DE2628914A1

DE2628914A1 - Thymusdruesenhormon, dessen herstellung und thymusdruesenhormon enthaltende praeparate

Info

Publication number: DE2628914A1
Application number: DE19762628914
Authority: DE
Inventors: Nathan Dr Trainin
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1975-07-04
Filing date: 1976-06-28
Publication date: 1977-01-27
Also published as: AU1549076A; DE2628914C2; AU513340B2; IL47645A; JPS5231816A; FR2315943A1; ZA763970B; IL47645A0; US4250084A; CA1065759A; GB1541275A; FR2315943B1

Description

Yeda Research and Development Go. Ltd. Rehovot, Israel

Thymusdrüsenhormon, dessen Herstellung und Thymusdrüsenhormon enthaltende Präparate

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von chemisch praktisch reinem Thymusiiormon, auf die reine Substanz als neuen Stoff sowie auf pharmazeutische Präparate, die dieses reine Thymushormon als aktives Ingredienz enthalten. Die Erfindung bezieht sich auch auf immununterstützende Therapie sowie weitere Behandlungsmethoden, bei denen dieser neue reine Stoff verwendet wird.

Es ist seit einiger Zeit bekannt, daß die bei neugeborenen, thymectomisierten Tieren verminderte Fähigkeit, Hauttrans« plantäte abzustoßen und eine Hauttransplantat-gegen-Wirt-Reaktion (graft~versus~host) herbeizuführen, partiell durch Implantation von zellimpermeablen Diffusionskammern, die Thymusgewebe enthalten, oder durch Injektion von zellfreien Thymusextrakten wiedererlangt werden kann. Es konnte gezeigt werden, daß durch Thymushormon enthaltende Extrakte die cytotoxische Reaktivität von Lymphzellen gegenüber syngene— tischen Tumoren in vitro und in vivo vergrößert wird (vgl. Trainin et al., J.Exp.Med., 1^8, 1521 (1973)·

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ORIGINAL INSPECTED

Angesichts dieser wichtigen und wertvollen Eigenschaften des Thymushormons wurde es als sehr vorteilhaft angesehen zu versuchen, dieses Hormon in chemisch reiner Form herzustellen, um so dessen Anwendung in der Medizin wie auch in der Forschung zu ermöglichen, ohne die Komplikationen und Nachteile von Präparaten in Kauf nehmen zu müssen, in denen das Hormon mit verschiedenen anderen Bestandteilen, wie Proteinen, Hormonen etc., kombiniert ist. Nur eine gereinigte Substanz kann unter einem Minimum von Nebenwirkungen angewendet und nur eine gereinigte Substanz kann standardisiert werden, und so eine genaue Dosierung bei / Applikationen ermöglicht werden. medizinischen

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von praktisch reinem Thymusdrüsenhormon, ausgehend von Thymusgewebe jeglicher geeigneter Herkunft. Wenn auch nachfolgend als Ausgangsmaterial für die Herstellung von Thymushormon frische Kalbsthymusdrüse verwendet worden ist, so ist doch darauf hinzuweisen, daß es sich hierbei nur um ein Beispiel Lsudelt und daß als Ausgangsmaterial auch andere Quellen für des Ehymushormon benutzt werden können.

las Verfahren der Erfindung umfaßt im wesentlichen folgende Stufen:

Homogenisierung frischer Thymusdrüse in einer geeigneten Menge eines flüssigen Mediums, wie Puffer, Salzlösung (saline) odgl., Entfernung der Zellbruchstücke, Entfernung weiterer unerwünschter Bestandteile durch Ultrasentrifugieren, Filtration der erhaltenen Flüssigkeit durch geeignete Membranfilter und erschöpfende Dialyse der so erhaltenen sterilen Flüssigkeit, Lyophilisierung des Diaiysats_s di"€ · Wieder auf lösung des so erhaltenen Produkts und dessen Fraktionierung (mittels Gelfiltration oder irgendeiner anderen geeigneten Technik)₉ Ber-rO-Lnung der sizLcelnen Proteinfraktionea (Protaingpitsen) hinsichtlich ihrer biologischen Aktivität, Eliroion des aktiven Katerials, das der weiteren iTSIrsionierrnng (soBo ätarcla lonenaustauscherchrsEiatograpliie) tants-rworfeE. wirä«, Ms praktisch

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reines und biologisch aktives Thymushormon erhalten wird, das dadurch charakterisiert ist, daß es bei Analyse durch elektrophoretische Fokussierung einen einzigen definierten Bereich von Protein ergibt und frei von Endotoxinen ist.

Das so erhaltene reine Thymushormon ist ein Polypeptid, hat ein Molekulargewicht von etwa 3323 + 220, einen isoelektrischen Wert zwischen 5,5 und 6,0 und umfaßt wahrscheinlich folgende 32+2 Aminosäuren:

Tabelle 1
Analyse der Aminosäurenzusammensetzung des Thymushormons *)

Aminosäurerest Mol Anzahl der Eeste (Leucin ~ 1)

Asparaginsäure Threonin Serin Glutaminsäure Prolin Glycin Alanin Leucin Lysin Arginin 1/2 Cystin

Summe 32+2

♦) Die Analyse der Aminosäuren (320 jig Protein des Thymushormons) zeigt keine unliblichen Aminosäuren. Basierend auf Leucin als Einheit beträgt das minimale Molekulargewicht 3323 + 220.

Mehr ins einzelne gehend umfaßt die Herstellung von gereinigtem Thymushormon gemäß einer bevorzugten Ausfiihrungsform der Erfindung folgende Stufen:

1) Homogenisierung von frischer Kalbsthymusdrüse in dem einbis fünffachen Volumen von Natriumphosphatpuffer, Phosphat-

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160,98	4
45,02	1
186,07	5
280,20	8
72,50	2
170,60	5
66,30	2
36,44	1
49,64	1
57,65	2
60,00	1-2

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gepufferter Salzlösung (PBS), Salzlösung, Iris-Puffer etc. in einem pH-Bereich von etwa 7 bis etwa 8. Diese Stufe wird mit 150 "bis 1OOO g Thymusmaterial (Haßgewieht) und einer entsprechenden Menge Pufferlösung durchgeführt.

2) Zentrifugieren des homogenen Mediums in der Kälte hei geringer Geschwindigkeit, um die Zellbruchstiicke zu entfernen.

3) Ultrazentrifugieren der überstehenden Flüssigkeit, wobei Dauer und Geschwindigkeit des Zentrifugierens von der Menge des zu behandelnden Materials abhängt. Die g-Geschwindigkeit variiert zwischen etwa 90 000 und etwa I50 000 g und die Dauer des Zentrifugierens von etwa 2 bis etwa 5 Stunden.

4·) Verwerfen des Niederschlags, Filtrieren der überstehenden Flüssigkeit durch verschiedene Membranfilter von etwa 0,8 bis etwa 0,4-5 pm, um Partifcelmaterialien sowie pyrogene Komponenten (Endotoxine) zu entfernen und um die Flüssigkeit zu sterilisieren.

5) Erschöpfende Dialyse der sterilen überstehenden Flüssigkeit gegen größere Volumen an destilliertem Wasser, Salzlösung, Phosphat-gepufferte Salzlösung etc. etwa 24- bis etwa 60 Stunden in der Kälte. Es werden hierfur/Dialysebeutel, die für die Filtration von Materialien mit einem Molekulargewicht von weniger als 10 000 geeignet sind, benutzt. Das aktive Material wird während dieses Verfahrens durch die Dialysebeutel hindurchgeführt.

6) Lyophilisierung des Dialysats und Wiederauflösung des erhaltenen Produkts in destilliertem Wasser, Ammoniumbicarbonat, Phosphat-gepufferter Salzlösung, Tris-Puffer etc., das auf Proteinkonzentrationen von 1 bis 5 mg/ccm Lösungsmittel verdünnt wird. Dieses Lyophilisat enthält das aktive Prinzip des Thymushormons.

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7) Fraktionierung des lyophilisierten und wiederaufgelösten Präparats durch Gelfiltration über Sephadex-Kolonnen im Bereich von G10 Ms G50. Anstelle von Sephadex können auch andere Biogelkolonnen benutzt werden. Alle erhaltenen Proteinspitzen werden lyophilisiert, erneut in Wasser, Ammoniumbicarbonat oder Iris-Puffer gelöst und zur Bestimmung der biologischen Aktivität unter Anwendung der weiter unten angegebenen Methoden untersucht.

8) Fraktionierung des aus den Kolonnen eluierten aktiven Materials durch Ionenaustauscherchromatographie. Die Kolonne wird mit Tris-Puffer, Ammoniumbicarbonat etc. vorzugsweise unter Anwendung eines linearen Konzentrationsgefälles von Salz eluiert. Die in einer konstanten Konzentration von Salz 0,12 bis 0,15 M) eluierte Spitze ist rein und enthält praktisch das gesamte aktive Thymushormon des Ausgangsmaterials.

9) Falls gewünscht, kann das aktive Material außerdem noch durch eine Sephadex- oder ähnliche Kolonne filtriert werden, die eine Entfernung der Salze ohne Beeinflussung der Aktivität ermöglicht. Der Beinheitsgrad des Thymushormons wurde durch elektrophoretische Fokussierung auf Polyacrylamidgelen mit einem pH-Gefälle von 3,5 bis 10 analytisch bestimmt. Dies zeigt die Anwesenheit von nur einem Bereich von Protein. Der für diesen Proteinbereich erhaltene isoelektrische Punkt variiert zwischen 5»5 und 6,0.

Zur Berechnung der biologischen Aktivität des Thymushormons sind folgende Bioversuche benutzt worden:

1) Die Wirkung von Thymushormon in dem in vitro-Transplantatgegen-Wirt-Modell (R.Auerbach und A.Globerson, Exp.Cell.

Ees. 42, 31 (1966); N.Trainin, M.Small, A.Globerson, J.Exp.

Med. 130, 765 (1969) und N.Trainin und M.Small, J.Exp.Med. !, 885 (197O)).

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2) Die Wirkung von Thymushormon in intracellularem cyclischem Adenosinmonophosphat (cAMP) auf Adenyleyeläseaktivität in Membranen (A.I.Eook und N.Trainin, J.Exp.Med. 1j52, 193 (1974); A.I.Eook und N.Trainin, J.Immunol. 114, 157 (1975) und N.Trainin, A.I.Eook, T.Umiel und M.Albala, Ann.N.X.Acad.Sci. 249, 349 (1975))·

3) Die Wirkung von Thymushormon in gemischten Lymphocytenkulturen (T.Umiel und K.Trainin, Eur.J.Immunol. *>, 85 (1975) und N.Trainin, A.I.Eook, T.Umiel und M.Albala, Ann.N.X.Acad.Sci., 249, 349 (1975))·

4) Die Wirkung von Thymushormon bei mitogener Aktivität von Phytohemagglutinin (PHA) und Concanavalin A (Y. Hott er und N.Trainin, Cell.Immunol. 16, 4-13 (1975)).

5) Die Wirkung von Thymushormon auf die Fähigkeit von T-Lymphocyten, Tumorzellen abzutöten (C.Camaud, D.Ilfeld, I.Brook und N.Trainin, J.Exp.Med. 1^8., 1521 (1973) und M.Small und N.Trainin, Int.J.Cancer, 1j>, 962 (1975).

6) Die Wirkung von Thymushormon auf die Proliferationsfähig— keit von Knochenmarkstammzellen (D.Zipori und N.Trainin, Exp. Haemat., ^, 389-398 (1975)).

7) Die Wirkung von Thymushormon gegen Autosensibilisierung (N.Trainin, M.Small, D.Zipori, T.Umiel, A.I.Eook und V.Eotter in "Biological activity of thymic hormones" (Verl.D.W.van Bekkum und A.M.Eruisbeek)(1975).

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—7—
Durch das folgende Beispiel soll das Verfahren der Erfindung

ti

näher erläutert werden. Verschiedene Änderungen und Modifikationen in den Verfahrensstufen sind möglich, die in den Bereich der Erfindung fallen und mit denen von ihrem Prinzip Gebrauch gemacht wird.

Beispiel

Zur Herstellung von gereinigtem Thymushormon wurden frische Kälberthymusdrüsen in dem doppelten Volumen von 0,005 M Natriumphosphatpuffer von pH 7»4 homogenisiert und 20 Minuten bei 2500 g zentrifugiert. Ausgegangen wurde von 3 Kalbsthymusdrüsen (insgesamt 400 bis 500 g Naßgewicht), und nach der Homogenisierung und Entfernung der Zellbruchstücke wurden insgesamt 4200 mg Protein erhalten, das der weiteren Aufarbeitung unterworfen wurde. Die überstehende Flüssigkeit wurde weiter 5 Stunden bei 105 000 g zentrifugiert und auf eine Standardprotein— konzentration verdünnt. Dieser aktive Extrakt wurde dann 60 Stunden in der Kälte erschöpfend gegen ein zwanzigmal größeres Volumen destilliertes Wasser dialysiert. Das Thymushormon passierte die Union Carbide-Dialysebeutel 27/32 oder 23/32, während der in den Dialysebeuteln zurückgehaltene Anteil keine Aktivität aufwies. Daraus ist zu schließen, daß das Molekuargewicht des aktiven Agens etwa 6000 oder weniger beträgt.

Es wurde der Gehalt an Protein, Eibonucleinsäure, Desoxyribonueleinsäure und an reduzierenden Kohlenwasserstoffen in dem Dialysat bestimmt, das durch Lyophilisierung konzentriert worden war. Es wurde keine Desoxyribonucleinsäure gefunden, dagegen ein konstantes Verhältnis von etwa 7 ^g Protein zu 2 mg reduzierenden Kohlenwasserstoffen und 1 mg Eibonucleinsäure festgestellt. Dieses lyophilisierte Dialysat wurde mit Desoxyribonucleinase und mit Ribonueleinase behandelt, wobei keines der Enzyme die Aktivität des Präparats vernichtete. Im Gegensatz dazu wurde das Präparat durch Pronase inaktiviert. Dieses partiell gereinigte Thymushormonpräparat war haltbar, wenn es einige Monate bei -20⁰C gehalten wurde, verlor jedoch die

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Aktivität bei Raumtemperatur nach 48 Stunden. Das lyophilisierte Präparat wurde dann in 0,1 M Ammoniumbicarbonat, pH 8,0, gelöst und durch Gelfiltration über eine Sephadex G-10-Kolonne (Pharmacia) (Fig. 1A) fraktioniert. Alle erhaltenen Proteinspitzen wurden lyophilisiert, erneut in Ammoniumbicarbonat gelöst und auf ihre Aktivität hin untersucht. Es wurde gefunden, daß nur die Substanzen, die in dem Hohlraumvolumen der Kolonne eluiert waren, die Fähigkeit besitzen, in den Milzzellen neugeborener thymectomisierter Mäuse eine Reaktion in dem in vitro-Hauttransplantat-gegen-Wirt-Versuch herbeizuführen (Fig. 1A und Tabelle 2). Das Molekulargewicht des Thymushormons beträgt anscheinend mehr als 700, da Substanzen mit einem Molekulargewicht oberhalb von 70° in das Hohlraumvolumen von Sephadex G-10-Kolonnen eluiert werden.

Das mit dem Hohlraumvolumen der G-10-Kolonne eluierte Material wurde weiter durch Gelfiltration über Sephadex G-25-Feinkolon— ne (Pharmacia) (Fig. 1B) fraktioniert. Die Kolonne wurde mit 0,1 M Ammoniumbicarbonat (pH 8,0) eluiert, die erhaltenen Spitzen erneut lyophilisiert, aufgelöst und auf ihre Aktivität in dem in vitro-Transplantat-gegen-Wirt-Versuchssystem geprüft. Die Aktivität wurde durchweg nur in einer Spitze (Fig. 1B und Tabelle 2) gefunden. Die Sephadex G-25-Kolonne wurde mit Insulin (Sigma)(MG 5700), Glucagon (Eli Lilly) (MG 3460) und Bacitracin (Teva, Israel) (MG 1400) kalibriert. Das Elutionsvolumen dieser Substanzen war - wie gefunden wurde - ihren Molekulargewichten umgekehrt proportional. Das aktive Material des Thymus-extraktes wurde unmittelbar nach Glucagon eluiert. Hieraus ergibt sich, daß das Molekulargewicht des ÜJhymushormons etwa 3000 beträgt. Die Komponenten der aktiven Spitze, die aus der Sephadex G-25-Kolonne eluiert worden wanfr?_;wurden weiter mittels Anionenaustauscherchromatographie über DEAE-Sephadex A-25 (Pharmacia) in 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, fraktioniert. Die Kolonne wurde mittels eines linearen Konzentrationsgefälles an NaCl entwickelt (Fig.1C). Ein analoges Elutions-

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muster kann man erhalten, wenn man den Tris-HCl-Puffer durch 0,1 M Ammoniumbicarbonat, pH 8,0, ersetzt. Bei Prüfung der von der Anionenaustauscherkolonne erhaltenen Spitzen ergab sich, daß die in 0,15 M NaCl eluierte Spitze die gesamte Aktivität enthielt (Fig.10 und Tabelle 2). Dieses Material wurde zur Entfernung der Salze durch eine Sephadex G-10-Kolonne filtriert. Die Aktivität wurde im Hohlraumvolumen der Kolonne gesammelt. Bei Verwendung von Kolonnen der oben angegebenen Dimensionen wurden nach dieser Stufe 10 bis 20 Mikrogramm aktives reines Protein erhalten. Das Material wurde durch Lyophilisierung konzentriert und sein Reinheitsgrad durch isoelektrische Foirussierung auf Polyacryl amid gel en analytisch bestimmt. 80 Mikrogramm Protein wurden auf die Gele aufgebracht, die danach entweder mit Coomassie Brilliantblau für Protein oder mit Alcian-Blau für Glycoproteine angefärbt wurden. Die von der Anionenaustauscherchromatographie— kolonne erhaltene Spitze zeigt die Anwesenheit von nur einem Bereich an, der für Protein angefärbt war. Glycopeptide wurden nicht entdeckt. Der für dieses Polypeptid in drei verschiedenen Versuchen ermittelte isoelektrische Punkt variiert zwischen 5>66 und 5»9Ο· Parallel dazu wurden Polyacrylamidgele, die nach dem Ansatz nicht fixiert und angefärbt wurden, in Scheiben zerschnitten, so daß deren Inhalt in der Kälte in Wasser diffundieren konnte. Die biologische Aktivität wurde in dem dem Proteinbereich entsprechenden Abschnitt gesammelt. Dieses eluierte Material entwickelte die volle Aktivität in dem in vitro-Transplantat-gegen-Wirt-Versuch bei Proteinkonzentrationen, die nach den Berechnungen unterhalb von 1 μg lagen und daher nicht nach dem Verfahren von Lowry bestimmt werden konnten. Daraus ergibt sich, daß die aktive Spitze, die von der Anionenaustauscherchromatographie-Kolonne eluiert wurde, Thymushormon enthält, das ein saures Polypeptid ist mit einem Molekulargewicht von etwa 3000. Dies wird weiterhin durch die Analyse der Aminosäurenzusammensetzung von Thymushormon (Tabelle 1) bestätigt. Zu dieser Analyse wurde

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der automatische Aminosäurenanalysator Beckman Modell 121 "benutzt. Eine Probe des aktiven Materials wurdie im Vakuum in 2 ecm 6 η Salzsäure bei 110⁰C 24, 48 und 72 Stunden hydrolysiert. Das Hydrolysat wurde in einem Rotationsverdampfer bei 50⁰C verdampft, der Rückstand in 0,2 η Citratpuffer, pH 2,2, gelöst und der aromatischen Kolonne zugeführt. Zurück auf Null— zeit extrapoliert, betrug die Anzahl der Reste für Serin und Threonin 5>36 bzw. 1,29. Sie wurden infolgedessen als 5 bzw. 1 engegeben (Tabelle 1). Eine getrennte basische Hydrolyse zur Tryptophanbestimmung wurde nicht durchgeführt. Es liegt jedoch der indirekte Beweis vor, daß diese Aminosäure nicht vorhanden ist. Tatsächlich weist das aktive Material, das von der letzten Sepadex G-10-Kolonne eluiert, lyophilisiert und wieder zu einer Konzentration von 1,25 mg/ccm Protein .aufgelöst wurde, ein Verhältnis der optischen Dichte (OD) bei 230 nm/280 nm von 9,77 auf; die optische Dichte bei 280 nm ist 0,09. Unter Annahme eines Molekulargewichts von nahezu 3300 beträgt die Konzentration an aktivem Polypeptid 0,4 mM. Da das molare Absorptionsvermögen des Tryptophans 5^00 beträgt und nur Spuren von Tyrosin, aber kein Phenylalanin enjjileekt wurden, sollte eine 0,4 mM-Tryptophan-Lösung eine optische Dichte von 2,24 bei 280 nm aufweisen. Diese Berechnungen zeigen an, daß in der Aminosäuren_zusammensetzung des aktiven Polypeptide kein Tryptophan vorhanden ist. Basierend auf Leucin als Einheit wird somit das Molekulargewicht mit 3323 angegeben. Es ist ein hoher Anteil an sauren Aminosäuren zu beobachten.

Das gemäß Erfindung erhaltene reine Thymushormon kann mit Erfolg in der Human- und Veterinärmedizin angewendet werden. Das Thymushormon ist das Hormon, das die Reifung unzulänglicher T-Zellen zu leistungsfähigen Zellen herbeiführt. Daher vergrößert das Thymushormon dieimmunologische Reaktion gegen eine Reihe von Antigenen, einschließlich gewisser Typen von bösartigen Zellen, und kann bei einigen neoplastischen Krankheiten von Vorteil sein. Es stellt somit ein wirksames Mittel in derdmmununterstützenden Therapie dar. Außerdem kann dieser physiologische Effekt des Thymushormons bei der Behandlung von Patienten

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"benutzt werden, bei denen ein Mangel an T-Zellen festgestellt worden ist. Dies umfaßt gewisse Immunmangelerscheinungen bei Kindern, wie Thymus-hypoplasia (Di-George-Syndrom), Wiskott-Aldrich-Syndrom sowie Ataxia telangiectasia und Mongolismus.

Das gemäß Erfindung erhaltene reine Thymushormon hat sich als besonders wertvoll bei der Behandlung von schweren Viruskrankheiten erwiesen, die von einer Unterdrückung der zellvermittelnden Immunität (cell-mediated immunity) begleitet sind. Die Unterdrückung der zellvermittelnden Immunität kann als !Folge von Virusinfektionen auftreten und hat einen ',sehr plötzlich ausbrechenden Verlauf der Krankheit zur Folge. Da eine ausreichende zellvermittelnde Immunempfindlichkeit für die Genesung von Infektionen dieses Types wesentlich ist, kann die Verbesserung der zellvermittelnden Immunität, die auf die Thymushormonapplikation folgt, einen vorteilhaften Einfluß auf den Krankheitsverlauf haben. Die Applikation von Thymushormon hat sich j.. auch bei Patienten als besonders wertvoll erwiesen, die eine Depression der zellvermittelnden Immunität nach Bestrahlung oder nach cytotoxischer Behandlung aufweisen. Dies bezieht sich insbesondere auf Patienten mit bösartigen Krankheiten. Die durch Thymushormon herbeigeführte Wiederherstellung der Äellvermittelnden Immunität erhöht die Widerstandsfähigkeit von Patienten mit Malignität gegenüber Infektionen und ermöglicht eine aggresivere chemotherapeutische und Bestrahlungstherapie.

Die Anwendung von therapeutisch wirksamen Thymushormondosierungen hat sich auch bei der Behandlung von Krankheiten, die autoimmune Prozesse, wie Lupus erythematosus, rheumatoide Arthritis, Hashimoto thyroiditis, chronisch aggresive Hepatitis, umfassen, als wertvoll erwiesen.

Die Thymushormon in gereinigter Form als aktives Ingredienz enthaltenden pharmazeutischen Präparate wurden einer Anzahl von Patienten verabreicht.

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Ein 3 1/2 Jahre alter Junge mit verbreiteter Virusdrüseninfektion und unterdrückter zellvermittlender Immunität "befand sich augenscheinlich in einem hoffnungslosen Zustand, war komatös und zeigte Depression des Atmungszentrums. Das Thymushormon wurde injiziert, die Menge betrug etwa 20 mg/Tag reines Thymushormon. Es setzte eine dramatische kindische Besserung ein, die mit der Wiederherstellung des normalen zellvermittelnden Immu— nitätsspiegels einherging.

Zwei Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie hatten si. ch Windpocken zugezogen. Die Krankheit bricht gewöhnlich sehr plötzlich aus und verläuft mit hoher Mortalität. Bei Anwendung von Thymushormon konnte bei der Krankheit ein relativ gutartiger Verlauf beobachtet werden.

Ein 10 Jahre altes Mädchen litt seit dem Alter von 2 1/2 Jahren an juveniler rheumatischer Arthritis. Die Krankheit zeigte während der letzten beiden Jahre eine kontinuierliche Aktivität. Es wurden hohe Dosen an Corticosteroiden angewendet, als mit anderen therapeutischen Mitteln die Krankheit nicht unter Kontrolle gebracht werden konnte. Das Mädchen wurde in einem Zustand von Hyperpyrexie, schwerer Polyarthritis, Myocarditis, pericardialer Effusion, diffuser Lungeninfiltration und Anzeichen von Leberschädigungen aufgenommen. Die Anzahl der T-Zellen im peripheren Blut war vermindert. Ihr Zustand verschlechterte sich, und sie schien sich in moribundem Zustand zu befinden. In diesem Zustand wurde i.m. reines Thymushormon in einer Dosierung von 1 mg/kg/Tag injiziert. Innerhalb von 24- Stunden fand eine dramatische Besserung statt, und innerhalb von weiteren 2 Wochen klärten sich die klinischen Erscheinungsformen praktisch ab. Diese Verbesserung war von einer Wiederherstellung der T— Zellenfunktion begleitet. Wurde die Thymushormonapplikation gestoppt oder vermindert, trat eine Verschlechterung der klinischen Erscheinungsformen ein. Dies wurde verschiedene Male durch weitere Applikationen von reinem Thymushormon rückgängig gemacht.

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Das Mädchen befindet sich jetzt mehr als 1 Jahr unter Thymushormonbehandlung, und die Krankheit ist - solange Thymushormon gegeben wird - unter Kontrolle.

Ein 2 Jahre altes Mädchen mit akuter lymphatischer Leukämie zog sich eine schwere Lungenentzündung mit Unterdrückung der zellvermittelnden Immunität zu. Es wurde reines Thymushormon in einer Dosis von 0,75 mg/kg/Tag verabreicht. Nach einigen Tagen konnte eine dramatische Besserung ihres Zustandes beobachtet werden.

Bei zwei 10 und 11 Jahre alten Kindern mit subakuter sclerosierender Panencephalitis wurde eine Verschlechterung der zellver— mittelnden Immunität durch die niedere T-Zellzahl und die verminderten cyclischen Adenosinmonophosphatspiegel der peripheren Blutlymphocyten sowie anderen Kriterien erklärt. Es wurde reines Thymushormon 10 bzw. 2.1 Tage verabreicht, wobei die Dosis 0,75 mg/kg/Tag betrug. Den Ergebnissen ist zu entnehmen, daß bei beiden Patienten mit der Verabreichung von Thymushormon eine Wiederherstellung der geschädigten T-Zellfunktion erzielt werden konnte.

Die Erfindung bezieht sich auch auf pharmazeutische Präparate, bestehend aus praktisch reinem und pyrogen-freiem Thymushormon als aktives Ingredienz, üblichen Hilfsstoffen und/oder Trägermaterialien. Unter der Bezeichnung "praktisch reines Thymushormon" ist reines 3?hymushormon zu verstehen, das durch das Verfahren der Erfindung oder auf anderen Wegen oder in anderer Weise erhalten wird und das in seiner Zusammensetzung demjenigen entspricht, das gemäß Erfindung erhalten wird.

Die pharmazeutischen Präparate der Erfindung enthalten etwa 0,25 bis etwa 2,0 mg reines Thymushormon pro kg Körpergewicht des Säugetiers, bei dem es angewandt werden soll; in Einheitsdosierungsform in der Humantherapie entspricht diese Dosierung etwa 5 bis 100 mg/Tag reine Substanz. Berechnet auf das reine

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Polypeptid entspricht dieses einer Dosierung von etwa 2 bis etwa 20 Mikrogramm reines Thymushormon pro kg Körpergewicht pro Tag. Die Dosierung der Erfindung soll somit Dosen von 1 Mikrogramm/kg/Tag bis etwa 100 Mikrogramm/kg/Tag reines Thymushormon umfassen.

Die bevorzugten pharmazeutischen Präparate liegen in Form von sterilen Injektionen vor, die das Thymushormon in einem geeigneten Träger oder Verdünnungsmittel enthalten. Das Thymushormon wird vorzugsweise durch i.m. Injektion appliziert. Gemäß Erfindung wird reines Thymushormon erhalten, das im wesentlichen frei von pyrogenen Komponenten ist, wodurch unerwünschte Nebenwirkungen vermieden werden.

flas reine Thymushormon kann in Kombination mit anderen Drogen, wie z.B. Antibiotica, cytotoxischen Drogen udgl., verwendet werden.

Die Untersuchungen wurden mit verschiedenen Arten von Säugetieren ausgeführt. Daraus ergab sich, daß die Kompositionen der Erfindung bei der Behandlung von Zuständen, die auf mangelnde T—Zellenfunktion zurückzuführen waren, eine hohe Wirksamkeit aufweisen. Durch die Behandlung wurde erreicht, daß die T-ZeI-len etwa auf die normale Anzahl gebracht werden konnten. . Sierexperimente zeigten, daß bei Anwendung der Kompositionen der Erfindung das Ausmaß des Wachstums und des Auftretens verschiedener Typen von Malignität wesent- werden konnte.

lieh reduziert

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-15-Tabelle 2

Herbeiführen der in vitro-Transplantat-gegen-Wirt-Reaktion in Milzzellen neugeborener thymectomisierter C57BL/6-Mäuse durch, aktive Fraktionen, die während der verschiedenen Stufen des Verfahrens zur Isolierung von Thymushormon erhalten worden waren

Untersuchte Fraktion (20 μg Protein/ccm)

Lieferant Vorkommen von Reaktion für Milz- reaktionsfähigen der KuI-zellen Kulturen tür

Dialysat des Thymusextrakts

aktive Spitze der Sephadex G-10-Kolonne

aktive Spitze der Sephadex G-25-Kolonne

aktive Spitze der DEAE Sephadex A-25-Kolonne

NTx ♦) intakt	0/5 V5	0/5 4/5	1/5 5/5	7 87
NTx	3/5	3/5	3/5	60
NTx	5/5	V5	V5	87
NTx	5/5	5/5	V5	93
NTx	V5	4/5		80

*) NTx » thymectomisierte neugeborene Tiere

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Claims

Patentanspräche

Chemisch im wesentlichen reines, nicht-pyrogenes, einheitliches Thymushormon, mit einem Molekulargewicht von 3J23 + 220, einem isoelektrischen Punkt von 5*7 bis 5» 9» einer Amino säur enzus amm ens et zung von annähernd

Asparaginsäure 4 Einheiten Threonin 1 If Serin 5 It Glutaminsäure 8 Il Prolin 2 Il Glycin 5 It Alanin 2 Il Leucin 1 Il Lysin 1 ti Arginin 2 It 1/2 Cystin 1-2 Il
1

erhältlich durch Reinigung von Thymusdrüsengewebe.

2. Verfahren zur Herstellung von im wesentlichen reinem und pyrogen-freiem Thymushormon, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) frisches Thymusdrüsengewebe (thymus tissue) von Säugetieren in einem geeigneten flüssigen Medium bei einem pH-Wert von etwa 7 bis etwa 8 fein zerkleinert,

t)) die Zellbruchstücke oder andere Zellrückstände mittels Zentrifugieren oder Ultrazentrifugieren entfernt,

c) die überstehende Flüssigkeit abtrennt und zur Entfernung von Partikelmaterial und Endotoxinen durch ein geeignetes liltrationsmedium hindurchführt, wobei die Flüssigkeit sterilisiert wird,

d) die erhaltene Flüssigkeit einer erschöpfenden Dialyse unterwirft,

e) das erhaltene Dialysat lyophilisiert und in einem geeig- _: neten Lösungsmittel erneut löst,

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f) das erhaltene lyophilisierte und wiedergelöste Material der Gelfiltration unterwirft und die erhaltenen Spitzen (Fraktionen) untersucht und

g) den aktiven Bestandteil in einer im wesentlichen reinen und pyrogen-freien Form eluiert.
3.. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zerkleinerung der Thymusdrüse in etwa dem ein- bis etwa dem fünffachen Volumen an Phosphatpuffer, Salzlösung (saline), Tris-Puffer odgl. bei einem pH-Wert von etwa 7 bis etwa 8 durchführt.
4. Verfahren nach Ansprüchen 2 oder 3» dadurch gekennzeichnet, daß man die nach dem Ultrazentrifugieren erhaltene Flüssigkeit durch Membranfilter von etwa 0,8 bis etwa 0,45 M-m hindurchführt.
5- Verfahren nach Ansprüchen 2, 3 oder 4·, dadurch gekennzeichnet, daß man die nach der Entfernung des Partikelmaterials erhaltene, einer erschöpfenden Dialyse gegenüber größeren Volumen an Wasser, Salzlösung, Phosphat-gepufferte Salzlösung odgl. unterwirft.
6. Verfahren nach Ansprüchen 2, 3j 4 oder 5> dadurch gekennzeichnet, daß man das lyophilisierte Dialysat in einer so großen Menge an destilliertem Wasser, Ammoniumbicarbonat, Phosphat-gepufferter Salzlösung, Tis-Puffer odgl. löst, daß die erhaltene Lösung eine Proteinkonzentration von etwa bis etwa 4 mg/ccm Lösungsmittel aufweist.
7· Verfahren nach Ansprüchen 2, 3i 4, 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Gelfiltration mit einer Sephadex-Eolonne des Bereichs G10 bis G50 durchführt.

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8, Verfahren nach Ansprächen 2, 3» 4-, 5, 6 oder 7» dadurch gekennzeichnet, daß man der Elution durch Ionenaustauscher-Chromatographie im wesentlichen die durch Fig. 1A definierten Spitzen (Fraktionen) unterwirft.
9. Pharmazeutische Präparate , bestehend aus praktisch reinem und pyrogen-freiem Thymushormon gemäß Anspruch 1 ,
üblichen Hilfsstoffen und/oder Trägermaterialien.

609004 /1147

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