DE2722645A1 - Antibiotikumgemisch a-35512, verfahren zu seiner herstellung und dieses enthaltendes mittel - Google Patents
Antibiotikumgemisch a-35512, verfahren zu seiner herstellung und dieses enthaltendes mittelInfo
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Description
Xb
PFENNING - MAAS
MEINIO - LEMKE - SPOTT
6CHLEIoCi-OMERSTR. 299 6000 MÜNCHEN 40
X-4767
Eli Lilly and Company, Indianapolis
,
Indiana, V.St.A.
Antibiotikumgemisch A-35512, Verfahren zu seiner Herstellung
und dieses enthaltendes Mittel
709849/0908
Gegenstand der Erfindung ist ein Antibiotikumgemisch A-35512, das mikrobiologisch wirksame verwandte Faktoren A, B, C, E, F,
G und H enthält und das durch submerse aerobe Züchtung des neuen Mikroorganismus Streptomyces candidus NRRL 8156 hergestellt
wird. Die einzelnen Faktoren von A-35512 werden chromatographisch voneinander getrennt und isoliert. Durch schwache
saure Hydrolyse von A-35512 Faktor B erhält man unter Entfernung mehrerer Zucker A-35512 Faktor B Aglykon. Das Antibiotikumgemisch
A-35512 stellt ein antibakterielles und wachstumsförderndes Mittel dar, mit dem sich die Futterverwertung bei
Wiederkäuern und Geflügel erhöhen läßt. Das Antibiotikum A-35512 Faktor B eignet sich ferner auch zur Behandlung von
Zahnkaries und Akne.
Bei dem antibiotischen Gemisch A-35512 handelt es sich um
ein Gemisch aus eng verwandten antibiotisch wirksamen Glycopeptiden.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B, das das am besten charakterisierte Glied aus dem Antibiotikumkomplex A-35512 darstellt,
scheint ein neuer Vertreter aus der Gruppe der peptidhaltigen Antibiotika zu sein, zu denen auch Vancomycin (US-PS
3 067 099), A-4696 Faktor A, Faktor B und Faktor C (US-PS 3 952 095), Avoparcin (US-PS 3 855 410), Ristomycin A (N. Loroakina,
7. Internationales Symposium für Chemie Nationaler Produkte, Riga, Latvia, Seite 625, 1970) und Ristocetin A (US-PS
2 990 329) gehören. Das Antibiotikumgemisch A-35512 unterscheidet sich von den bekannten Antibiotika beispielsweise in der
Laufgeschwindigkeit in verschiedenen Chromatograph!sehen Systemen sowie im Aminosäure- und Zuckergehalt.
Es gibt zwar bereits eine Reihe antibakteriell wirksamer Mittel, doch braucht man immer noch weitere neue und verbesserte Antibiotika.
Ein Problem der häufigen Therapie mit Antibiotika ist die Tatsache, daß sich die Antibiotika in ihrer Wirksamkeit gegenüber
pathogenen Organismen unterscheiden. Ein anderes Problem ist darin zu sehen, daß sich kontinuierlich Organismenstämme
709849/0908
entwickeln, die gegen die heute verwendeten Antibiotika resistent sind. Ein weiteres Problem liegt in der Tatsache, daß
einzelne Patienten aufgrund einer Uberempfindlichkeit und/oder
toxischer Effekte auf bestimmte Antibiotika oft stark reagieren. Aufgrund dieser Probleme bei der heutigen Therapie ist
Ziel der Erfindung die Schaffung neuer Antibiotika, die sich gegen durch Mikroorganismen hervorgerufene Erkrankungen einsetzen
lassen.
Erfindungsgemäß soll ferner ein Mittel geschaffen werden, mit
dem sich die Futterverwertung bei Wiederkäuern und Geflügel verbessern läßt, da die Notwendigkeit zur Erhöhung der Futterverwertung
immer wichtiger wird. Eine derartige Erhöhung der Futterverwertung bei einer Reihe von Tieren sowie bei Geflügel
läßt sich beispielsweise bereits mit Diäthylstilböstrol und anderen östrogenen erreichen. Diese Futterzusätze haben jedoch
den Nachteil, daß sie in dem zum Verzehr bestimmten Fleisch zurückbleiben.
Man sucht daher nach anderen und neuen Wegen zur Erhöhung der Futterverwertung, um so die begrenzten Futtermengen
bei der Mästung von Wiederkäuern und Geflügel besser auszunutzen. Das Antibiotikumgemisch A-35512 mit seinen Einzelfaktoren
und deren Derivaten stellt in dieser Richtung einen Schritt nach vorne dar.
Die Erfindung bezieht sich somit auf ein Antibiotikumgemisch A-35512 mit den Faktoren A, B, C, E, F, G und H, das Antibiotikum
A-35512 Faktor A, das Antibiotikum A-35512 Faktor B, das Antibiotikum A-35512 Faktor C, das Antibiotikum A-35512 Faktor
E, das Antibiotikum A-35512 Faktor F, das Antibiotikum A-35512 Faktor G und das Antibiotikum A-35512 Faktor H sowie
das Aglykonderivat des Faktors B.
Die Erfindung ist ferner auf ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikumgemisches A-35512 mit den Faktoren A, B, C,
E, F, G und H, des Antibiotikums A-35512 Faktor A, des Antibiotikums A-35512 Faktor B, des Antibiotikums A-35512 Faktor C,
709949/0308
des Antibiotikums A-35512 Faktor E, des Antibiotikums A-35512
Paktor F, des Antibiotikums A-35512 Faktor G und des Antibiotikums
A-35512 Faktor H sowie des Aglykonderivats des Faktors B gerichtet, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
a) den Mikroorganismus Streptomyces candidus NRRL 8156 oder eine das Antibiotikum A-35512 bildende Mutante hiervon
in einem Nährmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlehydrate, Stickstoff und anorganische Salze enthält, submers
unter aeroben Fermentationsbedingungen züchtet, bis eine wesentliche Menge des Antibiotikums gebildet ist,
b) das Antibiotikumgemisch A-35512 gegebenenfalls aus dem Kulturmedium abtrennt,
c) aus dem Antibiotikumgemisch A-35512 gegebenenfalls die Antibiotika A-35512 Faktoren A, B, C, E, F, G und H isoliert
und
d) aus dem Antibiotikum A-35512 Faktor B gegebenenfalls das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykon herstellt.
Die Erfindung ist ferner auf ein Zusatzfutter zur Steigerung der Futterverwertung von Wiederkäuern mit ausgebildeter Pansenfunktion
gerichtet, das ein Futter als Trägermaterial und als Wirkstoff eine propionaterhöhende Menge des Antibiotikumgemisches
A-35512, des Antibiotikums A-35512 Faktor A, des Antibiotikums A-35512 Faktor B, des Antibiotikums A-35512 Faktor
C, des Antibiotikums A-35512 Faktor E, des Antibiotikums A-35512 Faktor F, des Antibiotikums A-35512 Faktor G, des
Antibiotikums A-35512 Faktor H und des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykon oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz
der Antibiotika A-35512 Faktoren A, B, C, E, F, G und H oder des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykon enthält.
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Die Erfindung bezieht sich weiter auf ein Zusatzfutter für Geflügel aus einem Futter als Träger und einem Wirkstoff in
einer die Futterverwertung erhöhenden Konzentration, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es als Wirkstoff ein Antibiotikumgemisch
A-35512, das Antibiotikum A-35512 Faktor A, das Antibiotikum A-35512 Faktor B, das Antibiotikum A-35512 Faktor C,
das Antibiotikum A-35512 Faktor E, das Antibiotikum A-35512 Faktor F, das Antibiotikum A-35512 Faktor G, das Antibiotikum
A-35512 Faktor H oder das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykon
oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz des Antibiotikums A-35512 Faktoren A, B, C, E, F, G und H oder des Antibiotikums
A-35512 Faktor B Aglykon enthält.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Steigerung der FutterVerwertung von Wiederkäuern mit ausgebildeter
Pansenfunktion, das darin besteht, daß man den Tieren eine propionaterhöhende Menge des Antibiotikumgemisches A-35512, des
Antibiotikums A-35512 Faktor A, des Antibiotikums A-35512 Faktor B, des Antibiotikums A-35512 Faktor C, des Antibiotikums
A-35512 Faktor E, des Antibiotikums A 35512 Faktor F, des Antibiotikums A-35512 Faktor G, des Antibiotikums A-35512 Faktor H
oder des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykon oder eines pharmazeutisch unbedenklichen Salzes des Antibiotikums A-35512 Faktoren
A, B, C, E, F, G und H oder des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykon verabreicht.
Schließlich ist die Erfindung auf ein Verfahren zur Steigerung der Futterverwertung von Geflügel gerichtet, das sich dadurch
auszeichnet, daß man den Tieren oral eine wirksame Menge des Antibiotikumgemisches A-35512, des Antibiotikums A-35512 Faktor
A, des Antibiotikums A-35512 Faktor B, des Antibiotikums A-35512 Faktor C, des Antibiotikums A-35512 Faktor E, des Antibiotikums
A-35512 Faktor F, des Antibiotikums A-35512 Faktor G, des Antibiotikums A-35512 Faktor H oder des Antibiotikums
A-35512 Faktor B Aglykon oder eines pharmazeutisch unbedenklichen Salzes des Antibiotikums A-35512 Faktoren A, B, C,
E, F, G und H oder des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykon verabreicht. 7 0 9849/0908
Zahl und Verhältnis der bei diesem Antibiotikumgemisch gleichzeitig
gebildeten Einzelfaktoren schwanken in Abhängigkeit von den angewandten Fermentationsbedingungen. Die erfindungsgemäßen
antibiotisch wirksamen Substanzen werden willkürlich als Antibiotika A-35512 bezeichnet. Der Faktor B ist der überwiegende
Faktor in dem Antibiotikumgemisch A-35512. Die verschiedenen
Faktoren von A-35512 kommen in dem Gemisch A-35512 vor und lassen sich aus diesem Gemisch einzeln in Form ihrer Hydrochloridsalze
gewinnen. Jeder Einzelfaktor kann in seine freie Base (nämlich die ionische chlorfreie Form) überführt werden,
indem man ihn beispielsweise über ein schwach saures Ionenaustauscherharz chromatographiert. Außer den Formen der freien
Base und der Hydrochloridsalze eignen sich auch andere pharmazeutisch
unbedenkliche Salze der einzelnen Faktoren des Antibiotikums A-35512. Der Kürze halber wird bei der Diskussion
über die Verwendbarkeit des vorliegenden Antibiotikums einfach die Angabe Verbindung A-35512 verwendet, um auf diese Weise eine
Verbindung aus der Gruppe A-35512 Faktoren A, B, C, E und H und ihrer pharmazeutisch unbedenklichen Salze zu bezeichnen.
Aus der Zeichnung gehen die Infrarotabsorptionsspektren (die mit KBr-Preßlingen erhalten wurden) der folgenden Faktoren des
Antibiotikums A-35512 hervor:
Figur 1- A-35512 Faktor A Dihydrochlorid
Figur 2 - A-35512 Faktor B Dihydrochlorid
Figur 3 - A-35512 Faktor H Hydrochlorid
Figur 4 - A-35512 Faktor C Dihydrochlorid
Figur 5 - A-35512 Faktor E Hydrochlorid
Das Infrarotabsorptionsspektrum des Antibiotikums A-35512 Faktor
B Aglykon (gemessen in Nujol-Mull) ist in Figur 6 dargestellt.
Die erfindungsgemäßen A-35512 Faktoren sind engverwandte Verbindungen. Bis zu sieben antibiotisch wirksame Faktoren
lassen sich bei dem bei der Züchtung erhaltenen Antibiotikum-
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gemisch A-35512 isolieren. Die Einzelfaktoren werden voneinander
getrennt, und die Faktoren A, B, C, E und H werden in der im folgenden beschriebenen Weise als Einzelverbindungen isoliert.
Das Antibiotikumgemisch A-35512 ist in Wasser löslich, löst sich in Alkoholen, wie Methanol oder Äthanol, teilweise und
ist in anderen organischen Lösungsmitteln, wie Benzol, Chloroform,
Aceton, Diäthyläther, Äthylacetat, Toluol, Hexan, Acetonitril oder Dioxan vollständig unlöslich.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor A ist eine weiße amorphe basische
Verbindung. Das Antibiotikum A-35512 Faktor A hat in etwa eine Elementarzusammensetzung von 54,29 % Kohlenstoff, 5,19 %
Wasserstoff, 5,58 % Stickstoff, 33,76 % Sauerstoff und 1,69 % Chlor.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor A Dihydrochlorid ist eine weiße
amorphe hygroskopische Verbindung. Das Antibiotikum A-35512 Faktor A Dihydrochlorid hat eine mittlere Elementarzusammensetzung
von 51,03 % Kohlenstoff, 5,10 % Wasserstoff, 4,75 % Stickstoff, 34,20 % Sauerstoff und 4,80 % Chlor.
Das Infrarotabsorptionsspektrum des Antibiotikums A-35512 Faktor
A Dihydrochlorid in Form eines KBr-Preßlings geht aus Figur
1 der Zeichnung hervor und weist signifikante Absorptionsmaxima bei folgenden Frequenzen {cm" ) auf: 3405 (stark), 33OO
(Schulter), 2950 (schwach), 1750 (schwach), 1670 (stark), 1625 (Schulter), 1602 (stark), 1520 (stark), 147O (schwach), 1440
(schwach), 1405 (schwach), 1345 (Schulter), 1312 (mittel), 1225 (mittel), 118O (schwach), 1130 (schwach), 1080 (stark)
und 1O2O (Schulter).
Die Ultraviolettabsorptionsspektren des Antibiotikums A-35512
Faktor A Dihydrochlorid zeigen in saurem und neutralem Methanol
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ein Absorptionsmaximum bei 282 nm (epsilon =11 70O) und in basischem Methanol ein Absorptionsmaximum bei 292 nm (epsilon
=14 OOO), und zwar berechnet aufgrund eines Molekulargewichts von 20OO. Die Ultraviolettspektren des Antibiotikums A-35512
Faktor A Dihydrochlorid zeigen ferner auch bei 225 nm eine Endabsorption.
Ein C magnetisches Kernresonanzspektrum des Antibiotikums
A-35512 Faktor A Dihydrochlorid in D3O hat folgende Charakteristiken:
No. ppm Höhe (%)
3 175,3 0,8
4 173,0 2,1
5 # 172,1 2,0
6 171,4 1,5
7 170,9 2,7 a 170,5 2,3 9 169,5 1,6
10 159,0 1,3
11 157,9 2,3
12 156,2 2,6
13 155,6 2,3
14 155,3 2,4
15 154,4 1,1
16 136,3 1,4
17 136,0 1,0
18 135,1 1,4
19 133,5 1,2
20 129,6 1,6
709849/0908
| NO. | ppm |
2722645
Höhe (%) |
| 21 | 129,1 | 1,7 |
| 22 | 128,7 | 1,8 |
| 23 | 127,5 | 1,0 |
| 24 | 126,0 | 1,4 |
| 25 | 124,3 | 2,8 |
| 26 | 122,1 | 1,6 |
| 27 | 109,9 | 1,3 |
| 28 | 107,4 | 1,6 |
| 29 | 101,7 | 0,9 |
| 30 | 77,6 | 3,8 |
| 31 | 76,3 | 4,6 |
| 32 | 75,5 | 2,6 |
| 33 | 74,8 | 2,5 |
| 34 | 74,5 | 2,4 |
| 35 | 73,4 | 3,7 |
| 36 | 72,8 | 6,0 |
| 37 | 72,0 | 4,4 |
| 38 | 70,9 | 7,0 |
| 39 | 69,6 | 2,8 |
| 40 | 67,4 | 90,5*· |
| 41 | 65,4 | 1,7 |
| 42 | 61,7 | 3,1 |
| 43 | 56,7 | 1,7 |
| 44 | 55,5 | 1,3 |
| 45· | 54,7 | 0,8 |
| 46 | 24,6 | 0,9 |
| 47 | 19,1 | 1,7 |
| 48 | 17,9 | 2,0 |
709840/0908
| NO. | Ppm |
| 49 | 17,2 |
| 50 | 16,7 |
| 51 | 16,2 |
Höhe (%)
1,9 3,2 3,0
Dioxan als Standard
Das Antibiotikum A-35512 Faktor A Dihydrochlorid besitzt folgende
spezifische Drehwerte:
25
/alpha/D = -100 (c = 1, H2O)
/alpha/D = -100 (c = 1, H2O)
/alpha/365 = -400 (c = 1, H3O).
Die elektromatrische Titration des Antibiotikums A-35512 Faktor
A Dihydrochlorid in 66-prozentigem wäßrigem Dimethylformamid weist auf die Anwesenheit von vier titrierbaren Gruppen mit
pK -Werten von etwa 7,35, 9,09, 10,49 und 12,44 (Anfangs-pH-Wert
6,2) hin.
Das durch Titration bestimmte scheinbare Molekulargewicht des
Antibiotikums A-35512 Faktor A Dihydrochlorid beträgt etwa 2106.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor A Dihydrochlorid ist in Wasser
löslich, in Alkoholen, wie Methanol oder Äthanol, teilweise löslich und in anderen organischen Lösungsmitteln, wie Benzol»
Chloroform, Aceton, Diäthylather, Äthylacetat, Toluol, Hexan,
Acetonitril oder Dioxan im allgemeinen unlöslich.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor A Dihydrochlorid ist in wäßrigen Lösungen mit pH-Werten von etwa 3 bis etwa 10 über eine
Zeitspanne von 72 Stunden stabil.
709849/0908
Eine Aminosäureanalyse des saurehydrolysierten Antibiotikums
A-35512 Faktor A Dihydrochlorid ergibt, daß das Antibiotikum A-35512 Faktor A wenigstens 5 Aminosäurereste enthält, von
denen einer Glycin ist.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B ist eine weiße amorphe basische Verbindung. Das Antibiotikum A-35512 Faktor B hat eine
etwaige empirische Formel von C97_99HiO1-1O5N8-9°46-48Cl* Das
Antibiotikum A-35512 Faktor B weist eine mittlere Elementarzusammensetzung von 53,97 % Kohlenstoff, 4,75 % Wasserstoff,
5,25 % Stickstoff, 34,29 % Sauerstoff und 1,59 % Chlor auf.
Die obige Elementarzusammensetzung stimmt besonders mit der bevorzugten empirischen Formel C98H104NgO47Cl (berechnet:
C * 53,60; H == 4,75; N = 5,74; 0 = 34,30; Cl = 1,61) überein.
Eine andere bevorzugte empirische Formel ist CQgH10-NgO47Cl
(berechnet: C = 54,00; H = 4,75; N = 5,15; 0 = 34,50; Cl = 1,60).
Die Ultraviolettabsorptionsspektren des Antibiotikums A-25512
Faktor B zeigen in saurem und neutralem Methanol ein Absorptionsmaximum bei 282 nm (epsilon =15 000) und in basischem
Methanol ein Absorptionsmaximum bei 292 nm (epsilon =16 000), berechnet auf einem Molekulargewicht von 2000. Die Ultraviolettspektren
des Antibiotikums A-35512 Faktor B zeigen ferner auch eine Endabsorption bei 225 nm.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B verfügt über folgende spezifische
Drehwerte:
709849/0908
25 D
/alpha^ = -123° (c = 1,
/alpha/25 = -446° (c = 1, H-O).
365 *
Die elektrometrische Titration des Antibiotikums A-35512 Faktor
B in 66-prozentigem wäßrigem Dimethylformamid weist auf die Anwesenheit von vier titrierbaren Gruppen mit pK -Werten
von etwa 7,15, 8,81, 10,2O und 12,00 sowie auf die mögliche
Gegenwart <
13,50 hin.
13,50 hin.
Gegenwart einer weiteren Gruppe mit einem pK -Wert von über
Das durch Titration bestimmte scheinbare Molekulargewicht des Antibiotikums A-35512 Faktor B beträgt etwa 2143.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid ist eine weiße kristalline Verbindung (aus 50-prozentigem wäßrigem
Methanol). Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid ist zwar hygroskopisch und hat keinen sauber ausgeprägten
Schmelzpunkt, ein entsprechendes Thermogramm hiervon zeigt jedoch einen bei 25 C beginnenden Gewichtsverlust, mit
einem 7,4-prozentigen Gewichtsverlust bei 121 0C und einem
unter Zersetzung verlaufenden weiteren Gewichtsverlust bei 135 0C.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid hat eine mittlere Elementarzusammensetzung von 52,57 % Kohlenstoff,
4,80 % Wasserstoff, 5,66 % Stickstoff, 32,86 % Sauerstoff und 4,51 % Chlor. Die obige Elementarzusammensetzung stimmt
genau überein mit einer anderen möglichen empirischen Formel C98H103N9O47Cl.2HCl (berechnet: C = 51,93; H = 4,65; N 5,57;
0 33,20; Cl = 4,65).
Die ültraviolettspektren des Antibiotikums A-35512 Faktor B Dihydrochlorid zeigen in saurem und neutralem Methanol ein
709849/0908
Absorptionsmaximum bei 282 nm (epsilon =12 000) und in basischem Methanol ein Absorptionsmaximum bei 292 nm (epsilon
=14 000), berechnet unter Verwendung eines Molekulargewichts von 2000. Das Ultraviolettspektrum des Antibiotikums A-35512
Faktor B Dihydrochlorid zeigt ferner auch bei 225 nm eine Endabsorption.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid besitzt folgende spezifische Drehwerte:
/alpha/" = -128° (c = 1,
/alpha/^5 = -475° (c = 1,
Die elektrometrische Titration des Antibiotikums A-35512 Faktor B Dihydrochlorid in 66-prozentigem wäßrigem Dimethylformamid
weist auf die Anwesenheit von vier titrierbaren Gruppen mit pK -Werten von etwa 7,15, 8,87, 10,30 und 12,10 sowie
auf die mögliche Gegenwart einer weiteren Gruppe mit einem pK -Wert von über 13,1 hin.
Das durch Titration bestimmte scheinbare Molekulargewicht des Antibiotikums A-35512 Faktor B Dihydrochlorid beträgt
etwa 2027.
Das C magnetische Kernresonanzspektrum des Antibiotikums A-35512 Faktor B Dihydrochlorid in ϋ,Ο weist folgende Charakteristiken
auf:
709849/0908
| No. | ppm | Höhe (%) |
| 2 | 173,0 | |
| 3 | 171,9 | 3,7 |
| 4 | 171,6 | 3,3 |
| 5 | 171,0 | 5,8 |
| 6 | 170,8 | 5,0 |
| 7 | 169,6 | 3,6 |
| 8 | 159,0 | 4,1 |
| 9 | 157,9 | 4,4 |
| 10 | 157,5 | 3,7 |
| Ii | 156,6 | 4,8 |
| 12 | 155,6 | 6,1 |
| 13 | 155,3 | 4,2 |
| 14 | 154,9 | 3,3 |
| 15 | 154,3 | 4,2 |
| 16 | 151,7 | 3,3 |
| 17 | 144,3 | 3,1 |
| 18 | 136,7 | 3,5 |
| 19 | 136,2 | 4,9 |
| 20 | 135,4 | 4,0 |
| 21 | 135,2 | 4,4 |
| 22 | 133,6 | 4,2 |
709849/0908
| - Vi - |
2722645
Höhe (%) |
|
| No. |
Uo
PPm |
4,1 |
| 23 | 133,3 | 1,7 |
| 24 | 129,8 | 3,0 |
| 25 | 129,3 | 2,6 |
| 26 | 128,8 | |
| 27 | 127,6 | 3,9 |
| 28 | 126,1 | 5,6 |
| 29 | 124,2 | M |
| 30 | 122,4 | 4,4 |
| 31 | 122,0 | 3,3 |
| 32 | 120,7 | 2,7 |
| 33 | 116,5 | 0,8 |
| 34 | 109,5 | M |
| *5* | 108,2 | 2,7 |
| 36 | 107,7 | 1,7 |
| 37 | 104,5 | 2,9 |
| 38 | 101,8 | 1,6 |
| 39 | 100,9 | 1,0 |
| 40 | 98,2 | 1»2. |
| 41 | 76,9 | 1,8 |
| 42 | 76,1 | 2,0 |
| 43 | 74,1 | 2,7 |
| 44 | 73,5 | 2,4. |
| 45 | 72,7 | 4,0 |
| 46 | 72,3 | 7,1 |
| 47 | 71,0 |
2,5
2,5 |
|
48
709849/O908 49 |
70,3
69T7 |
74,7 + |
| 50 | 67,4 | 1:2 |
| 51 | 64,6 | |
| 2722645 | |
| PPro | Höhe (%) |
| 62,0 | 1,5 |
| 58,0 | 1,3 |
| 56,8 | 1,7 |
| 55,4 | 3,9 |
| 54,3 | 2,5 |
| 24,5 | 2,0 |
| 17,9 | 3,0 |
| 17,2 | 2,0 |
| 16,3 | 2,5 |
NO.
52
53
54
55
56
57
58
59
60
53
54
55
56
57
58
59
60
Dioxan als Standard
Das aus Methanol-Wasser umkristallisierte Antibiotikum A-35512
Faktor B Dihydrochlorid besitzt folgendes charakteristisches Pulver-Röntgenbeugungsdiagramm (Cu Strahlung, lambda 1,54Oi
Nickelfilter, d = Interplanarabstand in Angstrom):
d Relative Intensität
17,15 100
12,90 80
10,85 70
9,25 70
8,87 60
8,22 50
7,86 50
6,93 40
6,20 40
5,62 40
5,04 05
4,02 02
3,54 02
709840/0908
Das Infrarotabsorptionsspektrum des Antibiotikums A-35512
Faktor B Dihydrochlorid in Form von KBr-Preßlingen geht aus Figur 2 der Zeichnung hervor. Die signifikantesten Absorptionsmaxima
treten bei folgenden Frequenzen (cm ) auf: 3420 (stark), 3300 (Schulter), 2950 (schwach), 1752 (schwach),
1675 (stark), 1630 (Schulter), 1605 (stark), 1520 (stark), 1470 (schwach), 1440 (schwach), 1410 (schwach), 1345 (Schulter),
1312 (mittel), 1225 (mittel), 1180 (mittel), 1135 (schwach), 1080 (stark) und 1020 (schwach).
Die Aminosäureanalyse des säurehydrolysierten A-35512 Faktor B Dihydrochlorids ergibt, daß das Antibiotikum A-35512
Faktor B wenigstens 5 Aminosäurereste enthält, von denen einer Glycin ist. Die vier restlichen Aminosäurereste im Antibiotikums
A35512 Faktor B sind komplex und scheinen mit denen,
wie sie auch im Antibiotikum A-35512 Faktor A zu finden sind, identisch zu sein. Die Struktur eines dieser Aminosäurereste
dürfte folgende sein:
HOOC JnIHz
I Γ
ΥΎ
Hl/ XCOOH
Sine Analyse seiner säurehydrolysierten Produkte ergibt, daß
das Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid folgende Zucker erhält: Glucose, Fructose, Mannose, Rhamnose und
3-Amino-2,3,e-trideoxy-S-C-methyl-L-xylohexopyranose. Durch
milde saure Hydrolyse des Antibiotikums A-35512 Faktor B Dihydrochlorid werden die Glucose-, Fructose-, Mannose- und
Rhamnosegruppen entfernt, und es entsteht ein charakteristisches Aglykonderivat.
709849/0908
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid verfügt über
wenigstens eine veresterbare Hydroxylgruppe.
Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihvdrochlorid ist in Wasser
löslich, löst sich teilweise in Alkoholen, wie Methanol oder Äthanol, und ist in anderen weniger polaren organischen
Lösungsmitteln, wie Benzol, Chloroform, Aceton, Diäthylather,
Äthylacetat, Toluol, Hexan, Acetonitril oder Dioxan, unlöslich.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid ist in wäßrigen Lösungen mit pH-Werten von etwa 3 bis etwa 10 bis zu
72 Stunden stabil.
Das Antibioticum A-35512 Faktor C ist eine weiße amorphe basische Verbindung.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor C hat eine mittlere Elementarzusammensetzung
von 53,93 % Kohlenstoff, 5,15 % Wasserstoff, 5,80 % Stickstoff, 32,35 % Sauerstoff und 1,90 % Chlor.
Die obige Elementarzusammensetzung stimmt mit der bevorzugten empirischen Formel C84H-gNgO-gCl überein. Das Antibiotikum
A-35512 Faktor C hat ein Molekulargewicht von etwa 1862.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor C Dihydrochlorid ist eine weiße amorphe Verbindung. Das Antibiotikum A-35512 Faktor C
Dihydrochlorid hat eine mittlere Elementarzusammensetzung von 51,76 % Kohlenstoff, 5,07 % Wasserstoff, 5,61 % Stickstoff,
30,29 % Sauerstoff und 4,88 % Chlor.
709849/0908
Die empirische Formel für das Antibiotikum A-35512 Faktor C
Dihydrochlorid entspricht etwa C83-85H97-1O1N8°37-39C13*
Die Elementarzusammensetzung stimmt genau überein mit einer anderen
bevorzugten empirischen Formel C84Hg-NgO38Cl . 2 HCl (berechnet:
C = 52,2 %; H = 5,1 %; N = 5,8 %; 0 = 31,5 %; Cl = 5,4 %).
Das Infrarotabsorptionsspektrum des Antibiotikums A-35512 Paktor
C Dihydrochlorid in Form von KBr-Preßlingen geht aus Figur 4 der Zeichnung hervor. Die signifikantesten Absorptionsmaxima
treten bei folgenden Frequenzen (cm~ ) auf: 3370 (stark), 3280 (Schulter), 3040 (Schulter), 2980 (Schulter), 2920 (schwach),
1740 (schwach), 1658 (stark), 1620 (schwach), 1589 (mittel), 1503 (stark), 1460 (schwach), 1428 (mittel), 1385 (schwach),
1330 (schwach), 1295 (mittel), 121Ο (stark), 1162 (mittel), 1120 (schwach), 1060 (stark) und 1OO5 (mittel).
Die Ultraviolettabsorptionsspektren des Antibiotikums A 35512 Faktor C Dihydrochlorid zeigen in saurem und neutralem Methanol
ein Absorptionsmaximum bei 282 nm (epsilon =14 600) und in basischem Methanol ein Absorptionsmaximum bei 292 nm (epsilon
=16 400), berechnet unter Verwendung eines Molekulargewichts von 2OOO.
Das C magnetische Kernresonanzspektrum des Antibiotikums
A-35512 Faktor C Dihydrochlorid in D3O hat folgende Charakteristiken:
| NO. | ppm | Höhe (%) |
| 1 | 172,9 | 2,5 |
| 2 | 172,2 | 2,0 |
| 3 | 171,5 | 2,2 |
| 4 | 171,0 | 3,* |
| 5 | 169,6 | 2,0 |
| 709849/0908 6 | 158,6 | 1,8 |
| 7 | 15778 | 3,0 |
-yr-
| PPm | 2722645 | |
| No. | 156,5 | Höhe (%) |
| 8 | 156,1 | 2,1 |
| 9 | 155,6 | 2,8 |
| 10 | 154,6 | 4,2 |
| 11 | 151,1 | 3,9 |
| 12 | 143,3 | 1,5 |
| 13 | 136,0 | M |
| 14 | 135,4 | 3,2 |
| 15 | 133,2 | 2,7 |
| 16 | 128,7 | 3,7 |
| 17 | 126,5 | 2,3 |
| 18 | 124,6 | 3,1 |
| IS | 129,3 | 2,1 |
| 20 | 121,5 | 2,7 |
| 21 | 120,1 | 2,2 |
| 22 | 118,0 | 1,2 |
| 23 | 116,5 | 1,7 |
| 24 | 107,8 | 1,2 |
| 25 | 104,5 | 2,7 |
| 26 | 101,7 | 1,9 |
| 27 | 94,5 | 1,9 |
| 28 | 75,9 | 1,0 |
| 29 | 74,3 | 3,0 |
| 3D | 73,4 | 2,0 |
| 31 | 72,1 | 2,3 |
| 32 | 70,9 | 3,5 |
| 7Q9849/090833 | 68,7 | 4,3 |
| 34 | 67,4 | 2,9 |
| 35 | 71,7 + | |
No. ppm Höhe (%)
36 64,3 1,3
37 62,2 1,6
38 56,1 1,4
39 55,2 3,5
40 54,2 2,1
41 24,3 1,9
42 17,9 2,2
43 17,1 2,0
44 16,2 2,0
Dioxan als Standard
Das Antibiotikum A-35512 Faktor C Dihydrochlorid besitzt folgende
spezifische Drehwerte:
/p5 = -161° (c = 1,05, H3O)
/alpha/^5 = -614° (c = 1,05, H2O).
Die elektrometrische Titration des Antibiotikums A-35512 Faktor C Dihydrochlorid in 66-prozentigem wäßrigem Dimethylformamid
weist auf die Gegenwart von drei titrierbaren Gruppen mit pK -Werten von etwa 7,30, 8,92 und 10,99 sowie die mögliche
Gegenwart zweier oder mehrerer Gruppen mit pK -Werten von über 11,5 hin.
Das durch Titration bestimmte scheinbare Molekulargewicht des Antibiotikums A-35512 Faktor C Dihydrochlorid beträgt
etwa 1982.
709849/0908
Die Aminosäureanalyse des säurehydrolysierten Antibiotikums A-35512 Faktor C Dihydrochlorid ergibt, daß dieses wenigstens
5 Aminosäurereste enthält, von denen einer Glycin zu sein scheint. Die vier anderen Airdnsäurereste sind bisher nicht
identifiziert worden.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor C Dihydrochlorid ist in Was
ser, Dimethylsulfoxid und wäßrigem Dimethylformamid löslich,
löst sich teilweise in Alkoholen, wie Methanol oder Äthanol, und ist in weniger polaren organischen Lösungsmitteln, wie
Benzol, Chloroform, Aceton, Diäthyläther, Äthylacetat, Toluol/ Hexan, Acetonitril oder Dioxan, unlöslich.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor C Dihydrochlorid ist in wäß
rigen Lösungen mit pH-Werten von etwa 3 bis etwa 10 bis zu 146 Stunden stabil.
Das Antibiotikum A 35512 Faktor E ist eine weiße amorphe basi sche Verbindung. Das Antibiotikum A 35512 Faktor E hat eine
Elementarzusammensetzung von etwa 54,84 % Kohlenstoff, 4,73 % Wasserstoff, 5,26 % Stickstoff, 32,67 % Sauerstoff und 1,72 %
Chlor.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor E Hydrochlorid ist eine weiße
amorphe Verbindung. Das Antibiotikum A-35512 Faktor E Hydro chlorid hat eine Elementarzusammensetzung von etwa 52,67 %
Kohlenstoff, 4,59 % Wasserstoff, 5,55 % Stickstoff, 33,51 % Sauerstoff und 3,62 % Chlor.
Das Infrarotabsorptionsspektrum des Antibiotikums A-35512 Faktor E Hydrochlorid in Form von KBr-Preßlingen geht aus
Figur 5 der Zeichnung hervor. Die signifikantesten Absorptionsmaxima treten bei folgenden Frequenzen (cm ) auf: 3360 (stark)
7091UÜ/0U08
- έί -
3220 (Schulter), 29OO (schwach), 1725 (schwach), 1650 (stark),
1580 (mittel), 1498 (stark), 1450 (schwach), 1419 (schwach),
1295 (mittel), 1205 (mittel), 1172 (mittel), 1110 (schwach),
1060 (stark) und 10OO (schwach).
Die Ultraviolettspektren des Antibiotikums A-35512 Faktor E
Hydrochlorid weisen folgende Absorptionsmaxima auf: In neutralem Methanol bei 270 nm (Schulter) und 359 nm (epsilon = 16 216),
in saurem Methanol bei 286 nm (epsilon = 18 018) und 310 nm (Schulter), in basischem Methanol bei 270 nm (Schulter), 300 nm
(epsilon = 16 216) und 354 nm (epsilon = 17 568), berechnet unter Verwendung eines Molekulargewichts von 2000.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor E Hydrochlorid hat folgenden spezifischen Drehwert:
= -1O8,3 (c = 1,
Die elektrometrische Titration des Antibiotikums A-35512 Faktor E Hydrochlorid in 66-prozentigem wäßrigem Dimethylformamid
weist auf die Gsgenwart von drei titrierbaren Gruppen mit pK -
Werten von etwa 6,30, 9,09 und 11,62 sowie die mögliche Gegenwart von ein oder zwei Gruppen mit pK -Werten von etwa 12,5 oder
darüber (bei einem Anfangs-pH-Wert von 5,45) hin.
Das durch Titration bestimmte scheinbare Molekularlgewicht des
Antibiotikums A-35512 Faktor E Hydrochlorid beträgt etwa 2018.
Die Aminosäureanalyse des säurehydrolysierten Antibiotikums
A-35512 Faktor E Hydrochlorid ergibt, daß das Antibiotikum A-35512 Faktor E sechs bis jetzt noch nicht identifizierte
Aminosäurereste enthält.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor E Hydrochlorid ist in Wasser löslich, in Alkoholen, wie Methanol oder Äthanol, teilweise
709849/0908
löslich, in den meisten organischen Lösungsmitteln, wie Benzol, Chloroform, Aceton, Diäthylather, Äthylacetat, Toluol,
Hexan, Acetonitril oder Dioxan, jedoch unlöslich.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor H ist eine weiße amorphe basische Verbindung. Das Antibiotikum A-35512 Faktor H hat eine
Elementarzusammensetzung von etwa 53,76 % Kohlenstoff, 5,32 % Wasserstoff, 5,53 % Stickstoff, 33,48 Sauerstoff und 1,59 %
Chlor.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor H verfügt über die empirische
Formel C85_87H1O3-1O7N8°3&-4OC1' wobei die bevorzugte empirische
Formel C„ßHlo4NoO_gCl sein dürfte, und hat ein Molekulargewicht
von etwa 1908.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor H Hydrochlorid ist eine weiße
amorphe hydroskopische Verbindung. Das Antibiotikum A-35512 Faktor H Hydrochlorid hat eine Elementarzusammensetzung von
etwa 53,1O % Kohlenstoff, 5,37 % Wasserstoff, 5,35 % Stickstoff,
3O,12 % Sauerstoff und 3,78 % Chlor.
Das Infrarotabsorptionsspektrum des Antibiotikums A-35512 Faktor H Hydrochlorid in Form von KBr-Preßlingen geht aus Figur
der Zeichnung hervor. Die signifikantesten Absorptionsmax±ma treten bei folgenden Frequenzen (cm" ) auf: 3410 (stark),
3240 (Schulter), 2940 (schwach), 1670 (stark), 1630 (Schulter), 16O5 (stark), 1520 (stark), 1470 (schwach), 1442 (schwach),
1400 (schwach), 1345 (Schulter), 1310 (mittel), 1225 (mittel), 1118 (schwach), 1135 (schwach), 1O8O (stark) und 1O2O (Schulter)
.
709849/0908
Die Ultraviolettabsorptionsspektren des Antibiotikums A-35512
Faktor H Hydrochlorid ergeben in saurem und neutralem Methanol ein Absorptionsmaximum bei 282 nm (epsilon = 12500) und in
basischem Methanol ein Absorptionsmaximum bei 292 nm (epsilon = 14000), berechnet unter Verwendung eines Molekulargewichts von 2000. Die Ultraviolettspektren des Antibiotikums A-35512 Faktor H Hydrochlorid zeigen bei 225 nm ferner auch eine Endabsorption.
basischem Methanol ein Absorptionsmaximum bei 292 nm (epsilon = 14000), berechnet unter Verwendung eines Molekulargewichts von 2000. Die Ultraviolettspektren des Antibiotikums A-35512 Faktor H Hydrochlorid zeigen bei 225 nm ferner auch eine Endabsorption.
Das C magnetische Kernresonanzspektrum des Antibiotikums
A-35512 Faktor H Hydrochlorid in D2O weist folgende Charakteristiken
auf:
| No. | Ppm | Höhe (%) |
| 2 | 177,2 | 2,7 |
| 3 | 171,6 | 5,2 |
| 4 | 170,9 | 5,8 |
| 5 | 169,6 | 4,7 |
| 6 | 158,9 | 3,1 |
| 7 | 157,6 | 4,3 |
| 8 | 156,6 | 3,8 |
| 9 | 155,6 | 4,1 |
| 10 | 155,4 | 3,8 |
| 11 | 154,3 | 2,4 |
| 12 | 151,3 | 1,6 |
| 13 | 137,7 | 2,0 |
| 14 | 136,7 | 2,2 |
| 15 | 136,0 | 4,0 |
| 16 | 135,3 | 1,9 |
| 17 | 133,5 | 5,0 |
| 18 | 129,4 | 3,7 |
| 19 | 127,3 | 1,3 |
| 20 | 126,1 | 3,2 |
| 21 | 124,2 | 6,9 |
| 22 | 122,6 | 4,1 |
| 23 | 107,6 | 2,7 |
| 24 | 1O1,8 | 1,8 |
| 25 | 76,2 | 2,8 |
| 26 | 73,5 | 4,4 |
| 709849/0908 |
No. ppm Höhe (%)
27 72,3 7,4
28 71,0 12,2
29 69,7 4,6
30 67,4 73,1+
31 61,6 3,5
32 56,8 1,8
33 55,4 2,8
34 55,0 1,5
35 24,5 2,6
36 17,9 4,6
37 17,2 2,6
38 16,3 3,6
Dioxan als Standard
Das Antibiotikum A-35512 Faktor H Hydrochlorid hat folgenden spezifischen Drehwert:
/alpha/*5 = -123,5 ° (c = 1,
Die elektrometirsche Titration des Antibiotikums A-35512 Faktor H Hydrochlorid in 66-prozentigem wäßrigem Dimethylformamid
weist auf die Gegenwart von fünf titrierbaren Gruppen mit pK -Werten von etwa 5,0, 7,46, 9,80, 11,43 und 13,02
ei
(Anfangs-pH-Wert 5,93) hin.
Das durch Titration bestimmte scheinbare Molekulargewicht des Antibiotikums A-35512 Faktor H Hydrochlorid beträgt etwa
1660· 709849/0908
Die Aminosäureanalyse des säurehydrolysierten Antibiotikums A-35512 Faktor H Hydrochlorid ergibt, daß das Antibiotikum
A-35512 Faktor H wenigstens 5 Aminosäurereste enthält, von
denen eine Glycin ist. Die anderen vier Aminosäurereste im Antibiotikum A-35512 Faktor H scheinen mit denjenigen identisch
zu sein, wie man sie auch bei owui Antibiotikum A-35512
Faktoren A und B findet.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor H Hydrochlorid ist in Wasser löslich, löst sich in Alkoholen, wie Methanol oder Äthanol,
nur teilweise, ist jedoch in den meisten organischen Lösungsmitteln, wie Benzol, Chloroform, Aceton, Diäthyläther, Äthylacetat,
Toluol, Hexan, Acetonitril oder Dioxan, unlöslich.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor H Hydrochlorid ist in wäßrigen Lösungen mit pH-Werten von etwa 3 bis etwa 10 bis zu
72 Stunden stabil.
Die Auftrennung des Antibiotikumgemisches A-35512 in die Einzelfaktoren
A, B, C, E und H und die weniger häufigen Faktoren F und G erfolgt papierchromatographisch unter Verwendung
eines Lösungsmittelsystems aus 1-Butanol, Pyridin, Essigsäure
und Wasser (15 : 10 : 3 : 12). Eine bevorzugte Detektionsmethode besteht in einer Bioautographie unter Verwendung
von Sarcina lutea. Die ungefähren R,-Werte der einzelnen Faktoren
des Antibiotikums A-35512 in diesem System gehen aus folgender Tabelle I hervor.
Faktor A.2HC1 0,21
Faktor B.2HCl 0,34
Faktor C.2HCl 0,46
Faktor E.HCl 0,64
Faktor F 0,81
Faktor G 0,93
Faktor H.HCl 0,15
709849/0908
| Rf | -Wert |
| A35512H | AM374 |
| O,47 0,11 |
O,58 0,20 |
In verschiedenen Systemen hat das Antibiotikum A-35512 Faktor
H ein chromatographisches Profil, das demjenigen des Antibiotikums AM374 (US-PS 3 700 768) sehr ähnlich ist. Das Antibiotikum
A-35512 Faktor H läßt sich von dem Antibiotikum AM374 in wenigstens zwei papierchromatographischen Systemen unterscheiden.
Die Rf-Werte für das Antibiotikum A-35512 Faktor H.2HCl und AM374 in diesen beiden Systemen gehen aus der
folgenden Tabelle II hervor:
CH3OHzO,1n HCl (3:1)
1-Propanol:NH4OH:H20 (6:3:1)
1-Propanol:NH4OH:H20 (6:3:1)
Mehrere Faktoren des Antibiotikumgemisches A-35512 lassen sich auch durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)
unter Verwendung von Polyamid (ZIPAX, DuPont) als stationärer Phase und einer 1,33-molaren wäßrigen einbasischen Kaliumphosphatlösung
als mobiler Phase sowie durch Ultraviolettdetektion (250 nm) voneinander trennen. Aus der folgenden
Tabelle III gehen die Retentionszeiten für die Faktoren des Antibiotikums A-35512 bei einer typischen Auftrennung durch
Hochleistungsflüssigchromatographie unter Einsatz folgender Bedingungen hervor:
Säulengröße: 3,175 χ 152,4 mm
Packung: Polyamid (ZIPAX, DuPont)
Lösungsmittel: KH2PO4(327 g)/H2O (1800 ml)
Strömungsgeschwindigkeit: O,5 ml/min
Kartengeschwindigkeit: 5,1 cm/Std.
Druck: 1Ο5 kg/cm
709849/0908
Tabelle III
| A-35512 Faktor | Verweilzeit (Minuten) |
| A | 9,375 |
| B | 13,125 |
| C | 26,25 |
| E | 5,625 |
| F | 7,5 |
| G | 7,5 |
| H | 7,5 |
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykonhydrochlorid ist eine
weiße amorphe Verbindung mit einer Elementarzusammensetzung von etwa 54f29 % Kohlenstoff, 4,34 % Wasserstoff, 7,40 % Stickstoff,
5,02 % Chlor und 28,95 % Sauerstoff (durch Differenzbildung).
Das Infrarotabsorptionsspektrum des Antibiotikums A-35512 Fak tor B Aglykonhydrochlorid in Nujol-Mull geht aus Figur 6 der
Zeichnung hervor. Die signifikantesten Absorptionsmaxima tre
ten bei folgenden Frequenzen (cm" ) auf: 344O (Schulter), 3340 (Schulter), 3215 (stark), 2950 (Schulter), 2910 (stark),
2840 (stark), 2640 (Schulter), 1735 (schwach), 1655 (stark), 1590 (mittel), 1500 (stark), 1460 (stark), 1378 (mittel),
1365 (Schulter), 1298 (mittel), 1215 (mittel), 1155 (mittel), 1120 (Schulter), 1105 (schwach), 1060 (schwach), 1040 (schwach),
1OO8 (mittel), 925 (schwach), 875 (schwach), 765 (Schulter) und
718 (schwach).
Die elektrometrische Titration des Antibiotikums A-35512 Faktor
B Aglykonhydrochloiid in 66-prozentigem wäßrigem Dimethylformamid weist auf die Gegenwart von drei titrierbaren Gruppen
709849/0908
mit pK -Werten von etwa 7,5, 9,25 und 11,0 sowie die mögliche
Gegenwart zweier weiterer Gruppen mit pK -Werten von über
el
11,0 hin.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykonhydrochlorid hat ein
durch Titration bestimmtes Molekulargewicht von etwa 1282.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykonhydrochlorid hat folgende spezifische Drehwerte:
178° (c = 5, CH3OH)
716,8° (c = 5, CH-OH)
Methanol ein Absorptionsmaximum bei 282 nm (E1 = 1O2,62)
Die Ultraviolettabsorptionsspektren des Antibiotikums A-35512
Faktor B Aglykonhydrochlorid zeigen in saurem und neutralem
,1% '1cm und in basischem Methanol ein Absorptionsmaximum bei 3Ο2 nm
= 182,09).
Das C magnetische Kernresonanzspektrum des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykon in DMSO-d6 bei 90 °C hat folgende
Charakteristiken:
No.
ppm Höhe (%)
1 187,8 37,2
2 172,0 40,9
3 170,7 45,2
4 170,1 46,9
5 169,6 47,7
6 168,4 57,6
7 166,7 52,5
8 157,4 49,9
9 156,6 45,5
10 155,7 55,8
11 155,6 71,5
12 >n JS^^n , λ η« α 56,7
703840/0908
| . - *G - | 2722645 | Höhe (%) | |
| No. | PPtn | 50,5 | |
| 13 | 154,5 | 43,0 | |
| 14 | 149,3 | 38,8 | |
| 15 | 138,8 | 54,3 | |
| 16 | 136,9 | 40,2 | |
| 17 | 136,3 | 31,7 | |
| 18 | 135,2 | 28,4 | |
| 19 | 134,7 | 40,9 | |
| 20 | 133,8 | 102,9 | |
| 21 | 128,2 | 77,2 | |
| 22 | 126,2 | 57,5 | |
| 23 | 123,0 | 38,1 | |
| 24 | 121,3 | 44,4 | |
| 25 | 117.7 | 31,5 | |
| 26 | 117,0 | 31,0 | |
| 27 | 108,6 | 47,9 | |
| 28 | 106,7 | 81,2 | |
| 29 | 105,7 | 26,5 | |
| 30 | 103,2 | 33,4 | |
| 31 | 93,6 | 39,8 | |
| 32 | 74,9 | 33,9 | |
| 33 | 71,8 | 40,2 | |
| 34 | 68.9 | 43,1 | |
| 35 | 63,2 | 33,6 | |
| 36 | 60,4 | 57,8 | |
| 37 | 57,1 | 33,1 | |
| 38 | 55,2 | 30,1 | |
| 39 | 53,2 | 36,0 | |
| 40 | 51,8 |
No. ppm Höhe (%)
41 40,7 43,4+
42 39,9 60,9+
43 39,1 43,9+
44 23,8 55,7
45 17,1 47,8
46 O,O 43,7
+DMSO-d-ο
Das C magnetische Kernresonanzspektrum zeigt, daß auch im Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykon der 3-Amino-2,3,6-trideoxy-3-C-methyl-L-xylohexopyranoserest
(nämlich einer der Zucker, die auch beim Antibiotikum A-35512 Faktor B vorhanden
sind) enthalten ist.
Die Aminosäureanalyse des weiter säurehydrolysierten Antibiotikums
A-35512 Fakor B Aglykonhydrochlorid zeigt, daß das Antibiotikum A 35512 Faktor B Aglykon Glycin und wenigstens drei
komplexe Aminosäurereste enthält. Die Struktur eines dieser Aminosäurereste dürfte folgende sein:
HOC MHs
&6
ei Α
NHa' COOH
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B kglykonhydrochlorid enthält
wenigtens eine veresterbare Hydroxylgruppe.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykonhydrochlorid ist in Wasser und Methanol löslich, in weniger polaren Lösungsmitteln,
wie Benzol, Chloroform, Aceton, Diäthylather, Äthylacetat, Toluol,
Hexan, Acetonitril oder Dioxan, jedoch unlöslich.
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Sg
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykonhydrochlorid hat
bei einer Cellulosedünnschichtchromatographie (Aluminiumträger) unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus 1-Butanol,
Pyridin, Essigsäure und Wasser (15:10:3:12) einen R_-Wert von
etwa 0,80. Die Detektion erfolgt vorzugsweise durch Bioautographie unter Verwendung von Sarcina lutea.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykonhydrochlorid ergibt bei einer Silicageldünnschichtchromatographie unter Verwendung
eines Lösungsmittelsystems aus Methanol, Chloroform und konzentriertem Ammoniumhydroxid (3:2:1) einen R-.-Wert von etwa 0,26.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykon (freie Base) ist eine weiße amorphe Verbindung mit einer mittleren Elementarzusammensetzung
von etwa 52,65 % Kohlenstoff, 4,57 % Wasserstoff, 6,91 % Stickstoff, 2,94 % Chlor, 27,O4 % Sauerstoff
und 4,70 % Asche.
Das Infrarotabsorptionsspektrum des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykon (freie Base) in Form von KBr-Preßlingen
weist signifikante Absorptionsmaxima bei folgenden Frequenzen (cm"1) auf: 3360 (stark), 3260 (Schulter), 2940 (Schulter),
1735 (Schulter), 1660 (stark), 1598 (mittel), 1510 (stark), 1440 (mittel), 1295 (schwach), 1215 (mittel), 1165 (mittel),
1122 (schwach), 1070 (schwach), 1018 (stark), 940 (schwach) und 920 (schwach).
Die elektrometrische Titration des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykon (freie Base) in 66-prozentigem wäßrigem
Dimethylformamid weist auf die Gegenwart von fünf titrierbaren Gruppen mit pK -Werten von etwa 6,2, 8,2, 1O,1, 11,4 und
cL
12,4 und die mögliche Gegenwart einer oder zweier weiterer
Gruppen mit pK -Werten von über 12,5 hin.
a
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykon (freie Base) hat folgenden spezifischen Drehwert:
/alpha/^5 = -64,5° (c = 3, DMSO).
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Die Ultraviolettabsorptionsspektren des Antibiotikums A-35512
Faktor B Aglykon (freie Base) zeigen in neutralem und saurem
1 % Methanol ein Absorptionsmaximum bei 282 nm (E1 = 43,65)
und in basischem Methanol ein Absorptionsmaximum bei 301 nm (E1cm = 67'46>-
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykon (freie Base) hat die gleichen ungefähren Rf-Werte, wie sie vorher für das Antibiotikum
A-35512 Faktor B Aglykonhydrochlorid beschrieben worden sind.
Neben der freien Base und dem Hydrochlorid der einzelnen Faktoren des Antibiotikumgemisches A-35512 sowie des Antibiotikums
A-35512 Faktor B Aglykon gehören zum Gegenstand der Erfindung auch andere pharmazeutisch unbedenkliche Säureadditionssalze
des Antibiotikums A-35512 mit den Faktoren A, B, C, E und H sowie des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykon.
Unter pharmazeutisch unbedenklichen Salzen werden dabei Salze verstanden, die gegenüber der Nichtsalzform der Verbindungen
insgesamt keine Erhöhung der Toxizität gegenüber Warmblütern
ergeben. Typische und geeignete Salze des Antibiotikums A-35512 mit den Faktoren A, B, C, E und H sowie des Antibiotikums
A-35512 Faktor B Aglykon sind diejenigen, wie sie durch übliche Umsetzung mit organischen oder anorganischen Säuren entstehen,
beispielsweise mit Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Bernsteinsäure, Citronensäure, Milchsäure, Maleinsäure,
Fumarsäure, Palmitinsäure, Cholsäure, Pamoarsäure, Mutinsäure,
D-Glutaminsäure, d-Camphersäure, Glutarsäure, Glykolsäure,
Phthalsäure, Weinsäure, Laurinsäure, Stearinsäure, Salicylsäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Sorbinsäure,
Picrinsäure, Benzoesäure oder Zimtsäure.
Die neuen erfindungsgemäßen Antibiotika werden hergestellt,
indem man einen das Antibiotikum A-35512 bildenden Stamm von Streptomyces candidus NRRL 8156 submers unter aeroben
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Bedingungen solange in einem geeigneten Kulturmedium züchtet, bis eine wesentliche antibiotische Aktivität gebildet ist.
Die Gewinnung der dabei erhaltenen Antibiotika erfolgt unter Einsatz von in der Fermentationstechnik bekannten verschiedenen
Isolierungs- und Reinigungsverfahren.
Der zur Herstellung der Antibiotika A-35512 geeignete neue
Mikroorganismus wurde aus einer auf dem Eniwetok Atoll gesammelten Bodenprobe isoliert. Dieser Mikroorganismus läßt
sich als neuer Stamm von Streptomyces candidus (Kressilnikov) Waksman nach E. B. Shirling und D. Gottlieb in "Cooperative
Descripton of Type Cultures of Streptomyces" klassifizieren.
Diese Klassifizierung beruht auf Methoden, wie sie vom
International Streptomyces Project /E. B. Shirling und D. Gottlieb, "Methods for Characterization of Streptomyces
Species," Intern. Bull Systematic Bacteriol. 16: 313-340 (1966) empfohlen werden, zusammen mit bestimmten ergänzenden
Untersuchungen. Die Farbnamen werden nach der ISCC-NBS Methode (K. L. Kelly und D. B. Judd, "The ISCC-NBS
Method of Determining Colors and a Dictionary of Color Names," U.S. Department of Commerce Cir. 553, Washington,
D. C, 1955) bezeichnet. Die in Parenthesen befindlichen Zahlen beziehen sich auf die Farbreihen von Tresner und
Backus /H. D. Tresner und S. J. Backus, "System of Color Wheels for Streptomycete Taxonomy," Appl. Microbiol.
11: 335-338 (1963^/, wobei die Bezeichnungen der Farbstreifen unterstrichen sind. In Klammern sind die
Farbblöcke nach Maerz und Paul (A. Maerz und M. R. Paul,
"Dictionary of Color," McGraw-Hill, New York, N. Y., 1950) angegeben. Sofern nichts anderes gesagt ist, läßt man die
Kulturen jeweils 14 Tage bei 30 °C wachsen.
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Es werden lange gewellte Sporophoren gebildet. Die Sporen, die in 10- bis 5O-er Ketten auftreten, sind zylindrisch und haben
Abmessungen von 0,7 bis 1,05 ,u χ 1,4 bis 3,5 ,u. Auf mehreren
Medien entstehen sklerotiumartige Strukturen. Gelegentlich lassen sich auch besenförmige oder büschelartige Hyphen feststellen.
Die Sporenoberfläche ist einer elektronenmikroskopischen Untersuchung zufolge glatt.
Züchtungsverhalten auf verschiedenen Medien
Medium
Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar (ISP No. 2)
Hafermehl-Agar (ISP No. 3)
Anorganische Salze-Stärke-Agar (ISP No. 4)
Glycerin-Asparagin-Agar (ISP No. 5)
Emerson-Agar
modifizierter Bennet-Agar
Starkes Wachstum, Unterseite gräulichgelb (11J5), reichlich Luftmyzel
und Sporulation, weiß (w) a, kein lösliches Pigment;
mittleres Wachstum, Unterseite fahlgelbgrün /10BV, leidlich Luftmyzel
und Sporulation, weiß (w) 13ba, kein lösliches Pigment, es lassen sich sklerotiumartige Körper
feststellen;
gutes Wachstum, Unterseite bernsteinfarben weiß /10CV, gutes Luftmyzel und gute Sporulation,
gelblichgrau (GY) 2dc, leicht braunes lösliches Pigment, es lassen sklerotiumartige Körper feststellen;
gutes Wachstum, Unterseite fahlgelbgrün /10B2/, gutes Luftmyzel und
gute Sporulation, weiß (w) a, kein lösliches Pigment, das Myzel scheint büschelartig zu sein;
gutes Wachstum, Unterseite helloliv /14L6/, kein Luftmyzel und keine
Sporulation, hellbraunes lösliches Pigment;
reichliches Wachstum, Unterseite mäßig gelb /11J6/, reichliches Luftmyzel
und reichliche Sporulation, weiß (w) a, kein lösliches Pigment;
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Medium
Charakteristiken
Czapek-Lösung-Agar
Tomatenpaste-Hafermehl-Agar
Nährstoff-Agar
Glucose-Asparagin-Agar Trypton-Hefeextrakt-Agar Tyrosin-Agar
Glycerin-Glycin-Agar Calcium-Malat-Agar
gutes Wachstum, Unterseite fahlgelbgrün /1OBJ/, gutes Luftmyzel und gute
Sporulation, weiß (w) b, kein lösliches Pigment, das Myzel erscheint
büschelartig;
reichliches Wachstum, Unterseite gräulich gelb /1115/, reichliches
Luftmyzel und reichliche Sporulation, weiß (w) a, das Myzel rollt sich von der Agaroberflache ab, kein lösliches
Pigment;
leidliches bis gutes Wachstum, Unterseite fahlgelbgrün /18D2/# gutes
Luftmyzel und gute Sporulation, weiß (w) a, hellbraunes lösliches Pigment;
gutes Wachstum, Unterseite fahlgelbgrün /17E1/, gutes Luftmyzel und
gute Sporulation, weiß (w) 13ba, kein lösliches Pigment;
leidliches Wachstum, Unterseite weiß /1OAJ/, leidlich Luftmyzel und
Sporulation, weiß (w) b, kein lösliches Pigment;
gutes Wachstum, Unterseite weiß /10B2/, gutes Luftmyzel und gute
Sporulation, weiß (w) a, braunes lösliches Pigment, es lassen sich
sklerotiumartige Pigmente feststellen;
gutes Wachstum, Unterseite weiß /10B2/, gutes Luftmyzel und gute
Sporulation, weiß (w) b, hellbraunes lösliches Pigment;
gutes Wachstum, Unterseite weiß /1OBJ/, gutes Luftmycel und gute
Sporulation, weiß (w) a, kein lösliches Pigment, das Medium klärt sich um die Zone des Inokulums
herum auf.
Der Mikroorganismus wird ferner auch unter Verwendung von Standardverfahren
bezüglich ausgewählter physiologischer Eigenschaften untersucht. Hierbei ergibt sich folgendes:
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--af 63
Eigenschaften Wirkung auf Milch
Nitratreduktion
Melaninbildung auf:
Pepton-Eisen-Schrägagar Tyrosin-Schrägagar
Trypton-Hefeextrakt-Brühe Gelatineverflüssigung
Temperaturanforderungen:
Hefeextrakt-Malzextrakt-Schrägagar (ISP Medium No. 2):
Koagulation unter einer gewissen Aufklärung nach 14 Tagen;
positiv;
negativ;
schwach positiv (Pigment nach
7 Tagen)
negativ;
nach 14 Tagen vollständig beendet;
26-3O°C, gutes Wachstum und gute Sporulation;
37°C
40°C
45°C
spärliches Wachstum, kein Luftmyzel und keine Sporen;
nur leichtes vegatatives Wachstum;
kein Wachstum
Die bei entsprechenden Untersuchungen über die Kohlenstoffverwer
tung des Mikroorganismus NRRL 8156 erhaltenen Ergebnisse gehen aus folgender Aufstellung hervor:
Bewertung: + = (+) =
gutes Wachstum, positive Verwertung schwaches bis leidliches Wachstum
geringes Wachstum, möglicherweise
keine Verwertung kein Wachstum, keine Verwertung
Keine (negative Kontrolle)
D-Glucose (positive Kontrolle)
L-Arabinose Saccharose iso-Inosit
D-Mannit D-Fructose Rhamnose Raffinose D-Xylose
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- ys -
Bestimmte Eigenschaften des A-35512 bildenden Stammes S. candidus
NRRL 8156 unterscheiden sich von den Eigenschaften des von Shirling und Gottlieb beschriebenen Mikroorganismus /Elwood,
B. Shirling und David Gottlieb, "Cooperative Description of Type Cultures of Streptomyces III. Additional Species Descriptions
from First and Second Studies," Intern. J. Systematic Bacteriol. 18(2), 69-189 (1968) und von Waksman /S. A. Waksman,
"The Actinomycetes. Classification, Identification and Descriptions of Genera and Species," Vol. 2, The Williams and Wilkins
Co., Baltimore, Md., 196J/. Diese Unterschiede gehen aus folgender
Tabelle IV hervor:
NRRL 8156
L-Arabinose
Rhamnose
iso-Inosit
Veröffentlichte Beschreibung
Gelatineverflüssigung vollständig
nach 14 Tagen
Koagulation; gewisse Aufklärung nach 14 Tagen
langsam
keine Koagulation; gute Peptinisierung
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(ob
Eine Kultur des das Antibiotikum A-35512 produziernden Mikroorganismus
Streptomyces candidus ist in der ständigen Sammlung des Northern Regional Research Center, U. S. Department of
Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois, 61604 hinterlegt worden und von dort unter der Hinterlegungsnummer
NRRL 8156 frei beziehbar.
Wie bei anderen Organismen unterliegen die Eigenschaften der die Antibiotika A-35512 produzierenden Kultur, nämlich des
Streptomyces candidus NRRL 8156, einer Variation. Beispielsweise kann man durch Behandlung mit verschiedenen bekannten
mutagenen Mitteln, wie Ultraviolettstrahlen, Röntgenstrahlen, Hochfrequenzwellen, radioaktiver Strahlung oder Chemikalien,
künstliche Varianten und Mutanten des Stammes NRRL 8156 bilden. Alle natürlichen und künstlichen Varianten sowie Mutanten,
die zu Streptomyces candidus gehören und die Antibiotika A-35512 produzieren, können erfindungsgemäß verwendet werden.
Zur Züchtung des Mikroorganismus Streptomyces candidus NRRL 8156 kann man irgendeines der vielen Kulturmedien verwenden.
Aus Gründen einer wirtschaftlichen Produktion, einer optimalen Ausbeute bezüglich des Antibiotikums und einer leichten Isolierung
des Produkts werden jedoch gewisse Kulturmedien bevorzugt. So ist beispielsweise die für die Fermentation in großem Maßstab
vorzugsweise angewandte Kohlenhydratquelle Saccharose, obgleich man stattdessen auch Glucose, Tapiocadextrin, Fructose,
Mannit, Maltose, Lactose oder dergleichen verwenden kann. Eine bevorzugte Stickstoffquelle ist Fleischpepton, man kann jedoch
auch mit Sojabohnenmehl, Schweineblutmehl, Aminosäuren, wie Glutaminsäure, oder dergleichen arbeiten. Als anorganische
Nährsalze können den Kulturmedien übliche lösliche Salze zugegeben werden, die Zink-, Natrium-, Magnesium-, Calcium-,
Ammonium-, Chlorid-, Carbonat-, Sulfat- oder Nitrationen liefern.
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Die für das Wachstum und die Entwicklung des Mikroorganismus erforderlichen Spurenelemente sollen im Kulturmedium ebenfalls
vorhanden sein. Diese Spurenelemente treten normalerweise als Verunreinigungen der anderen Bestandteile des Mediums in solchen
Mengen auf, wie sie zum Wachsen des Mikroorganismus erforderlich sind.
Hat man es bei der großtechnischen Fermentation mit dem Problem eines Schäumens der Fermentationsmedien zu tun, dann muß man
diese mit geringen Mengen (nämlich mit 0,2 ml pro Liter) eines Antischäummittels, wie Propylenglykol, versetzen.
Für die Bildung wesentlicher Mengen der Antibiotika A-35512
wird eine submerse aerobe Fermentation in Tanks oder Behältern bevorzugt. Geringe Mengen der Antibiotika A-35512 lassen sich
auch durch Schüttelflaschenkultur herstellen. Wegen der Zeitverzögerung,
die bei der Antibiotikabildung auftritt, wenn man große Tanks oder Behälter mit den Sporen des Mikroorganismus
animpft, wird vorzugsweise mit einem vegatativen Inokulum gearbeitet. Das vegetative Inokulum wird hergestellt, indem
man ein kleines Volumen des Kulturmediums mit der Sporenform oder mit Myzelbruchstücken des Mikroorganismus animpft, wodurch
man eine frische aktiv wachsende Kultur des Organismus erhält. Die vegetative Impfkultur überträgt man dann in einen
größeren Behälter.
Der die Antibiotika A-35512 produzierende Mikroorganismus kann bei Teperatüren zwischen etwa 20 und 40 C gezüchtet werden.
Eine optimale Bildung der Antibiotika A-35512 scheint bei Temperaturen von etwa 30 bis 34 0C zu erfolgen.
Wie bei submersen aeroben Züchtungsverfahren üblich, bläst man auch vorliegend durch das Kulturmedium Luft. Zur Erzielung eines
effizienten Wachstums des Mikroorganismus sollte das bei einer Tankproduktion eingesetzte Luftvolumen vorzugsweise mehr
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als 0,1 Volumina Luft pro Volumen Kulturmedium pro Minute
(V/V/M) aufmachen. Für eine ausreichende Produktion der Antibiotika A-35512 arbeitet man bei einer Tankproduktion mit einem
Luftvolumen von etwa 0,25 V/V/M.
Die Bildung der Antibiotika A-35512 läßt sich während der Fermentation
verfolgen, indem man entsprechende Proben der Kulturbrühe oder von Extrakten der Myzelfeststoffe in bezug auf ihre
antibiotische Wirksamkeit gegenüber Mikroorganismen untersucht, deren Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika bekannt ist. Ein
hierzu besonders geeigneter Nachweisorganismus ist Bacillus subtilis ATCC 6633. Dieser Bioversuch wird vorzugsweise auf
Papierscheiben oder Agarplatten durchgeführt, die ein ernährungstechnisch
begrenztes Medium enthalten.
Die unter entsprechenden submersen aeroben Fermentationsbedingungen
hergestellten Antibiotika A-35512 lassen sich nach ihrer Bildung aus dem Fermentationsmedium durch in der Fermentationstechnik
übliche Methoden gewinnen. Die während der Fermentation des A-35512 produzierenden Mikroorganismus entstandene
antibiotische Aktivität tritt im allgemeinen in der filtrierten Kulturbrühe auf. Eine maximale Gewinnung der Antibiotika
A-35512 ergibt sich daher, wenn man von der Kulturbrühe zuerst die Myzelmasse abfiltriert. Die auf diese Weise erhaltene
filtrierte Brühe läßt sich dann nach irgendeiner Technik reinigen, wodurch man das antibiotisch wirksame Gemisch A-35512
erhält. Eine bevorzugte Methode zur Gewinnung dieser Antibiotika besteht in einer Adsorption der filtrierten Brühe auf einer Polyamidsäule
und einer Elution der Säule mit Wasser und wäßrigen Alkoholgemischen. Die dabei eluierten antibiotisch wirksamen
Fraktionen lassen sich unter Bildung des Antibiotikagemisches A-35512 vereinigen. Wahlweise kann man die eluierten Fraktionen
unter Anwendung dieser Technik auch auf Basis ihres Verhaltens bei der Dünnschichtchromatographie vereinigen, wodurch man gereinigtes
Antibiotikum A-35512 Faktor B und angereicherte Gemische der anderen A-35512 Faktoren erhält.
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Die weitere Reinigung der einzelnen Faktoren des Antibiotikums A-35512 besteht in zusätzlichen Adsorptions- und Extraktionsverfahren. Mit Vorteil verwendet man hierzu adsorptive Materialien, wie Aluminiumoxid, Silicagel, Ionenaustauscherharze
oder dergleichen. Die Faktoren des Antibiotikums A-35512 kommen in der Fermentationsbrühe als Hydrochloride vor. Das bevorzugte
Auftrennverfahren unter Verwendung von Polyamid ergibt das Antibiotikum A-35512 Faktor B und als Rest das Gemisch der anderen Faktoren des Antibiotikums A-35512 in Form der Hydrochloride. Jeder einzelne Faktor läßt sich in bekannter Weise, beispielsweise chromatographisch, über ein schwach basisches Ionenaustauscherharz in seine freie Base (ionische chlorfreie Verbindung) überführen.
Wahlweise kann man die Kulturfeststoffe unter Einschluß der Bestandteile des Mediums und des Myzels auch ohne Extraktion
oder Abtrennung, jedoch vorzugsweise nach Entfernung des Wassers, als Quelle für die Antibiotika A-35512 verwenden. So kann
man das Kulturmedium beispielsweise nach Bildung des antibiotisch wirksamen A-35512 durch Lyophylisieren trocknen und das
dabei erhaltene Material dann direkt in ein Futtervorgemisch einmischen.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykon wird durch milde saure Hydrolyse des Antibiotikums A-35512 Faktor B hergestellt.
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B ist am leichtesten in Form seines Dihydrochlorids zugänglich. Als Ausgangsmaterial zur
Herstellung des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykon verwendet man daher vorzugsweise das Antibiotikum A-35512 Faktor B
Dihydrochlorid. Man kann hierzu jedoch auch das Antibiotikum A-35512 Faktor B oder andere Säureadditionssalze des Antibiotikums A-35512 Faktor B einsetzen. Die saure Hydrolyse wird
in üblicher Weise vorgenommen. Man kann hierzu zwar mit irgendeiner Säure arbeiten, verwendet zur Bildung des Antibiotikums
A-35512 Faktor B Aglykon vorzugsweise jedoch Chlorwasserstoffsäure. Bei Einsatz von Chlorwasserstoffsäure erhält man das
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Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykon als Hydrochloridsalz.
Die Hydrolyse wird vorzugsweise in Wasser unter Rückflußsieden über eine Zeitspanne von etwa 1 bis 2 Stunden durchgeführt. Längere
Umsetzungszeiten führen zu einem Abbau des Aglykons unter Bildung weniger aktiver und später sogar inaktiver Produkte. Die
für die jeweiligen Reaktionsbedingungen optimalen Umsetzungszeiten lassen sich ohne weiteres bestimmen, indem man entsprechende
Teilmengen des jeweiligen Reaktionsgemisches bezüglich ihrer Biowirksamkeit untersucht.
Das Antibiotikagemisch A-35512, die Faktoren A, B, C, E und H des Antibiotikums A-35512 und das Antibiotikum A 35512 Faktor B
Aglykon hemmen das Wachstum bestimmter pathogener Mikroorganismen, insbesondere grampositiver Bakterien. Die Minimalinhiblerungskonzentrationen
(MIC-Werte), bei denen die Faktoren A, B, C und H des Antibiotikums A-35512 ausgewählte Baterien hemmen,
werden durch übliche Agar-Verdünnungsversuche ermittelt, und die dabei erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle
V hervor.
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Staphylococcus aureus 3055
OStaphylococcus aureus 3074
Streptococcus faecalis O
| 2 | MIC | (mcg/ml) | A-3551 | 2 | A-35512 | |
| A-3551 | 2HCl | A-35512 | 2HCl Faktoi | 2HCl | Faktor H-HCl | |
| Faktor A · | Faktor B · | 6, | 25,0 | |||
| 6,25 | 3,12 | S1 | 25,0 | |||
| 25,0 | 6,25 | 3, | 12,5 ? | |||
| 6,25 | 3,12 | : C· | ||||
| ,25 | ||||||
| ,25 | ||||||
| ,12 | ||||||
Besonders interessant und wichtig ist die Tatsache, daß die Antibiotika A-35512 auch das Wachstum von Mikroorganismen
hemmen, die gegenüber anderen Antibiotika resistent sind. Aus der folgenden Tabelle VI geht die beim Standard-Scheiben-Platten-Versuch
erhaltene Wirksamkeit der Faktoren A, B, C, E und H des Antibiotikums A-35512 (bei 30 Mikro-
gramm pro Scheibe) gegenüber typischen Mikroorganismen her vor. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen werden ausgedrückt
als der Durchmesser (mm) der beobachteten Inhibierungszonen.
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A-35512 A-35512 A-35512 A-35512 A-35512
Faktor A'2HCl Faktor B-2HCl Faktor C-2HCl Faktor E-HCl Faktor H-HCl
Staphylococcus ausreus 3055 (penicillin-G-suszeptibel)
18,4
14,4
Staphylococcus aureus 3074 ^J (penicillin-G-resistent
16,8
14,5
^Staphylococcus aureus 3130
to (methicillinresistent)
18,4
15,4
Streptococcus pyogenes <=>
(Gruppe A)
19,6
10,5
17,0
Streptococcus sp. 9960 (Gruppe D)
19,4
16,4
Diplococcus pneumoniae Park I
11,0
20,0
Weitere Ergebnisse aus Agar-Verdünnungsversuchen gehen aus der folgenden Tabelle VII für das Antibiotikum A-35512 Faktor B
Dihydrochlorid hervor, und darin sind die Minimalinhibierungskonzentrationen
(MIC-Werte) gegenüber mehreren Mikroorganismen aus der Gruppe A der Streptokokken sowie sowie gegenüber Diplococcus
pneumonia angeführt.
MIC (mcg/ml) Testorganismus A-35512 Faktor B
Streptococcus pyogenes C2O3 1
" " 10389 1
" " 12344 8
M " 12961 1
663-72 O,5
664-72 0,5
" " 665-72 1
13234 0,5
" " 19035 0,5
M6517 0,5
D27781 1
Diplococcus pneumoniae Park I 2
11 " Typ 14 2
Aus der folgenden Tabelle VIII gehen weitere bei der Untersuchung des Antibiotikums A-35512 Faktor B Dihydrochlorid
in Agar-Verdünnungsversuchen erhaltene Ergebnisse gegenüber mehreren Organismen aus der Gruppe D der Streptokokken hervor.
| Il | . D282 | MIC (mcg/ml) | |
| η | 9901 | A-35512 Faktor B | |
| η | 9913 | 2 | |
| Testorganismus | Il | 9933 | 2 |
| Streptococcus sp | Il | 9960 | 4 |
| Il | It | 12253F | 4 |
| Il | η | Shrigley | 4 |
| •1 | ■t | Mitis | 4 |
| η | ti | 238 709849/0908 | 4 |
| Il | SS992 | 4 | |
| Il | 2 | ||
| •ι | 4 | ||
| Il | |||
| η |
Andere bei Agar-Verdünnungsversuchen unter Verwendung des Mikroorganismus
A-35512 Faktor B Dihydrochlorid erhaltene Ergebnisse
gegenüber anderen grampositiven Organismen können der folgenden Tabelle IX entnommen werden.
MIC (mcg/ral) Testorganismus A-35512 Faktor B
Staphylococcus ausreus 3123 4
H43++ 4
3124++ 4
3126++ 2
3127++ 4
H57++ 2
3O74++ 4
313O+++ 4
3133+++ 2
3136+++ 2
3125+++ 4
Staphylococcus epidermis 3064 2
3078+ 2
Bacillus subtilis ATCC 66 33 2
Sarcina lutea PCI-1001-FDA 1
penicillin-G-suszeptibel
penicillin-G-resistent
penicillin-G-resistent
+penicillin-G-resistent; methicillinresistent
++++penicillin-G-resistent; methicillinresistent;
clindamycinresistent
++++penicillin-G-resistent; methicillinresistent;
clindamycinresistent
Die Antibiotika A-35512 hemmen ferner auch das Wachstum bestimmter
anaerober Bakterien. Die Wirksamkeit des Antibiotikums A-35512 Faktor B Dihydrochlorid gegenüber verschiedenen anaeroben Bakterien,
ermittelt nach dem Standard-Agar-Verdünnungsversuch, geht
aus der folgenden Tabelle X hervor.
709849/0908
Tabelle X
MIC (mcg/rol) Testorganismus A-35512 Faktor B
Actinomyces israelli 0,5
Clostridium perfringens . 2,0
Clostridium septicum 4,0
Eubacterium aerofaciens 2,0
Peptococcus asaccharolyticus 1,0
Peptococcus prevoti 2,0
Peptostreptococcus anaerobius 1,O
Peptostreptococcus intermedius 4,0
Propionibacterium acnes 0,5
Bacteroides fragilis ssp. fragilis 111 64,0
Fusobacterium necrophorum 8,0
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid hat sich in vivo auch gegenüber experimentell hervorgerufenen Bakterieninfektionen
als antimikrobiell wirksam erwiesen. Für diese Unersuchungen verabreicht man entsprechend infizierten Mäusen
subkutan zwei Dosen des Antibiotikums A-35512 Faktor B und bestimmt die hierdurch bedingte Wirksamkeit durch Messen der sogenannten
ED5Q-Werte /wirksame Dosis in mg/kg zum Schutz von
50 % der untersuchten Tiere, J. Bacteriol. 81, 233-235 (1961]_/.
Die dabei für das Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid erhaltenen ED- -Werte gehen aus der folgenden Tabelle XI hervor.
Tabelle XI
ED
Te s torgan i smu s 50 Infektion
Streptococcus pyogenes C 203 1,75 260 χ LD50
Diplococcus pneumoniae Park I 4,3 60,8 χ LD50(ip)
Staphylococcus aureus 3055 6,9 206 χ LD50(ip)
709849/0908
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid ergibt ferner
auch bei Meerschweinchen einen Schutz, die man mit dem anaeroben Clostridium chauvoei (der Ursache für Klauenseuche bei Rindern)
infiziert hat. Diese Untersuchungen werden nach der abgewandelten U.S.D.A. Methode zur Ermittlung der Stärke von Clostridium
chauvoei enthaltenden Produkten durchgeführt (SAM 200# U.S.
Department of Agriculture, Animal and Plant Health Inspection Service, Veterinary Services Laboratories, Arnes, Iowa 50010,
7. April 1975, unter 9 CF.R. 113.91). Die dabei erhaltenen
Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle XII hervor.
Infektion Prozentualer Behandlung tot/total Schutz
A-35512 Faktor B
10 mg/kg+ 0/10 100
A-35512 Faktor B
1 mg/kg+ 3/10 70
Infektionskontrolle 10/10 0
intramuskuläre Verabreichung
Die Wirksamkeit des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykon bei einem herkömmlichen Scheiben-Verdünnungsversuch (hierzu werden
6 mm große Bauschen in Lösungen getaucht, die pro Milliliter Lösung 1 Milligramm Wirkstoff enthalten, und dann auf mit den jeweils
zu untersuchenden Organismen beimpfte Agarplatten gegeben) geht aus der folgenden Tabelle XIII hervor. ··· .■
709849/0908
-rt
XIII
Staphylococcus aureus
Bacillus subtilis
Sarcina lutea
Bacillus subtilis+
Bacillus subtilis
Sarcina lutea
Bacillus subtilis+
Inhibierungszone (mm) A-35512 Faktor B Aglykon
(freie Base)
19 13 14 22
mit ernährungstechnisch begrenztem Agar
Aus der folgenden Tabelle XIV gehen Versuchswerte über die Minimalinhibierungskonzentrationen (MIC-Werte) hervor, mit
denen das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykonhydrochlorid gegenüber bestimmten Stämmen von Staphylococcus aureus wirksam
ist. Diese Werte sind durch Standard-Agar-Verdünnungsversuche ermittelt worden.
Staphylococcus aureus 3055
H29O+ V92+
» » V104+
307 4+H H43++
" V57++ H356+H
3130 3131
MIC (mgc/ml)
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,5
0,5
1,0
0,5
0,5
penicillin-G-suszeptibel
penicillin-G-resistent
penicillin-G-resistent; methicillinresistent
penicillin-G-resistent; methicillinresistent, clindamycinresistent
709849/0908
Weitere bei Agar-Verdünnungsversuchen unter Verwendung des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykonhydrochlorid gegenüber
der Gruppe D der Streptokokken erhaltene Versuche gehen aus der folgenden Tabelle XV hervor.
Streptococcus sp. Shrigley 1,0
Streptococcus sp. Mitis 1,0
Streptococcus sp. 12253F 1,0
Streptococcus sp. SS992 1,0
Streptococcus sp. 99 33 1 ,O
Streptococcus sp. 9913 1,0
Streptococcus sp. 282 1,0
Streptococcus sp. 238 1 ,0
Das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykon erweist sich auch in vivo als gegenüber experimentell hervorgerufenen Bakterieninfektionen
antibakteriell wirksam. Hierzu verabreicht man Mäusen mit den entsprechenden Infektionen subkutan zwei Dosen
des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykonhydrochlorid und bestimmt die dabei beobachtete Wirksamkeit durch die sogenannten
ED50-Werte. Die dabei für das Antibiotikum A-35512
Faktor B Aglykonhydrochlorid erhaltenen EDg_-Werte gehen aus
der folgenden Tabelle XVI hervor.
709849/0908
T a b e lie XVI
Testorqanismus
Streptococcus pyogenes C2O3
ED50 5,8
Infektion
χ LD50 (ip)
Streptococcus pneumoniae
Staphylococcus aureus 3055
O (O CD
7,0 1 ,04
374 χ LD50 (ip) 370 x LD50 (ip)
Die Antibiotika A-35512 sind verhältnismäßig nicht toxisch.
So liegt beispielsweise der LD_-Wert für das Antibiotikum
A-35512 Faktor A Dihydrochlorid bei subkutaner Verabreichung an ausgehungerte weibliche Cox- und Harlan-ICR-Mäuse bei
unter 8000 mg/kg. Der LD^-Wert für das Antibiotikum A-35512
Faktor B Dihydrochlorid an der Maus beträgt nach intraperi- tonealer Verabreichung etwa 1356 mg/kg und nach intravenöser
Verabreichung über 1000 und unter 1250 mg/kg. Sowohl das Anti biotikum A-35512 Faktor C Dihydrochlorid als auch das Antibioti
kum A-35512 Faktor E Hydrochlorid verfügen nach intraperitonealer Verabreichung an Mäuse über eine akute Toxizität von
über 300 mg/kg.
Eine weitere wichtige Eigenschaft des Antibiotikumgemisches
A-35512 und der entsprechenden Verbindungen ist ihre Fähigkeit zur Verbesserung der Futterverwertung bei Tieren. Diese
Fähigkeit zeigt sich anhand von Wiederkäuern mit entwickelter Pansenfunktion.
Die Wirksamkeit der Kohlehydratutilisation bei Wiederkäuern
läßt sich bekanntlich durch Behandlungen erhöhen, die die Pansenflora der Tiere eher zur Bildung von Propionatverbindungen
anregen als zur Bildung von Acetat- oder Butyratverbindungen. (Church et al. in "Digestive Physiology and
Nutrition of Ruminants", Band 2, 1971, Seiten 622 und 625).
Die Wirksamkeit für die Futterverwertung läßt sich durch in-vivo-Versuche
anhand entsprechender Rinder mit einer Magenfistula nach dem in US-PS 3 794 732 beschriebenen Verfahren (insbe
sondere Beispiel 8) bestimmen. Aus der folgenden Tabelle XVII gehen die bei derartigen Untersuchungen unter Verwendung des
Antibiotikums A-35512 Faktor B Dihydrochlorid erhaltenen Ergebnisse hervor, die die prozentualen Propionsäurekonzentrationen
im Rumen aus einem Mittel aus 5 Analysen während einer 21-tägigen Versuchsdauer darstellen.
709849/0908
Tabelle XVII
Mittlere molpro- Molprozentuale Zu-
Behand- Anzahl prozentuale Menge nähme gegenüber der
lung der Tiere Propionsäure Kontrolle
Kontrolle 5 19,3
A-35512 Faktor B
50 g/Tonne 5 26,0 6,7
Mit dem Antibiotikumgemisch A-35512 und den entsprechenden Verbindungen ergeben sich propionaterhöhende und somit futterverwertungsverbessernde
Wirkungen, wenn man diese Säugetieren oral in Mengen von etwa 0,15 bis 10,0 mg/kg und Tag verabreicht.
Die günstigsten Ergebnisse erhält man bei Verabreichungsmengen von etwa 1,0 bis 2,0 mg/kg und Tag. Eine
bevorzugte Methode zur Verabfolgung des Antibiotikumgemisches A-35512 oder der entsprechenden Verbindung erfolgt durch Vermischen
mit dem Tierfutter. Die vorliegenden Wirkstoffe lassen sich jedoch auch in anderer Weise verabreichen, beispielsweise
in Form von Tabletten, Tränken, Bolen oder Kapseln. Die Formulierung dieser verschiedenen Dosierungsformen läßt
sich in in der Tierarzneikunde üblicher Weise erreichen. Jede einzelne Dosierungseinheit soll dabei eine der jeweils geeigneten
Tagesdosis für das zu behandelnde Tier direkt entsprechende Menge an Antibiotikum A-35512 oder einer entsprechenden
Verbindung hiervon enthalten.
Das Antibiotikumgemisch A-35512 und die entsprechenden Verbindungen
eignen sich ferner auch als wachstumsfördernde Mittel bei Tieren. Die entsprechenden Untersuchungen unter Verwendung
von Brathühnchen ergeben bei einem Zusatz von 20 g Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid pro Tonne Futter
709843/0908
eine Gewichtszunahme und verbesserte Futterverwertung. Die bei entsprechenden Untersuchungen mit Tierbatterien mit jeweils
4 Gruppen aus jeweils 8 Tieren unter jeweiliger Wiederholung der einzelnen Versuche erhaltenen Ergebnisse gehen
aus der folgenden Tabell XVIII hervor.
709849/0908
Tabelle XVIII
Behandlung
Konz. (g/Tonne)
Gewichtszunahme (q)
Prozentuale Verbesserung gegenüber der Kontrolle
Futterverwertung
Prozentuale Verbesserung gegenüber der Kontrolle
Kontrolle
380
,850
to A-35512 cö Faktor B
20
394
3,68
,776
4,00
ro ro cn
Aus der folgenden Tabelle XIX gehen die bei Versuchen der obigen Art in Bodengehegeuntersuchungen unter Verwendung von
12 Gruppen aus jeweils 80 Tieren erhaltenen Ergebnisse hervor.
709849/0908
P = 0,05
Tabelle XIX
Behandlung
Konz. (g/Tonne)
Gewichtszunahme (g)
Prozentuale
Verbesserung
gegenüber der
Kontrolle
Verbesserung
gegenüber der
Kontrolle
Futterverwertung
Prozentuale Verbesserung gegenüber der Kontrolle
Kontrolle
1898
2,250
A-35512 Faktor B
20
195δ+
3,06
2,177"
2,81
-JHO-
Das Antibiotikumgemisch A-355512 und die entsprechenden Verbindungen
wirken bei Geflügel insbesondere dann wachstumsfordernd,
wenn man sie dem Futter der Tiere in Mengen von etwa 1 bis 100 g pro Tonne Futter zusetzt.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele weiter erläutert.
Beispiel 1 A. Schüttelflaschenfermentatlon des Antibiotikums A-35512
Man löst ein lyophilisiertes Plätzchen von Streptomyces candidus NRRL 8156 in 1 bis 2 ml sterilem Wasser. Mit dieser Lösung beimpft
man dann einen Bacto-Hefe-Malz-Extrakt-Schrägagar (ISP No. 2, Difco Laboratories, Detroit, Michigan).
Der inokulierte Schrägagar wird dann etwa 7 Tage bei einer Temperatur von 30 0C bebrütet. Die reife Schrägagarkultur
gewinnt man unter Verwendung von Wasser (2 ml) und durch Abkratzen mit einer sterilen Pipette zur Lockerung der Sporen.
Eine bestimmte Menge dieser Wassersuspension der Sporen (0,1 ml) verwendet man zur Beimpfung eines anderen Schrägagars
von ISP Nr. 2. Der hiermit beimpfte Schrägagar wird etwa 7 Tage bei 30 0C inkubiert. Die Gewinnung der reifen
Schrägagarkultur erfolgt unter Verwendung von Wasser (5 ml) und durch Abkratzen mit einer sterilen Pipette zum Lockern
der Sporen. Mit 2,5 ml der dabei erhaltenen Sporensuspension beimpft man dann 50 ml eines vegetativen Mediums
folgender Zusammensetzung:
Trypticase Sojabrühe 3O g
(Baltimore-Biological
Laboratories, Cockeysville, Md.)
Laboratories, Cockeysville, Md.)
Wasser (deionisiert) q. s. 1 Liter
709849/0908
272264S
Das inokulierte vegetative Medium bebrütet man anschließend in einem 250 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben bei einer Temperatur
von 30 0C über eine Zeitspanne von 48 Stunden auf einem Rotationsschüttler, der unter einem Bogendurchmesser von etwa 5 cm bei
einer Rotationsgeschwindigkeit von 2 50 Umdrehung pro Minute betrieben wird.
Mit dem auf diese Weise erhaltenen inkubierten vegetativen Medium (0,5 ml) beimpft man dann 50 ml eines Produktionsmediums
folgender Zusammensetzung:
| Bestandteile | Menge (g/l) |
| Tapioca-Dextrin | 25,0 |
| Glucose | 10,0 |
| NH4NO3 | 2,5 |
| KCl | 1,5 |
| MgSO4 | 1,1 |
| FeCl2.4H2O | 0,03 |
| ZnCl2 | 0,03 |
| KH2PO4 | 0,1 |
| L-Glutaminsäure | 1,0 |
| DL-Citrullin | 0,1 |
| CaCO3 | 5,0 |
| Deionisiertes Wasser | q.s. 1 Liter |
Das in obiger Weise hergestellte inokulierte Produktionsmedium bebrütet man in einem 250 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben bei
einer Temperatur von 32 0C 8 bis 10 Tage auf einem Rotationsschüttler, der bei einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 25O Umfrehungen
pro Minute unter einem Bogendurchmesser von etwa 5 cm rotiert.
7D98C9/0908
B. Tankfermentation zur Gewinnung des Antibiotikums A-35512
Zur Bildung eines größeren Volumens der Impfkultur verwendet
man 20 ml des oben beschriebenen inkubierten Mediums zum Animpfen von 4OO ml eines vegetativen Mediums der zweiten Stufe,
das die gleiche Zusammensetzung wie das vegetative Medium der ersten Stufe besitzt. Dieses angeimpfte vegetative Medium
der zweiten Stufe inkubiert man 24 Stunden bei einer Temperatur von 32 0C in einem 2 1 fassenden Kolben auf einem Rotationsschüttler,
der sich unter einem Bogendurchmesser von etwa 5 cm mit einer Geschwindigkeit von 250 Umdrehungen pro
Minute bewegt.
Das auf diese Weise hergestellte inkubierte vegetative Medium der zweiten Stufe (800 ml) verwendet man zur Beimpfung von
100 1 sterilem Produktionsmedium. Das inokulierte Produktionsmedium läßt man in einem 165 1 fassenden Fermentationstank
etwa 8 bis 10 Tage bei 32 0C fermentieren. Das Fermentationsmedium wird durch Einleiten steriler Luft mit einer Geschwindigkeit
von 0,25 V/V/M belüftet und mit herkömmlichen Rührern bei einer Geschwindigkeit von 200 Umdrehungen pro Minute gerührt.
Das nach Beispiel 1, Abschnitt A, hergestellte inkubierte
vegetative Medium läßt sich gegebenenfalls auch bis zu einer späteren Verwendung aufheben, indem man es in folgender Weise
in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff hält.
In ein kleines (13 χ 100 mm messendes) sterilisiertes Röhrchen mit Schraubverschluß gibt man 2 ml einer Suspension
folgender Zusammensetzung:
709849/0908
rt -
Bestandteile
Glycerin
Lactose
Wasser (deionisiert)
Die auf diese Weise erhaltene Suspension versetzt man dann mit 2 ml eines in obiger Weise hergestellten und über eine
Zeitspanne von 48 Stunden inkubierten vegetativen Mediums. Nach entsprechendem Vermischen friert man die Lösung ein
und hebt sie in der Gasphase eines Tanks mit flüssigem Stickstoff auf.
Zur Verwendung des auf diese Weise gelagerten vegetativen Mediums für eine Schüttelflaschen- oder Tankfermentation
gibt man das in obiger Weise bearbeitete Röhrchen zum Auftauen in ein Wasserbad mit einer Temperatur von 43 0C. Mit
einem Teil der dabei erhaltenen aufgetauten Lösung (1 ml) beimpft man dann 50 ml eines vegetativen Mediums der gleichen
Zusammensetzung, wie sie in Beispiel 1, Abschnitt A, beschrieben ist. Das inokulierte vegetative Medium verwendet man wie
in Beispiel 1 beschrieben entweder zur Schüttelflaschenfermentation
oder zur Bildung einer größeren Menge an Inokulum für eine Tankfermentation.
Das in Beispiel 1 beschriebene Fermentationsverfahren wird unter Verwendung eines Schüttelflaschen/Tankproduktionsmediums
folgender Zusammensetzung wiederholt:
709849/0908
| 2722645 | Menge (g/l) | |
| Bestandteile | 75,0 | |
| Tapioca-Dextrin | 40,0 | |
| Melasse | 15,0 | |
| lösliches Fleischpepton | 0,5 | |
| MgSO4.7H2O | 2,0 | |
| CaCO3 | σ. s. 1 Liter | |
| Wasser |
Beispiel 4 Abtrennung des Antibiotikumgemisches A-35512
Die in Beispiel 1 beschriebene gesamte FermentationsbrUhe
(946 1) filtriert man unter Verwendung einer Diatomeenerde-Filterhilfe (Hyflo Super-cel, Johns-Manville Products
Corp.) beim jeweiligen pH-Wert der BrUhe (pH 6,8 bis 7,2). Das dabei erhaltene klare Filtrat schickt man dann mit
einer Geschwindigkeit von 150 ml pro Minute durch eine Säule,
die 10 ml polymeres Adsorbens (AmberIite XAD-4, Rohm und Haas Co.)
pro 100 ml Brühenfiltrat enthält. Die hierbei anfallenden Fraktionen
werden unter Einsatz des herkömmlichen Scheibenversuchs gegenüber Sarcina lutea bezüglich ihrer biologischen Wirksamkeit
überwacht. Der biologisch unwirksame Abstrom wird verworfen. Die Säule wäscht man mit Wasser (1/8 des Brühenvolumens)
mit einer Geschwindigkeit von 150 ml pro Minute. Das inaktive Waschwasser wird ebenfalls verworfen.
Im Anschluß daran eluiert man die Säule unter Verwendung einer 50-prozentigen wässrigen Methanollösung (600 1) mit einer Geschwindigkeit
von 200 ml pro Minute. Sodann konzentriert man das dabei erhaltene Eluat, das das Antibioticumgemisch
A-35512 enthält, unter Vakuum auf ein Volumen von 15 1,
wodurch sich etwa 200 g Antibiotikum A-35512 pro 1 ergeben.
7098A9/0908
Beispiel 5 Isolierung der Faktoren des Antlbiotlkumgemlsches A-35512
Das nach Beispiel 4 erhaltene Antibiotikumgemisch A-35512 (etwa 3000 g, gelöst in 15 1 Methanol) chromatographiert man
über eine Polyamidsäule (Woelm, 1OO Liter). Die Säule wird
mit deionisiertem Wasser und einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 80 bis 120 ml pro Minute eluiert.
Die überwachung der einzelnen Fraktionen erfolgt durch Cellulosedünnschichtchromatographie
oder Papierchromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus n-Butanol, Pyridin,
Essigsäure und Wasser (15:10:3:12) sowie durch Bioautographie mit Sarcina lutea.
Die ersten 100 1 Eluat werden verworfen. Sodann erhöht man die
Strömungsgeschwindigkeit auf etwa 160 bis 200 ml pro Minute und sammelt Fraktionen von jeweils 12 1. Auf diese Weise werden
insgesamt 12 Fraktionen gesammelt.
An diesem Punkt ändert man das zum Eluieren verwendete Lösungsmittel
in folgender Weise in einen Gradienten aus Wasser und Methanol:
Ein Behälter mit 360 1 Methanol wird in einen Behälter mit 120 1 Wasser gehoben. Die im Wasserbehälter befindliche Mischlösung
wird gerührt und dann auf die Säule aufgegeben.
Es werden 24 Fraktionen (jeweils 24 1) bei einer Strömungsgeschwindigkeit
von 200 bis 300 ml pro Minute gesammelt.
Auf Basis der bei einer Bioautographie erhaltenen Ergebnisse faßt man Gruppen entsprechender Fraktionen zusammen und dampft
diese dann unter Vakuum zur Trockne ein, wodurch man das Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid und die folgenden
angereicherten Gemische von Faktoren erhält:
709849/0908
3a
| Fraktionen |
Volumen
(Liter) |
Faktoren | Gewicht |
| 1-10 | 120 | A+H | 192 g |
| 11-24 | 216 | B | 269 g |
| 25-31 | 168 | B+C | 590 g |
| 32-44 | 312 | C,E,F,G | 224 g |
Beispiel 6 Reinigung des Antibiotikums A-35512 Faktor B
Das nach Beispiel 5 erhaltene teilweise gereinigte Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid (400 g) löst man in 1,2 1
50-prozentigem wässrigem Methanol und chromatographiert die dabei erhaltene Lösung dann in folgender Weise über einer mit
Aluminiumoxid gefüllten Säule:
Man rührt saures Aluminiumoxid (10 kg, M. Woelm) in eine 50-prozentige
wässrige Methanollösung. Sodann läßt man das Gemisch stehen, dekantiert die überstehende Lösung und verwirft sie.
Das dabei erhaltene Aluminiumoxid verrüht man dann mit 50-prozentigem wässrigem Methanol und bepackt damit eine Säule
mit einem Durchmesser von 13,5 cm. Im Anschluß daran wäscht man die mit Aluminiumoxid gefüllte Säule solange mit 50-prozentigem
wässrigem Methanol, bis der Säulenabstrom klar ist.
Die mit obigem Absorbens gefüllte Säule eluiert man unter Verwendung
von 50-prozentigem wässrigem Methanol bei einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 8 bis 10 ml pro Minute unter
Auffangen von Fraktionen mit einem Volumen von etwa 240 bis 300 ml. Die einzelnen Fraktionen werden wie in Beispiel 5 be-
709849/0908
schrieben durch Dünnschichtbioautographie überwacht. Auf Basis der dabei erhaltenen Werte erhält man durch Vereinigen folgender
Fraktionen gereinigtes Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid:
Fraktionen Gewicht
| 17-21 | 9,6 g |
| 22-29 | 72,0 g |
| 30-37 | 117,0 g |
Jede dieser Fraktionen kristallisiert man aus einer konzentrierten
50-prozentigen wässrigen Methanollösung bei einer Temperatur von 4 0C. Das auf diese Weise erhaltene gereinigte Antibiotikum
A-35512 Faktor B Dihydrochlorid enthält etwa 4,6 % Chlor. Eine Lösung des Antibiotikums A-35512 Faktor B Dihydrochlorid
in 66-prozentigem wässrigem Dimethylformamid hat einen pH-Wert von etwa 6,5.
Faktor B
Man löst wie in Beispiel 6 hergestelltes gereinigtes Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid (1 g) in Wasser (40 ml)
und schickt diese Lösung unter einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,5 ml pro Minute durch eine mit einem Ionenaustauscher
gefüllte 2,5 x 18 cm messende Säule (Bio-Rad AG3-4X, in der OH Form) die man mit deionisiertem Wasser eluiert. Das erste
Eluat (5 ml) wird verworfen. Das sich daran anschließende Eluat
(50 ml) dampft man unter Vakuum zur Trockne ein, wodurch man 0,76 g eines an ionischem Chlor freien Antibiotikums A-35512
Faktor B in Form eines weißen Pulvers erhält, das etwa 1,59 %
709849/0908
3t
Chlor enthält. Eine Lösung dieses an ionischem Chlor freien Antibiotikums A-35512 Faktor B in 66-prozentigem wässrigem
Dimethylformamid hat einen pH-Wert von 9,13.
Beispiel 8 Reinigung des Antibiotikums A-35512 Faktor A
Nach Beispiel 5 (Fraktionen 1 bis 10) erhaltenes teilweise gereinigtes
Antibiotikum A-35512 Faktor A Dihydrochlorid (1 g) löst man in 50-prozentigem wässrigem Methanol (5 ml). Die so
erhaltene Lösung chromatographiert man dann über eine mit saurem Aluminiumoxid (M. Woelm) gefüllte und 3 χ 16 cm messende
Säule, die wie in Beispiel 5 beschrieben zugerichtet wird. Die Eluierung der Säule erfolgt mit 50-prozentigem wässrigem Methanol
unter einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,5 ml pro Minute. Es werden jeweils Fraktionen mit einem Volumen von 5 ml
gesammelt. Alle Fraktionen analysiert man durch Dünnschichtbioautographie nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren.
Auf Basis dieser Untersuchungen vereinigt man die Fraktionen 7 bis 15, konzentriert das Ganze unter vermindertem Druck auf
ein geringes Volumen und lyophilisiert das dabei erhaltene Material anschließend unter Bildung von 0,3 g Antibiotikum
A-35512 Faktor A Dihydrochlorid (Chlorgehalt = 4,71 %).
Herstellung von an ionischem Chlor freien Antibiotikum A-35512
Faktor A
Man löst ein nach Beispiel 8 hergestelltes Antinbiotikum A-35512 Faktor A Dihydrochlorid (200 mg) in Wasser (10 ml)
und schickt die so erhaltene Lösung dann unter einer Strömungs-
709849/0908
geschwindigkeit von 0,5 ml pro Minute durch eine mit Ionenaustauscherharz
gefüllte und 1,5 χ 10 cm messende Säule (Bio-Rad AG3-4X, in der OH Form), wobei man mit deonisiertem
Wasser eluiert. Das am Anfang kommende Eluat (10 ml) wird verworfen. Das sich daran anschließende Eluat (20 ml) konzentriert
man unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen und lyophilisiert das Ganze dann unter Bildung von 115 mg
an ionischem Chlor freiem Antibiotikum A-35512 Faktor A.
Beispiel 10 Reinigung des Antibiotikums A-35512 Faktor C
Man löst ein nach Beispiel 5 (Fraktionen 25 bis 31) erhaltenes teilweise gereinigtes Antibiotikum A-35512 Faktor C Dihydrochlorid
(15 g) in deionisiertem Wasser (40 ml). Die auf diese Weise erhaltene Lösung gibt man dann auf eine mit Polyamid
gefüllte und 4 χ 115 cm messende Säule (MN, mit einer Korngröße
von unter 0,07 mm von Brinkman Instruments, Inc.), die man in Wasser hergestellt und damit über Nacht gewaschen hat. Die
Säule wird unter Verwendung von deionisiertem Wasser bei einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 3 ml pro Minute eluiert. Das
erste Eluat (250 ml) wird verworfen. Im Anschluß daran sammelt man Fraktionen mit einem Volumen von jeweils 24 ml.
Die einzelnen Fraktionen werden durch dünnschichtchromatographlsche
Bioautographie überwacht. Hierzu arbeitet man mit Cellulosedünnschichtchomatographierplatten (auf Aluminiumfolien,
E. Merck, Deutschland), unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems
aus see.-Butanol, Pyridin, Essigsäure und
Wasser (10:10:3:8) und Einsatz von Bacillus subtilis als Detektionsorganismus. Auf Basis der bei der Dünnschichtchromatographie
erhaltenen Ergebnisse vereinigt man die Fraktionen 1 bis 33, konzentriert sie unter Vakuum auf ein Volumen von 150 ml
und lyophilisiert sie anschließend.
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-vf-
Unter Anwendung der gleichen Bedingungen chromatographiert man
zwei weitere Mengen von teilweise gereinigtem Antibiotikum A-35512 Faktor C Dihydrochlorid. Auch hier vereinigt man wiederum
die Fraktionen 1 bis 33, konzentriert sie anschließend unter Vakuum auf ein Volumen von 150 ml und lyophilisiert
das Ganze abschließend. Die drei dabei aus den drei Säulen erhaltenen lyophilisierten Proben werden vereinigt, wodurch man
12,3 g teilweise gereinigtes Antibiotikum A-35512 Faktor C Dihydrochlorid erhält.
Zur weiteren chromatographischen Reinigung gibt man das so erhaltene
Antibiotikum A-35512 Faktor C Dihydrochlorid in der oben beschriebenen Weise auf eine andere polyamidgefüllte Säule
auf/ wobei man jedoch hier Fraktionen mit einem Volumen von 15 ml bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml pro Minute
auffängt. Die einzelnen Fraktionen werden ebenfalls wiederum durch dünnschichtchromatographische Bioautographie überwacht.
Die Fraktionen 36 bis 58 werden vereinigt, unter Vakuum auf ein Volumen von 150 ml eingeengt und abschließend lyophilisiert,
wodurch man 5,3 g weiter gereinigtes Antibiotikum A-35512 Faktor C Dihydrochlorid erhält.
Zur Endreinigung chromatographiert man das Antibiotikum A-35512 Faktor C Dihydrochlorid unter Verwendung einer mit
saurem Aluminiumoxid (WoeIm) gefüllten und 5 χ 41 cm messenden
Säule. Die Säule wird nach entsprechendem Bepacken mit 50-prozentigem wässrigem Methanol gewaschen. Nach Klarwerden des
zum Waschen verwendeten Methanols gibt man auf die Säule das Antibiotikum A-35512 Faktor C auf (und zwar 5,3 g in Form
einer Lösung in 30 ml 50-prozentigem wässrigem Methanol). Anschließend eluiert man die Säule mit 50-prozentigem wässrigem
Methanol unter einer Strömungsgeschwindigkeit'von 1 ml
pro Minute. Es werden Fraktionen mit einem Volumen von jeweils 12 ml gesammelt und wie oben beschrieben durch
dünnschichtchromatographische Bioautographie überwacht. Die Fraktionen 22 bis 74 werden vereinigt, unter Vakuum auf
ein Volumen von 250 ml eingeengt und nachfolgend lyophilisiert, wodurch man 3,86 g Antibiotikum A-35512 Faktor C Dihydrochlorid
erhält. 7 0 9849/090 8
Beispiel 11
Faktor C
Das wie in Beispiel 10 beschrieben hergestellte Antibiotikum A-35512 Faktor C Dihydrochlorid (200 mg) chromatographiert man
über ein schwach basisches Ionenaustauscherharz nach dem in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren, wodurch man 156 mg an
ionischem Chlor freies Antibiotikum A-35512 Faktor C erhält. Dieses an ionischem Chlor freie Antibiotikum A-35512 Faktor C
enthält etwa 1,90 % Chlor.
Beispiel 12 Reinigung des Antibiotikums A-35512 Faktor E
Man löst nach Beispiel 5 (Fraktionen 32 bis 44) erhaltenes teilweise gereinigtes Antibiotikum A-35512 Faktor E Hydrochlorid
(8,1 g) in deionisiertem Wasser (40 ml). Die auf diese Weise erhaltene Lösung gibt man dann auf eine mit Polyamid
(MN, <Co,O7 mm, Brinkman Instruments, Inc.) gefüllte und
5 χ 110 cm messende Säule auf, wobei man dieses Material in Wasser herstellt und mit Wasser über Nacht wäscht. Anschließend
eluiert man die Säule mit deinonisiertem Wasser bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 ml pro 15 Minuten,
wobei man Fraktionen mit einem Volumen von 20 ml auffängt. Bei der Fraktion 118 ändert man das zum Eluieren verwendete
Lösungsmittel in 50-prozentiges wässriges Methanol. Die einzelnen Fraktionen überwacht man durch dünnschichtchromatographische
Bioautgraphie wie in Beispiel 10 beschrieben.
709849/0908
- ri -
Die Fraktionen 148 bis 195 enthalten das Antibiotikum A-35512
Faktor E. Diese Fraktionen werden vereinigt, unter verringertem Druck auf ein Volumen von 150 ml eingeengt und anschließend
lyophilisiert, wodurch man 2,7 g Antibiotikum A-35512 Faktor E Hydrochlorid erhält.
Eine Teilmenge des in obiger Weise hergestellten teilweise gereinigten
Antibiotikums A-35512 Faktor E Hydrochlorid (615 mg) löst man in 50-prozentigem wässrigem Methanol (5 ml) und gibt
die so erhaltene Lösung dann auf eine 1,5 χ 50 cm messende
Säule auf, die mit saurem Aluminiumoxid (Woelm) gefüllt ist, das man in 50-prozentigem wässrigem Methanol zubereitet und damit
so lange wäscht, bis der Abstrom klar ist. Anschließend eluiert
man die Säule mit 50-prozentigem wässrigem Methanol unter einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml pro Minute, wobei man Fraktionen
mit einem Volumen von jeweils 10 ml auffängt. Die einzelnen Fraktionen werden ebenfalls wieder durch dünnschichtchromatographische
Bioautographie überwacht. Die Fraktionen 5 bis 8 werden vereinigt und unter verringertem Druck auf
ein Volumen von etwa 10 ml eingeengt. Nach Zusatz von deionisiertem Wasser (etwa 50 ml) lyophilisiert man die dabei erhaltene
Lösung, wodurch man zu 480 mg Antibiotikum A-35512 Faktor E Hydrochlorid gelangt.
A-35512 Faktor E
Das wie in Beispiel 12 beschrieben hergestellte Antibiotikum A-35512 Faktor E Hydrochlorid (200 mg) chromatographiert man
nach dem in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren über ein schwach basisches lonenaustauscherharz, wodurch man 170 mg an ionischem
Chlor freies Antibiotikum A-35512 Faktor E erhält. Die-
709849/0908
- Τ3 -
ses an ionischem Chlor freie Antibiotikum A-35512 Faktor E
enthält etwa 1,72 % Chlor.
Beispiel 14 Reinigung des Antibiotikums A-35512, Faktor H
Man löst wie in Beispiel 5 (Fraktionen 1 bis 10) hergestelltes teilweise gereinigtes Antibiotikum A-35512 Faktor H Hydrochlorid
(30 g) in einer minimalen Menge eines Gemisches aus Methanol und Wasser (7:3). Die auf diese Weise erhaltene
Lösung adsorbiert man hierauf an eine mit saurem Aluminiumoxid gefüllte Säule (3 χ 60 cm, Woelm, in Methanol gepackt
und mit Methanol bis zum Klarwerden des Abstroms eluiert). Anschließend eluiert man die Säule mit Methanol unter einer
Strömungsgeschwindigkeit von 4 ml pro Minute. Man fängt Fraktionen mit einem Volumen von jeweils 24 ml auf. Bei der Fraktion
59 verändert man das zum Eluieren verwendete Lösungsmittel in ein Gemisch aus Methanol und Wasser (1:1).
Die einzelnen Fraktionen überwacht man durch Dünnschichtchromatographie
unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus Chloroform, Methanol und Ammoniumhydroxid (2:3:1) sowie durch
Bioautographie mit Bacillus subtllis bei alkalischem pH-Wert.
Die Fraktionen 51 bis 118 werden vereinigt und unter Vakuum
eingedampft, wodurch man 6,4 g gereinigtes Antibiotikum A-35512 Faktor H Hydrochlorid erhält.
709849/0908
AOO
Beispiel 15
Faktor H
Man chromatographiert ein nach Beispiel 14 hergestelltes Antibiotikum
A-35512 Faktor H Hydrochlorid (200 mg) über ein schwach basisches Ionenaustauscherharz nach dem in Beispiel 9 beschriebenen
Verfahren, wodurch man 143 mg an ionischem Chlor freies Antibiotikum A-35512 Faktor H erhält. Dieses an ionischem Chlor
freie Antibiotikum A-35512 Faktor H enthält etwa 1,59 % Chlor.
Beispiel 16 Herstellung von Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykon
Man löst nach Beispiel 6 hergestelltes Antibiotikum A-35512 Faktor B Dihydrochlorid (5,0 g) in Wasser (200 ml). Die auf diese
Weise erhaltene Lösung säuert man dann mit 4 normaler Chlorwasserstoff säure (14 ml) an, worauf man diese Lösung 2 Stunden
auf Rückflußtemperatur erhitzt. Sodann kühlt man die Lösung ab und dampft sie unter Vakuum auf etwa dreiviertel ihres ursprünglichen
Volumens ein. Die so erhaltene Lösung versetzt man hierauf solange tropfenweise mit Chlorwasserstoffsäure
(6 normal), bis die Ausfällung beendet ist. Der dabei erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet, wodurch man zu
3,56 g rohem Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykonhydrochlorid
gelangt.
Das oben erhaltene Filtrat wird eingeengt und analysiert. Es enthält Glucose, Fructose, Mannose und Rhamnose.
709849/0908
Das in obiger Weise hergestellte rohe Antibiotikum A-35512
Faktor B Aglykon reinigt man chromatographisch über mit Säure gewaschenes Aluminiumoxid (WoeIm, Sorte I) unter Verwendung
eines Lösungsmittelgemisches aus Wasser und Methanol (1:9). Die Elution der Säule überwacht man durch Cellulosedünnschichtchromatographie.
Die das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykon enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unter
Vakuum eingedampft, wodurch man zu 398 mg teilweise gereinigtem Produkt gelangt. Ein Vergleich dieser dünnschichtchromatographischen
Ergebnisse unter Besprühen mit Ninhydrin zur Detektion bestätigt, daß immer noch nicht bioaktive Verunreinigungen
vorhanden sind.
Eine Teilmenge dieses teilweise gereinigten Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykon (100 mg) reinigt man daher chromatographisch
über Polyamid (4 g, Machery, Nagel & Co. MN-SC-6, Lieferant Brinkman Instruments Co.;^0,07 mm) weiter, wobei
man mit Wasser eluiert. Auch diese Säule überwacht man wiederum in der bereits oben beschriebenen Weise durch Cellulosedünnschichtchromatographie.
Die das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykon enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und dann
lyophilisiert, wodurch man zu 64 mg gereinigtem Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykonhydrochlorid gelangt. (Gesamtausbeute
auf das als Ausgangsmaterial verwendete Abtibiotikum A-35512 Faktor B bezogen = 5,08 %).
Beispiel 17
Aglykon
Man löst wie in Beispiel 16 hergestelltes Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykonhydrochlorid (90 mg) in 30 ml eines Gemisches
aus Methanol und Wasser (1:1). Die so erhaltene Lösung neu-
709849/0908
AOt
tralisiert man dann mit einem Ionenaustauscherharz ^3,5 ml,
Bio-Rad AG-3-4X (OH~j_/. Anschließend rührt man die Lösung
15 Minuten bei Raumtemperatur, worauf man das Harz abfiltriert. Sodann engt man das Filtrat unter Vakuum und Einhalten einer
Temperatur von weniger als 60 0C auf etwa die Hälfte seines
Volumens ein und lyophilisiert das Ganze nachfolgend, wodurch man zu 68 mg der freien Base des Antibiotikums A-35512
Faktor B Aglykon gelangt.
709849/0908
Leerseite
A'03
Claims (14)
1. Antibiotikumgemisch A-35512 mit den Faktoren A, B, C, E,
F, G und H, Antibiotikum A-35512 Faktor A, Antibiotikum A-35512 Faktor B, Antibiotikum A-35512 Faktor C, Antibiotikum A-35512
Faktor E, Antibiotikum A-35512 Faktor F, Antibiotikum A-35512 Faktor G und Antibiotikum A-35512 Faktor H, Antibiotikum A-35512
Faktor B Aglykon und die pharmazeutisch unbedenklichen Säureadditionssalze der Faktoren A, B, C, E und H sowie von Faktor B
Aglykon.
f
2. Antibiotikum A-35512 Faktor A in Form einer weißen amorphen
basischen Verbindung mit einer Elementarzusairanensetzung von etwa
54,29 % Kohlenstoff, 5,19 % Wasserstoff, 5,58 % Stickstoff, 33,76 % Sauerstoff und 1,69 % Chlor, dessen Dihydrochlorid eine
weiße amorphe Verbindung ist, die über folgende Eigenschaften verfügt:
a) eine Elementarzusairanensetzung von etwa 51,03 % Kohlenstoff,
5,10 % Wasserstoff, 4,75 % Stickstoff, 34,2O % Sauerstoff und 4,80 % Chlor,
b) ein Infrarotabsorptionsspektrum in Form eines KBr-Preßlings
mit signifikanten Absorptionsmaxima bei folgenden Frequenzen
(cm"1): 34O5 (stark), 33OO (Schulter), 2950 (schwach), 1750
(schwach), 1670 (stark), 1625 (Schulter), 16O2 (stark), 1520 (stark), 1470 (schwach), 1440 (schwach), 1405 (schwach),
1345 (Schulter), 1312 (mittel), 1225 (mittel), 1180 (schwach), 1130 (schwach), 1080 (stark) und 1020 (Schulter),
c) Ultraviolettabsorptionsspektren in saurem und neutralem Methanol
mit einem Absorptionsmaximum bei 282 nm (epsilon = 1170O), einem Absorptionsmaximum in basischem Methanol bei 292 nm
(epsilon = 14OOO) sowie einer .Endabsorption bei 225 nm,
7Ü9.S49/OÖ08
ORIQMAL IN6PECTED
d) ein durch Titration bestimmtes Molekulargewicht von etwa
2106,
e) vier titrierbare Gruppen in 66-prozentigem wäßrigem Dimethylformamid
mit pK -Werten von etwa 7,35, 9,09, 10,49 und 12,44,
f) folgende spezifische Drehwerte:
/p5 = -100 (c = 1, H3O)
/alpha/^5 = -400 (c = 1, H3O),
g) eine Löslichkeit in Wasser, eine teilweise Löslichkeit in Methanol und Äthanol und eine Unlöslichkeit in Benzol, Chloroform,
Aceton, Diäthyläther, Äthylacetat, Toluol, Hexan, Acetonitril und Dioxan,
h) eine die Gegenwart von wenigstens fünf Aminosäureresten, von denen einer Glycin ist, zeigende Aminosäureanalyse,
i) einen R,-Wert von etwa 0,21 bei einer Papierchromatographie
in einem Lösungsmittelsystem aus 1-Butanol, Pyridin, Essigsäure
und Wasser (15:10:3:12) unter Verwendung von Sarcina lutea als Detektionsorganismus,
j) ein C magnetisches Kernresonanzspektrum in D3O mit folgenden
Charakteristiken:
No. ppm Höhe (%)
3 175,3 0,8
4 173,0 2,1
5 172,1 2,O
6 171,4 1,5
7 170,9 2,7
8 170,5 2,3
9 -ft^S" 1,6
703849/0908
- ja -
709849/0908
No. ppm Höhe (%)
39 69,6 2,8
40 67,4 90,9+
41 65,4 1,7
42 61,7 3,1
43 56,7 ^ 1,7
44 55,5 1,3
45 54,7 0,8
46 24,6 0,9
47 19,1 1,7
48 17,9 2,0
49 17,2 1,9
50 16,7 3,2
51 16,2 3,0
Dioxan als Standard
k) eine Stabilität in wäßrigen Lösungen mit pH-Werten von etwa 3 bis etwa 10 von 72 Stunden,
sowie die pharmazeutisch unbedenklichen Säureadditpnssalze des Antibiotikums A-35512 Faktor A.
3. Antibiotikum A-35512 Faktor B in Form einer weißen amorphen basischen Verbindung, die über folgende Eigenschaften
verfügt:
a) eine Elementarzusammensetzung von etwa 53,97 % Kohlenstoff, 4,75 % Wasserstoff, 5,25 % Stickstoff, 34,29 Sauerstoff und
1,59 % Chlor,
709849/Q908
b) Ultraviolettabsorptionsspektren in saurem und neutralem Methanol mit einem Absorptionsmaximum bei 282 nm (epsilon
= 15000) und einem Absorptionsmaximum in basischem Methanol bei 292 nm (epsilon = 16000),
c) ein durch Titration bestimmtes Molekulargewicht von etwa
2143,
d) vier titrierbare Gruppen in 66-prozentigem wäßrigem Dimethylformamid
mit pK -Werten von etwa 7,15, 8,81, 10,2O
el
und 12,00,
e) die folgenden spezifischen Drehwerte:
/alpha/" = -123° (c = 1, H2O)
^ = -446° (c = 1, H3O),
f) die folgende empirische Formel:
C97-99H1O1-1O5N8-9°46-48Cl'
wobei das Dihydrochlorid dieses Antibiotikums eine weiße hygroskopische kristalline Verbindung (aus 50-prozentigem
wäßrigem Methanol) darstellt, die über folgende Eigenschaften verfügt:
a1) eine Elementarzusammensetzung von etwa 52,57 % Kohlenstoff,
4,80 % Wasserstoff, 5,66 % Stickstoff, 32,86 % Sauerstoff und 4,51 % Chlor,
b1) ein Infrarotabsorptionsspektrum in Form von KBr-Preßlingen
mit signifikanten Absorptionsmaxima bei folgenden Frequenzen (cm"1): 3420 (stark), 3300 (Schulter), 2950 (schwach),
1752 (schwach), 1675 (stark), 1630 (Schulter), 1605 (stark), 1520 (stark), 1470 (schwach), 1440 (schwach), 1410 (schwach),
709849/0908
1345 (Schulter), 1312 (mittel), 1225 (mittel), 1180 (schwach), 1135 (schwach), 1080 (stark) und 1020 (schwach),
c1) Ultraviolettabsorptionsspektren in saurem und neutralem Methanol
mit einem Absorptionsmaximum bei 282 nm (epsilon = 12000), einem Absorptionsmaximum in basischem Methanol bei 292 nm
(epsilon = 14000) und mit einer Endabsorption bei 225 nm,
d') ein durch Tiration bestimmtes Molekulargewicht von etwa 2027,
e1) vier titrierbare Gruppen in 66-prozentigem wäßrigem Dimethylformamid
mit pK -Werten von etwa 7,15, 8,87, 10,30 und 12,10,
el
f) die folgenden spezifischen Drehwerte:
/alpha*5 = -128° (c = 1, H2O)
^ = -475° (c = 1, H2O) ,
g1) eine Löslichkeit in Wasser, eine teilweise Löslichkeit in
Methanol und Äthanol und eine Unlöslichkeit in Benzol, Chloroform, Aceton, Diäthyläther, Äthylacetat, Toluol, Hexan,
Acetonitril und Dioxan,
h1) eine die Gegenwart von wenigstens 5 Aminosäureresten, von
denen einer Glycin ist, zeigende Aminosäureanalyse,
i1) einen R~-Wert von etwa 0,34 bei einer Papierchromatographie
in einem Lösungsmittelsystem aus 1-Butanol, Pyridin, Essigsäure
und Wasser (15:10:3:12) unter Verwendung von Sarcina lutea als Detektionsorganismus,
j1) ein C magnetisches Kernresonanzspektrum in D3O mit folgen
den Charakteristiken:
709849/0908
No.
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 . 17 18 19 2O 21
22 23 24 25 26 27 28
7
709040/0908
No. ppm Höhe (%)
29 124,2 5f6
30 122,4 1,4
31 122,0 4,4
32 120,7 3,3
33 116,5 2,7
34 109,5 0,8
35 108,2 1,1
36 107,7 2,7
37 104,5 1,7
38 101,8 2,9
39 1OO,9 1,6
40 98,3 1,0
41 76,9 1,2
42 76,1 1,8
43 74,1 2,0
44 73,5 2,7
45 72,7 2,4
46 72,3 4,0
47 71,0 7,1
48 70,3 2,5
49 69,7 2,5
50 67,4 74,7+
51 64,6 1,2
52 62,0 1,5
53 58,0 1,3
54 56,8 1,7
709849/0908
No. ppm Höhe (%)
55 55,4 3,9
56 54,3 2,5
57 24,5 2,0
58 17,9 3,0
59 17,2 2,O
60 16,3 2,5
Dioxan als Standard
k1) eine Stabilität in wäßrigen Lösungen mit pH-Werten von
etwa 3 bis etwa 10 von bis zu 72 Stunden,
I1) ein Pulver-Röntgenbeugungsdiagramm (Cu -Strahlung,
lambda = 1,54O5, Nickelfilter) mit folgenden Interplanarabständen
(d) in Angström:
d relative Intensität
17,15 100
12,9O 80
10,85 70
9,25 70
8,87 60
8,22 50 7,86 .50
6,93 40
6,2O 40
5,62 40
5,O4 O5
4,02 02
3'54 709849/0908 °2
-WO-
m1) einen Gehalt folgender Zucker: Glucose, Fructose, Mannose,
Rhamnose und 3-Ainino-2,3, ö-trideoxy-S-C-methyl-L-xylohexopyranose,
n') wenigstens eine veresterbare Hydroxylgruppe,
und die pharmazeutisch unbedenklichen Säureadditionssalze des
Antibiotikums A-35512 Faktor B.
4. Antibiotikum A-35512 Faktor C in Form einer weißen amorphen basischen Verbindung, die über folgende Eigenschaf
ten verfügt:
a) eine Elementar zusammensetzung von etwa 53,93 % Kohlenstoff,
5,15 % Wasserstoff, 5,80 % Stickstoff, 32,35 % Sauerstoff und 1,90 % Chlor,
b) eine auf der Elemcntarzusammensetzung bezogene empirische
Formel von etwa C84H99NgO38Cl,
c) ein Molekulargewicht von etwa 1862,
wobei das Dihydrochlorid dieses Antibiotikums eine weiße amorphe
Verbindung darstellt, die folgende Eigenschaften aufweist:
a1) eine Elementarzusammensetzung von etwa 51,76 % Kohlenstoff,
5,07 % Wasserstoff, 5,61 % Stickstoff, 30,29 % Sauerstoff und 4,88 % Chlor,
b1) ein Infrarotabsorptionsspektrum in Form von KBr-Preßlingen
mit signifikanten Absorptionsmaxima bei folgenden Frequenzen (cm"1): 3370 (stark), 3280 (Schulter), 3040 (Schulter), 2980
(Schulter), 2920 (schwach), 1740 (schwach), 1658 (stark), 1620 (schwäch), 1589 (mittel), 1503 (stark), 1460 (schwach),
709849/09Q8
1428 (mittel), 1385 (schwach), 1330 (schwach), 1295 (mittel), 1210 (stark), 1162 (mittel), 1120 (schwach), 1060 (stark)
und 1005 (mittel),
c1) Ultraviolettabsorptionsspektren mit einem Absorptionsmaximum
in saurem und neutralem Methanol bei 282 mn (epsilon = 146ΟΟ) und einem Absorptionsmaximum in basischem Methanol
bei 292 nm (epsilon = 164ΟΟ),
d') ein durch Titration bestimmtes Molekulargewicht von etwa
1982,
e1) drei titrierbare Gruppen in 66-prozentigem wäßrigem Dimethylformamid
mit pK -Werten von etwa 7,30, 8,92 und 1O,99,
el
f) die folgenden spezifischen Drehwerte:
^5 = -161° (c = 1,05, H2O)
= -614° (c = 1,05, H2O),
g1) eine Löslichkeit in Wasser, Dimethylsulfoxid und wäßrigem
Dimethylformamid, eine teilweise Löslichkeit in Methanol und Äthanol und eine Unlöslichkeit in Benzol, Chloroform,
Aceton, Diäthylather, Äthylacetat, Toluol, Hexan, Acetonitril
und Dioxan,
h1) eine die Gegenwart von wenigstens fünf Aminosäureresten,
von denen einer Glycin zu sein scheint, zeigende Aminosäureanalyse
,
i1) einen R_-Wert von etwa 0,46 bei einer Papierchromatographie
in einem Lösungsmittelsystem aus 1-Butanol, Pyridin, Essigsäure
und Wasser (15:10:3:12) unter Verwendung von Sarcina lutea als Detektionsorganismus,
j') ein C magnetisches Kernresonanzspektrum in D„0 mit folgen
den Charakteristiken:
709849/0908
NO.
29
30
31
32 33 34
39 40 41 42 43 44
k1) eine Stabilität in wäßrigen Lösungen mit pH-Werten von
etwa 3 bis etwa 10 von bis zu 146 Stunden,
1') eine auf einer Elementarzusammensetzung beruhende empirische
Formel im Bereich von C83-85H97-1O1N8O37-39C^3
und eine angenäherte empirische Formel Cg4Hg7NgO38Cl.2HCl,
und die pharmazeutisch unbedenklichen Säureadditionssalze des
Antibiotikums A-35512 Faktor C.
7098A0/0908
5. Antibiotikum A-35512 Faktor E in Form einer weißen amor
phen basischen Verbindung mit einer Elementarzusammensetzung von etwa 54,84 % Kohlenstoff, 4,73 % Wasserstoff, 5,26 % Stickstoff,
32,67 % Sauerstoff und 1,72 % Chlor, dessen Hydrochloric! eine weiße amorphe Verbindung ist, die über folgende Eigenschaf
ten verfügt:
a) eine Elementarzusammensetzung von etwa 52,«7 % Kohlenstoff,
4,59 % Wasserstoff, 5,55 % Stickstoff, 33,51 % Sauerstoff und 3,62 % Chlor,
b) ein Infrarotabsorptionsspektrum in Form von KBr-Preßlingen
mit signifikanten Absorptionsmaxima bei folgenden Frequen zen (cm ) : 3360 (stark), 3220 (Schulter), 2900 (schwach),
1725 (schwach), 1650 (stark), 1580 (mittel), 1498 (stark), 1450 (schwach), 1419 (schwach), 1295 (mittel), 1205 (mittel),
1172 (mittel), 1110 (schwach), 1060 (stark) und 1000 (schwach),
c) Ultraviolettabsorptionsspektren mit folgenden Absorptionsmaxima:
in neutralem Methanol bei 270 nm (Schulter) und 359 nm (epsilon = 16216), in saurem Methanol bei 286 nm
(epsilon = 18018) und 310 nm (Schulter) und in basischem Methanol bei 270 nm (Schulter), 300 nm (epsilon = 16216)
und 354 nm (epsilon = 17568),
d) ein durch Titration bestimmtes Molekulargewicht von etwa
2018,
e) drei titrierbare Gruppen in 66-prozentigem wäßrigem Dimethylformamid
mit pK -Werten von etwa 6,30, 9,09 und 11,62,
f) den folgenden spezifischen Drehwert:
/alpha/*5 = -108,3 (c = 1, H3O),
709849/0908
g) eine Löslichkeit in Wasser, eine teilweise Löslichkeit in Methanol und Äthanol und eine Unlöslichkeit in Benzol,
Chloroform, Aceton, Diäthylather, Äthylacetat, Toluol,
Hexan, Acetonitril und Dioxan,
h) eine die Gegenwart von sechs Aminosäureresten zeigende Aminosäureanalyse,
i) einen Rf-Wert von etwa 0,64 bei einer Papierchromatographie
in einem Lösungsmittelsystem aus 1-Butanol, Pyridin, Essigsäure
und Wasser (15:10:3:12) unter Verwendung von Sarcina lutea als Detektionsorganismus,
und die pharmazeutisch unbedenklichen Säureadditionssalze des Antibiotikums A-35512 Faktor E.
6. Antibiotikum A-35512 Faktor F mit einem Rf-Wert von 0,81
bei einer Papierchromatographie in einem Lösungsmittelsystem aus 1-Butanol, Pyridin, Essigsäure und Wasser (15:10:3:12) unter
Verwendung von Sarcina lutea als Detektionsorganismus.
7. Antibiotikum A-35512 Faktor G mit einem Rf-Wert von 0,93
bei einer Papierchromatographie in einem Lösungsmittelsystem
aus 1-Butanol, Pyridin, Essigsäure und Wasser (15:10:3:12) unter Verwendung von Sarcina lutea als Detektionsorganismus.
8. Antibiotikum A-35512 Faktor H in Form einer weißen amorphen basischen Verbindung, die über folgende Eigenschaften verfügt:
a) eine Elementarzusammensetzung von etwa 53,76 % Kohlenstoff, 5,32 % Wasserstoff, 5,53 % Stickstoff, 33,48 % Sauerstoff
und 1,59 % Chlor,
709849/0908
b) eine empirische Formel im Bereich von cq5_q7HiO3-1O7N8038-4OC*'
c) ein auf einer Elementarzusammensetzung bezogenes Molekulargewicht
von etwa 1908,
dessen Hydrochloric! eine weiße amorphe Verbindung ist, die über
folgende Eigenschaften verfügt:
a1) eine Elementarzusammensetzung von etwa 53,10 % Kohlenstoff,
5,37 % Wasserstoff, 5,35 % Stickstoff, 30,12 % Sauerstoff und 3,87 % Chlor,
b1) ein Infrarotabsorptionsspektrum in Form von KBr-Preßlingen
mit signifikanten Absorptionsmaxima bei folgenden Frequenzen
(cm~1): 3410 (stark), 3240 (Schulter), 2940 (schwach), 1670 (stark), 1630 (Schulter), 1605 (stark), 1520 (stark), 1470
(schwach), 1442 (schwach), 1400 (schwach), 1345 (Schulter), 131O (mittel), 1225 (mittel), 1180 (schwach), 1135 (schwach),
1080 (stark) und 1020 (Schulter),
c') Ultraviolettabsorptionsspektren mit einem Absorptionsmaximum in saurem und neutralem Methanol bei 282 mn (epsilon = 12500,
einem Absorptionsmaximum in basischem Methanol bei 292 mn (epsilon = 14000) und einer Endabsorption bei 225 mn,
d1) ein durch Titration bestimmtes Molekulargewicht von etwa
1660,
e1) fünf titrierbare Gruppen in 66-prozentigem wäßrigem Dimethylformamid
IT
11,43 und 13,02,
11,43 und 13,02,
methylformamid mit pK -Werten von etwa 5,O, 7,46, 9,80,
f) den folgenden spezifischen Drehwert:
/alpha/*5 = -123,5° (c = 1,
709849/0908
g1) eine Löslichkeit in Wasser, eine teilweise Löslichkeit in
Methanol und Äthanol und eine Unlöslichkeit in Benzol, Chloroform, Aceton, Diäthyläther, Äthylacetat, Toluol, Hexan,
Acetonitril und Dioxan,
h') eine die Gegenwart von wenigstens fünf Aminosäureresten, von denen einer Glycin ist, zeigende Aminosäureanalyse,
i1) ungefähre R_-Werte in den im folgenden angegebenen papierchromatographisehen
Systemen unter Verwendung von Sarcina lutea als Detektionsorganismen:
Lösungsmittelsystem
Rf-Wert
1-Butanol:Pyridin:Essigsäure:Wasser (15:10:3:12) 0,15 CH3OH:O,1n HCl (3:1) 0,47
1-Propanol:NH4OH:H2O (6:3:1) 0,11
j1) ein C magnetisches Kernresonanzspektrum in D3O mit folgen
den Charakteristiken:
Ü2j- PEm Höhe (%)
8 156,6 3,8
9 155,6 4,1
10 155,4 3,8
11 154,3 2,4
12 151,3 1,6
13 137,7 2,0
14 136,7 2,2
15 136,0 4,0
16 135,3 1,9
17 133,5 5,0
18 129,4 3,7
19 127,3 1>3
20 126,1 3,2
21 124,2 6,9
22 122,6 4,1
23 107,6 2,7
24 101,8 1,8
25 76,2 2,8
26 73,5 4,4
27 72,3 7,4
28 71,0 12,2
29 69,7 4,6
31 61,6 3,5
32 56,8 1,8
33 55,4 2,8
34 55.0 1.5
k1) eine Stabilität in wäßrigen Lösungen mit pH-Werten von
etwa 3 bis etwa 10 von bis zu 72 Stunden,
und die pharmazeutisch unbedenklichen Säureadditionssalze des Antibiotikums A-35512 Faktor H.
9. Antibiotikum A-3 5512 Faktor B Aglykon, dessen Hydrochlorid
eine weiße amorphe Verbindung ist, die über folgende Eigenschaften verfügt:
a) eine Elementarzusammensetzung von etwa 54,29 % Kohlenstoff,
4,34 % Wasserstoff, 7,4O % Stickstoff, 28,95 % Sauerstoff
und 5,O2 % Chlor,
b) ein Infrarotabsorptionsspektrum in Nujol-Mull mit signifikanten
Absorptionsmaxima bei folgenden Frequenzen (cm ): 3440 (Schulter), 3340 (Schulter), 3215 (stark), 2950 (Schulter),
2910 (stark), 284O (stark), 2640 (Schulter), 1735 (schwach), 1655 (stark), 1590 (mittel), 1500 (stark), 146O
(stark), 1378 (mittel), 1365 (Schulter), 1298 (mittel), 1215 (mittel), 1155 (mittel), 1120 (Schulter), 1105 (schwach),
1060 (schwach), 1040 (schwach), 1008 (mittel), 925 (schwach), 875 (schwach), 765 (Schulter) und 718 (schwach),
709849/0908
c) Ultratiolettabsorptionsspektren rait einem Absorptionsmaximum
1%
in saurem und neutralem Methanol bei 282 nm (E.. = 102,62)
lern
und einem Absorptionsmaximum in basischem Methanol bei 302 nm 1= 182'09)'
d) ein durch Titration bestimmtes Molekulargewicht von etwa
1282,
e) drei titrierbare Gruppen in 66-prozentigem wäßrigem Dimethylformamid
mit pK -Werten von etwa 7,5, 9,25 und 11,0,
Ct
f) die folgenden spezifischen Drehwerte:
/alpha/p5 = -178° (c = 5, CH3OH)
/alpha/3^ = -716,8° (c = 5, CH3OH),
g) eine Löslichkeit in Wasser und Methanol, jedoch eine Unlöslichkeit
in Benzol, Chloroform, Aceton, Diäthyläther, Äthylacetat, Toluol, Hexan, Acetonitril und Dioxan,
h) eine die Gegenwart von wenigstens vier Aminosäureresten zeigende Aminosäureanalyse,
i) einen Rf-Wert von etwa 0,80 bei einer Cellulosedünnschichtchromatographie
(Aluminiumoxidträger) in einem Lösungsmittelsystem aus 1-Butanol, Pyridin, Essigsäure und Wasser
(15:10:3:12) unter Verwendung von Sarcina lutea als Detektionsorganismus,
j) einen R^-Wert von etwa 0,26 bei einer Silicageldünnschichtchromatographie
in einem Lösungsmittelsystem aus Methanol, Chloroform und konzentriertem Ammoniumhydroxid (3:2:1),
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k) ein C magnetisches Kernresonanzspektrum in DMSO-d, mit
folgenden Charakteristiken:
No.
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
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D
1) einen Gehalt an einem 3-Amino-2,3,ö-trideoxy-S-C-methyl-L-xylohexopyranoserest,
m) einen Gehalt an wenigstens einer veresterbaren Hydroxylgruppe,
wobei die freie Base dieses Antibiotikums eine weiße amorphe Verbindung ist, die über folgende Eigenschaften verfügt:
a1) eine Elementarzusammensetzung von etwa 52,65 % Kohlenstoff,
4,57 % Wasserstoff, 6,91 % Stickstoff, 27,04 % Sauerstoff und 2,94 % Chlor,
b1) ein Infrarotabsorptionsspektrum in Form von KBr-Preßlingen
mit signifikanten Absorptionsmaxima bei folgenden Frequenzen (cm~1): 3360 (stark), 3260 (Schulter), 2940
(Schulter), 1735 (Schulter), 1660 (stark), 1598 (mittel), 1510 (stark), 1440 (mittel), 1295 (schwach), 1215 (mittel),
1165 (mittel), 1122 (schwach), 1070 (schwach), 1018 (stark), 940 (schwach) und 920 (schwach),
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c1) Ultraviolettabsorptionsspektren mit einem Absorptionsmaximum in saurem und neutralem Methanol bei 282 nm
(E., = 43,65) und einem Absorptionsmaximum in basischem
1cm 1%
Methanol bei 301 nm (E1 = 67,46),
1 cm
d1) vier titrierbare Gruppen in 66-prozentigem wäßrigem Dimethylformamid
11,4 und 12,4,
11,4 und 12,4,
methylformamid mit pK -Werten von etwa 6,2, 8,2, 10,1,
e') den folgenden spezifischen Drehwert:
= -64,5° (c = 3, DMSO),
und die pharmazeutisch unbedenklichen Säureadditonssalze des
Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykon.
1O. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikumgemisches
A-35512 mit den Faktoren A, B, C, E, F, G und H, des Antibiotikums
A-35512 Faktor A, des Antibiotikums A-35512 Faktor B,
des Antibiotikums A-35512 Faktor C, des Antibiotikums A-35512 Faktor E, des Antibiotikums A-35512 Faktor F, des Antibiotikums
A-35512 Faktor G und des Antibiotikums A-35512 Faktor H sowie des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykon, dadurch
gekennzeichnet , daß man
a) den Mikroorganismus Streptomyces candidus NRRL 8156 oder eine das Antibiotikum A-35512 bildende Mutante hiervon in
einem Nährmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlehydrate« Stickstoff und anorganische Salze enthält, submers unter aero
ben Fermentationsbedingungen züchtet, bis eine wesentliche Menge des Antibiotikums gebildet ist,
b) das Antibiotikumgemisch A-35512 gegebenenfalls aus dem Kulturmedium
abtrennt,
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c) aus dem Antibiotikumgemisch A-35512 gegebenenfalls die Antibiotika
A-35512 Faktoren A, B, C, E, F, G und H isoliert und
d) aus dem Antibiotikum A-35512 Faktor D gegebenenfalls das Antibiotikum
A-35512 Faktor B Aglykon herstellt.
11. Zusatzfutter zur Steigerung der Futterverwertung von Wiederkäuern mit ausgebildeter Pansenfunktion aus einem Futter
als Trägermaterial und einer propionaterhöhenden Menge eines Wirkstoffs, dadurch gekennzeichnet,
daß es als Wirkstoff das Antibiotikumgemisch A-35512, das Antibiotikum A-35512 Faktor A, das Antibiotikum A-35512 Faktor
B, das Antibiotikum A-35512 Faktor C, das Antibiotikum A-35512 Faktor E, das Antibiotikum A-35512 Faktor F, das Antibiotikum
A-35512 Faktor G, das Antibiotikum A-35512 Faktor H oder das Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykon oder ein pharmazeutisch
unbedenkliches Salz der Antibiotika A-35512 Faktoren A, B, C, E, F, G und H oder des Antibiotikums A-35512 Faktor
B Aglykon enthält.
12. Zusatzfutter für Geflügel aus einem Futter als Träger und einem Wirkstoff in einer die Futterverwertung erhöhenden
Konzentration, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff das Antibiotikumgemisch A-35512, das Antibiotikum
A-35512 Faktor A, das Antibiotikum A-35512 Faktor B, das Antibiotikum A-35512 Faktor C, das Antibiotikum A-35512
Faktor E, das Antibiotikum A-35512 Faktor F, das Antibiotikum A-35512 Faktor G, das Antibiotikum A-35512 Faktor H oder das
Antibiotikum A-35512 Faktor B Aglykon oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz der· !Antibiotika A-35512 Faktoren A, B, C,
E, F, G und H oder des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykon enthält.
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13. Verfahren zur Steigerung der Futterverwertung von Wiederkäuern
mit ausgebildeter Pansenfunktion, dadurch gekennzeichnet , daß man solchen Tieren eine
propionaterhöhende Menge des Antibiotikumgemisches A-35512, des Antibiotikums A-35512 Faktor A, des Antibiotikums A-35512
Faktor B, des Antibiotikums A-35512 Faktor C, des Antibiotikums A-35512 Faktor E, des Antibiotikums A-35512 Faktor F,
des Antibiotikums A-35512 Faktor G, des Antibiotikums A-35512
Faktor H oder des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykon oder eines pharmazeutisch unbedenklichen Salzes der Antibiotika
A-35512 Faktoren A, B, C, E, F, G und H oder des Antibiotikums
A-35512 Faktor B Aglykon verabreicht.
14. Verfahren zur Steigerung der Fiitterverwertung von Geflügel,
dadurch gekennzeichnet, daß man solchen Tieren oral eine wirksame Menge des Antibiotikumgemisches
A-35512, des Antibiotikums A-35512 Faktor A, des Antibiotikums A-35512 Faktor B, des Antibiotikums A-35512 Faktor
C, des Antibiotikums A-35512 Faktor E, des Antibiotikums A-35512 Faktor F, des Antibiotikums A-35512 Faktor G, des
Antibiotikums A-35512 Faktor H oder des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykon oder eines pharmazeutisch unbedenklichen
Salzes der Antibiotika A-35512 Faktoren A, B, C, E, F, G und H oder des Antibiotikums A-35512 Faktor B Aglykon verabreicht.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8128 | New person/name/address of the agent |
Representative=s name: SPOTT, G., DIPL.-CHEM. DR.RER.NAT., PAT.-ANW., 800 |
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| 8130 | Withdrawal |