Verfahren zur Herstellung neuer Antibiotica Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Antibiotica auf mikrobiologischem Wege.
Erfindungsgemäss werden, neue Antibiotica gewon nen, indem man cinei gewisse Art der Gattung Micro- monospora (Ordnung Actinomycetales), nämlich Micro- monospora carbonacea (einschliesslich ihrer Mutanten und Varianten), in einem wässrigen Nährmedium be brütet, das assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthält, bis sich antibiotisch aktive Substanzen, gebildet haben und aus dem hiernach vorliegenden Substrat die antibiotisch aktiven Fraktionen isoliert.
Diese können weiter aufgetrennt und die so erhaltenen Antibiotica in ihre üblichen Derivate, wie N- und/oder O-Acylderivate, übergeführt werden..
Insbesond'ieire werden erfindungsgemäss durch Bebrü- tung geeigneter Micromonosporaarten neue und nütz liche Antibiotica gewonnen, deren wichtigste Vertreter im folgenden als Antibiotica der R-451-Gruppe be zeichnet sind.
Kulturen der erfindungsgaamäss vorzugsweise verwen deten Mikroorganismen wurden in der Kulturensamm- lung des Landwirtschaftsministeriums (Department of Agriculture) der Vereinigten Staaten von Amerika, Northern Utilization Research and Development Divi sion, Peoria, Illinois, hinterlegt, wo sie unter ihren NRRL-Nummern allgemein erhältlich sind.
<I>Die vorzugsweise</I> verwendeten <I>Mikroorganismen</I> Ein zur Gewinnung der Antibiotica der R-451- Gruppe als geeignet erkannter Mikroorganismus wurde als Micromonospora carbonacea n. sp. bezeichnet und wird im folgenden kurz M. carbonacea genannt.
Er hat die NRRL-Nummer 2972 erhalten und wurde ursprüng- "\ Unter Mutanten werden sowohl natürliche als auch künstliche Mutanten verstanden, insbesondere Mutanten, die aus den betreffenden Mikroorganismen mit Hilfe von Muta- tionsmitteln, wie Hochfrequenzstrahlung (Röntgen- und Ultra violettstrahlung), Actinophagen und Stickstofflosten, gebildet werden. lich aus einer Bodenprobe aus Olean, N.
Y., USA, er halten. - M. carbonacea zeichnet sich, wenn er unter 20tägiger Bebrütung bei 28 C in einem Medium aus 0,5 % Hefeextrakt, 1 % Dextrose, 0,1 % Calciumcarbonat und 1,5 % Agar kultiviert wird, durch kohlschwarze auf Sporenhäufung zurückzuführende Flecken in einem sonst orangefarbenen vegetativen Myced aus.
Die Sporen von M. carbonacea sind gewöhnlich länglich bis ellip- soidal, und die Dimensionen reifer Sporen betragen durchschnittlich 1,0 zu 1,5,u. Die vollreifen Sporen sind bei mikroskopischer Betrachtung im hindurchgehenden Licht dunkel gefärbt.
Sporophoren treten nicht einiger massen statistisch-gleichmässig über das gesamte Mycel verteilt auf, sondern stark konzentriert in bestimmten Gebieten des vegetativen Mycels. Dieses scheint sich normalerweise nicht in polymorphe Elemente (Frag mente) aufzuteilen, sondern bleibt ein Ganzes bis, zu einer etwaigen Autolyse. Das vegetative Mycel hat einen durchschnittlichen Durchmesser von 0,6 ,u, ist nicht säurefest, grampositiv. Der Organismus nährt sich von gewissen Protein- und Stärkearten,,
ist aerob und gedeiht gut im Bereiche von 16 bis 37 C; aber nicht bei 50 C oder darüber. Form und orange Farbe (mit braunschwarzen Flecken) sind typisch für frische Isolate aus dem Boden, doch können diese Merkmale zeitweilig oder dauernd verl'oren:gehen, wenn Stämme wiederholt isoliert und übertragen werden.
Zur Isolierung des genannten Mikroorganismus wird etwas von der betreffenden Bodenprobe in sterilem, destilliertem Wasser geschüttelt, und nach Herstellung geeigneter Verdünnungen wird die Suspension auf ein Agarmedium aufgestrichen. Das Medium enthält zweck mässig 0,5 % Tryptose, 2,0 % lösliche Stärke, 0,3 Calciumpropionat und 2,0 % Agar; alles in destilliertem Wasser.
Die Kulturen werden auf antibiotische Aktivität ge prüft, indem man sie zunächst bis zu 60 Tage bei 26 C in dem folgenden Medium wachsen lässt: 0,3% Rindfleischextrakt, 0,5% Tryptose, 0,1% Dextrose, 2,4% lösliche Stärke, 0,5% Hefeextrakt, 1,5 % Agar, alles in Leitungswasser.
Dann extrahiert man den ganzen wässrigen Agar mit Butanol- und engt den; Butanol- Wasser-Extrakt ein. Durch das Butanol-Wasser-Gemisch wird genügend Antibioticum extrahiert, um ein Kon zentrat zu liefern, das in einem Scheibentest das Wachs tum von Staphylococcus aureus und Bacillus subtilis verhindert.
Eine antibiotische Aktivität gegen die glei chen Organismen lässt sich beobachten, wenn man 96 Stunden in einem wässrigen Medium submers be brütet, das geeignete Nährstoffe: enthält; z. B.
<B><I>0,5%</I></B> Hefeextrakt, 0,17o lösliche Fischbestandteile, 0,1% Calciumcarbonat, 0,1% durch Versprühen getrockneten corn steep liquor und 3,0% Lactose.
Tabellen I bis V vergleichen die vorstehend be schriebenen neuen mit gewissen bekannten Micromono- sporaarten. Sofern sich in einzelnen Tabellenfeldern Striche: befinden, bedeutet dies, dass entsprechende Daten entweder fehlen oder nicht in die Tabellen. auf genommen wurden.
Die in Tabelle I aufgenommenen Koloniebeobachtun- gen wurden nach 14tägiger Bebrütung der betreffenden, Medien bei 24 bis 26 C angestellt. Diei gewählten Farbbezeichnungen beziehen sich auf die folgenden Systeme:
Die jeweils erste Farbbezeichnung besteht aus einem Farbnamen gemäss dem Descriptive Color Name Dietionary von Taylor, Knoche und Granville, heraus gegeben durch die Container Corporation of America, <B>1950,</B> in Verbindung mit einer diesem Namen entspre chenden Nummer, welche dem Color Harmony Ma nual , 4. Auflage (1958), herausgegeben ebenfalls von der Container Corporation of America, entnommen ist;
die zweite Bezeichnung besteht aus einem Farbnamen und einer Nummer gleicher Bedeutung, gemäss National Bureau of Standards (USA), Circular 553 vom 1. No vember 1955.
Tabelle 1I vergleicht die charakteristischen Eigen schaften von Kolonien der erfindungsgemäss bevorzugt verwendeten und einiger bekannter Arten der Gattung Micromonospora bei Verwendung verschiedener Medien nach 14tägiger Bebrütung bei 26 C. Die Daten für die bekannten Arten, mit denen die erfindungsgemäss ver wendeten verglichen werden, sind aus Bergey's Manual of Determinative Bacteriology , 7.
Auflage, 1957, herausgegeben von der Williams & Wilkins Company, Baltimore, entnommen..
In den Tabellen IIIA und IIIB sind Wachstum und Koloniefarbe der erfindungsgemäss bevorzugt verwende ten Micromonosporaarten mit den entsprechenden Eigenschaften dreier verfügbarer bekannter Micromono- sporaarten bei Verwendung weiterer Kulturmedien ver glichen.
Dies hier verwendeten Medien sind diejenigen, die man gewöhnlich zur Bestimmung von Streptomyces- arten verwendet. Die Koloniefarbe ist nach dem im Zu sammenhang mit Tabelle I erläuterten System bezeich net. Die oben :erwähnten Mikroorganismen sind im stande, verschiedene Kohlenstoff- und Stickstoffquellen zu benutzen.
In Tabelle IV wird ihre Kohlenstoffquell'enbenutzung mit derjenigen gewisser bekannter Micromonosporaarten an Hand visueller Schätzungen ihres Wachstums auf Agarplatten in einem Medium verglichen, das aus 0,5 Hefeextrakt Difcoe (einem Produkt der Firma Difco Laboratories Inc., Detroit); 1,5 % Agar und 1 % des ber treffenden Testkohlehydrats, alles in destilliertem Wasser, besteht.
In Tabelle V wird die Stickstoffquellenbenutzung der erfindungsgemäss bevorzugten Mikroorganismen der Gattung Mieromonospora mit derjenigen anderer Mi- cromonosporaarten an Hand visueller Schätzungen ihres Wachstums auf Agarplatten in einem Medium vergli chen, das aus 1 % Glucose, 1,5 % Agar und der be treffenden Stickstoffquelle (in einer Konzentration wie angegeben), alles in destilliertem Wasser, besteht. Die in Tabelle V verwendeten Farbbezeichnungen beruhen auf dem im Zusammenhang mit Tabelle I erläuterten System.
Wie oben gesagt, ist in der Erfindung die Verwen dung von Mutanten und Varianten der genannten neuen Micromonosporaarten für die Herstellung der Anti- biotica inbegriffen. Ein Beispiel einer solchen Variante, die sich von der oben beschriebenen Art in untergeord neter Weise, z.
B. morphologisch oder biochemisch, unterscheidet, ist mit M. carbonacea var. aurantiaca. Eine Kultur davon wurde ebenfalls in der Kul'turen- sammlung des Landwirtschaftsministeriums (Department of Agriculture) der Vereinigten Staaten von Amerika, Northern Utilization Research and Development Divi sion, Peoria, Illinois, USA,
hinterlegt und ist dort unter ihrer NRRL-Nummer 2997 verfügbar. Diese Variante wurde ebenfalls ursprünglich aus einer in Olean, N. Y., entnommenen Bodenprobe isoliert und ist taxonomisch gleich mit M. carbonacea, mit den folgenden Unter schieden:
M. carbonacea var. aurantiaca reduziert Nitrat nicht; bildet mitunter ein gelbes diffundierbares Pigment, wenn es in einem Kohlehydratmedium auf Basis von Mannose oder Xylose kultiviert wird und bildet Sporen in begrenztem Umfang. Die Koloniefarbe auf den meisten Agarmedien. ist orange mit einer Tendenz, mit zunehmendem Alter orangebraun zu werden.
Die orange Oberfläche besteht hauptsächlich aus vegetativem Mycel und enthält gelegentlich kleine schwarze Felder, die beinahe zur Gänze aus dunkel gefärbten Sporen be stehen. Auf Bennett's Agar ist das Wachstum dieser Variante gut; die Kolonie erhöht. Ihre Farbe ist feuer rot g5NC, intensivrotorange-35. Auf Tomatenmark- Hafermehl-Agar mit einem 0,1 % igen Natriumcarbonat- gehalt ist das Wachstum mittelmässig; die Kolonie er höht.
Ihre Farbe ist bittersüssfarben-g5PC, tieforange-51.
Die Variante ist der oben beschriebenen Art hin sichtlich der Bildung von Antibiotica im allgemeinen und von Antibiotica der R-451-Gruppe im besonderen äquivalent.
<I>Bildung und Isolierung der</I> Antibiotiea Die- oben beschriebenen und die andern erfindungs gemäss verwendbaren Mikroorganismen liefern mit Hilfe; der im folgenden beschriebenen Fermentationsverfahren antibiotisch aktive Substanzen. Nach der Fermentation (Bebrütung) finden sich diese sowohl im Mycel als auch in der Brühe; nach Abtrennung des Mycels von der Brühe wird als Quelle zu ihrer Gewinnung vor zugsweise die Brühe verwendet.
Aus papierchromatographischen Untersuchungen hat sich ergeben, dass die durch M. carbonacea und deren Äquivalente gebildeten antibiotischen Substanzen mindestens aus fünf Komponenten bestehen, die im fol genden als R-451A, 11-45113, R-451C, R-451D und R-451E bezeichnet werden. Ihre Abtrennung voneinan der hängt von der angewandten Methode ab. In einem bestimmten verteilungschromatographischen System wer den die Stoffe, mit den Komponenten A, B, C und D entsprechenden Wanderungseigenschaften als eine Gruppe (antibiotisch aktiv) isoliert, die im folgenden als R-451 bezeichnet wird.
Eine der Hauptkomponenten dieser Gruppe scheint R-451D zu sein.
Zur Bildung der antibiotischen Substanzen wird der Mikroorganismus M. carbonacea vorzugsweise bei einer Temperatur von 25 bis 40 C unter submersen aeroben Bedingungen in einem wässrigen Nährmedium kultiviert, das eine assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoff quelle enthält. Geeignete Kohlenstoffquellen sind Kohle hydrate, wie Stärke, Dextrin, gewisse Zucker und der gleichen.
Geeignete Stickstoffquellen können sowohl organischer als auch anorganischer Natur sein, vorzugs weise sind es aber organische Produkte, wie Soja bohnenmehl, Peptone und dergleichen.
Die Bebrütung erfolgt gewöhnlich bei einem pH im Bereiche von 6 bis 8; über einen Zeitraum von 60 bis 72 Stunden:. Gegen Ende dieser Zeitspanne ist maximale Antibioticabildung erreicht.
Da sich der überwiegende Anteil antibiotisch aktiver Substanzen in der Brühe befindet, wird das Mycel in der Regel abfiltriert und verworfen. Die antibiotischen Substanzen können aus der Brühe durch Lösungsmittel extraktion, etwa wie im folgenden beschrieben, isoliert werden. Sie können durch verteilungschromatographische Methoden, wie im folgenden näher erläutert, in ihre Komponenten aufgetrennt werden.
Es wird zweckmässig wie folgt vorgegangen: Die antibiotischen Substanzen werden zunächst aus dem von der Brühe erhaltenen Extrakt durch Ab dampfen des Lösungsmittels in Form eines Rückstandes abgetrennt. Der Rückstand wird papierchromatogra- phisch untersucht, was als Anhaltspunkt für die Ver- teilungschromatographie dient.
Die Papierchromato- gramme werden in verschiedenen Lösungsmittelsystemen aufgenommen und die Rr-Werte für die einzelnen Komponenten nach bioautographischen Standardmetho den ermittelt, die darin bestehen, dass man ein Papier- chromatogramm entwickelt und trocknet und es dann über eine mit Staphylococcus aureus beimpfte Agar- platte legt.
Nach einer Kontaktdauer von 15 Minuten wird das Papier von der Platte getrennt, die man dann 16 bis 20 Stunden bei 37 C bebrütet. Aus der Lage der Inhibitionszonen lässt sich auf die RT-Werte anti biotisch aktiven Komponenten schliessen.
Tabelle VI zeigt die verwendeten Lösungsmittel systeme und die darin für die Antibioticakomponenten ermittelten RF-Werte. Bei allen Systemen werden ab steigende Lösungsmittel verwendet.
In den folgenden Beispielen sind geeignete Verfahren zum Bebrüten der erfindungsgemäss bevorzugten Mikro organismen, zum Extrahieren der antibiotischen Sub stanzen aus der Brühe und zum Auftrennen, dieser Sub stanzen in ihre Hauptkomponenten erläutert. In einigen dieser Beispiele sind Prüfwerte der betreffenden anti biotischen Substanzen, ausgedrückt in Einheiten pro mg, als Massstab ihrer Aktivität angegeben.
Die Prüfung erfolgt mikrobiologisch nach einem standardisierten Agar-Diffusionsprüfverfahren [ cup type ;
vgl. Donald C. Grove and William A. Randell, Assay Methods of Antibiotics - A Laboratory Manual , New York (1955)], unter Verwendung von Staphylococcus aureus (ATCC 6538P) als Testorganismus. Es wird eine Kurve aufgenommen,
indem man die erzielte Wirkung gegen die Dosierung der betreffenden antibiotischen Substanz (verdünnt in Phosphatpuffer bei pH - 8) in dem fol genden Medium aufträgt:
EMI0003.0077
Pepton <SEP> <B>...................</B> <SEP> 0,6
<tb> Pankreatisches <SEP> .Caseinhydrolysat <SEP> 0,4
<tb> Hefeextrakt <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,3
<tb> Rindfleischextrakt <SEP> <B>..........</B> <SEP> 0,15
<tb> Dextrose <SEP> <B>.................. <SEP> <I>0,15%</I></B>
<tb> Agar <SEP> <B>.....................</B> <SEP> 1,5
<tb> pH <SEP> ......................
<SEP> 6,6 Die verwendete Suspension des Testorganismus (Staphylococcus aureus) wird derart standardisiert, dass sie in einem Kolorimeter Licht mit einer Wellenlänge von 660 mu zu 20% durchlässt. Die quantitative Wirk samkeit der jeweiligen Antibioticumprobe wird aus der Bezugskurve ermittelt und in Einheiten pro mg ausge drückt;
wobei als Einheit eine solche Menge Test substanz gilt, die erforderlich ist, um bei einem Stahl zylinder von 6,5 mm Aussendurchmesser eine Inhibi- tionszond von 15 mm Durchmesser hervorzurufen.
<I>Beispiel 1</I> Gewinnung von R-451 durch Bebrütung von M. carbonacea im Laboratoriumsmassstab A. Keimung: Man bringt eine lyophihsierte Kultur von M. carbo- nacea aseptisch in einen 300-ml-Schüttelkolben ein, der 100 ml des folgenden sterilen Mediums enthält:
EMI0003.0106
Bacto-Rindfleischextrakt <SEP> ... <SEP> 3 <SEP> g
<tb> Tryptose <SEP> ............... <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Dextrose <SEP> ............... <SEP> 1 <SEP> g
<tb> lösliche <SEP> Stärke <SEP> <B>..........</B> <SEP> 24 <SEP> g
<tb> Hefeextrakt <SEP> ............. <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> <B>..........</B> <SEP> 1000 <SEP> ml Man bebrütet den Kolben samt Inhalt 4 Tage bei. 37 C auf einer rotierenden Schüttelmaschine (280 Tou ren pro Minute, 5 cm Rüttelbewegung).
B. Bebrütung: Man überträgt je 25 ml des durch die vorstehende Keimung gewonnenen Inoculums auf vier 2-Liter- Kolben, deren jeder 500 ml des folgenden Mediums enthält: * In diesem und in ähnlichen Rezepten durch die ganze Beschreibung hindurch ist das Lösungsmittel (meist Wasser) einmal als absolute Menge, ein andermal mit dem Vorsatz ad angegeben.
Obwohl dies, genau genommen, unterschiedliche Angaben sind, so können doch im Rahmen der für diese Rezepte erforderlichen Genauigkeit diese beiden Ausdrücke be liebig gegeneinander ausgetauscht werden.
EMI0004.0001
Hefe <SEP> .................... <SEP> 5 <SEP> g
<tb> lösliche <SEP> Fischbestandteile <SEP> <B>....</B> <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Corn <SEP> steep <SEP> liquor <SEP> (getrocknet) <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Calciumearbonat <SEP> .......... <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Lactose <SEP> <B>..................</B> <SEP> 30 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> <B>............</B> <SEP> 1000 <SEP> ml Man bebrütet die Kolben samt Inhalt 2 bis 3 Tage bei 26 C auf einer rotierenden Schüttelmaschine und vereinigt dann die Kolbeninhalte.
C. Extraktion der antibiotischen Substanzen: Zu dem vereinigten Substrat nach Teil B dieses Bei spiels fügt man eine Filterhilfe (Diatomeenerde), filtriert und wäscht das Filtrat mit Äthylacetat oder Chloro form, wobei man das pH der wässrigen Phase bei oder oberhalb 7 (jedoch vorzugsweise so nahe an 7 wie möglich) hält.
Aus dem Extrakt wird das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft, das zurückbleibende Öl in überschüssigem Chloroform gelöst und durch Filtrieren geklärt. Die klare Chloroformlösung wird im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt und die so erhaltene konzentrierte Lösung unter Rühren zu dem zehnfachen Volumen Petroläther (Siedebereich 30 bis 60 C) ge fügt. Der dabei ausfallende Niederschlag wird ab- filtriert* und enthält die Hauptmenge der gebildeten antibiotischen Substanzen.
Er ist aktiv gegen Staphylo- coccus aureus, wenn Lösungen mit einem Gehalt von nur 10 pg/ml dem Scheibendiffusionstest unterzogen werden.
D. Reinigung der nach Teil C dieses Beispiels er haltenen rohen antibiotischen Substanz: Hier wird eine Reinigung durch Säulenchromato- graphie an Aluminiumoxyd angewandt. Das Haupteluax wird als R-451 bezeichnet und scheint von der Kompo nente R-451E frei zu sein. Die Aluminiumoxydreini- gung liefert ein wasserlösliches Produkt und ermöglicht so die Bereitung wässriger Dosierungsformen, oder besser löslicher Formen des Antibioticums.
Man bereitet eine Aluminiumoxyd-Adsorptions- chromatographiesäule, indem man eine Suspension von reinem Aluminiumoxyd (für die Chromatographie; Handelsprodukt Nr.<B>71707</B> der Firma Merck & Co.) in Chloroform-Methanol (3 : 1) in eine Glassäule von etwa 51 mm lichter Weite giesst, bis die Aluminiumoxyd schicht eine Höhe von etwa 61 cm erreicht hat.
Man löst 10 g nach Stufe C dieses Beispiels erhal tenen rohen antibiotischen Substanz in 50 ml Chloro form und gibt diese Lösung langsam auf die Säule auf. Diese eluiert man dann zunächst mit Chloroform- Methanol (3 : 1), wobei man 12 Fraktionen ä 500 m1 auffängt; sowie anschliessend mit Methanol,-Chloro- form (3:1), wobei man weitere 37 Fraktionen ä 500 m1 sammelt.
Die Fraktionen werden durch Ein dampfenlassen kleiner Proben an der Luft und Testen von deren Rückständen gegen Staphylococcus aureus untersucht und nach Massgabe ihrer Aktivität gegen diesen Organismus zu Gruppen vereinigt. Die Haupt menge eluierter Substanz und die Hauptaktivität befin, den sich in den Fraktionen 13 bis 30. Diese werden vereinigt, im Vakuum eingeengt und die gelöste Substanz durch Zugabe zu Petroläther ausgefällt. Der Nieder- Es kann nötig sein, ein- oder mehrmals aus Chloroform umzufällen, falls zunächst anstelle eines filtrierbaren Feststoffes ein Öl ausfällt.
schlag, bestehend aus 1,7g R-451, wird abfiltriert und an der Luft getrocknet. Er zeigt eine Aktivität gegen Staphylococcus aureus (im Scheibendiffusionstest) bei Konzentrationen von 1 pg/ml aufwärts.
In Tabelle VII ist gezeigt, wie die einzelnen Frak tionen vereinigt werden und in welcher Weise aus ihnen die, feste antibiotische Substanz isoliert wird, zusammen mit den Ergebnissen der Scheibentests gegen Staphylo- coccus aureus und den Rr-Werten der vereinigten Frak tionen in dem betreffenden System.
Die Rr-Werte wur den in der üblichen Weise durch Bioautographie des ent wickelten Papierchromatogramms gegen Staphylococcus aureus ermittelt.
<I>Beispiel 2</I> Gewinnung von R-451 durch Bebrütung von M. carbonacea vor. aurantiaca im Laboratoriums massstab Indem man die lyophilisierte Kultur von M. carbo- nacea gemäss Teil A des Beispiels 1 durch eine ent sprechende Kultur von M. carbonacea vor. aurantiaca ersetzt und sonst im wesentlichen dem Verfahren des genannten Beispiels folgt, gelangt man gleichermassen zu R-451.
<I>Beispiel 3</I> Gewinnung von R-451 durch Bebrütung von M. carbonacea in technischem Massstab A. Keimung: Man bringt eine liyophilisierte Kultur von M. carbo- nacea aseptisch in einen 300-ml-Schüttelkolben ein, der 100 ml des folgenden sterilen Nährmediums ent hält:
EMI0004.0094
Bacto-Rindfleischextrakt <SEP> 3 <SEP> g
<tb> Tryptose <SEP> <B>.............</B> <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Dextrose <SEP> <B>.............</B> <SEP> 1 <SEP> g
<tb> lösliche <SEP> Stärke <SEP> <B>........</B> <SEP> 24 <SEP> g
<tb> Hefeextrakt <SEP> <B>...........</B> <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> ...... <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> <B>........</B> <SEP> 1000 <SEP> ml Der Kolben samt Inhalt wird 4 Tage bei 35 C (oder bis gute Keimung erfolgt ist) auf einer rotierenden Schüttelmaschine (280 Touren pro Minute, 5 cm Rüttel bewegung) bebrütet.
B. Vorimpfung: Man fügt je 5 ml des durch obige Keimung erhal tenen ersten Inoculums zu drei 300-ml-Schüttelkolben, deren jeder 100 ml des obigen sterilen Nährmediums enthält, und bebrütet die Kolben samt Inhalt 72 Stun den bei 30 C auf der rotierenden Schüttelmaschine.
C. Bereitung des Inoculums: Man überträgt je 25 ml des durch obige Vor impfung erhaltenen zweiten Inoculums auf zehn 2-Liter- Kolben, deren jeder 500 ml des für die Keimung ver wendeten sterilen Nährmediums enthält, und bebrätet die Kolben samt Inhalt 72 Stunden bei 30 C auf einer rotierenden Schüttelmaschine (280 Touren pro Minute, 5 cm Rüttelbewegung). Dann werden die Kolbeninhalte vereinigt und aseptisch in einen sterilen Inoculum- kolben mit seitlichem Ansatzrohr übertragen (Gesamt volumen etwa 5 Liter).
D. Tankfermentation: Man überträgt die 5 Liter des nach Stufe C erhal tenen Inoculums aseptisch in einen etwa 130 Liter fassenden Fermenter, der 90 Liter des für die Keimung verwendeten sterilen Mediums enthält, und bebrütet 20 bis 30 Stunden aerob (bis das kompakte Zellvolumen -bestimmt durch 5 Minuten langes Zentrifugieren einer 10-ml-Probe@ bei 2800 Umdrehungen pro Minute etwa 2 bis 3 ml, das heisst 20 bis 30 %, beträgt), unter den folgenden Bedingungen: Temperatur: 35 C; Zufuhr an steriler Luft: etwa 153 Liter pro Minute; Druck: etwa 0,5 atü; Rührbewegung: 180 Umdrehungen pro Minute.
Sobald das kompakte Zeltvolumen mindestens 2 ml erreicht hat, überträgt man den Inhalt des Fermenters aseptisch in einen etwa 2500 Liter fassenden Fermen tationstank, der etwa 1665 Liter des. folgenden sterilen Mediums enthält:
EMI0005.0008
Hefeextrakt <SEP> .................... <SEP> 8,5 <SEP> kg
<tb> lösliche <SEP> Fischbestandteile <SEP> ......... <SEP> 1,7 <SEP> kg
<tb> Corn <SEP> steep <SEP> liquor <SEP> (getrocknet) <SEP> <B>......</B> <SEP> 1,7 <SEP> kg
<tb> Calciumcarbonat <SEP> ................ <SEP> 1,7 <SEP> kg
<tb> Lactose <SEP> <B>.......................</B> <SEP> 51,0 <SEP> kg
<tb> Schaumbekämpfungsmittel <SEP> ( GE <SEP> 60 ) <SEP> 500 <SEP> ml
<tb> weiches <SEP> Wasser <SEP> <B>.................</B> <SEP> 1665 <SEP> Liter Man bebrütet unter Rühren mit 120 Umdrehungen pro Minute etwa 50 bis 70 Stunden bei 35 C, wobei man pro Minute etwa 425 Liter Luft mit einem Druck: von etwa 0,5 atü zuführt.
Gegen Ende der B.ebrütungs- zeit erreicht die Aktivität des gebildeten Antibioticums ein Maximum, das im wesentlichen konstant bleibt, wie sich durch Probenahme und Testen gegen Staphylo- coccus aureus ermitteln lässt.
Während der Bebrütung bleibt das pH im wesent lichen konstant im Bereiche von 7,0 bis 7,3. Das kom pakte Zellvolumen erreicht einen konstanten Wert von etwa 2,0 ml.
E. Isolierung der antibiotischen Substanzen aus. der Tankfermentation: Zu den :etwa 1850 Litern Fermentationsbrühe nach Teil D dieses Beispiels fügt man 25 kg einer Filterhilfe ( Celite ), durchmischt und filtriert.
Der Mycelkuchen wird verworfen, das Filtrat zweimal mit einem gleich grossen Volumen Toluol extrahiert, die Toluolextrakte vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei ein dunkelbrauner öliger Rückstand hinterbleibt. Dieser wird in 1000 ml Chloroform suspendiert, filtriert und die Chloroformlösung unter heftigem Rühren zu dem zehnfachen Volumen Petroläther gefügt.
Man setzt das Rühren 5 Minuten lang fort, trennt den entstan denen halbfesten öligen Niederschlag durch Dekantieren von der überstehenden. Flüssigkeit, löst ihn in 600 ml Chloroform neuerlich auf und fügt die erhaltene Lösung unter heftigem Rühren zu dem fünffachen Volumen Petroläther. Der dabei ausfallende amorphe Nieder schlag wird abfiltriert, mit Petroläther gewaschen und an der Luft getrocknet. Ausbeute: 12,6 g; minimale Inh,ibitionskonzentration gegen Staphylococcus aureus: 1 bis 5 ,ug/ml.
F. Alternativverfahren zur Isolierung der antibioti schen Substanzen aus der Tankfermentation: Anstelle des Verfahrens von Teil E dieses Beispiels kann auch das Extraktionsverfahren von Beispiel 1 (Teil C) angewandt werden. Dabei erhält man etwa 125 g eines festen Produktes mit einer Aktivität, die derjenigen des Produktes von Beispiel 1 (C) vergleich bar ist.
G. Auftrennung der antibiotischen Substanzen in Komponenten: Hier wird im Gegensatz zu der Methode von Bei spiel 1 (D) eine Säulenchromatographie an Diatomeen- erde angewandt, mit deren Hilfe die antibiotischen Substanzen aufgetrennt und die Komponenten 11-451A, 11-451B, 11-451D, 11-451E sowie- die weitere Kompo nente 11-451C1 isoliert werden können.
Die Auftrennung der gemäss Teil E oder - weniger vorteilhaft - Teil F dieses Beispiels anfallenden anti- biotischen Substanzen erfolgt durch Verteilungschroma- tographie mit Hilfe, eines Zweiphasen Lösungsmittel systems und gereinigter Diatomeenerde (Handelsprodukt Chromosorb W der Firma Johns Manville & Co., nicht. mit Säure gewaschen,
Korngrösse 60 bis 100' mesh) als inerten Träger für die schwerere Phase. Man bereitet zu nächst ein Zweiphasen-Lösungsmittelsystem der folgen den Zusammensetzung:
EMI0005.0068
Petroläther <SEP> (Siedebereich <SEP> 60 <SEP> bis <SEP> 90 <SEP> C) <SEP> 25 <SEP> Teile
<tb> Äthylacetat <SEP> <B>......................</B> <SEP> 75 <SEP> Teile
<tb> Methylalkohol <SEP> <B>....................</B> <SEP> 70 <SEP> Teile
<tb> destilliertes <SEP> Wasser <SEP> <B>................</B> <SEP> 30 <SEP> Teile Dann bringt man 1,9 kg des inerten Trägers mit 950 ml der schwereren Phase, des obigen Zweiphasen- Lösungsmittelgemisches ins Gleichgewicht und giesst das Gemisch langsam in eine 9 cm weite, am Boden mit einer Frittenscheibe versehene Glassäule ein,
die vorher zu dreh Vierteln mit der leichteren Phase gefüllt wurde. Man lässt die Diatomeenerde sich in der Säule zu einem kompakten Bodensatz absetzen und komprimiert dann weiter mittels eines. Stickstoffdruckes von etwa 0,07 bis 0,15 atü (die Höhe der so hergestellten Säule ist 137 cm).
Nun löst man 7,0 g der amorphen Mischung aus Teil E bzw. F dieses. Beispiels in 38 ml der schwereren Phase des Zweiphasen-Lösungsmittelsystems, versetzt die Lösung mit 19g Diatomeenerde, bringt die so er haltene Mischung oben auf die Füllung der Säule auf und komprimiert fest. Man eluiert mit der leichteren Phase .des Zweiphasen-Lösungsmittelsystems.
Die Eluate werden mit einer Geschwindigkeit von 50 ml pro Minute entnommen. Die Anzahl einzelner Fraktionen ist beliebig, hängt aber von dem Holdup- Volumen (HUV) der Säule ab.
(Das HUV ist definiert als dasjenige Volumen, das die leichtere Phase des Zweiphasensystems innerhalb der gesamten Säulenfül lung einnimmt.) In der vorstehend beschriebenen Säule beträgt das HUV etwa 3500 ml. Das erste gesammelte HUV wird verworfen.
Von den darauffolgenden Frak tionen wird je eine Probe mittels des oben beschrie benen Lösungsmittel'systems I (Tabelle VI) papier- chromatographiert und das entwickelte und getrocknete Papierchromatogramm gegen Staphylococcus aureus bio- autographisch getestet.
Die Fraktionen werden entspre chend dem Testergebnis zu Gruppen vereinigt, die Fraktionsgruppen im Vakuum zur Trockne eingedampft, die Rückstände gewogen und zur Ermittlung ihrer rela tiven Zusammensetzung neuerlich papierchromatogra- phisch und bioautographisch untersucht. So gelangt man zu den Ergebnissen der Tabelle VIII.
1 g des aus HUV 3 bis 10 erhaltenen Produktes wird dann neuerlich ehromatographiert, wobei man den inerten Träger ( Chromosorb W ) für die schwerere Phase des folgenden Zweiphasen-Lösungsmittelsystems verwendet:
EMI0006.0004
Petroläther <SEP> (Siedebereich <SEP> 30 <SEP> bis <SEP> 60 <SEP> C) <SEP> 10 <SEP> Teile
<tb> Toluol <SEP> <B>..........................</B> <SEP> 200 <SEP> Teile
<tb> n-Butylalkohol <SEP> ................... <SEP> 15 <SEP> Teile
<tb> Äthylalkohol <SEP> ....................
<SEP> 15 <SEP> Teile
<tb> destilliertes <SEP> Wasser <SEP> <B>................</B> <SEP> 70 <SEP> Teile Man bringt zunächst 600 g des Diatomeenerdeträ- gers mit 300 ml der schwereren Phase des letztgenann ten Zweiphasen-Lösungsmittelsystems ins Gleichgewicht, giesst das Gemisch langsam in eine teilweise mit der leichteren Phase dieses Zweiphasen-Lösungsmittel- Systems gefüllte Glassäule mit einem Durchmesser von 5 cm, lässt den Träger sich durch seine Schwere zu einem kompakten Bodensatz absetzen und komprimiert weiter durch einen Stickstoffdruck von etwa 0,07 bis 0,15 atü.
Die Höhe der so bereiteten Säule beträgt 107 cm, und ihr Holdup-Volumen beträgt 900 ml. Darauf wird das zu chromatographierende Produkt in 10 ml der schwereren Phase gelöst, die Lösung mit 5 g des inerten Trägers versetzt und durchgemischt.
Die Mischung wird dann auf die Füllung der Säule auf gebracht und fest angepresst. Man eluiert anschliessend mit der leichteren Phase des Zweiphasen-Lösungsmittel- systems bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 100 ml pro Miunte. Man entnimmt dabei kontinuierlich Frak tionen von 50 bis 900 ml (entsprechend 1/1$ bis 1/1 des HUV der Säule).
Das erste HUV, das unmittelbar nach dem Aufbringen des Produktes anfällt, wird verworfen, das zweite und die folgenden werden gesammelt.
Eine Probe jeder gesammelten Fraktion wird so fort mittels des Lösungsmittelsystems I (Tabelle VI) papierchromatographiert und das entwickelte und ge trocknete Papierchromatogramm gegen Staphylococcus aureus bioautographisch getestet.
(Lösungsmittelsystem I wird bevorzugt, weil es am raschesten wandert.) Die Fraktionen werden entsprechend ihren papierchromato- graphischen Daten gruppenweise vereinigt und im Va kuum zur Trockne eingedampft, die Rückstände gewo gen und neuerlich einer Papierchromatographie und bioautographischen Testung unterzogen, um ihre Zu sammensetzung zu bestätigen. Das Ergebnis der so er folgten säulenchromatographischen Auftrennung ist in Tabelle IX gezeigt.
<I>Beispiel 4</I> Gewinnung von R-451 durch Bebrütung von von M. carbonacea var. aurantiaca in technischem Massstab Wenn man die lyophilisierte Kultur von M. carbo- nacea, wi;:
sie in Teil A von Beispiel 3 verwendet wird, durch eine entsprechende Kultur von M. carbonacea var. aurantiaca ersetzt und sonst dem Verfahren des Beispiels 3 (Teile A bis D, dann E oder F, schliesslich G) folgt, so gelangt man in gleicher Weise zu R-451.
<I>Beispiel 5</I> Abtrennung von Komponente R-451D aus R-451 Man suspendiert 100 mg des Rückstandes aus HUV 1,5 bis 14 gemäss Tabelle IX [Beispiel 3 (G)], oder der entsprechenden Fraktion des Beispiels 4, bei Zimmer temperatur unter heftigem Rühren in 40 ml Äther, filtriert und lässt das Filtrat über Nacht in der Kälte stehen.
Der dabei ausfallende Niederschlag wird abfil- triert, mit eiskaltem Äther gewaschen und an der Luft getrocknet, wobei man etwa 81 mg R-451D in Form eines nahezu farblosen Pulvers mit einem Prüfwert von 1155 Einheiten pro mg erhält.
Das so erhaltene R-451D erweist sich bei quantita tiver Prüfung gegen Staphylococcus aureus als biolo gisch homogen. Wenn man es nach der Methodik von Stahl unter Verwendung von Aceton-Benzol (1:l) als Elutionsmittel an einer dünnen Schicht Silikagel chromatographiert und die entwickelte und getrocknete Platte anschliessend mit Schwefelsäure behandelt, so lässt sich keine andere Substanz als R-451D- entdecken.
<I>Beispiel 5A</I> Das Produkt von Beispiel 5 kann weiter gereinigt werden, wie folgt: Man löst in möglichst wenig heissem Isopropanol, fügt Aktivkohle (etwa 10,'ö' des Gewichtes der zu reinigenden Substanz) zu, filtriert und kühlt in einem Eisbad. Der entstandene Niederschlag wird ab filtriert, mit kaltem Isopropanol gewaschen und im Hochvakuum bei Zimmertemperatur getrocknet. Das so, gereinigte Produkt hat einen Prüfwert von 1450 Ein heiten pro mg.
Der dabei ausfallende Niederschlag wird abfiltriert, mit eiskaltem Äther gewaschen und an der Luft ge trocknet, wobei man etwa 81 mg eines nahezu farblosen Pulvers mit einem Prüfwert von 1155 Einheiten pro mg erhält, das hochgradig reines R-451D ist.
Das so erhaltene gereinigte R-451D erweist sich bei quantitativer Prüfung gegen Staphylococcus aureus als biologisch homogen. Wenn man es nach der Methodik von Stahl unter Verwendung von Aceton-Benzol (1 : 1) als Elutionsmittel an einer dünnen Schicht Silikagel chromatographiert und die entwickelte und getrocknete Platte anschliessend mit Schwefelsäure behandelt, so lässt sich keine andere Substanz als R -451D entdecken.
<I>Beispiel 6</I> Herstellung von R-451D-Acetat Man löst 25 mg R-451D in 1 ml Pyridin, versetzt mit 0,4 ml Essigsäureanhydrid und lässt die Mischung über Nacht stehen. Dann wird der ausgefallene Nieder schlag abfiltriert, zur Entfernung des Pyridins und der entstandenen Essigsäure mit Wasser gewaschen und über Nacht im Hochvakuum über Phosphorpentoxyd getrocknet. Ausbeute: 11 mg eines farblosen amorphen Pulvers, Fp. = 135-136 C.
Eine zweite Menge lässt sich aus der Mutterlauge des genannten Niederschlages durch Kühlen über Nacht im Eisschrank (5 C), Ab filtrieren des Niederschlages, Freiwaschen von Pyridin und Essigsäureanhydrid sowie Trocknen, wie oben an gegeben, erzielen. Ausbeute: 6 mg eines. farblosen, amorphen Pulvers.
Wenn man das Produkt an einer dünnen Schicht chromatographiert, wobei man als Adsorbens Silikagel (Handelsprodukt Silikagel G der Firma E. Merek AG, Darmstädt) und als Eluierungssystem Aceton-Benzol (1 : 1) verwendet, und die entwickelte und getrocknete Platte mit Schwefelsäure besprüht, so lässt sich nur eine einzige Komponente mit dem RF-Wert 0,87 feststellen.
(Unter diesen Bedingungen hat R-451D einen RF-Wert von 0,49.) Bei alkalischer Hydrolyse in Methanol wird aus R-451D-Acetat das eingesetzte R-451D rück gebildet. <I>Beispiel 6A</I> Das Produkt von Beispiel 6 lässt sich weiter reini gen, wie folgt: Man löst in Methylenchlorid, fügt Aktiv kohle zu, filtriert und versetzt das klare Filtrat mit Hexan. Der Niederschlag wird abfil'triert und an der Luft getrocknet.
<I>Beispiel 7</I> Abtrennung der Komponente R-451E Diese unpolare Komponente der Antibioticami- schung findet sich gewöhnlich in hoher Konzentration in der überstehenden Flüssigkeit der Chloroform-Petrol- äther-Fällung, die in Teil E des Beispiels 3 beschrieben ist, und in der entsprechenden gemäss Beispiel 4 erhal tenen Fraktion. In geringerer Menge ist sie auch in den ausgefällten antibiotischen Substanzen enthalten und kann von da mit Hilfe des, Säulenchromatographie- verfahrens, das in Teil G des Beispiels 3 beschrieben ist, isoliert werden.
Zur Gewinnung von R-451E wird die Fraktion HUV 1 bis 1,5 (Tabelle IX) im Vakuum zur Trockne eingedampft und an der Luft getrocknet. So erhält man etwa 320 mg einer bernsteinfarbenen Substanz, von der man weiter durch Umfällen aus Äther-Hexan zu 280 mg eines nahezu farblosen amor phen Pulvers, gereinigtem R-451 E, gelangt.
Nach dem Ergebnis einer papierchromatographischen Untersuchung in System I (Tabelle VI) und anschliessender Bioauto- graphie gegen Staphylococcus aureus und Bacillus sub- tilis zu schliessen, ist das so hergestellte Antibioticum R-451E biologisch homogen.
<I>Beispiel 8</I> Abtrennung der Komponenten R-45113, R-451C1 und R -451A A. Vortrennung: Die Abtrennung der obengenannten Komponenten aus der rohen Antibioticamischung wird durch eine Verteilungschromatographie ähnlich der in Teil G des Beispiels 3 beschriebenen eingeleitet, wobei man ein Zweiphasen-Lösungsmittel'system und eine gereinigte Diatomeenerde (Handelsprodukt Chromosorb W der Firma Johns Manville & Co., nicht mit Säure gewa schen, Korngrösse 60 bis 100 mesh)
als inerten Träger für die schwerere Phase verwendet: Man stellt zunächst das Zweiphasensystem (Petrol- äther, Äthylacetat, Methanol, Wasser) her, wie in Bei spiel 3 (G) beschrieben. Dann bringt man 2,5 kg des inerten Trägers mit 1250 ml der schwereren Phase des Zweiphasen-Lösungsmittelgemisches ins Gleichgewicht und füllt die Säule wie in Beispiel 3 (G) beschrieben. Das HUV dieser Säule beträgt etwa 8000 ml.
Nun löst man 7,4 g der amorphen Mischung nach Beispiel 3 (E) oder der entsprechenden gemäss Beispiel 4 erhaltenen Fraktion in 40 ml der schwereren Phase des Zweiphasen-Lösungsmittelsystems, fügt 20 g Diato- meenerde zu, gibt die feste Mischung oben auf die Säulenfüllung auf und komprimiert fest. Man eluiert mit der leichteren Phase des Zweiphasen-Lösungsmittel- systems. Nach dem in Beispiel 3 (G) beschriebenen säulenchromatographischen Trennverfahren gelangt man zu den Ergebnissen der Tabelle X.
Wie man sieht, wer den die Komponenten R-451B und R-451C1 in der Fraktionengruppen HUV 1,9 bis 2,8, die Komponente R-451A in der Fraktionengruppe HUV 4,0 bis 5,0 an gereichert.
B. Trennung von R -451B und R-451C1 voneinander: Man chromatographiert 1,8 g des Rückstandes der bei der vorstehenden chromatographischen Trennung anfallenden Fraktionengruppe HUV 1,9 bis 2,8 -an 1.800 g Cellulosepulver (Marke Whatman, nicht mit Säure gewaschen, fein), das sich in einer Säule mit 7,5 cm Durchmesser und 150 cm Höhe befindet, wobei man das folgende einphasige Lösungsmittelgemisch ver wendet:
EMI0007.0068
Aceton <SEP> ......................... <SEP> 1 <SEP> Teil
<tb> Petroläther <SEP> (Siedebereich <SEP> 30 <SEP> bis <SEP> 60 <SEP> C) <SEP> 25 <SEP> Teile
<tb> Benzol <SEP> ......................... <SEP> 50 <SEP> Teile Man löst die zu chromatographierende Substanz in 68 ml des Lösungsmittelgemisches, fügt 50 g Cellulose bei und bringt das Gemisch oben auf die Säule auf. Dann eluiert man mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 50 ml pro Minute, wobei man kontinuierlich Frak tionen ä<B>100</B> ml entnimmt.
Das HÜV dieser Säule be trägt etwa 6000 ml. Die Eluate werden gruppenweise vereinigt, wie in Tabelle XI gezeigt. Wie ersichtlich, wird die Komponente R-451B in der Fraktionengruppe HUV 17,7 bis 27,7, die Komponente R-451C1 in der Fraktionengruppe- HUV 1,7 bis 17,6 angereichert.
C. Reinigung von R-451B: Man löst 200 mg des aus der Fraktionengruppe HUV 17,7 bis 27,7 (Tabelle XI) erhaltenen Rück standes in 5 ml Aceton und giesst die Acetonlösung unter heftigem Schütteln in 50 ml Hexan. Der aus fallende Niederschlag wird abfiltriert, mit Hexan ge waschen und bei Zimmertemperatur im Vakuum über Phosphorpentoxyd getrocknet, wobei man zu 120 mg eines nahezu weissen Pulvers gelangt.
Das so erhaltene R-451B kann mit Spuren anderer Komponenten ver unreinigt sein; wenn man es jedoch nach der Methode von Stahl an einer dünnen Silikagelschicht unter Ver wendung von Aceton-Benzol (1 :1) als Elutionsmittel chromatographiert und die entwickelte, getrocknete Platte anschliessend mit Schwefelsäure behandelt, so ist nur eine einzige Substanz nachweisbar, so dass also eine weitere Reinigung nicht nötig ist.
D. Reinigung von R-451C1: Man löst 100 mg des aus der Fraktionengruppe HUV 1,7 bis 17,6 (Tabelle XI) erhaltenen Rückstandes in 5 ml Aceton und giesst die Lösung unter heftigem Schütteln in 50 ml Isopropyläther. Der ausfallende Niederschlag wird abfiltriert, mit Isopropyläther gewa schen und bei Zimmertemperatur im Vakuum über Phosphorpentoxyd getrocknet. Man gelangt so zu etwa 70 mg eines nahezu weissen, aus R-451C1 bestehenden Pulvers.
Das so erhaltene Produkt ist, wie aus quanti tativer Testung gegen Staphylococcus aureus folgt, im wesentlichen biologisch homogen.
E. Reinigung von R-451A: Man schlämmt 100 mg des von der Fraktionen gruppe HUV 4,0 bis 5,0 aus der Diatomeenerdesäule (Tabelle X) erhaltenen Rückstandes in 1.0 ml Dichlor- methan auf, filtriert, wäscht den festen Rückstand mit Dichlormethan und trocknet ihn bei Zimmertemperatur im Vakuum über Phosphorpentoxyd. So erhält man 70 mg eines weisslichen, aus R-451A bestehenden Pulvers.
<I>Beispiel 9</I> Statt nach dem in Beispiel 8 (Teile A bis C) be schriebenen Verfahren kann R-451B auch wie folgt isoliert werden: Man bereitet eine 64 cm hohe Chroma tographiesäule mit einem Durchmesser von etwa 50 mm, indem man eine Aufschlämmung in Methylen- chlorid von 500 g Florisil (60-100 Mesh), das 18 Stunden bei l05 C aktiviert wurde, in eine Glassäule giesst - das Hold-up-Volumen der so bereiteten Säule ist 1100 ml.
Man löst 50 g des amorphen rohen Anti bioticums, wie man es aus Beispiel 3 (Teil E) erhält, in 300 ml Methylenchlorid und gibt die erhaltene klare Lösung auf die Florisil -Säule auf. Zur Elution schickt man erst
EMI0008.0012
4 <SEP> HUV <SEP> Methylenchlorid, <SEP> dann
<tb> 8 <SEP> HUV <SEP> Methylenchlorid-Aceton <SEP> <B>(95:</B> <SEP> 5), <SEP> hierauf
<tb> 8 <SEP> HUV <SEP> Methylenchlorid-Aceton <SEP> (90: <SEP> 10), <SEP> weiter
<tb> 8 <SEP> HUV <SEP> Methylenchlorid-Aceton <SEP> <B>(80:</B> <SEP> 20),
<tb> 8 <SEP> HUV <SEP> Methylenchlorid-Aceton <SEP> (50: <SEP> 50)
<tb> und <SEP> schliesslich
<tb> 16 <SEP> HW- <SEP> reines <SEP> Aceton durch die Säule.
Tabelle XIA zeigt das Ergebnis dieser Auftrennung, wobei die eingeklammerten Buchstaben in der rechten Tabellenspalte die in der betreffenden Frak tion vorliegenden R-451-Komponenten bezeichnen.
Das nach dem vorstehenden Absatz oder nach Bei spiel 8 (Teile A bis C) erhaltene Produkt kann weiter gereinigt werden, wie folgt: Man löst das amorphe Pulver in heissem Isopropanol, fügt Aktivkohle (etwa 10 % des Gewichtes der zu reinigenden Substanz) zu, rührt 10 Minuten, filtriert und kühlt das Filtrat auf 5 C. Der sich abscheidende Niederschlag wird auf einem Filter gesammelt, mit kaltem Isopropanol' ge waschen und 24 Stunden bei Zimmertemperatur im Hochvakuum getrocknet. Das Produkt hat einen Prüf- wert von 760 Einheiten: pro mg.
<I>Physikalische</I> und <I>chemische</I> Eigenschaften <I>der nach</I> <I>obigen Beispielen</I> gewonnenen Antibiotica Rohes R-451, hergestellt nach Beispiel 1 (D), ist eine farblose amorphe Substanz mit den folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften: I. Schmelzpunkt: 200-204 C.
II. Analysenwerte (qualitative Gruppenbestimmung): 1. Ninhydrintest: negativ.
2. Ferrichlorid: negativ. III. Optische Drehung:
EMI0008.0039
-16 (0,5 % in Chloroform). IV. Löslichkeit: Löslich in Wasser; unlöslich in Petroläther; löslich in den meisten organischen Lösungsmitteln; in einem Methanol-Methanol-System durch eine Cellophan membrane dialysierbar.
V. Ultraviolettspektrum: Fig. 1 der Zeichnungen zeigt das Absorptions spektrum für eine Konzentration in Methanol von 5 g/100 ml (A bedeutet die Wellenlänge in mu, D die optische Dichte): dm#"X bei 288 mu (EM- = 50).
VI. Infrarotspektrum: Fig. 2 der Zeichnungen stellt das Spektrum in Nujol * dar, wobei 2. die Wellenlänge in ,u, y die Fre quenz in cm-' und A die Absorption bedeuten.
Die Absorptionsmaxima (schw = schwach, m = mittel, m-st = mittel bis stark, st = stark, sst = sehr stark, Sch = Schulter) befinden sich bei den folgenden Wellen längen:
EMI0008.0064
A. <SEP> (u) <SEP> Intensität
<tb> 2,92.......: <SEP> st
<tb> 5,84........ <SEP> m
<tb> 6,00
<tb> 6,12 <SEP> m <SEP> (breit)
<tb> 6,45........ <SEP> m-st
<tb> 8,00........ <SEP> Sch
<tb> 8;07........ <SEP> st
<tb> 8,33........ <SEP> m-st
<tb> 8,55........ <SEP> Sch
<tb> 9,10 <SEP> <B>........</B> <SEP> st <SEP> (breit)
<tb> 9,60........ <SEP> st <SEP> (breit)
<tb> 10,26........ <SEP> m-st
<tb> 10,55........ <SEP> m-st
<tb> 11,02........ <SEP> schw VII. Stabilität:
Bei PH < 7 schon bei 20 C instabil. Bei pH > 7 bleibt die Aktivität noch nach 30 Minuten langem Er hitzen auf 100 C erhalten.
VIII. Papierchromatographische Daten: Bei papierchromatographischer Untersuchung, wie unten ausgeführt, und bioautographischer Ermittlung der Fleckenverteilung (gegen Staphylococcus aureus, wie oben beschrieben) gelangt man zu den folgenden RF- Werten für R-451:
EMI0008.0080
Angewandtes <SEP> Lösungsmittelsystem <SEP> RF-Werte
<tb> A: <SEP> <B>80,',</B> <SEP> iges <SEP> wässriges <SEP> Methanol <SEP> + <SEP> 3
<tb> Natriumchlorid; <SEP> aufsteigend;
<SEP> Papier
<tb> vorher <SEP> mit <SEP> Sulfat-Bisulfat <SEP> auf <SEP> pH <SEP> = <SEP> 2,3
<tb> gepuffert <SEP> 0,80
<tb> B,: <SEP> n-Propanol-Pyridin-Wasser-Essigsäure
<tb> (15: <SEP> 10:3: <SEP> 12); <SEP> aufsteigend <SEP> 1,0
<tb> C: <SEP> n-Propanol-Wasser-Essigsäure
<tb> (50 <SEP> : <SEP> 40: <SEP> 5); <SEP> aufsteigend <SEP> 0,93
<tb> D: <SEP> 80 <SEP> % <SEP> iges <SEP> wässriges <SEP> Phenol; <SEP> aufsteigend <SEP> 0,95
<tb> E: <SEP> Benzol <SEP> Methanol <SEP> <B>(9:</B> <SEP> 1); <SEP> aufsteigend <SEP> 1,0
<tb> F: <SEP> Benzol-Chloroform <SEP> (95:5); <SEP> absteigend;
<tb> Papier <SEP> zuerst <SEP> mit <SEP> Formamid-Methanol
<tb> (1 <SEP> : <SEP> 1) <SEP> gesättigt <SEP> und <SEP> vor <SEP> Verwendung
<tb> (zur <SEP> Entfernung <SEP> des <SEP> Methanols) <SEP> an <SEP> der
<tb> Luft <SEP> getrocknet <SEP> 0,0
<tb> G:
<SEP> Benzol <SEP> Petroläther <SEP> (Siedebereich <SEP> 30
<tb> bis <SEP> 60 <SEP> C) <SEP> Aceton <SEP> (10 <SEP> : <SEP> 2,5 <SEP> : <SEP> 5);
<tb> absteigend <SEP> 0,0; <SEP> 0,14
<tb> 0,28; <SEP> 0,64 * Nujol ist eine Handelsmarke für ein Mineralöl auf Kohlenwasserstoffbasis, hinreichend rein für die Infrarotspektro- skopie, erhältlich von der Firma Plough Inc., Memphis, Ten- nessee. Von den Einzelkomponenten von R-451 ist die Komponente R-451A, erhalten nach dem Verfahren von Beispiel 8 (E),
eine farblose amorphe Substanz mit den folgenden Eigenschaften: I. Ultraviolettspektrum: Transparent im Bereiche von 220 bis 360 mu. II. Infrarotspektrum: (Spektrum in Nujol>, siehe Fig. 3 der Zeichnungen.} Absorptionsmaxima (alle breit und stark ausgeprägt) befinden sich bei folgenden Wellenlängen: 2,90, 6,25, 8,25-10,00 ,u.
R-451B, hergestellt nach Beispiel 8 (C), ist eine farblose amorphe Substanz mit den folgenden Eigen schaften: I. Ultraviolettspetkrum: Transparent im Bereiche von 220 bis 360 my. II. Infrarotspektrum:
(Spektrum in Nujoln, siehe Fig. 4 der Zeichnungen.) Absorptionsmaxima (mit Intensitäten wie angegeben) befinden sich bei den folgenden Wellenlängen.
EMI0009.0018
Intensität
<tb> 2,94........ <SEP> m-st
<tb> 5,72........ <SEP> st
<tb> 5,80<B>........</B> <SEP> m <SEP> -st
<tb> 7,92........ <SEP> m-st
<tb> 8,60........ <SEP> m-st
<tb> 9,10 <SEP> <B>........</B> <SEP> st <SEP> (breit)
<tb> 9,64........ <SEP> st <SEP> (breit)
<tb> 12,50<B>........</B> <SEP> m-st <SEP> (breit)
<tb> 13,90<B>........</B> <SEP> m-st <SEP> (breit) Für das gemäss Beispiel 9, Absatz 2, gereinigte Pro dukt wurden die folgenden Kennwerte ermittelt: I.
Schmelzpunkt (Kofler-Block): 154 bis 157 C. 1I. Optische Drehung:
EMI0009.0023
= -25,5 (l% in Pyridin). III. Ultraviolettabsorption: = 228 mu <B>(EI-/-</B> = 12 in Methanol).
@max = 296 mg (Et% = 72 in 0,1n methanolischer NaOH).
IV. Anlaysenwerte: a) Elementaranalyse: C 51;02 % H 6,68 % N 1,23 %<B>0</B> 34,72 % Cl 3,97 %.
b) Quantitative Gruppenbestimmung: Methoxygruppen = 12,80%. C-Methylgruppen = 7,15%. N-Methylgruppen =<B>2,33%.</B>
V. Infrarotspektrum (in Nujol Absorptionsmaxima (mit Intensitäten wie angegeben) befinden sich bei den folgenden Wellenlängen:
EMI0009.0043
.l <SEP> (u) <SEP> Intensität
<tb> 2,88........ <SEP> st
<tb> 3,35-3,48 <SEP> ... <SEP> st <SEP> (breit)
<tb> 3,65........ <SEP> schw
EMI0009.0044
2. <SEP> (u) <SEP> Intensität
<tb> 4,54........ <SEP> schw.
<tb> 4,65........ <SEP> schw
<tb> 5,74........ <SEP> st
<tb> 5,82........ <SEP> Sch
<tb> 6,02........ <SEP> Sch
<tb> 6,10........ <SEP> m
<tb> 6,35-6,39 <SEP> ... <SEP> m <SEP> (Dublett)
<tb> 6,45........ <SEP> st
<tb> 6,78-6,87 <SEP> ... <SEP> st <SEP> (breit)
<tb> 7,24........ <SEP> st
<tb> 7,30........ <SEP> Sch
<tb> 7,40........
<SEP> Sch
<tb> 7,67-7,80 <SEP> ... <SEP> Sch
<tb> 7,92........ <SEP> Sch
<tb> 7,98........ <SEP> st
<tb> 8,12........ <SEP> Sch
<tb> 8,30-8,35 <SEP> ... <SEP> st <SEP> (breit)
<tb> 8,55........ <SEP> Sch
<tb> 8,75-9,80 <SEP> ... <SEP> st <SEP> (breit)
<tb> 10,20-10,26 <SEP> .. <SEP> st <SEP> (breit)
<tb> 10,30........ <SEP> Sch
<tb> 10,33........ <SEP> Sch
<tb> 10,61........ <SEP> st
<tb> 10,85........ <SEP> Sch
<tb> 11,03........ <SEP> m
<tb> l1,52........ <SEP> m
<tb> 11,70........ <SEP> Sch
<tb> 11,85-12,00.. <SEP> Sch
<tb> 12,75-12,81 <SEP> .. <SEP> schw <SEP> (breit)
<tb> 12,98........ <SEP> schw
<tb> 13,54-13,60. <SEP> . <SEP> m <SEP> (breit)
<tb> 13,85-13,90 <SEP> .. <SEP> m <SEP> (breit) VI. Löslichkeit:
Löslich in Chlorkohlenwasserstoffen (Methylen- chlorid, Chloroform), Alkohol, Aceton, Pyridin und verdünntem Alkali; wenig löslich in Benzol; unlöslich in Äther, Hexan und Wasser.
R 451D, hergestellt wie vorstehend beschrieben, ist ein weisses amorphes Pulver mit den folgenden physika lischen und chemischen Eigenschaften: I. Schmelzpunkt (im Kofler-Block): Produkt nach Beispiel 5 138 bis 140 C. Produkt nach Beispiel' 5A 160 bis 161 C. II. Analysenwerte: a) Elementaranalyse des Produktes nach Beispiel 5: C 52,02 % H 6,81 % N 0,72 % Cl 5,04 %. b) Elementaranalyse des Produktes nach Beispiel 5A: C<B>51,79%</B> H 6,35% N 1,40% Cl<B>3,98%,</B> O 36,35%.
c) Quantitative Gruppenbestimmung des Produktes nach Beispiel 5: -OCHS = 14,15%. d) Quantitative Gruppenbestimmung des Produktes nach Beispiel 5A: -OCHS = 13,30%, C-Methyl =<B>6,93%,</B> N-Methyl =<B>1,98%.</B>
e) Qualitative Gruppenbestimmung:
EMI0010.0008
1. <SEP> Ninhydrintest <SEP> <B>.............</B> <SEP> negativ
<tb> 2. <SEP> Elson-Morgan-Test <SEP> <B>.........</B> <SEP> positiv
<tb> 3. <SEP> Test <SEP> mit <SEP> alkalischem <SEP> KMn04. <SEP> . <SEP> positiv
<tb> 4. <SEP> Anthrontest <SEP> <B>...............</B> <SEP> graublau
<tb> 5. <SEP> 2,4-Dinitro-phenylhydrazintest <SEP> . <SEP> positiv
<tb> 6. <SEP> Ehrlich-Test <SEP> (Diphenylamin) <SEP> . <SEP> . <SEP> negativ
<tb> 7. <SEP> Triphenyl-tetrazoliumtest <SEP> .... <SEP> negativ III. Optische Drehung:
Produkt nach Beispiel 5
EMI0010.0010
= -i- 29,2 (1 % in Dioxan) Produkt nach Beispiel 5A -37,7" (1 % in Pyridin)
EMI0010.0014
= -25,3 (1 % ihn Methanols) IV. Löslichkeit: Sehr gut löslich in Chloroform, Methylenchlorid, Aceton und Methanol sowie O,ln Natriumhydroxyd; wenig löslich in Äther;
unlöslich in Petroläther, Toluol, Benzol, Wasser und 10 % iger wässriger Natriumbicarbo- nat- oder -carbonatlösung.
V. Ultraviolettspektrum: Fig. 1 der Zeichnungen: zeigt das Spektrum in Methanol des Produktes nach Beispiel 5 bei einer Konzentration von 2,97 mg/100 ml; Am"" bei 290 bis 295 mu (EM, = 37); der entsprechende Wert für das Produkt nach Beispiel 5A beträgt .1m@X = 289 mu (EM- = 22).
In einer Lösung von 6 ml 1,0n methano- lischer Kaliumhydroxydlösung, mit Methanol auf 100 ml aufgefüllt, beträgt das EM- für beide Produkte 79; das Am", des Produktes nach Beispiel 5A ist auf 295 my verschoben.
VI. Infrarotspektrum: Fig. 5 der Zeichnungen zeigt das Spektrum in Nujol des Produktes nach Beispiel 5. Die Absorp- tionsmaxima befinden sich bei den folgenden Wellen längen:
EMI0010.0056
2. <SEP> (u) <SEP> Intensität
<tb> 2,88........ <SEP> st
<tb> 5,73........ <SEP> st
<tb> 6,13 <SEP> <B>........</B> <SEP> m-st
<tb> 6,33........ <SEP> m-st
<tb> 6,45........ <SEP> st
<tb> 7,98........ <SEP> st
<tb> 8,32........ <SEP> st
<tb> 8,50........ <SEP> st
<tb> 10,M........ <SEP> st
<tb> 10,22........ <SEP> st
<tb> 10,55........ <SEP> st
<tb> 11,00<B>........</B> <SEP> m <SEP> -st
<tb> 11,55........ <SEP> m-st
<tb> 12,30........ <SEP> sches
<tb> 12,98........ <SEP> sches
EMI0010.0057
Ä. <SEP> (,u) <SEP> Intensität
<tb> 13,55........ <SEP> m-st
<tb> 13,87........ <SEP> m-st Für das Produkt nach Beispiel 5A wurden die fol genden Werte gemessen:
EMI0010.0058
.1 <SEP> (u) <SEP> Intensität
<tb> 2,89........ <SEP> st
<tb> 3,35-3,48 <SEP> <B>...</B> <SEP> st <SEP> (breit)
<tb> 5,73........ <SEP> st
<tb> 6,12 <SEP> <B>........</B> <SEP> sches
<tb> 6,35........ <SEP> Sch
<tb> 6,45........ <SEP> st
<tb> 6,77-6,82 <SEP> ... <SEP> st
<tb> 7,10........ <SEP> Sch
<tb> 7,24........ <SEP> st
<tb> 7,30........ <SEP> Sch
<tb> 7,42........ <SEP> st
<tb> 7,68-7,84 <SEP> ... <SEP> st <SEP> (breit)
<tb> 7,99........ <SEP> st
<tb> 8,33........ <SEP> st
<tb> 8,48-8,70 <SEP> ... <SEP> Sch
<tb> 8,84-9,17 <SEP> ... <SEP> st <SEP> (breit)
<tb> 9,57........ <SEP> st <SEP> (breit)
<tb> 10,00........ <SEP> Sch
<tb> 10,22-10,26 <SEP> .. <SEP> st <SEP> (Dublett)
<tb> 10,55........ <SEP> st
<tb> 10,91........ <SEP> Sch
<tb> 11,00........ <SEP> m
<tb> 11,50-11,60 <SEP> .. <SEP> m <SEP> (breit)
<tb> 11,66........
<SEP> Sch
<tb> 11,90-12,00 <SEP> .. <SEP> m <SEP> (breit)
<tb> 12,25-12,35 <SEP> .. <SEP> sches <SEP> (breit)
<tb> 12,70-12,85 <SEP> .. <SEP> sches <SEP> (breit)
<tb> 13,00........ <SEP> sches
<tb> 13,52-13,60 <SEP> .. <SEP> sches <SEP> (breit)
<tb> 13,85-13,90. <SEP> . <SEP> sches <SEP> (breit)
<tb> 14,42-14,58. <SEP> . <SEP> sches <SEP> (breit) VII. Bildung von Derivaten: Acetat, hergestellt nach Beispiel 6: Fp. = 135-136 C; nach Reinigung gemäss Bei spiel 6A: Fp.= 151-160 C.
Ultraviolettabsorptionsmaximum bei 285 bzw. 286 mu <B>(EI/-</B> = 9,2).
Elementaranalyse: C 53,08% H 7,08% N<B>0,77%</B> Infrarotabsorptionsband (in Nujol ) bei den fol genden Wellenlängen:
EMI0010.0069
.@ <SEP> (u) <SEP> Intensität
<tb> 2,85........ <SEP> sches <SEP> (breit)
<tb> 5,57<B>........</B> <SEP> m <SEP> -st
<tb> 5,7l........ <SEP> st
<tb> 6,14 <SEP> <B>........</B> <SEP> sches
<tb> 6,45........ <SEP> m-st
EMI0011.0001
<B><U>#</U></B> <SEP> (u) <SEP> Intensität
<tb> 8,02........ <SEP> st
<tb> 8,38........ <SEP> m-st
<tb> 8,88........ <SEP> st
<tb> 9,17........ <SEP> st
<tb> 9,55........ <SEP> st VIII. Stabilität:
R-451D ist bei 0 C und in der Dunkelheit stabil. Bei Zimmertemperatur im direkten Sonnenlicht nimmt die Aktivität nach 24 Stunden langsam ab und ist nach etwa 3 Wochen vollständig verschwunden. Gelöst in Methanol, ist R-451D mindestens 2 Wochen stabil. Bei einem pH unterhalb 5,5 geht die Aktivität rasch ver loren, wogegen bei einem pH von mehr als 7 und bis zu 14 die Aktivität mehrere Tage lang erhalten bleibt.
Bei Behandlung mit 0,1n methanolischer Chlorwasser stoffsäure bei Zimmertemperatur geht die antibiotische Aktivität innerhalb 16 Stunden verloren; behandelt man die saure Mischung mit einer stöchiometrischen Menge 2%Iger wässriger Natriumbicarbonatlösung, dampft an schliessend das Methanol im Vakuum ab und extrahiert mit Chloroform, so erhält man, wie sich durch Dünn schichtchromatographie an Silikagel mit Benzol-Aceton (75:25) als Lösungsmittel und anschliessendes Be sprühen mit Schwefelsäure feststellen lässt, eine Mi schung von fünf Komponenten, die sämtlich weniger polar als R-451D sind.
Bei 16stündigem Behandeln mit 1,0n NaOH-Lösung bei Zimmertemperatur bleibt die Aktivität vollständig erhalten.
R-451E, isoliert und gereinigt wie in Beispiel 7 beschrieben, ist ein nahezu farbloses amorphes Pulver mit den folgenden physikalischen und chemischen Eigen schaften: I. Schmelzpunkt: 89-96 C. II. Analysenergebnisse: a) Elementaranalyse: C 65,17 % H 7,54 % N 1,31 %<B>0</B> 24,23 %.
b) Qualitative Gruppenbestimmungen:
EMI0011.0021
1. <SEP> Ninhydrintest <SEP> <B>..............</B> <SEP> negativ
<tb> 2. <SEP> Elson-Morgan-Test <SEP> <B>.........</B> <SEP> positiv
<tb> 3. <SEP> Test <SEP> mit <SEP> alkalischem <SEP> KMnOi. <SEP> . <SEP> positiv
<tb> 4. <SEP> Anthrontest <SEP> ............... <SEP> positiv
<tb> 5. <SEP> 2,4-Dinitro-phenylhydrazin-Test <SEP> positiv
<tb> 6. <SEP> Ehrlich-Test <SEP> (mit <SEP> Diphenylamin) <SEP> negativ
<tb> 7. <SEP> Triphenyl-tetrazoliumtest <SEP> ..... <SEP> positiv III. Optische Drehung:
EMI0011.0023
= + 36,7 (1 % in Dioxan). IV.
Löslichkeit: Löslich in Chloroform, Methylenchlorid, Aceton, Methanol und Äther; schlecht löslich in Benzol, Toluol und Hexan; unlöslich in Wasser.
V. Ultraviolettspektrum: Fig. 1 der Zeichnungen zeigt das Spektrum in Methanol bei einer Konzentration von 3,0 mg/100 ml: A.",;,, = 240 mu (Et", = 232).
VI. Infrarotspektrum: (Spektrum in Nujob>, siehe Fig. 6 der Zeichnungen.) Die Absorptionsmaxima (Intensitäten wie angege ben) befinden sich bei den folgenden Wellenlängen:
EMI0011.0040
.1 <SEP> (u) <SEP> Intensität
<tb> 2,94........ <SEP> m-st
<tb> 5,68........ <SEP> st
<tb> 5,76........ <SEP> st
<tb> 5,83........ <SEP> st
<tb> 6,00........ <SEP> sst
<tb> 6,16<B>........</B> <SEP> m-st
<tb> 6,22........ <SEP> m-st
<tb> 7,87........ <SEP> sst
<tb> 8,31........ <SEP> schw
<tb> 8,55........ <SEP> schw
<tb> 8,96........ <SEP> schw
<tb> 9,33........ <SEP> schw
<tb> 9,55........ <SEP> schw
<tb> 9,77........ <SEP> m-st
<tb> 10,50........ <SEP> schw
<tb> 10,90........ <SEP> schw
<tb> 11,26........ <SEP> m-st
<tb> 11,42........ <SEP> schw
<tb> l2,22........
<SEP> schw
<tb> 12,62<B>........</B> <SEP> m <SEP> -st <I>Biologische</I> Eigenschaften <I>der</I> nach <I>obigen Beispielen</I> <I>erhaltenen</I> Antibiotica Die Antibiotica der R-451-Gruppe, besonders R-451 und R-451D, haben einen breiten Wirkungsbereich gegen grampositive Organismen.
Sie sind von beson derem Wert für die Behandlung von Krankheiten, die durch penicillinresistente Mikroorganismen hervor gerufen wurden (siehe Tabellen XII und XVI). Ausser dem sind sie zur Behandlung von durch Staphylococcus aureus, Diplococcus pneumoniae und andere pathogene Mikroorganismen hervorgerufenen Krankheiten brauch bar.
Die Antibiotica der R-451-Gruppe sind auch gegen gewisse durch Penicillin. angreifbare Mikroorganismen wirksam; es hat sich jedoch gezeigt, dass sie nicht zu den Penicillinen gehören, was daraus hervorgeht, dass weder R-451 noch R-451D durch Penicillinase inakti- viert werden.
Sie können übrigens auch bei Patienten verwendet werden, die eine durch die Behandlung mix Penicillin oder synthetischen Penicillinderivaten hervor gerufene Empfindlichkeit zeigen - eine relativ häufige Erscheinung, tritt sie doch laut Statistik bei etwa 8 bis 10 % z. B. der Bevölkerung der Vereinigten. Staaten von Amerika auf.
Das rohe R4-51, hergestellt nach Beispiel 1, ist unter anderem als antünfektiöses Mittel zur Verhinde- rung gewisser Krankheitserscheinungen brauchbar, die durch Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, D.iplococcus pneumoniae und andere pathogene Orga nismen hervorgerufen, werden.
- Seine In-vitro-Aktivität gegen verschiedene Mikroorganismen folgt aus Tabelle XII. Die Anfälligkeit der Mikroorganismen gegen die Antibiotica wurde nach normierten Rohrverdünnungs- verfahren ermittelt: Als Inoculum wurden durchweg Verdünnungen auf 10-5 von 24 Stunden alten Brühe kulturen verwendet, wobei die Endpunkte nach 24 stündiger Bebrütung bei 37 C aufgenommen wurden.
Das Nährmedium war auf Basis Hefeextrakt-Rindfleisch- extrakt-Glucose hergestellt. - Seine In vivo-Aktivität gegen gewisse bakterielle Infektionen wurde ebenfalls, und zwar an 18 bis 20 g schweren Mäusen. unter sucht. Die Mäuse wurden mit einem Inoculum der be treffenden Bakterien durch intraperitoneal'e Injektion infiziert und wurden dann zweimal täglich mit sub kutanen Injektionen von R-451, gelöst in Wasser, be handelt.
Tabelle XIII zeigt, welche Dosis jeweils erfor derlich ist, um einen bestimmten Prozentsatz so be handelter Tiere zu schützen. Bei oraler Verabreichung von 400 ,ug (20 mg pro kg Maus) in zwei gleichen Gaben, die erste eine halbe Stunde vor der Infektion, wird ebenfalls 100%iger Schutz gegen Streptococcus pyogenes erzielt.
Die akute Toxizität von R-451 wurde an Mäusen mit eineue Gewicht von 18 bis 20 g nach verschiedenen normierten Verfahren geprüft, mit den folgenden Ergebnissen:
EMI0012.0016
Verabreichungsweise <SEP> LDro <SEP> (mg/kg <SEP> Maus)
<tb> Subkutan <SEP> 1000
<tb> Intraperitoneal <SEP> 1000
<tb> Intravenös <SEP> 850
<tb> Oral <SEP> >2500 11-451A und R-45113, hergestellt nach Beispiel 8 (E) bzw.
8 (C), zeigen nach dem Scheibenprüfverfahren (Scheibendurchmesser 6,3 mm), wobei die Inhibitions- zone gemessen wurde, nachdem eine mit dem Aniibio- ticum imprägnierte Scheibe auf eine mit dem Testorga nismus beimpfte Agarplatte aufgebracht und 24 Stunden bei 37 C bebrütet worden war, eine In-vitro-Aktivität gegen gewisse Mikroorganismen, wie in Tabellen XIV bzw. XV ausgeführt.
- Weitere Daten betreffend die In vitro-Aktivität von R-45113 (ermittelt an nach Bei spiel 9 gereinigtem Material) sind der Tabelle XVA zu entnehmen. (Das Verhalten der Testorganismen gegen über dem Antibioticum wurde hierbei nach genormten Verdünnungsmethoden bestimmt. In jedem Falle wur den Verdünnungen auf 10-5 von 24 Stunden alten Kulturen als Inoculum verwendet, und die Endpunkte wurden nach 24stündiger Bebrütung bei 37 C in einem Difco Pen-assay Brühemedium aufgenommen.
Die Tabelle zeigt die Aktivität des Antibioticums in Ein heiten pro ml, wobei die Einheit wie oben definiert ist.) Die In-vivo-Aktivität von 11-451B, hergestellt nach Beispiel 8 (C), wurde in der bei R-451 angegebenen Weise geprüft, mit den folgenden Ergebnissen:
Gegen Staphylococcus aureus beträgt die PD5o = 500 lug pro Maus (25 mg pro kg Maus); gegen Streptococcus pyo- genes beträgt sie 80,ug pro Maus (4 mg pro kg Maus). - Weitere Daten betreffend die In vivo-Aktivität von R -451B (ermittelt an nach Beispiel 18A gereinigtem Material) sind der Tabelle XVB zu entnehmen.
(Die Daten dieser Tabelle wurden pharmakologisch an 18 bis 20 g schweren Mäusen als Versuchstiere gegenüber gewissen pathogenen Mikroorganismen ermittelt, und zwar nach dem folgenden genormten Verfahren: 30 Mäuse wurden mit einem Inoculum des betreffenden Organismus durch intraperitoneale Injektionen infiziert.
Dann wurden 20 der Mäuse subkutan mit einer Lö sung des Antibioticums in 2 Teilen Äthanol, 0,5 Teilen Tween 80 und 8,5 Teilen Erdnussöl behandelt, wo- bei die Injektionen in zwei gleichen täglichen Dosie rungen verabreicht wurden.; 10 Mäuse blieben als Kontrolltiere unbehandelt. Alle Kontrolltiere starben innerhalb 18 Stunden.
Die Dosis, die erforderlich ist, damit<B>50%</B> der behandelten Tiere nach 48 Stunden noch leben (PD5o), ergab sich gemäss Tabelle XVB.) Die akute Toxizität von 11-451B wurde bestimmt wie folgt:
EMI0012.0070
<U>Verabreichungsweise <SEP> LD5o <SEP> (mg <SEP> pro <SEP> kg <SEP> Maus)</U>
<tb> Subkutan <SEP> 2500
<tb> Intraperitoneal <SEP> 750 11-451D, hergestellt nach Beispiel 5, zeigt eine In- vitro-Aktivität gegen verschiedene grampositive Orga nismen, wie aus Tabelle XVI ersichtlich - bestimmt wie bei R-451 angegeben.
- Ferner wurde die In vivo-Akti- vität des nach Beispiel 5 hergestellten R -451D in der bei R-451 angegebenen Weise untersucht. Tabelle XVII zeigt die Ergebnisse. - Weitere Daten betreffend die In vitro- und In-vivo-Aktivität von 11-451D (ermittelt an nach Beispiel 5A gereinigtem Material) sind den Tabellen XVA bzw. XVB zu entnehmen;
die Bestim mung dieser Daten ist im Zusammenhang mit 11-451B näher erläutert. - Die akute Toxizität von 11-451D wurde bestimmt wie folgt:
EMI0012.0088
<U>Verabreichungsweise <SEP> LD"o <SEP> (mg <SEP> pro <SEP> kg <SEP> Maus)</U>
<tb> Subkutan <SEP> 1000
<tb> Intraperitoneal <SEP> 500
<tb> Intravenös <SEP> 150 Für R-45lE, hergestellt nach Beispiel 7, wurde in der für 11-451A und R-45113 angegebenen Weise die in Tabelle XVIII aufgeführte Invitro-Aktivität ermittelt.
<I>Pharmazeutische</I> Verabreichungsformen <I>der obigen</I> Antibiotica Die erfindungsgemäss erhältlichen Antibiotica kön nen zur Verabreichung an den Patienten in eine der für Antibiotica üblichen Dosierungsformen gebracht werden. Hierzu können übliche pharmazeutische Träger substanzen verwendet werden.
EMI0013.0001
<I>Tabelle <SEP> 1</I>
<tb> Vergleichende <SEP> Taxonomie <SEP> von <SEP> Mikromonosporaarten
<tb> <I>Teil <SEP> A:</I> <SEP> Medium <SEP> enthält <SEP> 0,1 <SEP> % <SEP> NZ-Amin <SEP> Typ <SEP> A, <SEP> 1 <SEP> % <SEP> Dextrose, <SEP> 1,5 <SEP> % <SEP> Agar
<tb> Verwendeter <SEP> Beobachtete <SEP> Eigenschaften
<tb> Mikroorganismus <SEP> Makroskopisch <SEP> Mikroskopisch
<tb> M. <SEP> carbonacea <SEP> Kein <SEP> Luftmycel; <SEP> Kolonie <SEP> flach, <SEP> feucht; <SEP> Wachstum <SEP> Mycel <SEP> lang, <SEP> verzweigt, <SEP> regelmässig, <SEP> wandlos,
<tb> NRRL <SEP> 2972 <SEP> mittelmässig; <SEP> kein <SEP> diffundierbares <SEP> Pigment <SEP> ge- <SEP> Durchmesser <SEP> 0,6,u; <SEP> reichliche <SEP> Bildung <SEP> läng bildet. <SEP> licher <SEP> bis <SEP> ellipsoidaler <SEP> Sporen, <SEP> 1,0 <SEP> zu <SEP> 1,5,u,
<tb> Farbe:
<SEP> Oberfläche: <SEP> Peripherie <SEP> hellorange-g4NA, <SEP> getragen <SEP> von <SEP> büschelweise <SEP> auftretenden
<tb> lebhaft <SEP> orange-48, <SEP> Zentrum: <SEP> braunschwarz; <SEP> Sporophoren, <SEP> dunkel <SEP> gefärbt.
<tb> Rückseite: <SEP> desgleichen.
<tb> M. <SEP> chalcea <SEP> Kein <SEP> Luftmycel; <SEP> Kolonie <SEP> schwach <SEP> erhöht, <SEP> Mycel <SEP> lang, <SEP> verzweigt, <SEP> regelmässig, <SEP> wandlos,
<tb> ATCC <SEP> 12452 <SEP> gefurcht, <SEP> wachsartig; <SEP> mittelmässiges <SEP> Wachstum; <SEP> sehr <SEP> fein, <SEP> Durchmesser <SEP> kleiner <SEP> als <SEP> 0,5,u;
<tb> kein <SEP> diffundierbares <SEP> Pigment <SEP> gebildet. <SEP> reichliche <SEP> Bildung <SEP> kugelförmiger <SEP> bis <SEP> ellip Farbe: <SEP> Oberfläche:
<SEP> kaffeebraun-g3PN, <SEP> dunkel- <SEP> soidaler <SEP> Sporen, <SEP> braun, <SEP> 1,0 <SEP> ,u <SEP> im <SEP> .Durchmesser,
<tb> olivbraun-96; <SEP> Rückseite: <SEP> desgleichen. <SEP> grösstenteils <SEP> frei, <SEP> aber <SEP> einige <SEP> einzeln <SEP> an <SEP> langen
<tb> Sporophoren.
<tb> M. <SEP> fusca <SEP> Kein <SEP> Luftmycel; <SEP> Kolonie <SEP> schwach <SEP> erhöht, <SEP> Mycel <SEP> kurz, <SEP> unregelmässig, <SEP> bildet <SEP> viele <SEP> poly NRRL <SEP> B-943 <SEP> feucht. <SEP> körnig <SEP> bis <SEP> gefurcht; <SEP> mittelmässiges <SEP> morphe <SEP> Elemente, <SEP> Durchmesser <SEP> 0,8 <SEP> bis <SEP> 2,0,u;
<tb> Wachstum;
<SEP> ganz <SEP> schwach <SEP> gelblichbraunes <SEP> Sporen <SEP> 1;0,u <SEP> im <SEP> Durchmesser, <SEP> schwer
<tb> diffundierbares <SEP> Pigment <SEP> gebildet. <SEP> auffindbar <SEP> unter <SEP> zahlreichen <SEP> dunkelwandigen
<tb> Farbe: <SEP> Oberfläche: <SEP> braunrotorange-g4PC, <SEP> (olivbraunen) <SEP> polymorphen <SEP> Formen.
<tb> tieforange-51; <SEP> Rückseite: <SEP> kofferbraun-g4NE,
<tb> intensivbraun-55.
<tb> M. <SEP> sp. <SEP> Kein <SEP> Luftmycel; <SEP> Kolonie <SEP> schwach <SEP> erhöht, <SEP> Mycel <SEP> lang, <SEP> verzweigt, <SEP> regelmässig, <SEP> wandlos,
<tb> ATCC <SEP> <B>10026</B> <SEP> trocken, <SEP> körnig <SEP> bis <SEP> gefurcht; <SEP> kein <SEP> diffundierbares <SEP> 0,5,u <SEP> im <SEP> Durchmesser;
<SEP> Sporen <SEP> äusserst <SEP> reichlich,
<tb> Pigment <SEP> gebildet. <SEP> in <SEP> Büscheln <SEP> und <SEP> einzeln, <SEP> 1,0,u <SEP> im <SEP> Durchmesser,
<tb> Farbe: <SEP> Oberfläche: <SEP> Peripherie <SEP> kaffeebraun-g3PN, <SEP> einige <SEP> polymorphe <SEP> Formen <SEP> vorliegend; <SEP> sowohl
<tb> dunkelolivbraun-96, <SEP> Zentrum <SEP> rotbraunorange- <SEP> Sporen <SEP> als <SEP> auch <SEP> polymorphe <SEP> Formen
<tb> g4PC, <SEP> tieforange-51; <SEP> Rückseite:
<SEP> desgleichen. <SEP> dunkelwandig.
<tb> <I>Teil <SEP> B:</I> <SEP> Medium <SEP> enthält <SEP> 3 <SEP> % <SEP> NZ-Amin <SEP> Typ <SEP> A, <SEP> 1 <SEP> % <SEP> Dextrose, <SEP> 1,5 <SEP> % <SEP> Agar
<tb> Verwendeter <SEP> Beobachtete <SEP> Eigenschaften
<tb> M<U>i</U>k<U>r</U>oo<U>rg</U>anis<U>m</U>u<U>s</U> <SEP> Makroskopisch <SEP> Mikroskopisch
<tb> M. <SEP> carbonacea <SEP> Kein <SEP> Luftmycel; <SEP> Kolonie <SEP> erhöht, <SEP> gefurcht; <SEP> Mycel <SEP> lang, <SEP> verzweigt, <SEP> regelmässig, <SEP> wandlos,
<tb> NRRL <SEP> 2972 <SEP> Wachstum <SEP> gut; <SEP> kein <SEP> diffundierbares <SEP> Pigment <SEP> ge- <SEP> 0,6 <SEP> ,u <SEP> im <SEP> Durchmesser; <SEP> Sporen <SEP> einzeln, <SEP> an <SEP> ein bildet. <SEP> zelnen <SEP> Sporophoren <SEP> getragen, <SEP> länglich <SEP> bis
<tb> Farbe: <SEP> Oberfläche:
<SEP> terracottafarbeng5PE, <SEP> irrten- <SEP> ellipsoidal, <SEP> 1,0 <SEP> zu <SEP> 1,5,u, <SEP> dunkel <SEP> gefärbt.
<tb> sivbraun <SEP> 55; <SEP> Rückseite: <SEP> desgleichen.
<tb> M. <SEP> chalcea <SEP> Kein <SEP> Luftmycel; <SEP> Kolonie <SEP> erhöht, <SEP> faltig, <SEP> wachs- <SEP> Mycell <SEP> lang, <SEP> verzweigt, <SEP> regelmässig, <SEP> wandlos,
<tb> ATCC <SEP> 12452 <SEP> artig; <SEP> mittelmässiges <SEP> Wachstum; <SEP> kein <SEP> diffundier- <SEP> 0,5 <SEP> ,u <SEP> im <SEP> Durchmesser; <SEP> Sporen <SEP> reichlich, <SEP> ein bares <SEP> Pigment <SEP> gebildet. <SEP> zeln <SEP> und <SEP> büschelweise <SEP> getragen, <SEP> kugelförmig
<tb> Farbe: <SEP> Oberfläche: <SEP> kupferbraun-g5PI, <SEP> intensiv- <SEP> bis <SEP> ellipsoidal, <SEP> 1,0 <SEP> ,u <SEP> im <SEP> Durchmesser.
<tb> braun-55; <SEP> Rückseite:
<SEP> rotbraun- <SEP> bis <SEP> braun-g4PI,
<tb> intensivbraun-55.
<tb> M. <SEP> fusca <SEP> Kein <SEP> Luftmycel; <SEP> Kolonie <SEP> erhöht, <SEP> grobkörnig, <SEP> Mycel <SEP> unregelmässig, <SEP> viele <SEP> polymorphe <SEP> Ele NRRL <SEP> B-943 <SEP> matt; <SEP> gutes <SEP> Wachstum; <SEP> ganz <SEP> schwach <SEP> gelblich- <SEP> mente <SEP> vorliegend, <SEP> 0,5 <SEP> bis <SEP> 2,0 <SEP> ,u <SEP> im <SEP> Durch braunes <SEP> diffundierbares <SEP> Pigment <SEP> gebildet. <SEP> messer, <SEP> olivbraun <SEP> gefärbt; <SEP> echte <SEP> Sporen, <SEP> 1,0 <SEP> ,u
<tb> Farbe: <SEP> Oberfläche: <SEP> terracottafarben <SEP> g5PE, <SEP> irrten- <SEP> im <SEP> Durchmesser, <SEP> stufenweiser <SEP> übergang <SEP> in
<tb> sivbraun-55; <SEP> Rückseite:
<SEP> rotbraun-g5PG, <SEP> intensiv- <SEP> polymorphe <SEP> Formen <SEP> mit <SEP> Durchmesser <SEP> 0,5 <SEP> bis
<tb> braun-55. <SEP> 2,0 <SEP> ,u.
<tb> M. <SEP> sp. <SEP> Kein <SEP> Luftmycel; <SEP> Kolonie <SEP> erhöht, <SEP> dichtkörnig, <SEP> Zwei <SEP> Arten <SEP> Mycel: <SEP> lang <SEP> und <SEP> regelmässig <SEP> einer ATCC <SEP> 10026 <SEP> trocken; <SEP> gutes <SEP> Wachstum. <SEP> seits,, <SEP> kurz <SEP> und <SEP> unregelmässig <SEP> anderseits, <SEP> bildet
<tb> Farbe: <SEP> Oberfläche: <SEP> Peripherie <SEP> rotbraunorange- <SEP> viele <SEP> polymorphe <SEP> Elemente, <SEP> 0,8 <SEP> bis <SEP> 2,0 <SEP> ,u <SEP> im
<tb> g4PC, <SEP> intensivorange-50; <SEP> Zentrum: <SEP> Schokolade- <SEP> Durchmesser; <SEP> reichlich <SEP> echte <SEP> Sporen, <SEP> büschel braun <SEP> g4PN, <SEP> dunkelgraubraun-62; <SEP> Rückseite:
<SEP> weise <SEP> getragen, <SEP> 1,0 <SEP> ,u <SEP> im <SEP> Durchmesser, <SEP> kugel dunkelzimtbraun-g4PL, <SEP> dunkelbraun-59. <SEP> förmig <SEP> bis <SEP> ellipsoidal.
EMI0014.0001
EMI0015.0001
<I>Tabelle <SEP> 111A</I>
<tb> Verwendetes <SEP> M. <SEP> carbonacea <SEP> M. <SEP> chalcea <SEP> M. <SEP> fusca
<tb> M.
<tb> Medium <SEP> NRRL <SEP> 2972 <SEP> ATCC <SEP> 12452 <SEP> NRRL <SEP> B-943 <SEP> sp. <SEP> ATCC <SEP> 10026
<tb> Bennett's <SEP> * <SEP> Wachstum: <SEP> gut; <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum: <SEP> gut.
<tb> Agar <SEP> erhöhte <SEP> und <SEP> gefurchte <SEP> Farbe: <SEP> Peripherie <SEP> terra- <SEP> Farbe: <SEP> terracotta- <SEP> Farbe: <SEP> Peripherie <SEP> terra Kolonie. <SEP> cottafarben-g5.PE, <SEP> farben-g5PE, <SEP> cottafarben-g5PE,
<tb> Farbe:
<SEP> hellorange-g5NA, <SEP> intensivbraun-55m, <SEP> intensivbraun-55. <SEP> intensivbraun-55,
<tb> lebhaftorange-48 <SEP> Zentrum <SEP> schokoladebraun- <SEP> Zentrum <SEP> gewürznelken (braunschwarz <SEP> gefleckt). <SEP> g4PN, <SEP> dunkelbraun-59. <SEP> braun-3iPL, <SEP> dunkel gelbbraun-78.
<tb> Emerson- <SEP> * <SEP> Wachstum: <SEP> mittelmässig; <SEP> Wachstum: <SEP> gut <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum: <SEP> gut.
<tb> Agar <SEP> erhöhte <SEP> Kolonie. <SEP> Farbe: <SEP> bittersüssfarben- <SEP> Farbe: <SEP> mandarinen- <SEP> Farbe: <SEP> eichenbraun Farbe: <SEP> terracottafarben- <SEP> g5PC, <SEP> tieforange-51. <SEP> farben-g5PA, <SEP> g4PI, <SEP> intensivbraun-55.
<tb> g5PE, <SEP> intensivbraun-55. <SEP> lebhaftorange.
<tb> Tomaten- <SEP> * <SEP> Wachstum: <SEP> gut; <SEP> Wachstum: <SEP> gut: <SEP> Wachstum: <SEP> mittel- <SEP> Wachstum:
<SEP> mittelmässig.
<tb> mark-Hafer- <SEP> gefurchte <SEP> Kolonie. <SEP> Farbe: <SEP> Peripherie <SEP> terra- <SEP> mässig. <SEP> Farbe: <SEP> hellpfirsich mehl-Agar <SEP> Farbe: <SEP> Peripherieorange- <SEP> cottafarben-g5PE, <SEP> Farbe: <SEP> hellpfirsich- <SEP> farben-g5IA, <SEP> mittel g5LA, <SEP> intensivorange-50, <SEP> intensivbraun-55, <SEP> Zentrum <SEP> farben-g5IA, <SEP> mittel- <SEP> rotorange-37.
<tb> Zentrum <SEP> braunschwarz. <SEP> schokoladebraun-4PN, <SEP> rotorange-37.
<tb> dunkelbraun-59.
<tb> Glucose- <SEP> Wachstum: <SEP> schlecht. <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum: <SEP> mittel- <SEP> Wachstum: <SEP> schlecht.
<tb> Asparagin- <SEP> Farbe: <SEP> terracottafarben- <SEP> mässig.
<tb> Agar <SEP> g5PE, <SEP> intensivbraun-55. <SEP> Farbe: <SEP> leuchtend orange-g5LA,
<tb> intensivorange-50.
<tb> Glucose- <SEP> * <SEP> Wachstum:
<SEP> mittelmässig; <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum: <SEP> gut.
<tb> Hefeextrakt- <SEP> gefurchte <SEP> Kolonie. <SEP> Farbe: <SEP> tiefbraun-g4PL, <SEP> Farbe: <SEP> terracotta- <SEP> Farbe: <SEP> eichenbraun Agar <SEP> Farbe: <SEP> rotbraunorange- <SEP> dunkelbraun-59. <SEP> farben-g5PE, <SEP> g4PI, <SEP> intensivbraun-55.
<tb> g4NC, <SEP> tieforange-51. <SEP> intensivbraun-55.
<tb> * <SEP> Zusatz <SEP> von <SEP> 0,1% <SEP> CaC03 <SEP> zum <SEP> Medium.
<tb> <I>Tabelle <SEP> 111B</I>
<tb> Verwendetes <SEP> M. <SEP> carbonacea <SEP> M. <SEP> chalcea <SEP> M. <SEP> fusea <SEP> M. <SEP> sp. <SEP> ATCC <SEP> 10026
<tb> Medium <SEP> NRRL <SEP> 2972 <SEP> ATCC <SEP> 12452 <SEP> NRRL <SEP> B-943
<tb> Kartoffel <SEP> Wachstum: <SEP> mittelmässig. <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum: <SEP> gut
<tb> Farbe:
<SEP> rostrot-g6PG, <SEP> Farbe: <SEP> bittersüss- <SEP> Farbe: <SEP> bittersüss mittelrotbraun-43. <SEP> farben-g5PC, <SEP> farben-g5PC,
<tb> tieforange-51. <SEP> tieforange-51.
<tb> Karotte <SEP> Wachstum: <SEP> schlecht. <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum: <SEP> schlecht. <SEP> Wachstum:
<tb> Farbe: <SEP> Schokolade- <SEP> mittelmässig.
<tb> braun-g4PN, <SEP> Farbe: <SEP> feuerrot dunkelbraun-59. <SEP> g5NC, <SEP> intensivrot orange-35.
<tb> Saccharose-Nitrat- <SEP> Kein <SEP> Wachstum. <SEP> Kein <SEP> Wachstum. <SEP> Kein <SEP> Wachstum. <SEP> Kein <SEP> Wachstum.
<tb> Agar <SEP> (Czapek-Agar)
<tb> Tyrosin-Agar <SEP> Wachstum: <SEP> mittelmässig. <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum: <SEP> mittel- <SEP> Wachstum: <SEP> schlecht.
<tb> (Beobachtungen <SEP> Farbe: <SEP> kein <SEP> diffundier- <SEP> Farbe: <SEP> schwarzes <SEP> mässig. <SEP> Farbe:
<SEP> kein <SEP> diffun nach <SEP> 2, <SEP> 7 <SEP> und <SEP> bares <SEP> Pigment. <SEP> diffundierbares <SEP> Farbe: <SEP> kein <SEP> diffun- <SEP> dierbares <SEP> Pigment.
<tb> 14 <SEP> Tagen; <SEP> nach <SEP> Pigment. <SEP> dierbares <SEP> Pigment.
<tb> Gordon <SEP> und <SEP> Smith,
<tb> J. <SEP> Bact. <SEP> 69, <SEP> 147)
<tb> Pepton-Eisen-Agar <SEP> Wachstum: <SEP> mittelmässig. <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum: <SEP> mittel- <SEP> Wachstum: <SEP> mittel (Beobachtungen <SEP> nach <SEP> Farbe: <SEP> keine <SEP> Reaktion. <SEP> Farbe: <SEP> keine <SEP> Reaktion. <SEP> mässig, <SEP> Farbe: <SEP> mässig. <SEP> Farbe:
<tb> 2, <SEP> 7 <SEP> und <SEP> 14 <SEP> Tagen) <SEP> keine <SEP> Reaktion. <SEP> keine <SEP> Reaktion.
<tb> Bromkresolpurpur- <SEP> Wachstum: <SEP> mittelmässig; <SEP> Wachstum: <SEP> gut; <SEP> Wachstum: <SEP> mittel- <SEP> Wachstum:
<SEP> gut;
<tb> Milch <SEP> teilweise <SEP> Verdauung. <SEP> Verdauung <SEP> findet <SEP> statt. <SEP> mässig; <SEP> Verdauung <SEP> Verdauung <SEP> findet
<tb> Farbe: <SEP> keine <SEP> pH= <SEP> findet <SEP> statt. <SEP> Farbe: <SEP> statt. <SEP> Farbe: <SEP> keine
<tb> Änderung. <SEP> keine <SEP> pH-Anderung, <SEP> pH <SEP> Änderung.
EMI0016.0001
<I>Tabelle <SEP> IV</I>
<tb> Verwendetes <SEP> M. <SEP> carbonacea <SEP> M. <SEP> chalcea <SEP> M. <SEP> fusca <SEP> M. <SEP> sp.
<tb> <U>Test</U>k<U>ohlehydrat</U> <SEP> NRRL <SEP> 2<U>9</U>72 <SEP> ATCC <SEP> 12452 <SEP> NRRL <SEP> B-943 <SEP> ATCC <SEP> 10026
<tb> Arabinose <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut
<tb> Glucose <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut
<tb> Galactose <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut <SEP> mittelmässig
<tb> Lactose <SEP> gut <SEP> mittelmässig <SEP> schlecht <SEP> schlecht
<tb> Laevulose <SEP> gut <SEP> mittelmässig <SEP> schlecht <SEP> schlecht
<tb> Mannose <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut
<tb> Raffinose <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> schlecht
<tb> Rhamnose <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> schlecht
<tb> Stärke <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut
<tb>
Saccharose <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut
<tb> Xylose <SEP> gut <SEP> gut <SEP> schlecht <SEP> schlecht
<tb> Inosit <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> schlecht
<tb> Mannit <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> gut <SEP> gut
<tb> Sorbit <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> schlecht
<tb> Zur <SEP> Kontrolle:
<tb> 0,5 <SEP> % <SEP> Hefeextrakt <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> schlecht
EMI0016.0002
<I>Tabelle <SEP> V</I>
<tb> Verwendete <SEP> M. <SEP> carbonacea <SEP> M. <SEP> chalcea <SEP> M. <SEP> fusca <SEP> M. <SEP> sp.
<tb> <U>Stickstoffquelle <SEP> NRRL <SEP> 2972 <SEP> ATCC <SEP> 1</U>2<U>452</U> <SEP> NRRL <SEP> B-943 <SEP> ATCC <SEP> 10026
<tb> <B>0,5%</B> <SEP> Difco - <SEP> Wachstum: <SEP> mittelmässig; <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum:
<SEP> gut.
<tb> Hefeextrakt <SEP> Kolonie <SEP> erhöht <SEP> und <SEP> gefurcht. <SEP> Farbe: <SEP> rostrot-g6tPG, <SEP> Farbe: <SEP> rotbraun- <SEP> Farbe: <SEP> bittersüss Farbe: <SEP> Peripherie <SEP> orange- <SEP> mittelrotbraun-43. <SEP> orange-g4PC, <SEP> farben-g5PC,
<tb> g5LA, <SEP> intensivorange-50, <SEP> intensivorange-50. <SEP> tieforange-51.
<tb> Zentrum <SEP> braunschwarz
<tb> gefleckt.
<tb> 1,0% <SEP> NZ-Amin, <SEP> Wachstum: <SEP> mittelmässig: <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum: <SEP> gut.
<tb> Typ <SEP> A <SEP> Kolonie <SEP> erhöht <SEP> und <SEP> gefurcht. <SEP> Farbe: <SEP> hennafarben- <SEP> Farbe: <SEP> henna- <SEP> Farbe: <SEP> terracotta Farbe:
<SEP> rotbraunorange-g4PC, <SEP> g5PG, <SEP> intensivbraun-55. <SEP> farben-gSPG, <SEP> farben-g5PE,
<tb> tieforange-51 <SEP> (schwach <SEP> intensivbraun-55. <SEP> intensivbraun-55.
<tb> braunschwarz <SEP> gefleckt).
<tb> 1 <SEP> % <SEP> Asparagin <SEP> Wachstum: <SEP> schlecht. <SEP> Wachstum: <SEP> mittelmässig. <SEP> Wachstum: <SEP> Wachstum:
<tb> Farbe: <SEP> gewürznelken- <SEP> schlecht. <SEP> schlecht.
<tb> braun-g3PL, <SEP> dunkel gelbbraun-78.
<tb> 1 <SEP> % <SEP> Glutaminsäure <SEP> Wachstum: <SEP> schlecht. <SEP> Wachstum: <SEP> mittelmässig. <SEP> Wachstum: <SEP> Wachstum:
<tb> Farbe:
<SEP> gewürznelken- <SEP> schlecht. <SEP> schlecht.
<tb> braun-g3PL, <SEP> dunkel gelbbraun-78.
<tb> 1 <SEP> % <SEP> Natriumnitrat <SEP> Kein <SEP> Wachstum. <SEP> Kein <SEP> Wachstum. <SEP> Kein <SEP> Wachstum. <SEP> Kein <SEP> Wachstum.
<tb> 1 <SEP> % <SEP> Ammonium- <SEP> Kein <SEP> Wachstum. <SEP> Kein <SEP> Wachstum. <SEP> Kein <SEP> Wachstum. <SEP> Kein <SEP> Wachstum.
<tb> nitrat
EMI0016.0003
<I>Tabelle <SEP> V1</I>
<tb> Chromatographische <SEP> Studien <SEP> an <SEP> den <SEP> durch <SEP> Bebrütung <SEP> von <SEP> M. <SEP> carbonacea <SEP> gebildeten
<tb> antibiotischen <SEP> Substanzen
<tb> Verwendete <SEP> Lösungsmittelsysteme <SEP> Rr-Werte <SEP> für
<tb> R-451A <SEP> R-451B <SEP> R-451C <SEP> R-451D <SEP> R-451E
<tb> 1. <SEP> Benzol <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 10 <SEP> V.
<SEP> T.*
<tb> Petroläther <SEP> (Siedebereich <SEP> 30-60 C) <SEP> 2,5 <SEP> V. <SEP> T. <SEP> 0 <SEP> 0,14 <SEP> 0,28 <SEP> 0,64 <SEP> 0,74
<tb> Aceton <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>...</B> <SEP> 5 <SEP> V. <SEP> T.
<tb> Entwicklungsdauer: <SEP> 11/2 <SEP> Stunden
EMI0017.0001
<I>Tabelle <SEP> V1</I> <SEP> (Fortsetzung)
<tb> Verwendete <SEP> Lösungsmittelsysteme <SEP> RF-Werte <SEP> für
<tb> R-451A <SEP> R-451B <SEP> R-451C <SEP> R-451D <SEP> R-451E
<tb> II. <SEP> Toluol <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 20 <SEP> V. <SEP> T.
<tb> n-Butanol <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,5 <SEP> V. <SEP> T.
<tb> Destilliertes <SEP> Wasser <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 7 <SEP> V. <SEP> T.
<SEP> 0 <SEP> 0,19 <SEP> 0,42 <SEP> 0,61 <SEP> 0,71
<tb> Petroläther <SEP> (Siedebereich <SEP> 30-60 <SEP> C) <SEP> 1,5 <SEP> V. <SEP> T.
<tb> Entwicklungsdauer: <SEP> 41/2 <SEP> Stunden
<tb> III. <SEP> Petroläther <SEP> (Siedebereich <SEP> 60-90 C) <SEP> 5 <SEP> V. <SEP> T.
<tb> Methanol <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 8 <SEP> V. <SEP> T.
<tb> Äthylacetat <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 5 <SEP> V. <SEP> T. <SEP> 0 <SEP> 0,08 <SEP> 0,26 <SEP> 0,60 <SEP> 0,82
<tb> Destilliertes <SEP> Wasser <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 2 <SEP> V. <SEP> T.
<tb> Entwicklungsdauer: <SEP> 2 <SEP> Stunden
<tb> * <SEP> V. <SEP> T. <SEP> = <SEP> Volumteile; <SEP> im <SEP> Originalversuch: <SEP> 1 <SEP> V. <SEP> T. <SEP> = <SEP> 1 <SEP> pint.
EMI0017.0002
<I>Tabelle <SEP> VII</I>
<tb> Chromatographie <SEP> von <SEP> Antibioticä <SEP> der <SEP> R-451 <SEP> -Gruppe <SEP> an <SEP> Aluminiumoxyd
<tb> Inhibitionszone <SEP> in <SEP> mm
<tb> Getestete <SEP> Fraktionen <SEP> Behandlungsweise <SEP> und <SEP> bei <SEP> 6,35 <SEP> mm <SEP> im <SEP> Durchmesser <SEP> Papierbioautographische <SEP> Verteilung
<tb> (Gruppen) <SEP> Ausbeute <SEP> messenden <SEP> Filterpapierscheiben <SEP> (RF-Werte)
<tb> und <SEP> Konzentrationen
<tb> (in <SEP> ,u/ml) <SEP> von
<tb> 1000 <SEP> 100 <SEP> 10 <SEP> 1
<tb> Ausgangsmaterial <SEP> - <SEP> 20 <SEP> 14 <SEP> 8 <SEP> 0 <SEP> 0,0; <SEP> 0,15; <SEP> 0,29; <SEP> 0,60; <SEP> 0,74
<tb> 1 <SEP> Inaktiv <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> Rückstand <SEP> in <SEP> Chloroform <SEP> 23 <SEP> 17 <SEP> 10 <SEP> 0 <SEP> 0,0; <SEP> 0,12 <SEP> (Spur); <SEP> 0,62;
<SEP> 0,74
<tb> gelöst, <SEP> mit <SEP> 10fachem <SEP> Vo lumen <SEP> Petroläther <SEP> gefällt;
<tb> Ausbeute: <SEP> 102 <SEP> mg
<tb> 3 <SEP> bis <SEP> 4 <SEP> Behandelt <SEP> wie <SEP> Fraktion <SEP> 2; <SEP> 15 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0,0
<tb> Ausbeute: <SEP> 725 <SEP> mg
<tb> 5 <SEP> bis <SEP> 8 <SEP> Behandelt <SEP> wie <SEP> Fraktion <SEP> 2; <SEP> 18 <SEP> 11 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0,0; <SEP> 0,18 <SEP> (Spur); <SEP> 0,62 <SEP> (Spur)
<tb> Ausbeute: <SEP> 541 <SEP> mg
<tb> 9 <SEP> bis <SEP> 12 <SEP> Inaktiv <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 13 <SEP> bis <SEP> 30 <SEP> Behandelt <SEP> wie <SEP> Fraktion <SEP> 2; <SEP> 26 <SEP> 22 <SEP> 16 <SEP> 8 <SEP> 0,0; <SEP> 0,14; <SEP> 0,28; <SEP> 0,64
<tb> Ausbeute: <SEP> 1,73 <SEP> g
<tb> 31 <SEP> bis <SEP> 34 <SEP> Behandelt <SEP> wie <SEP> Fraktion <SEP> 2; <SEP> 25 <SEP> 22 <SEP> 16 <SEP> 8 <SEP> 0,0;
<SEP> 0,15; <SEP> 0,29; <SEP> 0,60
<tb> Ausbeute: <SEP> 32,5 <SEP> mg
<tb> 35 <SEP> bis <SEP> 42 <SEP> In <SEP> Wasser <SEP> gelöst, <SEP> lyophili- <SEP> 22 <SEP> 17 <SEP> 11 <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 0,13 <SEP> (schwach);
<tb> siert; <SEP> Ausbeute: <SEP> <B>111</B> <SEP> mg <SEP> 0,24 <SEP> (schwach); <SEP> 0,59
<tb> 43 <SEP> bis <SEP> 49 <SEP> Behandelt <SEP> wie <SEP> Fraktionen <SEP> 22 <SEP> 16 <SEP> 9 <SEP> 8 <SEP> 0,0; <SEP> 0,13; <SEP> 0,25; <SEP> 0,58
<tb> 35 <SEP> bis <SEP> 42;
<tb> Ausbeute: <SEP> 67,5 <SEP> mg
<tb> * <SEP> Angewandtes <SEP> System: <SEP> Benzol-Petroläther-Aceton <SEP> (10: <SEP> 2,5: <SEP> 5), <SEP> absteigend; <SEP> chromatographisches <SEP> Papier <SEP> der <SEP> Sorte <SEP> Whatman
<tb> Nr. <SEP> 1; <SEP> 1 <SEP> Y2 <SEP> stündige <SEP> Entwicklung.
EMI0017.0003
<I>Tabelle <SEP> VIIl</I>
<tb> Chromatographie <SEP> von <SEP> Antibiotica <SEP> der <SEP> R-451-Gruppe <SEP> an <SEP> Diatomeenerde
<tb> HW <SEP> Eluierungsmittel <SEP> Gewicht <SEP> des <SEP> Rückstandes <SEP> Bioautographisch <SEP> ermittelte
<tb> in <SEP> ml <SEP> in <SEP> mg <SEP> RF-Werte
<tb> 1 <SEP> 3500 <SEP> - <SEP> 2 <SEP> 3500 <SEP> 4300 <SEP> 0,77
<tb> 2,1 <SEP> bis <SEP> 2,9 <SEP> 2800 <SEP> 190 <SEP> 0,79
<tb> 3 <SEP> bis <SEP> 10 <SEP> 24500 <SEP> 2200 <SEP> 0,3; <SEP> 0,65; <SEP> 0,75
<tb> 11 <SEP> bis <SEP> 13 <SEP> 7000 <SEP> <B>1</B>00 <SEP> 0,14; <SEP> 0,28;
<SEP> 0,64
<tb> 14 <SEP> bis <SEP> 16 <SEP> 7000 <SEP> 100 <SEP> 0
EMI0018.0001
<I>Tabelle <SEP> IX</I>
<tb> Chromatographische <SEP> Auftrennung <SEP> von <SEP> HUV <SEP> 3 <SEP> bis <SEP> 10 <SEP> aus <SEP> den <SEP> Antibiotica <SEP> der <SEP> R-451-Gruppe
<tb> Eluierungsmittel <SEP> Gewicht <SEP> des <SEP> Rückstandes <SEP> Papierchromatographisch HUV <SEP> in <SEP> ml <SEP> in <SEP> m <SEP> bioautographisch <SEP> ermittelte
<tb> g <SEP> Rr-Werte
<tb> 1 <SEP> 900 <SEP> - <SEP> 1 <SEP> bis <SEP> 1,5 <SEP> 450 <SEP> 320 <SEP> 0,78
<tb> 1,5 <SEP> bis <SEP> 14 <SEP> 11000 <SEP> 680 <SEP> 0,64;
<SEP> 0,74
EMI0018.0002
<I>Tabelle <SEP> X</I>
<tb> Vortrennung <SEP> der <SEP> Antibiotica <SEP> der <SEP> R-451-Gruppe <SEP> durch <SEP> Chromatographie <SEP> an <SEP> Diatomeenerde
<tb> HUV <SEP> Menge <SEP> Eluierungsmittel <SEP> Gewicht <SEP> des <SEP> Rückstandes <SEP> Bioautographisch <SEP> ermittelte
<tb> in <SEP> ml <SEP> in <SEP> mg <SEP> RF-<U>W</U>erte
<tb> 0,9 <SEP> 7000 <SEP> - <SEP> 1,0 <SEP> bis <SEP> <B>1</B>,<B>1</B> <SEP> 800 <SEP> 186 <SEP> 0,8; <SEP> 0,55
<tb> 1,2 <SEP> bis <SEP> 1,8 <SEP> 5000 <SEP> 900 <SEP> 0,56; <SEP> 0,43
<tb> 1,9 <SEP> bis <SEP> 2,8 <SEP> 7200 <SEP> 5700 <SEP> 0,16; <SEP> 0,23; <SEP> 0,43; <SEP> 0,55
<tb> 2,9 <SEP> bis <SEP> 3,9 <SEP> 8000* <SEP> 100 <SEP> 0; <SEP> 0,16; <SEP> 0,23;
<SEP> 0,55 <SEP> (Spur)
<tb> 4,0 <SEP> bis <SEP> 5,0 <SEP> 8000"e\ <SEP> 120 <SEP> 0
<tb> Eluierung <SEP> mit <SEP> Aceton
<tb> ** <SEP> Eluierung <SEP> mit <SEP> Aceton-Methanol <SEP> <B>(1:</B> <SEP> 1)
EMI0018.0003
<I>Tabelle <SEP> XI</I>
<tb> Chromatographische <SEP> Auftrennung <SEP> der <SEP> Fraktionengruppe <SEP> HUV <SEP> 1,9 <SEP> bis <SEP> 2,8 <SEP> von <SEP> Tabelle <SEP> XI
<tb> HUV <SEP> Verwendetes <SEP> Eluierungsmittel <SEP> Gewicht <SEP> des <SEP> Rückstandes <SEP> Bioautographisch <SEP> ermittelte
<tb> in <SEP> ml <SEP> in <SEP> mg <SEP> RF-Werte
<tb> 0,7 <SEP> 4200 <SEP> 0,8 <SEP> bis <SEP> 1,6 <SEP> 4800 <SEP> 1100 <SEP> 0,55
<tb> 1,7 <SEP> bis <SEP> 17,6 <SEP> 96000 <SEP> 300 <SEP> 0,43
<tb> 17,7 <SEP> bis <SEP> 27,7 <SEP> 60000 <SEP> 200 <SEP> 0,16; <SEP> 0,23
<tb> 27,7 <SEP> bis <SEP> 28,1 <SEP> 2400 <SEP> 70 <SEP> 0;
<SEP> 0,15
EMI0018.0004
<I>Tabelle <SEP> XIA</I>
<tb> Chromatograpbie <SEP> von <SEP> Antibiotica <SEP> der <SEP> R-451-Gruppe <SEP> an <SEP> Florisil
<tb> Elutionsmittel <SEP> Eluat <SEP> Gewicht <SEP> des <SEP> Rückstandes <SEP> Bioautographisch <SEP> ermittelte
<tb> in <SEP> mm <SEP> in <SEP> g <SEP> Rr-Werte
<tb> CH2C12 <SEP> 4400 <SEP> 10,2 <SEP> 0,43(D); <SEP> 0,56(E)
<tb> CH2C12 <SEP> + <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Aceton <SEP> 8800 <SEP> 8,1 <SEP> 0,45(D)
<tb> CH2C12 <SEP> + <SEP> 10% <SEP> Aceton <SEP> 8800 <SEP> 13,2 <SEP> 0,43(D)
<tb> CH2C12 <SEP> + <SEP> 20% <SEP> Aceton <SEP> 8800 <SEP> 2,3 <SEP> 0,45(D);
<SEP> 0,24(B)
<tb> CH2Cl2 <SEP> + <SEP> 50 <SEP> % <SEP> Aceton <SEP> 8800 <SEP> 6;3 <SEP> 0,23(B)
<tb> <B>100%</B> <SEP> Aceton <SEP> 8800 <SEP> 5,4 <SEP> <B><I>0,15(?);</I></B> <SEP> 0,23(B)
EMI0018.0005
<I>Tabelle <SEP> X11</I>
<tb> In-vitro-Aktivität <SEP> von <SEP> R-451
<tb> Systematischer <SEP> Name <SEP> Stammbezeichnung <SEP> Minimale <SEP> Inhibitionskonzentration
<tb> der <SEP> verwendeten <SEP> Mikroorganismen <SEP> in <SEP> ,ug/ml
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> ATCC <SEP> 7064 <SEP> 0,75
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> var.
<SEP> mycoides <SEP> DA <SEP> 39 <SEP> 0,25
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> DA <SEP> 31 <SEP> 0,75
EMI0019.0001
<I>Tabelle <SEP> XTI</I> <SEP> (Fortsetzung)
<tb> Systematischer <SEP> Name <SEP> Minimale <SEP> Inhibitionskonzentration
<tb> der <SEP> verwendeten <SEP> Mikroorganismen <SEP> Stammbezeichnung <SEP> in <SEP> ,ug/ml
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> ATCC <SEP> 6633 <SEP> 0,25
<tb> Staphylococcus <SEP> albus <SEP> DA <SEP> 2100 <SEP> 0,10
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 6538P <SEP> 0,075
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 1163 <SEP> 0,25
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 12715 <SEP> 0,75
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Gray <SEP> 0,50
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> DA <SEP> 201 <SEP> 0,10
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> DA <SEP> 202** <SEP> 0,
25
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> DA <SEP> 203*** <SEP> 0,30
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> DA <SEP> 204*** <SEP> 0,15
<tb> Staphylococcus <SEP> aurcus <SEP> DA <SEP> 205*** <SEP> 0,40
<tb> Streptococcus <SEP> fecalis <SEP> DA <SEP> 20 <SEP> 0,75
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> ATCC <SEP> 12384 <SEP> 0,175
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> DA <SEP> 21 <SEP> 0,375
<tb> * <SEP> ein <SEP> gegen <SEP> Novobiocin <SEP> resistenter <SEP> Stamm.
<tb> ** <SEP> ein <SEP> gegen <SEP> Oleandomycin <SEP> und <SEP> Erythromycin <SEP> resistenter <SEP> Stamm.
<tb> *** <SEP> gegen <SEP> Penicillin <SEP> resistente <SEP> Stämme.
EMI0019.0002
<I>Tabelle <SEP> X111</I>
<tb> In-vivo-Aktivität <SEP> von <SEP> R-541
<tb> Infizierender <SEP> Mikro- <SEP> Verabreichte <SEP> Dosis <SEP> R-451 <SEP> in <SEP> ,ug <SEP> Prozentsatz <SEP> überlebender <SEP> Mäuse
<tb> organismus <SEP> pro <SEP> Maus <SEP> und <SEP> Tag <SEP> nach <SEP> 24 <SEP> Stunden
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 0 <SEP> (Kontrollsalzlösung) <SEP> 0
<tb> 40 <SEP> (2 <SEP> mg <SEP> pro <SEP> kg <SEP> Maus) <SEP> 50
<tb> 40 <SEP> (2 <SEP> mg <SEP> pro <SEP> kg <SEP> Maus) <SEP> 100
<tb> eine <SEP> einzige <SEP> Injektion
<tb> 1 <SEP> Stunde <SEP> nach <SEP> der
<tb> Infektion
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> - <SEP> 40 <SEP> (2 <SEP> mg <SEP> pro <SEP> kg <SEP> Maus) <SEP> 50
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> 50 <SEP> (2,5 <SEP> mg <SEP> pro <SEP> kg <SEP> Maus)
<SEP> 100 <SEP> (nach <SEP> 2 <SEP> Tagen)
EMI0019.0003
<I>Tabelle <SEP> XIV</I>
<tb> In-vitro-Aktivität <SEP> von <SEP> R-451A
<tb> Konzentration <SEP> in <SEP> ,ug <SEP> Durchmesser <SEP> in <SEP> mm <SEP> der <SEP> Inhibitionszone <SEP> gegen
<tb> R-451/ml <SEP> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Streptococcus <SEP> fecalis <SEP> Bacillus <SEP> subtilis
<tb> 1000 <SEP> 18 <SEP> 23 <SEP> 13
<tb> 100 <SEP> 9 <SEP> 15 <SEP> 10
<tb> 10 <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 0
<tb> 1 <SEP> 0 <SEP> 7 <SEP> 0
EMI0019.0004
<I>Tabelle <SEP> XV</I>
<tb> In-vitro-Aktivität <SEP> von <SEP> R <SEP> -451B
<tb> Konzentration <SEP> in <SEP> Aug <SEP> Durchmesser <SEP> in <SEP> mm <SEP> der <SEP> Inhibitionszone <SEP> gegen
<tb> R-451B/ml <SEP> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Streptococcus <SEP> fecalis <SEP> Bacillus <SEP> subtilis
<tb> 1000 <SEP> 23 <SEP> 30
<SEP> 17
<tb> 100 <SEP> 20 <SEP> 26 <SEP> 8
<tb> 10 <SEP> 15 <SEP> 22 <SEP> 4.
<tb> 1 <SEP> 8 <SEP> 15 <SEP> 0
EMI0020.0001
<I>Tabelle <SEP> XVA</I>
<tb> Antibiotisches <SEP> Spektrum <SEP> (In-vitro <SEP> Aktivität) <SEP> von <SEP> R-451B <SEP> und <SEP> R-451D
<tb> Testorganismen <SEP> Minimale <SEP> Inhibitionskonzentration
<tb> Systematischer <SEP> Name <SEP> Stammbezeichnung <SEP> in <SEP> Einheiten <SEP> pro <SEP> ml
<tb> R-451B <SEP> R-451D
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> QMCC <SEP> B964 <SEP> 0,3 <SEP> 0,025
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> ATCC <SEP> 5773 <SEP> 1,2 <SEP> 0,15
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> ATCC <SEP> 6633 <SEP> 1,2 <SEP> 0,15
<tb> -Sarcina <SEP> lutea <SEP> ATCC <SEP> 9341 <SEP> 1,2 <SEP> 0,3
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 6538 <SEP> 0,15 <SEP> 0,
025
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 6538P <SEP> 0,15 <SEP> 0,025
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 12715 <SEP> 0,6 <SEP> 0,15
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 9996 <SEP> 0,15 <SEP> 0,075
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 1163 <SEP> 0,6 <SEP> 0,3
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Gray <SEP> 0,3 <SEP> 0,025
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Smith <SEP> 0,6 <SEP> 0,3
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> DA <SEP> 2027-2036 <SEP> - <SEP> je <SEP> 0,25
<tb> 10 <SEP> klinische <SEP> Isolate, <SEP> die <SEP> gegen
<tb> Penicillin, <SEP> Streptomycin,
<tb> Tetracyclin <SEP> und <SEP> Erythromycin
<tb> resistent <SEP> sind.)
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> * <SEP> DA <SEP> 150 <SEP> - <SEP> 0,25
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> * <SEP> DA <SEP> 21 <SEP> 0,15 <SEP> 0;
0075
<tb> Streptococcus <SEP> haemolyticus <SEP> 0,1 <SEP> 0,01
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> ATCC <SEP> 10541 <SEP> 0,3 <SEP> 0,025
<tb> * <SEP> Him-Herz-Infusionsbrühe <SEP> -h <SEP> 0,5% <SEP> menschliches <SEP> Serum.
EMI0020.0002
<I>Tabelle <SEP> XVB</I>
<tb> In-vivo-Aktivität <SEP> von <SEP> R-451B <SEP> und <SEP> R <SEP> -451D
<tb> Infizierende <SEP> Mikroorganismen <SEP> pD/50 <SEP> (in <SEP> mg/kg)
<tb> R-451B <SEP> R-451D
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 1,3 <SEP> 3;
75
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> <I>2,5 <SEP> 12,5</I>
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> - <SEP> 3,75
EMI0020.0003
<I>Tabelle <SEP> XVI</I>
<tb> In <SEP> vitro-Aktivität <SEP> von <SEP> R-451D
<tb> Systematischer <SEP> Name <SEP> der <SEP> Minimale <SEP> Inhibitionskonzentration
<tb> untersuchten <SEP> Mikroorganismen <SEP> Stammbezeichnung <SEP> in <SEP> <U>ug/</U>ml
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> ATCC <SEP> 7064 <SEP> 0,25
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> var.
<SEP> mycoides <SEP> DA <SEP> 39 <SEP> 0,075
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> DA <SEP> 31 <SEP> 0,25
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> QMCC <SEP> 3773 <SEP> 0,025
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> DA <SEP> 38 <SEP> 0,25
<tb> Bacillus <SEP> sphaericus <SEP> DA <SEP> 32 <SEP> 0,75
<tb> Bacillus <SEP> sphaericus <SEP> DA <SEP> 33 <SEP> <B>0,25</B>
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> ATCC <SEP> 6633 <SEP> 0,25
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> * <SEP> DA <SEP> 150 <SEP> 0,25
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> ATCC <SEP> 9431 <SEP> 0,0075
<tb> Staphylococcus <SEP> albus <SEP> DA <SEP> 2100 <SEP> 0,25
EMI0021.0001
<I>Tabelle <SEP> XVI</I> <SEP> (Fortsetzung)
<tb> Systematischer <SEP> Name <SEP> der <SEP> Stammbezeichnung <SEP> Minimale <SEP> Inhibitionskonzentration
<tb> untersuchten <SEP> Mikroorganismen <SEP> in <SEP> ,
ug/ml
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> (10 <SEP> klinische <SEP> DA <SEP> 2027 <SEP> bis <SEP> 2036 <SEP> je <SEP> 0,25
<tb> Isolate, <SEP> die <SEP> gegen <SEP> Penicillin,
<tb> Streptomycin, <SEP> Tetracyclin <SEP> und
<tb> Erychromycin <SEP> resistent <SEP> sind)
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Gray <SEP> 0,25
<tb> Streptococcus <SEP> fecalis <SEP> DA <SEP> 20 <SEP> 0,025
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> * <SEP> DA <SEP> 21 <SEP> 0,25
<tb> * <SEP> Hirn-Herz-Infusionsbrühe <SEP> -F- <SEP> 0,5% <SEP> menschliches <SEP> Serum.
EMI0021.0002
<I>Tabelle <SEP> XVll</I>
<tb> In <SEP> vivo-Aktivität <SEP> von <SEP> R-451D
<tb> Infizierender <SEP> Mikroorganismus <SEP> Dosierung <SEP> in <SEP> <B>Mg</B> <SEP> R-451D <SEP> Prozentsatz <SEP> überlebender <SEP> Mäuse
<tb> pro <SEP> Maus <SEP> und <SEP> Tag <SEP> nach <SEP> 24 <SEP> Stunden
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 0 <SEP> (Kontrollsalzlösung) <SEP> 0
<tb> 75 <SEP> ( <SEP> 3,75 <SEP> mg <SEP> pro <SEP> kg <SEP> Maus) <SEP> 50
<tb> 100 <SEP> ( <SEP> 5,0 <SEP> mg <SEP> pro <SEP> kg <SEP> Maus) <SEP> 100
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 250 <SEP> (12,5 <SEP> mg <SEP> pro <SEP> kg <SEP> Maus) <SEP> 50
<tb> 400 <SEP> (20 <SEP> mg <SEP> pro <SEP> kg <SEP> Maus) <SEP> 100
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> 75 <SEP> ( <SEP> 3,75 <SEP> mg <SEP> pro <SEP> kg <SEP> Maus) <SEP> 50 <SEP> (nach <SEP> 2 <SEP> Tagen)
<tb> 100 <SEP> ( <SEP> 5,0 <SEP> mg <SEP> pro <SEP> kg <SEP> Maus) <SEP> 100 <SEP> (nach <SEP> 2 <SEP> Tagen)
EMI0021.0003
<I>Tabelle <SEP> XVlll</I>
<tb> In-vitro-Aktivität <SEP> von <SEP> R-451E
<tb> Konzentration <SEP> in <SEP> ,ug <SEP> Inhibitionszone <SEP> in <SEP> mm <SEP> gegen
<tb> R-451E/ml <SEP> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Streptococcus <SEP> fecalis <SEP> Bacillus <SEP> subtilis
<tb> 1000 <SEP> 20 <SEP> 19 <SEP> 24
<tb> 100 <SEP> 15 <SEP> 13 <SEP> 19
<tb> 10 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 15
<tb> 1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 8