CH639667A5

CH639667A5 - Verfahren zur herstellung von peptidkomplexen aus dns-haltigen organismen.

Info

Publication number: CH639667A5
Application number: CH420678A
Authority: CH
Inventors: Guenther Prof Dr Wilhelm
Original assignee: R & Z Vermoegensverw Gmbh
Priority date: 1977-04-20
Filing date: 1978-04-19
Publication date: 1983-11-30
Also published as: PT67916B; IT1112622B; FR2387991B1; NO151153B; DK168078A; NO781360L; FI781194A; CA1128860A; US4228068A; IT7822501A0; NL7803973A; SE7804098L; EG14174A; IE780767L; IE46618B1; JPS5417108A; PT67916A; AT374928B; ATA260878A; ES468918A1

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptidkomplexen aus desoxyribonucleinsäurehaltigen Organismen.

Es ist bekannt, dass Peptide verschiedenster Zusammensetzung allein oder in Verbindung mit Polysacchariden oder Lipiden, spezifische Antigendeterminanten aufweisen können. Sie sind zum Teil nur als Haptene, zum Teil als Immunogene wirksam. Es wurden zahlreiche Untersuchungen durchgeführt, um aus den verschiedensten Organismen Antigene zu isolieren, die zu diagnostischen, therapeutischen oder prophylaktischen Zwecken in der Humanoder Tiermedizin einsetzbar sind. Die heute in der Tier- und Humanmedizin zur Verfügung stehenden Antigene sind meist Gemische aus zum Teil wirksamen, zum Teil unwirksamen Proteinen, Polysacchariden, Lipiden und Nuclein-säuren. Als Beispiel für die diagnostische Anwendung solcher Zubereitungen sei hier das gereinigte Tuberkulin für die Tuberkulosediagnostik angeführt. Bei der prophylaktischen Anwendung zur Erzielung eines Impfschutzes gegen bakterielle oder pilzliche Infektionen genügen solche Zubereitungen, wie z.B. das gereinigte Tuberkulin nicht. Man ist gezwungen, ganze, lebende oder aufgelöste Mikroorganismen zu verabreichen, wie dies z.B. bei der Tuberkulose-, Pertussis- oder Salmonellenimpfung geschieht. Diese Methoden sind mit einer nicht unbeträchtlichen Gefährdung der Patienten verbunden.

Es stellt sich damit zunächst die Aufgabe, Antigene herzustellen, die chemisch genau definierbar, weitgehend rein und gleichzeitig für diagnostische, therapeutische und prophylaktische Zwecke eingesetzt werden können.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Peptidkomplexen aus desoxyribonucleinsäurehaltigen Organismen ist im vorangehenden Patentanspruch 1 charakterisiert.

Bei den erfindungsgemässe hergestellten Peptidkomplexen handelt es sich um solche, die folgendermassen charakterisiert sind:

a) ein Molekulargewicht kleiner als 5000

b) die Fähigkeit zur Bildung einer Ribonucleinsäurever-bindung mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 9000 - 20 000, die bei der Gelelektrophorese und der Acetat-folienelektrophorese eine singuläre, einheitliche Bande ergibt,

c) intrazelluläres Vorkommen,

d) einen Calcium-Gehalt e) eine Fällungsreaktion mit Terbium-III-Ionen f) sehr gute Wasserlöslichkeit g) einen mittleren Gehalt an Asparagin- und Glutaminsäure von etwa 30 Mol%, bezogen auf den Gesamtaminosäuregehalt,

h) ein Molverhältnis (Asparaginsäure + Glutaminsäure): (Lysin + Arginin) grösser als 1

i) eine herkunftsspezifische Aminosäurezusammensetzung k) antigene Wirkung und

1) Verursachung von Resistenzsteigerung.

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Im folgenden werden drei mögliche spezielle Verfahrensweisen beschrieben:

I. Das lyophilisierte, in Wasser gelöste RNP wird mit Phenol versetzt, auf etwa 95 - 100°C erhitzt, nach dem Abkühlen bis zur Phasentrennung zentrifugiert, die Phenolphase mit Wasser versetzt, dämm mit Äther wiederholt ausgeschüttelt. Der wässrige Rückstand wird lyophilisiert.

II. Das in Wasser gelöste RNP wird einer Hochspan-nungselektrophoresis unterworfen und der Peptidkomplex in üblicher Weise isoliert.

III. Aus dem in Wasser gelösten RNP wird dünnschicht-chromatographisch der Peptidkomplex isoliert.

Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Arzneimittel, enthaltend einen Peptidkomplex gemäss Erfindung in einem üblichen pharmazeutischen Träger, gegebenenfalls in Verbindung mit üblichen pharmazeutischen Additiven.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert. Die in den Beispielen angegebenen Teile sind, falls sie nicht ausdrücklich als Volumenanteile gekennzeichnet sind, Gewichtsteile.

Beispiel 1

Native oder denaturierte Bakterien, Pilze, Pflanzen, menschliches oder tierisches Gewebe werden in Ultra-Turrax und Potterhomogenisator in 0,2 molarem Phosphatpuffer, pH 7,2, homogenisiert. Das Homogenisat wird danach zentrifugiert, bis der Überstand klar ist. Der Überstand wird 30 Minuten mit Phosphatpuffer beladener DEAE-Zellulose gerührt. Die DEAE-Zellulose wird drei bis fünf Mal mit 0,2 molarem Phosphatpuffer gewaschen und die Waschlösung jeweils verworfen. Sodann wird die beladene DEAE-Zellulose in eine Säule gefüllt und mit obigem Phosphatpuffer gewaschen, bis die Extinktion bei 280 nm unter 0,1 abgesunken ist. Danach wird mit 0,1 molarer Essigsäure-Acetatlösung, pH 3,2, weitergewaschen, bis die Extinktion unter 0,1 abgesunken ist. Danach wird der Essigsäurelösung 3 % NaCl zugefügt und die mit der NaCl-Front im Eluat erscheinende Ribonucleoproteinfraktion gesammelt. Nach Dialyse gegen destilliertes Wasser wird die Ribonucleoproteinfraktion eingeengt und lyophilisiert. Die Ausbeute ist unterschiedlich. Sie beträgt für 30 g Bakterien und Pilze ungeführ 30 mg, bei pflanzlichen, tierischen und menschlichen Geweben ist sie von der Zellart abhängig.

Das Ribonucleoprotein (RNP) wird dann einer modifizierten Phenolextraktion nach Westphal (Z. Naturforschung 7b (1952) 148 - 155) unterworfen. Dabei arbeitet man wie folgt: Das RNP wird in aquadest. (ca. 1,5 ml H:0 auf 10 mg RNP) gelöst. Zu dieser Lösung wird die halbe Menge an verflüssigtem Phenol p.a. zugesetzt (10 ml aqua dest. + 5 ml Phenol). Dieses Gemisch wird unter Rühren etwa 10 Minuten auf 95 - 100°C erhitzt. Anschliessend kühlt man ab auf ca. 2-3°C. Man zentrifugiert das Gemisch bis zur exakten Tren-s nung der Phasen. Die H:0-Phase enthält RNS + Bruchstücke + Aminosäuren. Die mit H2O gesättigte Phenolphase enthält den Peptidkomplex. Die Phenolphase wird mit dem halben Volumen an frischem aqua dest. versetzt und mit drei- bis fünffachem Überschuss an Äther ausgeschüttelt. Dieser Vor-10 gang wird dem gesamten Ablauf nach zwei Mal wiederholt. Nach der Phenoleliminierung wird der wässrige Rückstand, welcher jetzt das gereinigte Peptid beinhaltet, gewünschten-falls durch ein Sterilfilter (Millipore) gepresst und gefriergetrocknet. Ausbeute der Extraktion: ca. 1-1,5 % Peptidkom-15 plex bezogen auf RNP. Die Ätherphase wird nach der Trennung in der Schüttelbirne verworfen.

Beispiel 2

Die erfindungsgemässen Peptidkomplexe können aus dem 20 beispielsweise gemäss Beispiel 1 erhaltenen Ribonucleoprotein (RNP) auch durch Hochspannungselektrophorese gewonnen werden.

Die RNP-Lösung wird hierzu auf Whatman Nr. 1-Elektro-phoresepapier aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgt in 0,1 25 molarem Eises^ig-Pyridin-Puffer, pH 5,7, mit 50 V/cm über 30 Minuten. Nach Anfärbung von Randstreifen wird die mit Amidoschwarz und Ninh> drin färbbare Bande ausgeschnitten und nit destilliertem Wasser eluiert.

Die so eluier:en Peptidkomplexe sind in destilliertem 30 Wasser und phy siologischen Salzlösungen sehr gut löslich. Die Peptidkomplexe können über Seph.idex und bakteriendichte Filter ohne Wirkungsverlust filtriert werden.

Beispiel 3

35 Herstellung durch präparative Dünm.chichtchromatogra-phie. Die RNP-Lösung wird auf eine präparative Kieselgelplatte aufgetragen und aufsteigend in einem Gemisch von Chloroform/Methanol/Eisessig (3:2:1) etwa 1 -2 Stunden chromatographiert. Nach Trocknung der Platte wird ein 40 Randstreifen ir.it Ninhydrin und ein zweiter abgetrennter Randstreifen mit Amidoschwarz angefärbt. Aus der jeweils gefärbten Bande wird der gewünschte Peptidkomplex eluiert und aus dem Eluat gewonnen.

Gemäss den obigen Herstellungsbeispielen 1 - 3 gewon-45 nene Peptidkomplexe sind herkunftsspezifisch. Je nachdem, aus welchem Organismus sie gewonnen wurden, unterscheiden sie sich in der Aminosäurezusammensetzung. In der nachfolgenden Tabelle sind die ungefähren Aminosäureanalysen einiger erfindungsgemässer Peptidkomplexe verschie-50 dener Organismen zusammengefasst:

Aminosäureanalysen verschiedener Peptide (in umol)

Tabelle I

Mycobact. tbc.

B. pertussis

E. coli

S. typhi

Str. pyog.

Humane Lymphozyten

Asparaginsäure

0,035

0,067

0,038

0,0049

0,042

0,025

Threonin

0,013

0,025

0,019

0,0026

0,024

0,010

Serin o,017

0,031

0,043

0,0090

0,020

0,017

Glutaminsäure

0,035

0,074

0,092

0,0114

0,076

0,025

Prolin

0,018

0,024

-

0,017

Glycin

0,032

0,082

0,049

0,0540

0,025

0,020

Alanin

0,030

0,074

0,036

0,0043

0,035

0,015

Valin

0,011

0,040

0,023

-

0,024

0,015

Isoleucin

-

0,021

-

0,019

-

Leucin

0,016

0,029

0,018

-

0,026

0,025

Phenylalanin

-

0,010

Lysin

-

0,026

0,016

-

0,024

0,010

Arginin

-

0,014

-

0,015

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Daraus würde sich etwa folgende Aminosäurenverteilung in den Peptidkomplexen ergeben:

Tabelle 2

Wahrscheinliche Aminosäurenzusammensetzung der Peptide

Mycobact. B. per- E. coli S. typhi Str. Humane tbc. tussis pyog. Lympho zyten

Asparagin

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1 bzw.

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Threonin

1

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Serin

1

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2 bzw.

3

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Glutamin

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Prolin

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Glycin

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Alanin

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Isoleucin

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Lysin

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Arginin

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Die aus den verschiedenen Organismen auf dem in den obigen Herstellungsbeispielen beschriebenen Weg isolierten Peptidkomplexe können z.B. zur Erzeugung von spezifischen Antikörpern, zum Nachweis von spezifischen Antikörpern, zum Nachweis einer spezifischen verzögerten Immunitätslage und zur Resistenzsteigerung gegen Infektionserkrankungen sowie zur Übertragung einer spezifischen verzögerten Immunität (Transferfaktor-Eigenschaft) verwendet werden. Dazu die folgenden Anwendungsneispiele:

Anwendungsbeispiel A:

Zur Erzeugung von spezifischen Antikörpern werden die aus verschiedenen Organismen isolierten - ■> ie oben beschrieben - Peptidkomplexe an Kaninchen verabreicht. Hierbei werden 10 - 100 ,ug Peptidkomplex n 0,1 %-iger NaCl gelöst und im Verhältnis 1:1 mit Freund'schem Adju-vans emulgiert. Die Dosis wird zu vier gleichen Teilen in die Pfoten der Tiere injiziert. Nach vierzehn Tagen werden lOug Peptidkomplex intravenös zur Boosterung verabreicht. Das Serum der Tiere wird auf Antikörperbildung im Ouchterlo-nytest überprüft. Die Boosterung wird in achttägigen Abständen wiederholt, bis gut sichtbare Ouchterlonyreak-tionen zu beobachten sind. Hierzu genügen meist ein bis drei Boosterinjektioner Im Ouchterlonytest werden die gebildeten Antikörper auf Spezifität überprüft. Die Überprüfung ergibt, dass die aus verschiedener Organismen isolierten Peptidkomplexe spezifische Antikörper hervorrufen. Auffällig ist z.B. bei Peptidkomplexen aus Bakterien, dass keine Typenoder Gruppenspezifität besteht.

Beispiel B:

liitzeabgetöteten, lyophilisierten Tuberke'bakterien (Mycobacterium tuberculosis, typus humanus oder bovinus) wird gemäss dem Verfahren nach Beispiel 1-3 der erfindungsgemässe Peptidkomplex gewonnen. Er ist sehr gut löslich in Wasser und in mit Blutsrum isoosmotischen Salzlösungen. Er ist unlöslich in organischen Lösungsmitteln wie Alkohol, Äther, Ch;oroform und ist praktisch frei von Nukleinsäuren, Polysacchariden und Lipiden. Aus der Aminosäurezusammensetzung gemäss Tabelle 1 errechnet sich ein Molekulargewicht von etwa 1.200. Bei Messung in Mas-

senspektrographen ergibt sich ein Molekularpiek bei 1.152. Weitere Eigenschaften:

- Der Peptidkomplex lässt sich durch eine UM2-Mem-bran der Firma Amicon filtrieren.

- Der Peptidkomplex enthält Calcium in einer Menge von ungefähr 1 Mol/Mol Peptid. Das Calcium ist relativ fest gebunden und liegt wahrscheinlich in Komplexbindung vor.

- Der Peptidkomplex wandert bei der Dünnschichtchromatographie mit Chloroform, Methanol, Ammoniak 2:2:1 als Laufmittel einheitlich.

- Der Komplex wird auch durch mehrstündiges Erhitzen auf 100°C in wässrigen Lösungen bei neutralen pH-Werten nicht in seiner Antigenität beeinflusst.

- Der Komplex wird durch Erhitzen auf 100°C in 1 n Essigsäure für 2 Stunden nicht wesentlich in seiner Antigenität beeinflusst.

- Der Komplex wird teilweise durch Zugabe von Ter-bium-III-Chlorid-Lösungen in hohen Verdünnungen gefällt. Er wird hierbei schwerer löslich in wässrigen Lösungen.

Der Peptidkomplex wird bei Meerschweinchen gegen gereinigtes Tuberkulin standardisiert. Ein ng entspricht etwa einer Tuberkulineinheit (gereinigtes Tuberkulin der Farbwerke Hoechst AG). Zur Intracutantestung wird der Peptidkomplex in 0,9 % NaCl-Lösung gelöst. Erhitzen auf 100°C hat keinen Einfluss auf die Wirksamkeit. Der gelöste Peptidkomplex ist mehrere Monate lang ohne Wirkungsverluste stabil. Die Testung erfolgt mit in Zehnerpotenzen abgestuften Konzentrationen. Es werden jeweils 0,1 ml streng intracutan injiziert. Die Ablesung erfolgt nach 24, 48 und 72 Stunden durch Ausmessen des Infiltrats.

Bei der Testung mit 1 ng und 10 ng kann die Möglichkeit des Bestehens einer aktiven Tuberkulose (extrapulmonale und pulmonale Formen) des Kindes mit grosser Sicherheit innerhalb von 48 Stunden erkannt werden. Mit 0,1 ng und 1 ng ist die Möglichkeit des Bestehens einer extrapulmonalen Tuberkulose bei Kindern und Erwachsenen innerhalb von 48 Stunden mit grosser Sicherheit erkennbar. BCG-geimpfte Kinder bleiben bei Testung mit 1 ng zu einem grossen Prozentsatz negativ. Es ergibt sich ein hoher Trenneffekt zwischen BCG-geimpften und tatsächlich an Tuberkulose erkrankten Personen. Bereits kleine Infiltrate sind als spezifisch anzusehen. Dies konnte bei einem Infiltrat von 3 mm Durchmesser, das mit 0,1 ng ausgelöst wurde, histologisch nachgewiesen werden. Nicht infizierte Personen entwickeln keine Reaktion. Unspezifische Reaktionen wurden nicht beobachtet.

Erwachsene mit tertiärer Lungentuberkulose zeigen in fortgeschrittenen Stadien schwächere Reaktionen gegenüber Patienten in weniger fortgeschrittenen Stadien. Patienten mit einer tuberkulösen Pleuritis entwickeln schwächere Reaktionen als Patienten mit Lungentuberkulose ohne Pleuritis. Die mit dem Peptidkomplex ausgelösten Reaktionen sind in der Konzentrationsabhängigkeit und der Reaktionsstärke nicht identisch mit den durch gereinigtes Tuberkulin hervorgerufenen Reaktionen.

Vorteile der Testung mit dem Peptidkomplex:

1. Schnellerer Verlauf der verzögerten Immunreaktion: die Ablesung ist hierdurch nach 24. Std. optimal.

2. Eine Testung mit 1 ng Peptid erlaubt in mindestens 75 % der Fälle, das Bestehen einer aktiven Tuberkulose bei Kindern innerhalb von 24 Std. zu erkennen.

3. 2Testungen mit 1 ngund 10 ng Peptid erlauben mit einem hohen Grad an Sicherheit, die Möglichkeit einer Tuberkulose-Infektion beim Kind unabhängig von der Tuberkuloseform zu erkennen.

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4. Die hohe Empfindlichkeit von Patienten mit extrapulmonalen Tuberkuloseformen gegen das Peptid erlaubt eine rasche und sichere Diagnostik dieser Tuberkuloseformen.

5. Die hohe Trenneigenschaft zwischen BCG-geimpften und erkrankten Personen erspart einen unnötigen diagnostischen Aufwand, insbesondere Röntgenuntersuchungen.

6. Es konnten keine unspezifischen Nebenreaktionen ausser einer flüchtigen leichten Rötung von bis zu 1 Std. Dauer nach der Injektion beobachtet werden.

Aus den angeführten Gründen ist das Peptid dem Tuberkulin auch in seiner gereinigten Form überlegen. Das Peptid erfüllt als singuläres, hochpotentes Antigen alle Ansprüche, die an einen Teststoff für die Erkennung einer Tuberkuloseinfektion zu stellen sind. Man kann es als das lang gesuchte, reine Prinzip der Tuberkuloseteststoffe ansprechen.

Beispiel C

Messung der Stimulierbarkeit von Lymphozyten im Lym-phozytentransformationstest nach Harztman und Mitarbeitern (Transplantation 11 (1971)268-273). Im Lymphozyten-transformationstest bewirkt der gemäss Beispiel 1-3 gewonnene Peptidkomplex eine dosisabhängige Stimulation der Lymphozyten von tuberkulinpositiven, natürlich infizierten Personen in einem Bereich von 1 ug bis 10 pg. Oligopeptid-komplex pro Kultur. Lymphozyten von tuberkulinnegativen Personen werden nicht stimuliert. Eine unspezifische Basisstimulation, wie sie durch gereinigtes Tuberkulin ausgelöst wird (Proc. Nat. Acad. Sei. USA Vol. 71 (1974) 1178 - 82), ist nicht nachweisbar. Im Gegensatz zu den Lymphozyten von natürlich infizierten Personen, waren Lymphozyten von BCG-geimpften Personen nicht messbar stimulierbar. Lymphozyten von Personen mit einer tuberkulösen Pleuritis waren ebenfalls nicht messbar stimulierbar.

Beispiel D

Serumproben von Leprakranken, Tuberkulosekranken oder auf Tuberkulin positiv reagierenden, gesunden Personen, sowie auf Tuberkulin negativ reagierenden Personen wurden im Mikroouchterlonytest auf humorale Antikörper untersucht gegen den aus Mycobacterium Tuberculosis isolierten Peptidkomplex, untersucht. Bei auf Tuberkulin negativ und positiv reagierenden gesunden Personen ergaben sich keine Reaktionen. Bei an Tuberkulose erkrankten Personen kam es nur vereinzelt zu Präzipitationsreaktionen. Diese Seren stammten ausschliesslich von Patienten mit fortgeschrittenen tertiären Lungentuberkulosen. Bei Leprakranken mit einer iepramatösen Verlaufsform ergaben sich auffallend starke Präzipitationsreaktionen, während Leprakranke mit einer tuberkuloiden Verlaufsform nur schwache oder keine Reaktionen aufwiesen.

Gemäss vorstehenden Beispielen B-D sind dennoch exakte in vitro-Messungen der verzögerten Immunität bei Tuberkulose und Lepra möglich. Dies stellt einen grossen Fortschritt dar. Der Peptidkomplex kann zur Resistenzsteigerung gegen eine Infektion mit Mycobacterium tuberculosis eingesetzt werden. Wegen der gemeinsamen Antigendeterminante mit Mycobacterium ieprae kann der erfindungsgemässe Oligo-pmtidkompiex für eine Resistenzste'-gerung gegen eine Infektion mit Mycobacterium leprae vorgesehen werden.

Beispiel E

Pertussis (Keuchhusten) ist, gemessen an Letalität und Komplikationen, bis heute eine der gel uhrlichsten Infektionskrankheiten des Kindesalters. Besonders gefährdet sind Kinder in den ersten sechs bis acht Lebensmonaten. Die Impfung mit ganzen Bordetella-pertussis-Keimen ist gefährlicher als viele andere Impfungen. Man ist gezwungen, mit den resistenzsteigernden Faktoren alle Inhaltsstoffe der Keime zu verabreichen, d.h. Stoffe, die zum Teil toxisch sind und eine Vielzahl von Antigenen enthalten, die keine Beziehung zur Resistenz aufweisen, jedoch keine unerwünschten Reaktionen des Organismus bewirken.

Es wurde nun gefunden, dass man diese Nachteile vermeiden und eine Resistenzsteigerung dadurch erreichen kann, dass man einen aus Bordetella-pertussis-Keimen gewonnenen kleinmolekularen Peptidkomplex gemäss Erfindung zur Impfung verwendet.

Die Isolierung des erfindungsgemässen Peptidkomplexes aus Bordetella-pertussis-Keimen wird vorgenommen, indem man die hitzeabgetöteten Bordetella-pertussis-Keime homogenisiert und die so erhaltene Aufbereitung von ihren Festbestandteilen durch Zentrifugieren, Filtrieren mit geeigneten Filtern oder Sedimentieren weitgehendst trennt. Im Anschluss daran kann die erhaltene flüssige Phase einem Trennverfahren unterworfen werden, wie es in den Beispielen 1-3 erläutert wurde. Aus 30 g lyophilisierten, hitzeabgetöteten Bakterien ergeben sich etwa 30 mg Peptidkomplex-Substanz in lyophilisierter Form.

Die Aminosäurenzusammensetzung des gewonnenen Peptidkomplexes ergibt sich gemäss Tabelle 1. Hieraus errechnet sich ein wahrscheinliches Molekulargewicht von 1.760 (mit 1 Valin ) bzw. 1.880 (mit 2 Valin). Weitere Eigenschaften:

- Das Peptid lässt sich durch eine UM2-Membran der Firma Amicon filtrieren.

- Das Peptid enthält Calcium in einer Menge von ungefähr 1 Mol/Mol Peptid. Das Calcium ist relativ fest gebunden und liegt wahrscheinlich in Komplexbindung vor.

- Das Peptid erweist sich bei der Dünnschichtchromatographie mit dem Laufmittel Chloroform, Methanol, Amo-niak 2:2:1 als einheitliche Substanz.

- Das Peptid ist stabil gegen Erhitzen auf 100°C in wässrigen Lösungen.

- Das Peptid wird durch Zugabe von Terbium-III-Chlorid-Lösungen in hoher Verdünnung gefällt. Es wird hierbei unlöslich in wässrigen Lösungen.

- Das Peptid ist praktisch frei von Nucleinsäuren, Polysacchariden und Lipiden.

- Das Peptid ist sehr gut löslich in Wasser und in mit Blutserum isoosmotischen Salzlösungen. Es ist unlöslich in organischen Lösungsmitteln wie Alkohol, Äther, Chloroform.

Der aus Bordetella-pertussis-Bakerien isolierte Peptidkomplex wurde in 0,9 % NaCl-Lösung gelöst und die jeweilige zur Impfung verwendete Konzentration 1:1 mit kompletten Freund'schen Adjuvans versetzt.

Weisse Mäuse von 17 bis 22 Gramm erhalten eine intramuskuläre Injektion des Peptidkomplexes (z.B. 1 /ig/Maus, 0,1 ugpro Maus, 0,01 /igpro Maus). Nach 14Tagen erfolgt eine intracerebrale Challenge-Infektion mit Bordetella-pertussis-Keimen nach den Vorschriften des Europäischen Arzneibuches für die Impfstoffprüfung. Die Absterbekurve zeigt eine dosisabhängige Resistenzsteigerung. Bei 1 ng pro Maus Peptidkomplex aus Bordetella pertussis ist die resistenzsteigernde Wirkung bereits ausgezeichnet. Sie entspricht der Schutzdosis von 0,1 IE des handelsüblichen Pertussisimpf-stoffes, der abgetötete Bakterien enthält, ohne dessen bereits erwähnte Nachteile aufzuweisen.

Die neuartige Impfung gegen eine Bordetella-pertussis-Infektion stellt einen grossen Fortschritt dar. Die Gefährdungen des bisherigen Impfstoffes werden vermieden. Die Impfung kann in das frühe Säuglingsalter vorgeschoben werden und damit in die Zeit der höchsten Gefährdung. Der neue Impfstoff ist ausserordentlich stabil gegen Temperatureinflüsse und ist über lange Zeit (Monate und Jahre) haltbar.

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Er stellt ein resistenzsteigerndes Prinzip ohne schädliche Begleitsubstanzen dar. Der neue Impfstoff entspricht somit allen Kriterien eines idealen Impfstoffes gegen eine bakterielle Infektion.

Mit der Methodik der Beispiele 1 - 3 können aus vielen anderen Bakterien und anderen DNS-haltigen Organismen Peptidkomplexe isoliert werden, die sich als hochpotente, für den jeweiligen Organismus spezifische Antigene erweisen. Die Peptide sind jeweils durch eine charakteristische Amino-sjurezusammensetzung gekennzeichnet. Es ist dabei offensichtlich, dass die bei Pertussis und Tuberkulosis (vergi. Beispiele B - E) beobachtete Resistenzsteigerung nur ein Beispiel für die spezifisch resistenzsteigernde Eigenschaft der spezifischen Peptide dieser Gruppe ist.

Beispiel F

Der spezifische aus Streptokokken isolierte Peptidkomplex wird in 0,9 %-iger NaCl gelöst. Bei intracutaner Injektion von 10 bis 100 ng Peptidkomplex treten bevorzugt bei Patienten mit rheumatischem Fieber und einer akuten, diffusen Glomerulonephritis verzögerte Hautreaktionen auf, die sich im Auftreten und in ihrer Stärke von Reaktionen gesunder Kontrollpersonen unterscheiden.

Beispiel G

Mit dem spezifischen aus Streptokokken (Streptococcus pyogenus) isolierten Peptidkomplex treten im Ouchterlony-test positive Reaktionen mit dem Serum von Patienten mit einem rheumatischen Fieber und einer akuten diffusen Glomerulonephritis auf. Quantitativ kann der Antikörperspiegel z.B. mit dem Laser-Nephelometer der Firma Behring-werke AG, Marburg, bestimmt werden. Hierzu werden zu 200 ul Serum unterschiedliche Mengen Peptidkomplex (z.B. 10 ng, lOOng, 1 /ig) gegeben.

Beispiel H

Der spezifische aus Escherichia coli isolierte Peptidkomplex wird in 0,9'Viger NaCl gelöst. Im Ouchterlonytest werden positive Reaktionen im Serum von Patienten, die an einer Colitis ulcerosa erkrankt sind, beobachtet. Bei gesunden Personen (z.B. Blutspenderseren) werden nur vereinzelt schwache Reaktionen beobachtet. Quantitativ kann der Antikörperspiegel z.B. mit dem Laser-Nephelometer der Firma Behring bestimmt werden. Hierzu werden zu 200 /il Serum unterschiedliche Mengen Peptidkomplex (z.B. 10 ng, 100 ng, 1 tig) gegeben.

Beispiel I

Der spezifische aus Salmonella-typhi-Bakerien isolierte Peptidkomplex wird in 0,9%-iger NaCl gelöst. Im Ouchterlonytest werden positive Reaktionen im Serum von Patienten beobachtet, die an Typhus erkrankt waren oder bereits zwei bis drei Wochen an Typhus erkrankt sind. Quantitativ kann der Antikörperspiegel z.B. mit dem Laser-Nephelometer bestimmt werden. Hierzu werden zu 200 /xl Serum unterschiedliche Mengen Peptidkomplex (z.B. lOng, lOng, 1 /ig) gegeben.

Beispiel K

Der spezifische aus Candida-albicans-Pilzen isolierte Peptidkomplex wird in 0,9%-iger NaCl gelöst. Im Ouchterlonytest werden positive Reaktionen im Serum von Patienten beobachtet, die an einer Candida-albicans-Infektion erkrankt sind oder waren. Quantitativ kann der Antikörperspiegel z.B. mit dem Laser-Nephelometer bestimmt werden. Hierzu werden zu 200 /il Serum unterschiedliche Mengen Peptidkomplex (z.B. 10 ng, lOOng, 1 /ig) gegeben.

Beispiel L

Aus Synovia, die durch Operation aus dem entzündeten Gelenk von Patienten, die an einer rheumatoiden Arthritis erkrankt sind, gewonnen wird, wird ein Peptidkomplex auf den in den Beispielen 1 - 3 genannten Weg gewonnen. Der Peptidkomplex wird in 0,9%-iger NaCl gelöst. Im Ouchterlonytest werden im Serum von an rheumatoider Arthritis erkrankten Personen positive Reaktionen beobachtet. Quantitativ kann der Antikörperspiegel z.B. mit dem Laser-Nephelometer bestimmt werden. Hierzu werden zu 200 ul Serum unterschiedliche Mengen Peptid (z.B. 10 ng, 100 ng, 1 /ig) gegeben.

Beispiel M

Aus Blastenzellen von Patienten, die an einer akuten lymphatischen Leukämie erkrankt sind, wird ein Peptidkomplex auf dem in den Beispielen 1 - 3 genannten Weg gewonnen. Zur Kontrolle wird aus normalen Lymphocyten ebenfalls ein Peptidkomplex gewonnen. Die beiden Peptidkomplexe werden in 0,9° ó-iger NaCl gelöst. 10 ng bis 1 /ig der beiden Peptidkomplexe werden in 0,1 ml Lösung streng intracutan injiziert. Die Verabreichung erfolgt an der Innenseite der Vorderarme, wobei der Peptidkomplex aus Blastenzellen jeweils auf den rechten Arm und der Peptidkomplex aus normalen Lymphocyten jeweils auf den linken Arm appliziert wird. Als positive Reaktion wird das Auftreten einer typischen verzögerten Reaktion bezeichnet. Während mit dem aus normalen Lymphocyten gewonnenen Peptidkomplex keine positiven Reaktionen beobachtet werden können, verursacht der aus Blasten isolierte Komplex bei einem Teil der Probanden verzögerte Reaktionen. Die verzögerten Reaktionen lassen eine charakteristische Verteilung erkennen. Sie treten in grosser Häufigkeit bei Personen auf, die in Kontakt zu an akuter lymphatischer Leukämie erkrankter Patienten stehen.

Beispiel N

Gewinnt man den erfindungsgemässen Peptidkomplex gemäss den Beispielen I - 3 aus Lymphozyten eines menschlichen Organismus, der gegen ein bestimmtes Antigen, z.B. Tuberkulin, eine verzögerte Immunität aufweist, und injiziert diesen Peptidkomplex einem anderen Menschen, der keine verzögerte Immunität gegen das genannte Antigen aufweist, so löst der vorgenannte Peptidkomplex eine verzögerte Immunität bei dem bisher nicht immunen Menschen aus, die gegen das genannte Antigen gerichtet ist. Der Peptidkomplex aus Lymphozyten besitzt somit Transferfaktor-Eigenschaften für die verzögerte Immunität.

Beispiel O

Die spezifischen Peptidkomplexe werden nach der Methode von Hunter (Fundstelle: Hunter, W.M. Radioim-munoassay in: Handbook of Expérimental Immunology, Vol. 1: Immunochemistry, Chapter 17. See. Edition. Blackwell Scientific Publications, Oxford-London-Edinbourgh-Melbourne, 1973) mit125 J gekoppelt. Mit den radioaktiv markierten Peptidkomplexen werden jeweils für den eingesetzten Peptidkomplex spezifische Radioimmunoassays durchgeführt.

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Claims

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1) Verursachung von Resistenzsteigerung.

1. Verfahren zur Herstellung von Peptidkomplexen aus desoxyribonucleinsäurehaltigen Organismen, wobei a) die Organismen und/oder deren Teile in nativem oder denaturiertem Zustand in 0,2 m Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,2 homogenisiert werden,

b) das Homogenisat zentrifugiert wird,

c) der Überstand mit Phosphatpuffer beladener 2-Diäthyl-aminoäthyl-Cellulose verrührt und in eine Säule gefüllt wird,

d) die beladene 2-Diäthylaminoäthyl-Cellulose solange mit 0,2 molarem Phosphatpuffer eluiert wird, bis die Extinktion des Eluats bei 280 nm unter 0,1 liegt, anschliessend mit 0,1 m Essigsäure-Acetatlösung bei einem pH-Wert von 3,2 weiter eluiert wird, bis die Extinktion des Eluats bei 280 nm wieder unter 0,1 liegt, dann mit einer 3 Gew.-% NaCl-hal-tigen 0,1 m Essigsäure-Acetatlösung, bei einem pH-Wert von 3,2 eluiert und die mit der NaCl-Front im Eluat erscheinende Ribonucleoproteidfraktion gesammelt, gegen Wasser dialy-siert, eingeengt und lyophilisiert wird,

dadurch gekennzeichnet, dass man

I) das lyophilisierte in Wasser gelöste Ribonucleoproteid mit Phenol versetzt, auf 95-100°C erhitzt, nach dem Abkühlen bis zur Phasentrennung zentrifugiert, die Phenolphase mit Wasser versetzt, dann mit Äther wiederholt ausschüttelt und den wässrigen Rückstand lyophilisiert und den Peptidkomplex isoliert, oder

II) das lyophilisierte, in Wasser gelöste Ribonucleoproteid einer Hochspannungselektrophorese unterwirft und den Peptidkomplex isoliert, oder

III) aus dem lyophilisierten, in Wasser gelösten Ribonucleoproteid dünnschichtchromatographisch den Peptidkomplex isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Peptidkomplex aus Organismen oder Species Mycobacterium tuberculosis oder leprae, oder aus Bordetella pertussis, Escherichia coli, Salmonella typhi, Streptococcus pyo-genus oder Candida albicans gewonnen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Peptidkomplex aus Blastenzellen akut lymphatisch erkrankter menschlicher Patienten, aus Synovia des entzündeten Gelenkes oder aus Lymphozyten gewonnen wird.

4. Peptidkomplexe, hergestellt gemäss dem Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch:

a) ein Molekulargewicht kleiner als 5000

b) die Fähigkeit zur Bildung einer Ribonucleinsäurever-bindung mit einem mittleren Molekulargewicht von 9000 bis 20 000, die bei der Gelelektrophorese und der Acetatfolien-

e lektrophorese eine singuläre, einheitliche Bande ergibt,

c) intrazelluläres Vorkommen,

d) einen Calcium-Gehalt,

e) eine Fällungsreaktion mit Terbium-III-Ionen,

0 sehr gute Wasserlöslichkeit,

g) einen mittleren Gehalt an Asparagin- und Glutaminsäure von etwa 30 Mol%, bezogen auf den Gesamtaminosäuregehalt,

i) eine herkunftsspezifische Aminosäurezusammensetzung k) antigene Wirkung und

5. Peptidkomplexe nach Anspruch 4, hergestellt gemäss dem Verfahren nach einem der Ansprüche 2 und 3.

6. Arzneimittel, enthaltend einen Peptidkomplex nach Anspruch 4, in einem pharmazeutischen Träger, in Verbindung mit pharmazeutischen Additiven.

7. Arzneimittel nach Anspruch 6, enthaltend einen Peptidkomplex gemäss Anspruch 5.