinigung der Lactat-Oxidase

260 g S. faecalis Zellen wurden bei 5°C innerhalb von 65 Stunden aufgetaut. Die Zellen wurden dann in einem Gesamtvolumen von 1 Liter einer 0,1 molaren Kaliumphosphatpufferlösung eines pH-Wertes von 7,0 suspendiert. Eine homogene Suspension wurde durch eine 2 Minuten lange Behandlung in einem Mischgerät vom Typ Waringblender hergestellt. Die Zellsuspension wurde dann 20 Minuten lang bei 13 000×g zentrifugiert, worauf die in Form eines sog. "Pellet" abzentrifugierte feste Masse mit den Zelltrümmern verworfen wurde. Diese Verfahrensstufe und alle übrigen Verfahrensstufen wurden bei etwa 5°C durchgeführt.

Nunmehr wurde eine 1%ige Protaminsulfatlösung langsam unter Rühren innerhalb eines Zeitraumes von 1 Stunde zugesetzt. Auf diese Weise wurde der rohe zellfreie Extrakt auf einem Protaminsulfatgehalt von 0,05% gebracht. Der Extrakt wurde dann 20 Minuten lang bei 13 000×g zentrifugiert, worauf die abzentrifugierte Masse mit ausgefällten Nukleinsäuren verworfen wurde.

Innerhalb eines Zeitraumes von 90 Minuten wurde soviel festes (NH₄)₂SO₄ von Enzymgrad zu dem mit Protaminsulfat behandelten Extrakt zugegeben, daß der Extrakt eine 50%ige Sättigung erreichte. Daraufhin wurde nochmals 20 Minuten lang bei 13 000×g zentrifugiert. Die abzentrifugierte Masse mit Lactat-Oxidase wurde in einem 0,1 molaren Kaliumphosphatpuffer eines pH-Wertes von 7 gelöst, gegen den gleichen Puffer dialysiert und gefroren aufbewahrt.

2. Bestimmung der Lactat-Oxidase

Für die spektrophotometrische Bestimmung der Lactat-Oxidase verwendete Standard-Reaktionsmischungen enthielten in einem Gesamtvolumen von 1,0 ml: 100 µMole Kaliumphosphatpuffer eines pH- Wertes von 7,0, 25 µMole Milchsäure, 30 µg Meerrettich-Peroxidase (5,6 Purpurogallin-Einheiten) sowie 0,25 µMole o-Dianisidin.

Proben wurden auf eine Temperatur von 30°C gebracht, worauf die Reaktionen durch Zusatz von S. faecalis Lactat-Oxidase eingeleitet wurden. Festgestellt wurde die Absorption bei 430 nm in einem üblichen Spektrophotometer vom Typ Beckman A-25. Die Anfangswerte wurden aus einem linearen Teil der Kurve berechnet und in Einheiten von Lactat-Oxidase-Aktivität umgerechnet, wo es zweckmäßig war. Eine Einheit entsprach einem µMol Farbstoff, erzeugt pro Minute bei 30°C unter Verwendung von ε=1,1×10⁴ für o-Dianisidin.

Ein weiteres Verfahren zur Bestimmung der Lactat-Oxidase-Aktivität beruht auf der Verwendung einer Sauerstoffelektrode. Die folgende Elektrode ist typisch für dies Verfahren.

Für die Sauerstoffelektroden-Bestimmungsmethode wurde eine Sauerstoffelektroden-Apparatur vom Typ Yellow Springs Instrument Company Model 53 verwendet. Die Apparatur war mit einem konstanten Temperaturbad und einem mit konstanter Geschwindigkeit umlaufenden Motorrührer ausgestattet. Routinegemäß wurde das Meßinstrument im Falle einer Probe von mit Stickstoff ausgespülten destilliertem Wasser auf 0% Sauerstoff und auf 100% Sauerstoff im Falle einer Probe von mit Luft gesättigtem destilliertem Wasser eingestellt. Die inkubierten Mischungen, die in einem Gesamtvolumen von 3,0 ml 280 µMole Kaliumphosphatpuffer eines pH-Wertes von 7,0 und 4,17 µMole L(⁺) Lactat enthielten, wurden auf eine Temperatur von 30°C eingestellt. Die Reaktionen wurden durch Zusatz vonn 0,42 Einheiten Lactat-Oxidase eingeleitet, worauf die Abnahme an gelöstem Sauerstoff gemessen wurde. Zu Vergleichszwecken inkubierte Proben, die sämtliche Komponenten außer der Lactat-Oxidase enthielten, zeigten weder eine Verminderung an gelöstem Sauerstoff noch eine Entwicklung von Sauerstoff bei Katalasezusatz.

3. Methoden zur Bestimmung von Milchsäure oder Lactat a. Lactat-Dehydrogenase-Vergleichsmethode

Ein "Rapid Lactate STAT-Pack", Hersteller Calbiochem, Los Angeles, Kalifornien, USA, wurde als Reagenzlieferant verwendet. Die Reaktionsmischungen enthielten in einem Gesamtvolumen von 1,0 ml: 0,22 mMole Tris-Puffer (pH-Wert=9,4), 22 Mole Glutamat, 2,4 Einheiten Glutamat-Pyruvat-Transaminase, 21 Einheiten Lactat-Dehydrogenase sowie 3,1 Mole NAD⁺. Bei dem "Rapid Lactate STAT-Pack" handelt es sich um ein Reagenz zur Schnellbestimmung von Lactat. Die Prüflinge wurden auf 30°C gebracht, worauf die Anfangsabsorption bei 340 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers (Beckman A25) gemessen wurde. Durch Zusatz von entweder L(⁺)-Lactat-Standard (6 bis 54 nMole) oder Serum (20 µLiter) wurden Reaktionen eingeleitet. Nach 5 Minuten wurde die Endabsorption bei 340 nm gemessen. Im Falle einer jeden Serumprobe wurde eine Vergleichsprobe, die Serum und 0,9% NaCl in einem Gesamtvolumen von 1,0 ml enthielt, in gleicher Weise wie der Prüfling behandelt. Der Δ A-₃₄₀-Wert einer jeden Vergleichsprobe (eine Korrektur der Serumabsorption bei 340 nm) wurde von dem Δ A-₃₄₀-Wert des Prüflings abgezogen, worauf die Lactat-Konzentration der Serumprobe bestimmt wurde durch Vergleich mit einer Lactat-Standardkurve.

b. Lactat-Oxidase-Methode

Die Reaktionsmischungen enthielten in einem Gesamtvolumen von 1,0 ml: 90 µMole Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert=7,0), 0,2 µMole o-Dianisidin oder 96 µg 4-Aminoantipyren-Hydrochlorid sowie 32 µg 1,7-Dihydroxynaphthalin, 25 µg Meerrettich-Peroxidase (5,6- Purpurogallin-Einheiten) und 0,64 mg Lactat-Oxidase (0,4 Einheiten).

Die Proben wurden auf 30°C gebracht, worauf die Anfangsabsorption bei 430 nm gemessen wurde. Die Reaktionen wurden dann eingeleitet, indem entweder ein L(⁺)-Lactat-Standard (6 bis 40 nMole) oder Serum (20 µLiter) zugesetzt wurde. Nach 6 Minuten wurde die Endabsorption bei 430 nm gemessen. Für jede Serumprobe wurde eine Vergleichsprobe in gleicher Weise behandelt, die sämtliche Komponenten mit Ausnahme der Lactat-Oxidase enthielt. Der Δ A-₄₃₀-Wert jeder Vergleichsprobe wurde von dem Δ A-₄₃₀-Wert des Prüflings abgezogen, worauf die Lactat-Konzentration durch Vergleich mit einer Lactat-Standard-Kurve bestimmt wurde.

Beispiel 1 Quantitative Bestimmung von Milchsäure unter Verwendung von Lactat-Oxidase-Lösungsbestimmung

Verwendet wurde Lactat-Oxidase von S. faecalis. Die Reaktionen, die durch Zusatz von L(⁺)-Lactat in den in Fig. 2 angegebenen Konzentrationen eingeleitet wurden, waren nach 6 Minuten bei 30°C beendet. Die rasche Reaktion bei Vorhandensein von lediglich 0,4 Einheiten Enzym beruht teilweise auf dem vergleichsweise geringen K _m-Wert (0,20 mM) des L(⁺)-Lactates.

Die Absorption (nach einer Reaktionszeit von 6 Minuten) wurde in einem Diagramm in Abhängigkeit von der Milchsäurekonzentration aufgetragen. Verwiesen wird auf Fig. 3. Innerhalb des getesteten Bereiches war die Farbstoffbildung proportional der Milchsäurekonzentration. Der getestete Bereich entsprach Serumkonzentrationen von 2,97 bis 18,6 mg/dl (0,33 mM bis 2,03 mM), wenn man von einer Zugabe von 20 µl einer jeden Serumprobe zu einem Gesamtvolumen von 1,0 ml ausgeht. Die normalen Lactat-Werte, die in der Literatur angegeben werden, liegen bei 5 bis 15 mg/dl.

Beispiel 2 Vergleich der Lactat-Oxidase-Methode mit der Vergleichsmethode - Lösungsbestimmung

Für die Untersuchungen wurden Serumproben von 20 µl verwendet. Sie wurden einmal nach der oben beschriebenen Vergleichsmethode untersucht und zum anderen nach der Lactat-Oxidase-Methode unter Verwendung o-Dianisidin als Chromogen und unter Verwendung von 1,7-Dihydroxynaphthalin (DHN) und Aminoantipyren (AAP)-HCl als farberzeugendes System. Die Auswahl der zwei verschiedenen farberzeugenden Systeme veranschaulicht den Spielraum, den die Lactat-Oxidase-Methode bietet, unter Berücksichtigung der Auswahl der Wellenlängen für die Bestimmung der Milchsäure. Aus den in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellten Daten ergibt sich die gute Übereinstimmung zwischen den beiden Methoden.

Tabelle I

Quantitative Bestimmung von Serum-Lactat nach der Lactat-Oxidase-Methode im Vergleich zur Lactat-Dehydrogenase-Methode

Beispiel 3 Reproduzierbarkeit der Milchsäurebestimmung unter Verwendung der Lactat-Oxidase-Methode

Die Genauigkeit des erfindungsgemäßen analytischen Verfahrens wurde bestimmt durch eine wiederholte Analyse einer üblichen Serumprobe nach der beschriebenen Methode unter Verwendung von o-Dianisidin als farbbildendes System. Aus den Daten der folgenden Tabelle II wurde ein Abweichungskoeffizient von 2,88% errechnet. Dieser Koeffizient läßt sich vorteilhaft vergleichen mit den entsprechenden Koeffizienten von 3%, der sich bei der Lactat-Dehydrogenase-Methode ergibt.
Lactat-Konzentration mg/dl

10,772 11,500 11,515 11,909 11,500 11,909 11,681 11,531 Mittelwert11,543 Abweichung ± 0,333 Abweichungskoeffizient % 2,88

Die folgenden Beispiele veranschaulichen eine bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung unter Verwendung eines mehrschichtigen analytischen Elementes des in Fig. 1 schematisch dargestellten Typs.

Beispiel 4 Verwendung eines mehrschichtigen analytischen Elementes für die Bestimmung von Milchsäure unter Verwendung von Lactat-Oxidase und einem Triarylimidazol- Farbstoffsystem

Auf einen 0,175 mm starken Polyesterschichtträger (Estar) wurden folgende Schichten aufgetragen:
eine Reagenzschicht aus 11 g/m² Gelatine, 161 mg/m² des Oleyläthers eines Polyäthylenglykols (PÄG), 323 mg/m² einer oberflächenaktiven Verbindung (Alkanol XC), 807 mg/m² Kaliumphosphat, 215 mg/m² 5,5-Dimethyl-1,3-cyclohexandion, 6460 Einheiten/m² Peroxidase, 280 Einheiten/m² Lactat-Oxidase, 130 mg/m² Bis(vinyl sulfonmethyl)äther sowie eine Dispersion vn 269 mg/m² 2(3,5-Dimethoxy-4-hydroxyphenyl)-4,5-bis (4-dimethylaminophenyl)- imidazol in 358 mg/m² Diäthyllauramid.

Auf die Reagenzschicht wurde eine Gelatineschicht aufgetragen aus 5,4 g/m² Gelatine, 161 mg/m² Oleyläther eines Polyäthylenglykols (PÄG), 161 mg/m² einer oberflächenaktiven Substanz (Alkanol XC), 807 mg/m² Kaliumphosphat sowie 65 mg/m² Bis(vinyl sulfonylmethyl)äther. Auf diese Gelatineschicht wurde eine Haftschicht aus 320 mg/m² Poly-n-isopropylacrylamid aufgetragen und auf diese Schicht eine Celluloseacetat/TiO₂-Ausbreitschicht aus 6 g/m² Celluloseacetat sowie 46 mg/m² TiO₂.

Des weiteren wurden Standardproben dadurch hergestellt, daß 6,4 mg Lithium-Lactat/dl in 2,0 ml von (33,3 mM) frisch hergestellten 7%igen Bovin-Serumalbumin (0,9% Salzzugabe) gelöst wurden. Durch Auftragen der Reflexionsdichten in Abhängigkeit von der L-Lactat-Konzentration wurde die in Fig. 4 dargestellte Eichkurve erhalten. Die Serumlactatwerte waren die Durchschnittswerte von zwei 10 µl-Proben, die direkt auf das analytische Element aufgebracht wurden. Die Dichtemessungen erfolgten nach 10 Minuten. Die Lactat-Konzentrationen ergaben sich aus den Eichkurven.

Beispiel 5 Vergleich der Lactat-Oxidase-Methode im Falle der Anwendung eines analytischen Elementes und der Lösungs-Vergleichsmethode

Serum-Milchsäure wurde unter Verwendung des in Beispiel 4 beschriebenen analytischen Elementes und nach der oben beschriebenen Lösungs-Vergleichsmethode bestimmt. Eine Aufzeichnung der in beiden Fällen erhaltenen Werte (vergl. die folgende Tabelle III) zeigt, daß im Falle der Verwendung des analytischen Elementes etwa 10% höhere Werte erzielt wurden.

Tabelle III

Serum-Lactat-Werte (mg/dl)

Beispiel 6 Reproduzierbarkeit der erfindungsgemäß erzielbaren Ergebnisse unter Verwendung eines analytischen Elementes (Web-Format)

Es wurden zwei verschiedene Serum-Milchsäurekonzentrationen von 5 und 10 mg/dl an zwei verschiedenen Tagen getestet, um die Genauigkeit der Testmethode unter Verwendung des analytischen Elementes zu ermitteln. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV zusammengestellt.

Tabelle IV

Analytische Veränderungen

Beispiel 7 Verwendung eines mehrschichtigen analytischen Elementes für die Bestimmung von Milchsäure unter Verwendung eines selbstkuppelnden Farbstoffsystems

Im Falle dieses analytischen Elementes wurde ein leichter zugängliches Chromogen, nämlich das 4-Isopropoxy-1-naphthol-Selbst kupplungsfarbsystem verwendet, durch das der analytische Bereich des Bestimmungsverfahrens beträchtlich erweitert wird. Das analytische Element hatte einen Aufbau wie in Fig. 1 dargestellt. Der Aufbau der einzelnen Schichten war wie folgt:

Ein 0,175 mm starker Polyesterschichtträger (Estar) wurde zunächst mit einer Reagenzschicht folgender Zusammensetzung beschichtet: 16,0 g/m² Gelatine, 592 mg/m² Natriumphosphat, 356 mg/m² Kaliumphosphat, 323 mg Triton-X-100/m², 861 mg/m² 4-Isopropoxy-1-naphthol, 3,4 g/m² eines Mischpolymerisates aus n-Butylmethacrylat, Styrol und 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure im Verhältnis 55 : 40 : 5, 215 mg/m² 5,5-Dimethyl-1,3-Cyclohexandion, 118 mg/m² Peroxidase, 280 Einheiten/m² Lactat-Oxidase sowie 242 mg/m² Bis(vinylsulfonyl methyl)äther. Auf diese Reagenzschicht wurde eine Gelatineschicht aufgetragen aus: 5,4 g/m² Gelatine, 140 mg/m² Natriumphosphat, 280 mg/m² Kaliumphosphat, 108 mg/m² Triton-X-100 sowie 81 mg/m² Bis(vinylsulfonmethyl)äther. Auf diese Schicht wurde eine Haftschicht aus 320 mg/m² Poly-n-isopropylacrylamid aufgetragen und auf diese Haftschicht eine Celluloseacetat-TiO₂-Ausbreitschicht des bereits beschriebenen Typs.

Des weiteren wurden Lactat-Standards in der beschriebenen Weise hergestellt, worauf eine Eichkurve (Fig. 5) durch Auftragen der Konzentrationen in Abhängigkeit von den Dichtewerten, die nach 10 Minuten bei 37°C abgelesen wurden, hergestellt wurde.

Bei 12,5 mg/dl Lactat betrug die Standard-Abweichung (n=9)=0,024, und der Abweichungskoeffizient (%) lag bei 4,2.

Claims

1. Präparat für die analytische Bestimmung von Milchsäure oder Lactat, gekennzeichnet durch einen Gehalt einer Lactat-Oxidase, die

(1) zur Erzeugung von bestimmbarem Wasserstoffperoxid befähigt ist,
(2) eine spezifische Aktivität von mindestens etwa 0,1 µMol Lactat pro Minute pro Milligramm Protein aufweist,
(3) praktisch katalasefrei ist und
(4) eine Michaelis-Konstante K _m für Lactat von mindestens etwa 0,2 mM hat.

2. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es außer der Lactat-Oxidase eine Substanz mit peroxidativer Aktivität sowie einen Stoff, der in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und der Substanz mit peroxidativer Aktivität einer bestimmbaren Veränderung unterliegt, enthält.

3. Analytisches Element für die analytische Bestimmung von Milchsäure oder Lactat mit einer Ausbreitschicht und einer Reagenzschicht, dadurch gekennzeichnet, daß es eine praktisch katalasefreie, zur Erzeugung von bestimmbarem Wasserstoffperoxid befähigte, Lactat-Oxidase gemäß Anspruch 1 enthält.

4. Analytisches Element nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Lactat-Oxidase in der Reagenzschicht enthalten ist.

5. Analytisches Element nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzschicht enthält: (1) eine praktisch katalasefreie, zur Erzeugung von bestimmbarem Wasserstoffperoxid befähigte Lactat-Oxidase gemäß Anspruch 1, (2) eine Substanz mit peroxidativer Aktivität und (3) einen Stoff, der in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und der Substanz mit peroxidativer Aktivität einer bestimmbaren Veränderung unterliegt, und daß das analytische Element eine dritte Schicht zwischen der Ausbreitschicht und der Reagenzschicht aufweist, die verhindert, daß der Stoff, der einer bestimmbaren Veränderung unterliegt, in die Ausbreitschicht wandern kann.

6. Analytisches Element nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Schichten auf einem Schichtträger aufgetragen sind und daß die Reagenzschicht dem Schichtträger näher liegt als die Ausbreitschicht.

7. Analytisches Element nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Stoff, der einer bestimmbaren Veränderung unterliegt, aus einem Triarylimidazolfarbstoff besteht und daß die Peroxidase in einer Konzentration von 3000 bis etwa 10 000 Einheiten/m² vorliegt.

8. Analytisches Element nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Stoff, der einer bestimmbaren Veränderung unterliegt, aus einem selbstkuppelnden Farbstoff besteht, und daß die Peroxidase in einer Konzentration von etwa 3000 bis etwa 10 000 Einheiten/m² vorliegt.

9. Analytisches Element für die Bestimmung von Milchsäure oder Lactat, gekennzeichnet durch eine Matrix aus einem absorbierenden Material mit einem von dem absorbierenden Material aufgesaugten Präparat mit einer praktisch katalasefreien, zur Erzeugung von bestimmbarem Wasserstoffperoxid befähigten Lactat-Oxidase gemäß Anspruch 1.

10. Analytisches Element nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich eine Substanz mit peroxidativer Aktivität sowie einen Stoff enthält, der in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und der Substanz mit peroxidativer Aktivität einer bestimmbaren Veränderung unterliegt.