DE2512975A1 - Polypeptid mit thymischer wirksamkeit - Google Patents
Polypeptid mit thymischer wirksamkeitInfo
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Description
Es ist bekannt, daß die immunologische Punktion zur Abstoßung
von Hauttransplantaten bei Mäusen, denen im neugeborenen Zustand der Thymus entfernt wurde, durch Injektion von zellfreien Thymusextrakten
wiederhergestellt werden kann. In einer Millipore- -Kammer bestimmte Werte, aus denen eine teilweise Erholung von
im neugeborenen Zustand der Thymektomie unterworfenen Mäusen durch
Thymusverpflanzungen hervorgeht, deuten darauf hin, daß der Thymus
die Punktion einer endokrinen Drüse aufweist und ein Hormon produziert,
das in den Blutkreislauf gelangt; vgl. D.Osoba et al., Nature 199 (1963), Seite 359. Die Erfindung betrifft ein neues PoIypeptidhormon
sowie ein neues Verfahren zur Isolierung und Reinigung dieser für medizinische Zwecke geeignete Substanz.
Man erhält das Hormon im allgemeinen aus Schweineblut durch Defibrinierung,
Dialyse, Konzentrierung an einem geeigneten Filter, Fraktionierung durch ein Molekularsieb, weitere Fraktionierung
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durch DünnschichtChromatographie und schließlich Elektrophorese.
Jede Stufe des Isolierverfahrens wird durch einen Biotest überwacht, bei dem die hemmende Wirkung des Peptids auf die Bildung
von Rosetten in Gegenwart von Azathioprin bestimmt wird.
Das nach dem vorgenannten Verfahren erhaltene neue Polypeptid eignet
sich für die Behandlung von Autoimmunerkrankungen, wie lupusartigen
Krankheitserscheinungen, insbesondere Lupus Erythematosus
beim Menschen. Das neue Polypeptid kann ferner in der Geriatrie
zur selektiven Stimulierung der T-Zellen-Aktivität eingesetzt werden.
Eine Methode zur Isolierung des erfindungsgemäßen Polypeptidshormons
aus Schweineblut bzw. zu seiner Reinigung ist in Beispiel 1 näher beschrieben. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur
Isolierung des Polypeptidshormons aus menschliehern, Mäuse-, Rinder-
und Schweineblut. Das Serum von Schweinen, denen der Thymus entfernt wurde, enthält eine Woche nach der Thymektomie kein PoIypeptidhormon,
während dieses im Serum von Schweinen, die einer Scheinthymektomie unterworfen wurden, vorhanden ist. Das Hormon
ist nicht artspezifisch; daher eignet sich aus Schweine-, Mäuse- und Rinderblut isoliertes Hormon auch für die Humanmedizin.
B e ispi e 1 1
Isolierung und Reinigung des Polypeptide Die Isolierung des Polypeptide erfolgt in 10 Stufen: 1) Defibrinierung,
2) Dialyse, 3) Eonzentrierung an einer Amicon UM2-Membran,
4) Filtration durch Sephadex G25, 5) Garboxymethylcellulose-Chromatographie,
6) Behandlung mit Aktivkohle, 7)DünnschichtChromatographie ( DC ) mit Butanol/Pyridin als Lösungsmittel, 8) zweidimensionale
Dünnschichtchromatographie (erste Dimension mit 0,01 η Essigsäure, zweite Dimension mit Methanol/Chloroform/Ammoniumhydroxid
als Lösungsmittel, 9) Rechromatographie mit dem letzteren Lösungsmittel und 10) Elektrophorese.
Jede dieser Stufen wird nachstehend näher erläutert. Bei der Fraktionierung
geht man von 8 Liter Schweineblut aus.
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•δ-
1) Serumhersteilung durch Defibrinierung
Normale 3 bis 4 Monate alte Schweine werden in einem Schlachthaus
verbluten gelassen. Das Blut wird sofort durch mechanisches Rühren def ibriniert. Anschließend kühlt man das Blut auf 40C ab und bringt
es ins Labor, wo es zur Serumgewinnung zentrifugiert wird.
8 Liter defibriniertes Blut liefern bei einmaligem 15minütigem Zentrifugieren
bei 40C und 1700 g 3,6 Liter Serum.
Die nach dem (nachstehend beschriebenen) Rosettentest bestimmte biologische Aktivität des defibrinierten und zentrifugierten Serums
beträgt 1/128.
2) Dialyse
3,6 Liter Serum werden in der Kälte (bei 40C) unter Ultrafiltrationsbedingungen
(positiver Druck in der Membran, keine Flüssigkeit außerhalb der Membran) 4Std. dialysiert. Man verwendet eine PoIyacryinitrilmembran
(Handelsprodukt von Rhone Poulenc) mit einer Permeabilität von 0,36 bis 0,45 ml/min/mm /mm Hg und einer Gesamt-
2
oberfläche von 1,02 m . Die Membran wird in einem handelsüblichen Rhone Poulenc 6-Dialysator eingesetzt. Eine Pumpe sorgt für die Serumzirkulation. Das Ultrafiltrat wird in der äußeren Kammer des Dialysators mit Hilfe einer zweiten Pumpe, die mit einer automatischen Ausfluß- und Druckeinrichtung ausgestattet ist, aufgefangen. 0,5 $ Protein werden im Ultrafiltrat (80 mg/ml im anfänglichen Serum und 0,4 mg/ml im Ultrafiltrat) gewonnen. Aus 3,6 Liter Serum erhält man 2,8 Liter Ultrafiltrat.
oberfläche von 1,02 m . Die Membran wird in einem handelsüblichen Rhone Poulenc 6-Dialysator eingesetzt. Eine Pumpe sorgt für die Serumzirkulation. Das Ultrafiltrat wird in der äußeren Kammer des Dialysators mit Hilfe einer zweiten Pumpe, die mit einer automatischen Ausfluß- und Druckeinrichtung ausgestattet ist, aufgefangen. 0,5 $ Protein werden im Ultrafiltrat (80 mg/ml im anfänglichen Serum und 0,4 mg/ml im Ultrafiltrat) gewonnen. Aus 3,6 Liter Serum erhält man 2,8 Liter Ultrafiltrat.
Die Aktivität des Ultrafiltrats aufgrund des Rosettentests beträgt
3) Amicon UM2-Membran-Diafiltration
In sieben Amicon-Diafiltrationskammern (Modell 402) werden jeweils
400 ml Serumultrafiltrat gegeben. Dann wird ein ständiger Druck von 3,51 kg/cm (50 psi) angelegt. Nach 8 Stunden, wenn die Membran
trocken ist, füllt man die Kammer mit 4 ml Phosphatpuffer (0,2 m;
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.ν-
PtJ 7f3) und rührt 1 Minute, damit das Polypeptid vom Puffer aufgenommen
wird.
Die nach dem Rosettentest "bestimmte Aktivität hat sich auf
1/25 000 erhöht. Die Waschflüssigkeiten (jeweils 4 ml) werden vereinigt und der Sephadex-Chromatographie unterworfen.
4) Sephadex G-25-Chromatographie
Die vereinigte Probe (28 ml) wird auf eine mit "feinem" Sephadex G-25 gefüllte 100 cm χ 5 cm-Säule aufgegeben und mit Phosphatpuffer
(0,2 mj PtT 7,3) eluiert. Man hält die Fließgeschwindigkeit
"bei 5 ml/min und fängt 5 ml-Fraktionen auf. Das mit Hilfe von Dextranblau
bestimmte Leervolumen (Vq) beträgt 580 ml. Die in der Probe enthaltene Proteinhauptmenge wird mit den Elutionsvolumina
im Bereich von 540 bis 580 ml gewonnen.
Beim Rosettentest werden aktive Fraktionen bei einem Elutionsvolumen
(V-g) von 1250 ml (v e/vq = 2>1) festgestellt. Die aktiven
Fraktionen umfassen 15 ml mit Aktivität bei 1/256 000 und 30 ml mit Aktivität bei 1/128 000.
5) Carboxymethylcellulose-Chromatographie
Die durch die Sephadex-Chromatographie gewonnenen aktiven Fraktionen
werden mit Hilfe von Amicon UM2-Membranen in der beschriebenen Weise entsalzt, indem man diese Fraktionen (insgesamt 45 ml)
zusammen mit 300 ml destilliertem Wasser in die Amicon-Einheit
einbringt, bis die Flüssigkeit vollständig durch die Membran hindurchgegangen ist. Der Filterrückstand wird in 7 ml Phosphatpuffer
(0,01 m; pH 6,3) aufgenommen. Die erhaltene Probe wird'auf eine mit
CM52-Cellulose (Whatman) gefüllte 15 cm χ 0,9cm-Säule aufgegeben. Die
Carboxymethylcellulose wird in der vorbeladenenForm eingesetzt und
mit Phosphatpuffer (0,02 mj pH 6,3) ins Gleichgewicht gebracht.
Nachdem man 40 ml 0,01 m Phosphatpuffer (p™ 6,3) hinzugegeben hat,
um ungebundenes Material zu entfernen und um die Säule wieder ins Gleichgewicht zu bringen, eluiert man mit Lösungen mit abgestuften
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.5-
NaCl-Konzentrationen (von 0,01 m bis 0,4 m).
In dem vor der NaCl-Zugabe eluierten Volumen werden weniger als
5 ^ der biologischen Aktivität festgestellt. Die gesamten übrigen biologisch aktiven Substanzen werden in Form eines einzigen Maximums
mit 0,12 m NaCl eluiert. Man fängt 0,33 ml-Fraktionen auf· Die
aktiven Fraktionen umfassen zwei 0,33 ral-Fraktionen, jeweils mit
Aktivität bei 1/256 000, vier Fraktionen mit Aktivität bei 1/512 000 und eine Fraktion mit Aktivität bei 1/256 000. Alle
diese Fraktionen werden vereinigt und mit Aktivkohle behandelt.
6) Behandlung mit Aktivkohle
Zur Entfernung der Substanzen, die sich durch Aktivkohle binden lassen, wird die bei der Carboxymethylcellulose-Chromatographie
eluierte Probe 1 Stunde bei 40C mit Aktivkohle behandelt (1 ml
Aktivkohle bei 50 mg/ml Wasser mit 1 Vol. der bei der Carboxymethylcellulose-Chromatographie
erhaltenen aktiven Fraktionen). Es wird keine Änderung der biologischen Aktivität festgestellt.
7) Präparative DünnschichtChromatographie
Das mit Aktivkohle behandelte Material wird mit Hilfe einer Amicon
UM2-Membran in der beschriebenen Weise entsalzt. Der Filterrückstand wird in Wasser aufgenommen und gefriergetrocknet. Das
gefriergetrocknete Material wird in 50jxl Wasser aufgenommen und
längs einer horizontalen Linie auf eine präparative Cellulose-Chromatographieplatte
aufgebracht. Nach Entwicklung mit Butanol/Pyridin (60 : 30) wird ein schmaler Streifen am Plattenrand mit Fluorescamin
oder Ninhydrin sichtbar gemacht. Die den Fluorescaminflecken
entsprechenden Plattenbereiche werden eluiert.
Die Peptidwanderung wird durch Einfärbung mit Fluorescamin bestimmt
(das verwendete Fluorescamin ist "Fluram", ein Produkt von
Hoffman La Roche). Man sprüht Fluram in Form einer Acetonlösung bei 30 mgfo auf und macht die Flecken durch Bestrahlung mit einer
UV-Lampe sichtbar. Die Flecken werden bald nach dem Sprühvorgang markiert, da festgestellt wird, daß sie nicht langer als 1 bis
509841/1Cm.
2 Minuten bestehen bleiben. Die Färbung des Peptids läßt sich
auch durch Besprühen mit einer Lösung von Ninhydrin/Cadmiumacetat
erreichen. Der 1 cm breite Cellulosestreifen, auf welchem sich
der Fluorescaminfleck befindet, wird vom ungefärbten Teil der
Platte abgetrennt und eluiert. Die Elution erfolgt durch 36stündiges mechanisches Rühren bei 40C (1 cm2 Cellulose/5 ml H2O). Anschließend
wird die Probe anhand des Rosettentests auf die biologische Aktivität geprüft. 30 ml zeigen Aktivität bei 1/25 000.
Nach Entwicklung mit Butanol/Pyridin (60 : 30) als Lösungsmittel
finden sich nicht mehr als 2 $ der ursprünglichen Aktivität am
Startpunkt, während eine von 100 fo nicht unterscheidbare Aktivität
an der Lösungsmittelfront festgestellt wird. Der Cellulosestreifen
an der Lösungsmittelfront wird eluiert und das Eluat gefriergetrocknet.
8) Zweidimensional praparative DünnschichtChromatographie
Man führt eine zweite dünnschichtchromatographische Reinigungsstufe
durch zweidimensionale Chromatographie an Celluloseplatten durch. Als erstes Lösungsmittelsystem dient 0,01 η Essigsäure,
in welcher die biologische Aktivität bei einem R~-Wert von 0,8 festgestellt wird. Das zweite Lösungsmittelsystem ist Methanol/
Chloroform/Ammoniumhydroxid (50 : 50 : 22,5). Nach der Entwicklung
in der zweiten Dimension werden mit Fluorescamin immer noch drei Flecken festgestellt. Bei der Elution zeigt sich, daß der
Fleck bei dem R~-Wert von 0,32 die gesamte biologische Aktivität beinhaltet. 30 ml des Eluats zeigen Aktivität bei 1/20 000.
9) Rechromatographie
Das eluierte Material ergibt bei der Rechromatographie mit Methanol/Chloroform/Ammoniumhydroxid
(50 : 50 : 22,5) lediglich einen Fleck, der sich bei Einfärbung mit Fluorescamin oder Ninhydrin
in gleicher Weise zeigt. 30 ml des Eluats besitzen Aktivität bei 1/20 000.
10) Hochspannungs-Elektrophorese
Die Hochspannungs-Elektrophorese bildet die letzte Stufe der Reinigung.
Man führt eine Papierelektrophorese während 50 Minuten
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bei 40 V/cm und 40 mA in bis zu einem p„-Wert von 1,9 verdünnter Ameisensäure
durch. Drei Komponenten werden durch Ninhydrin und Fluoresrescamin sichtbar gemacht. Bei diesen Bedingungen wandert das aktive
Produkt um 9 cm zur Kathode. Die aktive Probe wird mit destilliertem
Wasser vom Papier eluiert (1 ml H20/1 cm Papier). 4 ml
Eluat zeigen Aktivität bei 1/128 000; es werden 30 jug Peptid gewonnen,
wie der Test mit Ninhydrin und Pluorescamin zeigt (nach Hydrolyse über Nacht in 6 η HGl bei 1100C).
Bestimmung der th;/mischen Aktivität von Serum durch den Rosettentest
Der Rosettentest wird von J-.F.Bach und M.Dardenne in "Immunology"
25 (1973), Seite 353 beschrieben.
Zur Bestimmung der thymischen Aktivität des Serums wird dieses zuerst
durch eine Amicon-Membran (Centriflo CF50 A, Amicon) filtriert,
durch welche Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 50 000 hindurchgehen. Man inkubiert das infiltrierte Serum in
einem HämolyserÖhrchen mit 3 x 10 Milzzellen, welche von ausgewachsenen
C 57/Bl 6-Mäusen (erhalten vom Centre d'Elevage des Animaux de Laboratoire du C.N.R.S., 45 Orleans, La Source), denen 10
bis 20 Tage vorher der Thymus entfernt wurde, erhalten wurden. Die Thymektomiemethode wird von M.Dardenne und J.-P.Bach in "Immunology"
25 (1973), Seiten 343/344 beschrieben.
Die Inkubierung wird während 90 Minuten bei 370C in Gegenwart von
Azathioprin bei einer Konzentration von 10jug/ml durchgeführt. Diese
Konzentration liegt in der Mitte zwischen der Mindest-Azathioprinkonzentration, welche 50 $ rosettenbildende Milzzellen von normalen
Mäusen blockiert (1 iig/ml), und der entsprechenden Mindesthemmkonzentration
für rosettenbildende Milzzellen von ausgewachsenen, der Thymektomie unterworfenen Mäusen (25 bis 10ju.g/ml). Nach
der Inkubierung gibt man zu den Zellen in der Testprobe 12 χ 10 Schaf-Erythrozyten. Die in der Probe enthaltenen Zellen werden innerhalb von
6 Min. bei 200 g abzentrifugiert und anschließend durch Rotation an
einer Drehtrommel (10 cm Durchmesser) bei geringer Drehzahl (1OUpM)
neuerlich vorsichtig und langsam suspendiert. Die rosettenbildenden
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00002 L ° ' L Ό ' °
Zellen werden in einem Hämatocytometer gezählt. Wenn keine thermische
Aktivität vorhanden ist, beträgt die Anzahl der rosettenbildenden Zellen (RBZ) 1210/10 + 120 (Standardabweichung). Wenn
thymische Aktivität vorliegt, verringert sich die RBZ-Anzahl auf 200 bis 400/10 Zellen. In Abwesenheit von Azathioprin bewirkt
normales Serum keine RBZ-Hemmung. Thymische Aktivität liegt definitionsgemäß
bei einer Hemmung von mehr als 50 $ rosettenbildenden Zellen vor.
Das erfindungsgemäße Polypeptidhormon weist einen isoelektrischen Punkt (py) bei einem p^-Wert von 7,5 + 0,1 auf. Die mangelnde Affinität
gegenüber Aktivkohle deutet auf die Abwesenheit von aromatischen Aminosäuren hin. Die Elution des Polypeptids mit dem Leervolumen
bei der Chromatographie an Sephadex G10 und die Zurückhaltung an Sephadex G15, G-25 und G50 zeigen ein Molekulargewicht
von mehr als 700 und weniger als 3000 an. Die Ultrafiltration durch Amicon-Membranen ergibt ein Molekulargewicht von 500 bis 10 000.
An CF50-, PM30- bzw. PM 10-Membranen (Mgw.-grenzen bzw. -trennwerte
50000, 30000 bzw. 10000) wird kedne nennenswerte Retention festgestellt.Andererseits
wird keine merkliche Aktivität inUM2-und UMO, 5-Filtraten vorgefunden,
deren Molekulargewichtsgrenzen bzw. -trennwerte bei 1000 bzw. 500 liegen. Das Polypeptid besitzt die Eigenschaft, daß es an Carboxymethylcellulose
bei p„-Werten von weniger als 7,0 und an Diäthylaminoäthylcellulose
bei Pjr-Werten von mehr als 9,0 gebunden wird.
Das an Carboxymethylcellulose gebundene Polypeptid kann mit 0,12 m
NaCl eluiert werden. Die Chromatographie an Celluloseplatten ergibt
mit Methanol/Chloroform/Ammoniumhydroxid (50 : 50 : 22,5) als Lösungsmittel einen Rf-Wert von 0,68, mit destilliertem Wasser
einen R~-Wert von 1,0 und mit 0,01 η Essigsäure einen R^-Wert von
0,8.
Das neue Polypeptid der Erfindung kann intravenös oder intramuskulär
verabfolgt werden. Als Trägermedien für Präparate, welche das Polypeptid enthalten, eignen sich z.B. sterile Flüssigkeiten,
wie Wasser oder Kochsalzlösung. Neben einem Trägermedium können die erfindungsgemäßen Arzneimittel bzw. Lösungen weitere Bestandteile,
wie Stabilisatoren, Oxidationsinhibitoren, Suspen-
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diermittel oder Konservierungsmittel, z.B.Phenol oder Chlorbutanol,
enthalten. Die fertigen Lösungen können leicht nach herkömmlichen Filtriermethoden sterilisiert werden.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel stellen wäßrige Lösungen dar,. welche eine für den medizinischen Zweck ausreichende Menge des
Wirkstoffs enthalten. Die zu verabfolgende Dosis hängt in hohem Maße vom Zustand und Körpergewicht des Patienten ab. Der parenterale
Veiabfolgungsweg wird bevorzugt. Im allgemeinen beträgt
eine geeignete Tagesdosis etwa 0,01 bis etwa 1 mg Wirkstoff/kg Körpergewicht bei einer oder mehreren täglichen Verabfolgung(en).
Der bevorzugte Dosisbereich beträgt etwa 0,05 bis 0,5 mg Wirkstoff/kg Körpergewicht. Besonders vorzuziehen ist eine Tages-Injektionsdosis
von 5 mg Wirkstoff. Für die parenterale Verabreichung dient als Einheitsdosis im allgemeinen eine Lösung der reinen Verbindung
in sterilem Wasser. Das Präparat kann auch die Form eines löslichen Pulvers aufweisen, aus dem nach Bedarf eine Lösung hergestellt
wird.
In den nachstehenden Beispielen sind parenteral verabfolgbare Präparate
beschrieben, die in Ampullen, Fläschchen oder Mehrfachdosis-
-Fläschchen abgefüllt werden können.
Polypeptidhormon 5,0 mg
pyrogenfreies, steriles, destilliertes V/asser 1,0 ml
Das Präparat wird durch Filtration sterilisiert und anschließend in Ampullen, Fläschchen oder Mehrfachdosis-Fläschchen verpackt.
Beispiel 3
Parenteral verabfolgbare Lösung mit einem Gehalt von 5 mg Polypeptidhormon
pro Ampulle
Polypeptidhormon 5,0 mg
Lösungsmittel: für Injektionszwecke
geeignetes steriles V/asser 1,0-ml
geeignetes steriles V/asser 1,0-ml
509841/103 k
Nach Bedarf verwendet man passende Vielfache der vorgenannten Mengen.
5088^1/103
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptidhormons mit
thymischer Aktivität, gekennzeichnet durch die folgenden Stufen:
a) Dialyse von defibriniertem Blutserum zur Entfernung von
Substanzen mit hohem Molekulargewicht,
b) Konzentrierung des Dialysats an einer Filtermembran,
c) Fraktionierung des Filterrückstands durch ein Molekularsieb,
d) Chromatographie der entsalzten biologisch aktiven Fraktion an Carboxymethylcellulose,
e) Behandlung der biologisch aktiven Fraktion mit Aktivkohle zur Entfernung von Substanzen, die durchAktivkohlß gebunden werden,
f) Chromatographie des mit Aktivkohle behandelten Materials an
einem oberflächenaktiven Adsorptionsmittel und
g) Elektrophorese der von Dünnschichtchromatographieplatten eluierten biologisch aktiven Fraktionen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) die Defibrinierung durch mechanisches Rühren bzw. Schütteln durchführt und die Dialyse durch eine Polyacrylnitrilmembran
vornimmt,
b) die Konzentrierung des Polypeptidhormons durch Zurückhalten an einer Filtermembran vornimmt, durch welche Substanzen mit
einem Molekulargewicht von weniger als 1000 hindurchgehen,
c) die Fraktionierung durch ein Molekularsieb vornimmt, welches Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als 1000 zurückhält
,
d) die Chromatographie an Carboxymethylcellulose durch Elution
unter Anwendung abgestufter NaCl-Konzentrationen durchführt,
e) die Behandlung mit Aktivkohle in wäßrigem Medium vornimmt,
f) die Chromatographie an einem oberflächenaktiven Adsorptionsmittel
an einer Celluloseplatte mit Butanol/Pyridin (60 : 3 0)
als Lösungsmittel durchführt, wobei man anschließend eine zweidimensionale Chromatographie mit 0,01 η Essigsäure in
- 11 -
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äsr "srsten Dimension iind Msthanol/Ohlorcfοrm/Aamioniumliyarcziu.
·; 50 % 50 g 22?3) in der sweiten Dimension und
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s) BindsTsrsiogsn gegenüber Biäthylaminoäthyleellulose bei pTJj·-
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4* Arsneimi'G'cöl aus einer therapeutisch wirksamen Menge des PoIypeptidhoriäoiis
τοη Anspruch 3 und einem niclvc-toxischenj pharmazolosiseh
verträglichen !Eraser oder Verdünnungsmittel.
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