DE2512975A1 - Polypeptid mit thymischer wirksamkeit - Google Patents

Polypeptid mit thymischer wirksamkeit

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Description

Es ist bekannt, daß die immunologische Punktion zur Abstoßung von Hauttransplantaten bei Mäusen, denen im neugeborenen Zustand der Thymus entfernt wurde, durch Injektion von zellfreien Thymusextrakten wiederhergestellt werden kann. In einer Millipore- -Kammer bestimmte Werte, aus denen eine teilweise Erholung von im neugeborenen Zustand der Thymektomie unterworfenen Mäusen durch Thymusverpflanzungen hervorgeht, deuten darauf hin, daß der Thymus die Punktion einer endokrinen Drüse aufweist und ein Hormon produziert, das in den Blutkreislauf gelangt; vgl. D.Osoba et al., Nature 199 (1963), Seite 359. Die Erfindung betrifft ein neues PoIypeptidhormon sowie ein neues Verfahren zur Isolierung und Reinigung dieser für medizinische Zwecke geeignete Substanz.
Man erhält das Hormon im allgemeinen aus Schweineblut durch Defibrinierung, Dialyse, Konzentrierung an einem geeigneten Filter, Fraktionierung durch ein Molekularsieb, weitere Fraktionierung
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durch DünnschichtChromatographie und schließlich Elektrophorese. Jede Stufe des Isolierverfahrens wird durch einen Biotest überwacht, bei dem die hemmende Wirkung des Peptids auf die Bildung von Rosetten in Gegenwart von Azathioprin bestimmt wird.
Das nach dem vorgenannten Verfahren erhaltene neue Polypeptid eignet sich für die Behandlung von Autoimmunerkrankungen, wie lupusartigen Krankheitserscheinungen, insbesondere Lupus Erythematosus beim Menschen. Das neue Polypeptid kann ferner in der Geriatrie zur selektiven Stimulierung der T-Zellen-Aktivität eingesetzt werden.
Eine Methode zur Isolierung des erfindungsgemäßen Polypeptidshormons aus Schweineblut bzw. zu seiner Reinigung ist in Beispiel 1 näher beschrieben. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur Isolierung des Polypeptidshormons aus menschliehern, Mäuse-, Rinder- und Schweineblut. Das Serum von Schweinen, denen der Thymus entfernt wurde, enthält eine Woche nach der Thymektomie kein PoIypeptidhormon, während dieses im Serum von Schweinen, die einer Scheinthymektomie unterworfen wurden, vorhanden ist. Das Hormon ist nicht artspezifisch; daher eignet sich aus Schweine-, Mäuse- und Rinderblut isoliertes Hormon auch für die Humanmedizin.
B e ispi e 1 1
Isolierung und Reinigung des Polypeptide Die Isolierung des Polypeptide erfolgt in 10 Stufen: 1) Defibrinierung, 2) Dialyse, 3) Eonzentrierung an einer Amicon UM2-Membran, 4) Filtration durch Sephadex G25, 5) Garboxymethylcellulose-Chromatographie, 6) Behandlung mit Aktivkohle, 7)DünnschichtChromatographie ( DC ) mit Butanol/Pyridin als Lösungsmittel, 8) zweidimensionale Dünnschichtchromatographie (erste Dimension mit 0,01 η Essigsäure, zweite Dimension mit Methanol/Chloroform/Ammoniumhydroxid als Lösungsmittel, 9) Rechromatographie mit dem letzteren Lösungsmittel und 10) Elektrophorese.
Jede dieser Stufen wird nachstehend näher erläutert. Bei der Fraktionierung geht man von 8 Liter Schweineblut aus.
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•δ-
1) Serumhersteilung durch Defibrinierung
Normale 3 bis 4 Monate alte Schweine werden in einem Schlachthaus verbluten gelassen. Das Blut wird sofort durch mechanisches Rühren def ibriniert. Anschließend kühlt man das Blut auf 40C ab und bringt es ins Labor, wo es zur Serumgewinnung zentrifugiert wird.
8 Liter defibriniertes Blut liefern bei einmaligem 15minütigem Zentrifugieren bei 40C und 1700 g 3,6 Liter Serum.
Biologische Aktivität;
Die nach dem (nachstehend beschriebenen) Rosettentest bestimmte biologische Aktivität des defibrinierten und zentrifugierten Serums beträgt 1/128.
2) Dialyse
3,6 Liter Serum werden in der Kälte (bei 40C) unter Ultrafiltrationsbedingungen (positiver Druck in der Membran, keine Flüssigkeit außerhalb der Membran) 4Std. dialysiert. Man verwendet eine PoIyacryinitrilmembran (Handelsprodukt von Rhone Poulenc) mit einer Permeabilität von 0,36 bis 0,45 ml/min/mm /mm Hg und einer Gesamt-
2
oberfläche von 1,02 m . Die Membran wird in einem handelsüblichen Rhone Poulenc 6-Dialysator eingesetzt. Eine Pumpe sorgt für die Serumzirkulation. Das Ultrafiltrat wird in der äußeren Kammer des Dialysators mit Hilfe einer zweiten Pumpe, die mit einer automatischen Ausfluß- und Druckeinrichtung ausgestattet ist, aufgefangen. 0,5 $ Protein werden im Ultrafiltrat (80 mg/ml im anfänglichen Serum und 0,4 mg/ml im Ultrafiltrat) gewonnen. Aus 3,6 Liter Serum erhält man 2,8 Liter Ultrafiltrat.
Biologische Aktivität;
Die Aktivität des Ultrafiltrats aufgrund des Rosettentests beträgt
3) Amicon UM2-Membran-Diafiltration
In sieben Amicon-Diafiltrationskammern (Modell 402) werden jeweils 400 ml Serumultrafiltrat gegeben. Dann wird ein ständiger Druck von 3,51 kg/cm (50 psi) angelegt. Nach 8 Stunden, wenn die Membran trocken ist, füllt man die Kammer mit 4 ml Phosphatpuffer (0,2 m;
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.ν-
PtJ 7f3) und rührt 1 Minute, damit das Polypeptid vom Puffer aufgenommen wird.
Biologische Aktivität;
Die nach dem Rosettentest "bestimmte Aktivität hat sich auf 1/25 000 erhöht. Die Waschflüssigkeiten (jeweils 4 ml) werden vereinigt und der Sephadex-Chromatographie unterworfen.
4) Sephadex G-25-Chromatographie
Die vereinigte Probe (28 ml) wird auf eine mit "feinem" Sephadex G-25 gefüllte 100 cm χ 5 cm-Säule aufgegeben und mit Phosphatpuffer (0,2 mj PtT 7,3) eluiert. Man hält die Fließgeschwindigkeit "bei 5 ml/min und fängt 5 ml-Fraktionen auf. Das mit Hilfe von Dextranblau bestimmte Leervolumen (Vq) beträgt 580 ml. Die in der Probe enthaltene Proteinhauptmenge wird mit den Elutionsvolumina im Bereich von 540 bis 580 ml gewonnen.
Biologische Aktivität:
Beim Rosettentest werden aktive Fraktionen bei einem Elutionsvolumen (V-g) von 1250 ml (v e/vq = 2>1) festgestellt. Die aktiven Fraktionen umfassen 15 ml mit Aktivität bei 1/256 000 und 30 ml mit Aktivität bei 1/128 000.
5) Carboxymethylcellulose-Chromatographie
Die durch die Sephadex-Chromatographie gewonnenen aktiven Fraktionen werden mit Hilfe von Amicon UM2-Membranen in der beschriebenen Weise entsalzt, indem man diese Fraktionen (insgesamt 45 ml) zusammen mit 300 ml destilliertem Wasser in die Amicon-Einheit einbringt, bis die Flüssigkeit vollständig durch die Membran hindurchgegangen ist. Der Filterrückstand wird in 7 ml Phosphatpuffer (0,01 m; pH 6,3) aufgenommen. Die erhaltene Probe wird'auf eine mit CM52-Cellulose (Whatman) gefüllte 15 cm χ 0,9cm-Säule aufgegeben. Die Carboxymethylcellulose wird in der vorbeladenenForm eingesetzt und mit Phosphatpuffer (0,02 mj pH 6,3) ins Gleichgewicht gebracht. Nachdem man 40 ml 0,01 m Phosphatpuffer (p™ 6,3) hinzugegeben hat, um ungebundenes Material zu entfernen und um die Säule wieder ins Gleichgewicht zu bringen, eluiert man mit Lösungen mit abgestuften
5 0 9 8 U 1 / 1 0 3 4
.5-
NaCl-Konzentrationen (von 0,01 m bis 0,4 m).
Biologische Aktivität:
In dem vor der NaCl-Zugabe eluierten Volumen werden weniger als 5 ^ der biologischen Aktivität festgestellt. Die gesamten übrigen biologisch aktiven Substanzen werden in Form eines einzigen Maximums mit 0,12 m NaCl eluiert. Man fängt 0,33 ml-Fraktionen auf· Die aktiven Fraktionen umfassen zwei 0,33 ral-Fraktionen, jeweils mit Aktivität bei 1/256 000, vier Fraktionen mit Aktivität bei 1/512 000 und eine Fraktion mit Aktivität bei 1/256 000. Alle diese Fraktionen werden vereinigt und mit Aktivkohle behandelt.
6) Behandlung mit Aktivkohle
Zur Entfernung der Substanzen, die sich durch Aktivkohle binden lassen, wird die bei der Carboxymethylcellulose-Chromatographie eluierte Probe 1 Stunde bei 40C mit Aktivkohle behandelt (1 ml Aktivkohle bei 50 mg/ml Wasser mit 1 Vol. der bei der Carboxymethylcellulose-Chromatographie erhaltenen aktiven Fraktionen). Es wird keine Änderung der biologischen Aktivität festgestellt.
7) Präparative DünnschichtChromatographie
Das mit Aktivkohle behandelte Material wird mit Hilfe einer Amicon UM2-Membran in der beschriebenen Weise entsalzt. Der Filterrückstand wird in Wasser aufgenommen und gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Material wird in 50jxl Wasser aufgenommen und längs einer horizontalen Linie auf eine präparative Cellulose-Chromatographieplatte aufgebracht. Nach Entwicklung mit Butanol/Pyridin (60 : 30) wird ein schmaler Streifen am Plattenrand mit Fluorescamin oder Ninhydrin sichtbar gemacht. Die den Fluorescaminflecken entsprechenden Plattenbereiche werden eluiert.
Die Peptidwanderung wird durch Einfärbung mit Fluorescamin bestimmt (das verwendete Fluorescamin ist "Fluram", ein Produkt von Hoffman La Roche). Man sprüht Fluram in Form einer Acetonlösung bei 30 mgfo auf und macht die Flecken durch Bestrahlung mit einer UV-Lampe sichtbar. Die Flecken werden bald nach dem Sprühvorgang markiert, da festgestellt wird, daß sie nicht langer als 1 bis
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2 Minuten bestehen bleiben. Die Färbung des Peptids läßt sich auch durch Besprühen mit einer Lösung von Ninhydrin/Cadmiumacetat erreichen. Der 1 cm breite Cellulosestreifen, auf welchem sich der Fluorescaminfleck befindet, wird vom ungefärbten Teil der Platte abgetrennt und eluiert. Die Elution erfolgt durch 36stündiges mechanisches Rühren bei 40C (1 cm2 Cellulose/5 ml H2O). Anschließend wird die Probe anhand des Rosettentests auf die biologische Aktivität geprüft. 30 ml zeigen Aktivität bei 1/25 000.
Nach Entwicklung mit Butanol/Pyridin (60 : 30) als Lösungsmittel finden sich nicht mehr als 2 $ der ursprünglichen Aktivität am Startpunkt, während eine von 100 fo nicht unterscheidbare Aktivität an der Lösungsmittelfront festgestellt wird. Der Cellulosestreifen an der Lösungsmittelfront wird eluiert und das Eluat gefriergetrocknet.
8) Zweidimensional praparative DünnschichtChromatographie
Man führt eine zweite dünnschichtchromatographische Reinigungsstufe durch zweidimensionale Chromatographie an Celluloseplatten durch. Als erstes Lösungsmittelsystem dient 0,01 η Essigsäure, in welcher die biologische Aktivität bei einem R~-Wert von 0,8 festgestellt wird. Das zweite Lösungsmittelsystem ist Methanol/ Chloroform/Ammoniumhydroxid (50 : 50 : 22,5). Nach der Entwicklung in der zweiten Dimension werden mit Fluorescamin immer noch drei Flecken festgestellt. Bei der Elution zeigt sich, daß der Fleck bei dem R~-Wert von 0,32 die gesamte biologische Aktivität beinhaltet. 30 ml des Eluats zeigen Aktivität bei 1/20 000.
9) Rechromatographie
Das eluierte Material ergibt bei der Rechromatographie mit Methanol/Chloroform/Ammoniumhydroxid (50 : 50 : 22,5) lediglich einen Fleck, der sich bei Einfärbung mit Fluorescamin oder Ninhydrin in gleicher Weise zeigt. 30 ml des Eluats besitzen Aktivität bei 1/20 000.
10) Hochspannungs-Elektrophorese
Die Hochspannungs-Elektrophorese bildet die letzte Stufe der Reinigung. Man führt eine Papierelektrophorese während 50 Minuten
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bei 40 V/cm und 40 mA in bis zu einem p„-Wert von 1,9 verdünnter Ameisensäure durch. Drei Komponenten werden durch Ninhydrin und Fluoresrescamin sichtbar gemacht. Bei diesen Bedingungen wandert das aktive Produkt um 9 cm zur Kathode. Die aktive Probe wird mit destilliertem Wasser vom Papier eluiert (1 ml H20/1 cm Papier). 4 ml Eluat zeigen Aktivität bei 1/128 000; es werden 30 jug Peptid gewonnen, wie der Test mit Ninhydrin und Pluorescamin zeigt (nach Hydrolyse über Nacht in 6 η HGl bei 1100C).
Bestimmung der th;/mischen Aktivität von Serum durch den Rosettentest
Der Rosettentest wird von J-.F.Bach und M.Dardenne in "Immunology" 25 (1973), Seite 353 beschrieben.
Zur Bestimmung der thymischen Aktivität des Serums wird dieses zuerst durch eine Amicon-Membran (Centriflo CF50 A, Amicon) filtriert, durch welche Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 50 000 hindurchgehen. Man inkubiert das infiltrierte Serum in einem HämolyserÖhrchen mit 3 x 10 Milzzellen, welche von ausgewachsenen C 57/Bl 6-Mäusen (erhalten vom Centre d'Elevage des Animaux de Laboratoire du C.N.R.S., 45 Orleans, La Source), denen 10 bis 20 Tage vorher der Thymus entfernt wurde, erhalten wurden. Die Thymektomiemethode wird von M.Dardenne und J.-P.Bach in "Immunology" 25 (1973), Seiten 343/344 beschrieben.
Die Inkubierung wird während 90 Minuten bei 370C in Gegenwart von Azathioprin bei einer Konzentration von 10jug/ml durchgeführt. Diese Konzentration liegt in der Mitte zwischen der Mindest-Azathioprinkonzentration, welche 50 $ rosettenbildende Milzzellen von normalen Mäusen blockiert (1 iig/ml), und der entsprechenden Mindesthemmkonzentration für rosettenbildende Milzzellen von ausgewachsenen, der Thymektomie unterworfenen Mäusen (25 bis 10ju.g/ml). Nach der Inkubierung gibt man zu den Zellen in der Testprobe 12 χ 10 Schaf-Erythrozyten. Die in der Probe enthaltenen Zellen werden innerhalb von 6 Min. bei 200 g abzentrifugiert und anschließend durch Rotation an einer Drehtrommel (10 cm Durchmesser) bei geringer Drehzahl (1OUpM) neuerlich vorsichtig und langsam suspendiert. Die rosettenbildenden
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00002 L ° ' L Ό ' °
Zellen werden in einem Hämatocytometer gezählt. Wenn keine thermische Aktivität vorhanden ist, beträgt die Anzahl der rosettenbildenden Zellen (RBZ) 1210/10 + 120 (Standardabweichung). Wenn thymische Aktivität vorliegt, verringert sich die RBZ-Anzahl auf 200 bis 400/10 Zellen. In Abwesenheit von Azathioprin bewirkt normales Serum keine RBZ-Hemmung. Thymische Aktivität liegt definitionsgemäß bei einer Hemmung von mehr als 50 $ rosettenbildenden Zellen vor.
Eigenschaften des Polypeptidhormons
Das erfindungsgemäße Polypeptidhormon weist einen isoelektrischen Punkt (py) bei einem p^-Wert von 7,5 + 0,1 auf. Die mangelnde Affinität gegenüber Aktivkohle deutet auf die Abwesenheit von aromatischen Aminosäuren hin. Die Elution des Polypeptids mit dem Leervolumen bei der Chromatographie an Sephadex G10 und die Zurückhaltung an Sephadex G15, G-25 und G50 zeigen ein Molekulargewicht von mehr als 700 und weniger als 3000 an. Die Ultrafiltration durch Amicon-Membranen ergibt ein Molekulargewicht von 500 bis 10 000. An CF50-, PM30- bzw. PM 10-Membranen (Mgw.-grenzen bzw. -trennwerte 50000, 30000 bzw. 10000) wird kedne nennenswerte Retention festgestellt.Andererseits wird keine merkliche Aktivität inUM2-und UMO, 5-Filtraten vorgefunden, deren Molekulargewichtsgrenzen bzw. -trennwerte bei 1000 bzw. 500 liegen. Das Polypeptid besitzt die Eigenschaft, daß es an Carboxymethylcellulose bei p„-Werten von weniger als 7,0 und an Diäthylaminoäthylcellulose bei Pjr-Werten von mehr als 9,0 gebunden wird. Das an Carboxymethylcellulose gebundene Polypeptid kann mit 0,12 m NaCl eluiert werden. Die Chromatographie an Celluloseplatten ergibt mit Methanol/Chloroform/Ammoniumhydroxid (50 : 50 : 22,5) als Lösungsmittel einen Rf-Wert von 0,68, mit destilliertem Wasser einen R~-Wert von 1,0 und mit 0,01 η Essigsäure einen R^-Wert von 0,8.
Das neue Polypeptid der Erfindung kann intravenös oder intramuskulär verabfolgt werden. Als Trägermedien für Präparate, welche das Polypeptid enthalten, eignen sich z.B. sterile Flüssigkeiten, wie Wasser oder Kochsalzlösung. Neben einem Trägermedium können die erfindungsgemäßen Arzneimittel bzw. Lösungen weitere Bestandteile, wie Stabilisatoren, Oxidationsinhibitoren, Suspen-
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diermittel oder Konservierungsmittel, z.B.Phenol oder Chlorbutanol, enthalten. Die fertigen Lösungen können leicht nach herkömmlichen Filtriermethoden sterilisiert werden.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel stellen wäßrige Lösungen dar,. welche eine für den medizinischen Zweck ausreichende Menge des Wirkstoffs enthalten. Die zu verabfolgende Dosis hängt in hohem Maße vom Zustand und Körpergewicht des Patienten ab. Der parenterale Veiabfolgungsweg wird bevorzugt. Im allgemeinen beträgt eine geeignete Tagesdosis etwa 0,01 bis etwa 1 mg Wirkstoff/kg Körpergewicht bei einer oder mehreren täglichen Verabfolgung(en). Der bevorzugte Dosisbereich beträgt etwa 0,05 bis 0,5 mg Wirkstoff/kg Körpergewicht. Besonders vorzuziehen ist eine Tages-Injektionsdosis von 5 mg Wirkstoff. Für die parenterale Verabreichung dient als Einheitsdosis im allgemeinen eine Lösung der reinen Verbindung in sterilem Wasser. Das Präparat kann auch die Form eines löslichen Pulvers aufweisen, aus dem nach Bedarf eine Lösung hergestellt wird.
In den nachstehenden Beispielen sind parenteral verabfolgbare Präparate beschrieben, die in Ampullen, Fläschchen oder Mehrfachdosis- -Fläschchen abgefüllt werden können.
Beispiel 2
Polypeptidhormon 5,0 mg
pyrogenfreies, steriles, destilliertes V/asser 1,0 ml
Das Präparat wird durch Filtration sterilisiert und anschließend in Ampullen, Fläschchen oder Mehrfachdosis-Fläschchen verpackt.
Beispiel 3
Parenteral verabfolgbare Lösung mit einem Gehalt von 5 mg Polypeptidhormon
pro Ampulle
Polypeptidhormon 5,0 mg
Lösungsmittel: für Injektionszwecke
geeignetes steriles V/asser 1,0-ml
509841/103 k
Nach Bedarf verwendet man passende Vielfache der vorgenannten Mengen.
5088^1/103

Claims (2)

Patentanspruch e
1. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptidhormons mit thymischer Aktivität, gekennzeichnet durch die folgenden Stufen:
a) Dialyse von defibriniertem Blutserum zur Entfernung von Substanzen mit hohem Molekulargewicht,
b) Konzentrierung des Dialysats an einer Filtermembran,
c) Fraktionierung des Filterrückstands durch ein Molekularsieb,
d) Chromatographie der entsalzten biologisch aktiven Fraktion an Carboxymethylcellulose,
e) Behandlung der biologisch aktiven Fraktion mit Aktivkohle zur Entfernung von Substanzen, die durchAktivkohlß gebunden werden,
f) Chromatographie des mit Aktivkohle behandelten Materials an einem oberflächenaktiven Adsorptionsmittel und
g) Elektrophorese der von Dünnschichtchromatographieplatten eluierten biologisch aktiven Fraktionen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) die Defibrinierung durch mechanisches Rühren bzw. Schütteln durchführt und die Dialyse durch eine Polyacrylnitrilmembran vornimmt,
b) die Konzentrierung des Polypeptidhormons durch Zurückhalten an einer Filtermembran vornimmt, durch welche Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 1000 hindurchgehen,
c) die Fraktionierung durch ein Molekularsieb vornimmt, welches Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als 1000 zurückhält ,
d) die Chromatographie an Carboxymethylcellulose durch Elution unter Anwendung abgestufter NaCl-Konzentrationen durchführt,
e) die Behandlung mit Aktivkohle in wäßrigem Medium vornimmt,
f) die Chromatographie an einem oberflächenaktiven Adsorptionsmittel an einer Celluloseplatte mit Butanol/Pyridin (60 : 3 0) als Lösungsmittel durchführt, wobei man anschließend eine zweidimensionale Chromatographie mit 0,01 η Essigsäure in
- 11 -
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