DE3689246T2

DE3689246T2 - Physiologisch aktives Polypeptid BUF-3.

Info

Publication number: DE3689246T2
Application number: DE3689246T
Authority: DE
Inventors: Yuzuru Eto; Hiroshiro Shibai; Satoshi Takano; Misako Takezawa; Tomoko Tsuji; Yasunori Yokogawa
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1985-07-03
Filing date: 1986-07-02
Publication date: 1994-05-26
Anticipated expiration: 2006-07-03
Also published as: EP0210461A2; DE3689246D1; EP0210461B1; JPH0637520B2; EP0210461A3; US5847078A; JPS62240700A

Description

Die Erfindung betrifft ein physiologisch aktives Polypeptid. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Polypeptid, das befähigt ist, die Differenzierung und Reifung von malignen Zellen in normale Zellen zu bewirken, oder das befähigt ist, die Bildung von Erythroblasten zu beschleunigen. Das erfindungsgemäße Polypeptid BUF-3 ist befähigt, die Differenzierung und Reifung von menschlichen Leukämiezellen in normale Zellen zu bewirken (benigne Veränderung) und die Bildung von Erythroblasten zu beschleunigen. Im Gegensatz zu Substanzen tierischen oder mikrobiellen Ursprungs ist es bei diesem von menschlichen Zellen gebildeten Polypeptid möglich, es als Arzneimittel zur Behandlung von menschlicher Leukämie und Anämie einzusetzen.
Derzeit wird auf der ganzen Welt intensiv nach die Differenzierung induzierenden Substanzen (Substanzen, die befähigt sind, maligne Zellen in normale Zellen überzuführen) gesucht, um verschiedene Krebsarten zu lindern. Es ist bekannt, daß Mäuse-Friend-Leukämiezellen und humane mononukleare Leukämiezellen bei Behandlung mit einigen Chemikalien oder physiologischen Faktoren einer Differenzierung oder Reifung zu Makrophagen, granulozytenähnlichen Zellen oder erythrozytenähnlichen Zellen unterliegen und dabei die besonderen Eigenschaften von malignen Zellen, wie Proliferations- und Transplantationsvermögen, verlieren.
Als Chemikalien der vorstehend genannten Art sind polare Verbindungen, wie DMSO, Lipopolysaccharide, immunverstärkende Substanzen, Antibiotika, wie Bleomycin und Actinomycin D, Vitamine, Phorbolester, wie TPA (12-O-Tetradecanoylphorbol-13- acetat), Alginase, Proteine, wie Histon, und andere Verbindungen, bekannt. Ein typisches Beispiel für die physiologischen Faktoren ist der D-Faktor, bei dem es sich um ein Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von 40000 bis 50000 handelt und der durch fötale Mäusezellen (M1-Zellen) gebildet wird; vergl. Cancer & Chemotherapy, Bd. 9 (1982), S. 105-114. Es ist ferner bekannt, daß die Stimulation von humanen mononuklearen Leukozyten mit einem Mitogen, wie Concanavalin A, zur Bildung von CSF (LeukozytenInduktionsfaktor) und von D-Faktor (Molekulargewicht 25000 bzw. 40000) führt und daß der auf diese Weise gebildete D-Faktor zur Differenzierung von humanen, promyelozytischen Leukämiezellen (HL-60) zu makrophagenähnlichen Zellen befähigt ist. In entsprechender Weise wurde berichtet, daß die Stimulation von humanen, mononuklearen Leukozyten mit einem Mitogen, wie einem Lipopolysaccharid, einen Faktor ergibt, der zur Differenzierung von humanen, myeloiden Leukämiezellen und humanen, mononuklearen Leukämiezellen befähigt ist (vergl. Proceedings of 43th General Meeting of the Japanese Cancer Assodiation; Nr. 639 (1984), S. 190 und JP-B-28934 (1985)). Jedoch wurde bisher nicht über einen die Differenzierung induzierenden Faktor berichtet, der zur Differenzierung der bekannten Friend-Leukämiezellen befähigt ist.
Zur Linderung von Anämien werden je nach deren Ursache zahlreiche Arten von Arzneimitteln verwendet. Eisenpräparate werden im allgemeinen für Eisenmangelanämien, Vitamin B&sub1;&sub2; und Folsäure für maligne Anämien und Nebennierenrindensteroide, wie Cortikoide, für hämolytische Anämien verwendet. Von Steroidhormonen ist bekannt, daß sie eine starke stimulierende Wirkung auf die Erythropoiese ausüben und als wirksame Arzneistoffe angesehen werden. Sie weisen jedoch starke Nebenwirkungen auf. Es ist allgemein bekannt, daß ihre Verabreichung über lange Zeiträume hinweg häufig Schwierigkeiten verursacht.
In letzter Zeit hat Erythropoietin starke Aufmerksamkeit als eine Substanz gewonnen, die in engem Zusammenhang mit der Bildung von Erythrozyten steht und eine Linderung von Anämie bewirkt. Das in der Leber gebildete Erythropoietin ist ein Glycoprotein, das in der α-Globulinfraktion vorkommt und ein Molekulargewicht von 45000 hat. Es wird als humoraler Regulationsfaktor definiert, der auf die hämatopoietischen Stammzellen insofern wirkt, als er deren Differenzierung zu Erythroidzellen und die Bildung von Erythroblasten beschleunigt. Es wird erwartet, daß diese Substanz einen neuen Arzneistoff zur Behandlung von Anämie darstellt. Jedoch ist es schwierig, diese Substanz in ausreichenden Mengen bereitzustellen, da sie derzeit aus menschlichem Urin, in dem es nur in sehr geringen Mengen enthalten ist, extrahiert wird. Untersuchungen zur Herstellung dieser Substanz durch Gentechnik wurden durchgeführt, blieben jedoch bisher erfolglos, was auf die Schwierigkeiten zurückzuführen ist, die dadurch entstehen, daß es sich um ein Glycoprotein handelt.
Somit ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, unter Verwendung verschiedener Typen von humanen Zellen einen neuen Faktor zur Differenzierung von malignen Zellen sowie einen neuen Faktor, der bei der Behandlung von Anämie wirksam ist, aufzufinden und dessen chemische Natur zu ermitteln.
Um die vorstehend erwähnte Aufgabe zu lösen, haben wir verschiedene Typen von humanen Zellen bezüglich ihrer Fähigkeit zur Bildung von differenzierenden Faktoren untersucht. Dabei haben wir festgestellt, daß eine Kultur von humanen Leukämiezellen in Gegenwart einer spezifischen, die Differenzierung induzierenden Substanz einen neuen humanen, die Differenzierung induzierenden Faktor, BUF-3, ergibt, der zur Differenzierung und Reifung von Leukämiezellen zu normalen Zellen befähigt ist. Es gelang uns, BUF-3 aus der Kulturlösung zu isolieren, es zu reinigen und dessen chemische Natur zu charakterisieren. Ferner wurde gezeigt, daß das auf diese Weise erhaltene BUF-3 eine Linderung von Anämie bewirkt. Auf der Basis dieser Befunde wurde die Erfindung fertiggestellt.
Somit betrifft die Erfindung ein neues Polypeptid, BUF-3, das befähigt ist, die Differenzierung und Reifung von Mäuse-Leukämiezellen in normale Zellen zu bewirken und das folgende Eigenschaften besitzt:

(a) Molekulargewicht

16±1 Kd (SDS-Elektrophorese in Gegenwart von 1,0% Mercaptoethanol)
25±1 Kd (SDS-Elektrophorese in Abwesenheit von Mercaptoethanol)

(b) Aminosäuresequenz am Amino-Ende

Gly-Leu-Glu-X-Asp-Gly-Lys-Val-Asn-Ile-X-X-Lys-Lys Gln-Phe-Phe-Val-Ser-Phe-Lys-Asp-Ile-Gly-Trp-Asn-Asp- Trp-Ile-Ile-Ala-Pro-Ser-Gly-Tyr (X: nicht identifizierte Aminosäure)

(c) Aminosäuresequenz des durch Bromcyan-Spaltung gebildeten Peptidfragments

Leu-Tyr-Tyr-Asp-Asp-Gly-Gln-Asn-Ile-Ile-Lys-Lys-Asp- Ile-Gln-Asn

(d) pH-Stabilität

Stabil im pH-Bereich von 2,0 bis 10,0 (7 h bei 4ºC)

(e) Wärmebeständigkeit

Beständig gegenüber 60-minütigem Erwärmen auf 65ºC (bei pH 7,4)

(f) Beständigkeit gegen organische Lösungsmittel

Beständig gegen niedere Alkohole und Acetonitril (bei 25ºC)

(g) Protease-Beständigkeit

Wird durch Behandlung mit Pronase vollständig desaktiviert.
Das Polypeptid BUF-3 ist erhältlich, indem man menschliche Leukämiezellen in Gegenwart von mindestens einer die Differenzierung induzierenden Substanz züchtet und das angereicherte Polypeptid aus dem Kulturmedium isoliert.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 zeigt das Elutionsmuster des erfindungsgemäßen menschlichen, die Differenzierung induzierenden Faktors BUF-3 bei der hydrophoben Chromatographie an Butyl-Toyopearl.
Fig. 2 zeigt das Elutionsmuster des erfindungsgemäßen humanen, die Differenzierung induzierenden Faktors BUF-3 bei der Gelfiltration.
Fig. 3 zeigt das Elutionsmuster des erfindungsgemäßen menschlichen, die Differenzierung induzierenden Faktors BUF-3 bei der Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie.
Unter menschlichen Leukämiezellen sind hier gebildete, von menschlicher Leukämie oder Myeloidzellen abgeleitete Stämme, die einer künstlichen malignen Veränderung unterworfen worden sind, zu verstehen. Insbesondere gehören dazu menschliche Gewebs-Lymphomzellen (U-937 ATCC CRL 1593; Int. J. Cancer, Bd. 17 (1976), S. 565; menschliche chronische Myeloid-Leukämiezellen (K 562 ATCC CCL 243; Blood, Bd. 45 (1975), S. 321); menschliche mononukleare Leukämiezellen (J-111; Blood, Bd. 10 (1955), S. 1010); und menschliche akute mononukleare Leukämiezellen (THP-1 ATCC TIB 202; Int. J. Cancer, Bd. 26 (1980), S. 171-176). Bei diesen spezifischen, die Differenzierung induzierenden Substanzen handelt es sich um Substanzen, die bei Kontakt mit menschlichen Leukämiezellen BUF-3 ergeben. Spezielle Beispiele sind Actinomycin D, Mitomycin C, Concanavalin A und Phorbolester (TPA und dergl.).
Das erfindungsgemäße BUF-3 kann durch Züchtung von menschlichen Leukämiezellen in Gegenwart von mindestens einer der vorstehend erwähnten spezifischen, die Differenzierung induzierenden Substanzen gebildet werden. BUF-3 wird in der Kulturlösung angereichert (extrazelluläre Bildung).
Bei der Züchtung von tierischen Zellen üblicherweise verwendete Medien können beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Züchtung von menschlichen Leukämiezellen verwendet werden. Ein bevorzugtes Beispiel ist das Roswell Park Memorial Institute 1640-Medium (nachstehend kurz RPMI-1640-Medium), jedoch können auch Dulbecco-modifiziertes Eagle-Minimal-Essentialmedium und Click- Medium mit Erfolg verwendet werden. Fötales Rinderserum (nachstehend als FBS abgekürzt), Serum von neugeborenen Kälbern oder Pferdeserum wird üblicherweise diesen Medien zugesetzt; im vorliegenden speziellen Fall besteht jedoch keine Notwendigkeit für derartige Additive.
Menschliche Leukämiezellen werden bei 35-38ºC unter einem Strom von 4-6% Kohlendioxidgas nach dem statischen Verfahren oder unter mäßigem Rühren im allgemeinen bei einer Zelldichte von 1- 5 · 10&sup6; Zellen/ml gezüchtet. Die spezifische, die Differenzierung induzierende Substanz kann dem Medium entweder zu Beginn oder während des Züchtungsverlaufs zugesetzt werden. Die geeignete zuzusetzende Menge variiert je nach der Art des Additivs: 0,1 bis 10 ug/ml für Actinomycin D und Mitomycin C und 1 bis 500 ng/ml für TPA. BUF-3 reichert sich auf diese Weise innerhalb von 1 bis 5 Tagen in der Kulturlösung an.
Die Aktivität von BUF-3 kann gemäß der bekannten Technik gemessen werden (Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 71 (1975), S. 98), indem man Leukämiezellen F5-5 verwendet, die durch den Mäuse- Friend-Leukämievirus induziert worden sind (Bibl. Haemat., Bd. 43 (1976), S. 37). Die Aktivität pro ml einer Probenlösung wird durch den reziproken Wert der Verdünnungsrate dieser Probenlösung, bei der eine Differenzierung von F5-5-Zellen klar festgestellt wird, angegeben. Wird BUF-3 gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren gebildet, so zeigen die erhaltenen Kulturlösungen im allgemeinen eine Aktivität von 4 bis 1000 Einheiten/ml.
BUF-3 kann nach Verfahren gereinigt werden, die für Proteine üblich sind. Beispielsweise wird die Kulturlösung zuerst durch Ultrafiltration eingeengt, und die Proteine werden aus dem Konzentrat durch Aussalzen isoliert, wonach sich eine Reinigung durch Dialyse und Ionenaustauschchromatographie an einem Anionenaustauscher anschließt. Das auf diese Weise erhaltene Rohprotein-Präparat wird sodann von fast sämtlichen enthaltenen Verunreinigungen entweder durch hydrophobe Chromatographie oder durch Chromatofokussierung befreit. Ein höherer Reinigungsgrad kann durch Kombination dieser beiden Methoden erreicht werden. Das auf diese Weise hergestellte Produkt kann durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie, durch Hochleistungsgelfiltration unter Verwendung eines FPLC-Systems (Fast Protein Peptide Polynucleotide Liquid Chromatography der Firma Pharmacia Fine Chemicals), die mit einer Superlose- oder Mono- QHR 5/5-Säule ausgerüstet ist, oder durch Ionenaustauschchromatographie weiter gereinigt werden.
Das auf diese Weise gereinigte BUF-3 weist folgende Eigenschaften auf:

(1) Molekulargewicht

(2) Isoelektrischer Punkt

pI 6,3±0,2 (Chromatofokussierung)
pI 7,3 (Elektrofokussierung)

(3) pH-Stabilität

Stabil im Bereich von 2,0 bis 10,0

(4) Wärmebeständigkeit

Beständig gegenüber 60-minütiges Erwärmen auf 65ºC

(5) Beständigkeit gegen organische Lösungsmittel

Beständig gegen niedere Alkohole und Acetonitril

(6) Protease-Beständigkeit

Wird durch Behandlung mit Pronase vollständig desaktiviert.

(7) Spezifische Aktivität

2 · 10&sup6; U/mg Protein

(8) Aminosäuresequenz am Amino-Ende

Gly-Leu-Glu-X-Asp-Gly-Lys-Val-Asn-Ile-X-X-Lys-Lys- Gln-Phe-Phe-Val-Ser-Phe-Lys-Asp-Ile-Gly-Trp-Asn-Asp- Trp-Ile-Ile-Ala-Pro-Ser-Gly-Tyr (X: nicht identifizierte Aminosäure)

(9) Aminosäuresequenz des durch Bromcyan-Spaltung gebildeten Peptidfragments

Leu-Tyr-Tyr-Asp-Asp-Gly-Gln-Asn-Ile-Ile-Lys-Lys-Asp Ile-Gln-Asn
Das erfindungsgemäße BUF-3 bewirkt eine Differenzierung und Reifung von Mäuse-Friend-Leukämiezellen in normale Zellen und eine Beschleunigung der Bildung von Erythroblasten.
Eine Anämie bei Mäusen kann durch Verabreichung von BUF-3 gelindert werden. Werden durch Mäuse-Friend-Virus induzierte Leukämiezellen einer Maus transplantiert, so nimmt deren Hämatokritwert (Volumen-% Erythrozyten, was die Schwere der Anämie besser wiedergibt als die Erythrozytenzahl), allmählich ab, was dazu führt, daß die Maus 1 Woche nach der Transplantation anämisch wird. Wird BUF-3 unmittelbar nach der Transplantation intravenös verabreicht, so wird in diesem Fall ein geringer Abfall des Hämatokritwertes verzeichnet, während sich nach 3 Wochen ein signifikanter Unterschied ergibt. Wird BUF-3 einer an Anämie leidenden Maus eine Woche nach der Transplantation verabreicht, so wird der Abfall des Hämatokritwerts unterdrückt, und der Wert steigt 2 oder 3 Tage später allmählich wieder an, was klar die therapeutische Wirkung von BUF-3 gegen Anämie belegt. Das erfindungsgemäße Arzneimittel zur Behandlung von Anämie dient zur Prophylaxe und Therapie von menschlicher Anämie, die durch eine verringerte Erythrozytenproduktivität verursacht wird, wobei keine Toxizität gegen menschliche Zellen besteht. Es wird vorwiegend parenteral (intramuskulär, subkutan oder intravenös) verabreicht. Die geeignete Dosis des Wirkstoffs (BUF-3) kann je nach dem Zustand der Patienten variieren, jedoch sollte im allgemeinen eine Menge im Bereich von 0,05 bis 25 mg, unterteilt in mehrere Portionen an Erwachsene verabreicht werden. Somit liegt die geeignete Tagesdosis im Bereich von 0,1 bis 50 mg. Die optimale Dosis hängt von der Schwere der Anämie, dem Gewicht des Patienten und anderen Faktoren, die vom Fachmann für wichtig angesehen werden, ab.
BUF-3 wird vorwiegend in Form von parenteralen Injektionspräparaten verwendet, kann aber auch in anderen Dosierungsformen, wie Kapseln und Tabletten, eingesetzt werden. Parenterale Injektionen (z. B. subkutane, intramuskuläre und intravenöse Injektionen) können nach bekannten Verfahren hergestellt werden, indem man nach Bedarf ein pH-Regulationsmittel, ein Pufferungsmittel, einen Stabilisator und ein Konservierungsmittel zusetzt. Orale Präparate (z. B. Tabletten und Kapseln) können ebenfalls nach bekannten Verfahren durch Mischen mit einem Bindemittel, einem Sprengmittel und einem farbgebenden Mittel hergestellt werden.

Beispiel 1

Die in Tabelle 1 aufgeführten menschlichen malignen Leukämiezellen wurden jeweils in RPMI-1640-Medium mit einem Gehalt an 5% FBS oder in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Minimal-Essentialmedium mit einem Gehalt an 5% FBS in einer Zellkonzentration von 1 · 10&sup6; Zellen/ml suspendiert. Die erhaltenen Suspensionen wurden in eine flachbodige Mikrotiterplatte mit 24 Vertiefungen (Pharcon) gegeben und bei 37ºC inkubiert. TPA wurde in Konzentrationen von 10 ng/ml und 100 ng/ml zugegeben. Die Kulturlösung wurde 1, 2, 3, 4 und 5 Tage nach Inkubationsbeginn entnommen und zentrifugiert. In den einzelnen Überständen wurde die Differenzierung induzierende Aktivität gegenüber F5-5- Zellen gemessen. In Abwesenheit von TPA gezüchtete Zellen wurden bei diesem Test als Kontrolle herangezogen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Tabelle 1 BUF-3-Produktivität von menschlichen Leukämiezellen Menschl. Leukämiezellen TPA-Konzentration Züchtungsdauer (Tage) Aktivität * ng = Nanogramm
Wie sich aus der Tabelle ergibt, wurde die höchste Aktivität mit K-562- und THP-1-Zellen beobachtet, gefolgt von U-937- und J-111-Zellen, während HL-60-Zellen überhaupt keine Aktivität zeigten. Ein ähnlicher Versuch wurde durchgeführt, um die Wirkung von verschiedenen, die Differenzierung induzierenden Substanzen unter Verwendung von THP-1-Zellen zu untersuchen. Das Ergebnis ist in Tabelle 2 zusammengestellt. Tabelle 2 Wirkung von die Differenzierung induzierenden Substanzen die Differenzierung induzierende Substanzen Konzentration Züchtungsdauer (Tage) Aktivität Actinomycin Mitomycin * LPS aus E.coli

Beispiel 2

Ein 20-Liter fassender "Spinner"-Kolben wurde mit 5,0 Liter keimfreiem RPMI-1640-Medium mit einem Gehalt an 5% fötalem Rinderserum beschickt. Gemäß Beispiel 1 erhaltene THP-1-Zellen wurden in diesem Medium in einer Dichte von 2 · 10&sup5;-Zellen/ml suspendiert und 4 Tage bei 37ºC gezüchtet. Die Kulturlösung wurde zentrifugiert, die gewonnenen THP-1-Zellen wurden in 5,0 Liter frisches RPMI-1640-Medium ohne FBS übertragen und mit 10 ng/ml TPA versetzt. Die Züchtung wurde 2 Stunden bei 37ºC unter mäßigem Rühren (mit 100 U/min) zur Durchführung der Induktion fortgesetzt. Nach Entfernung der Zellen durch Zentrifugation erhielt man eine Kulturlösung mit einer Aktivität von 20 U/ml. Ammoniumsulfat wurde bis zu einer Sättigung von 70% zu 100 Liter dieser Kulturlösung gegeben. Der ausgefallene Niederschlag wurde durch Zentrifugation (10 000 U/min, 10 Minuten) gewonnen und in einer geringen Menge an 0,05 M Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 7,8) gelöst. Die wäßrige Lösung wurde gegen den vorstehend genannten Puffer dialysiert. Das Dialysat wurde auf eine DEAE-Toyopearl 650M-Säule (7 · 70 cm), die mit dem gleichen 0,05 M Tris-HCl-Puffer äquilibriert worden war, aufgesetzt. Anschließend wurde die Säule mit 5,0 Liter des gleichen Puffers gewaschen. Der adsorbierte Anteil wurde mit 0,05 m Tris-HCl-Pufferlösungen mit einem Gehalt an 0 bis 0,2 M Natriumchlorid eluiert. Die aktive Substanz konnte mit 0,1 M Natriumchloridlösung eluiert werden. Diese aktive Fraktion wurde gewonnen, festes Ammoniumsulfat wurde bis zu einer Sättigung von 70% zugesetzt, und der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugation gewonnen und in 20 ml Wasser gelöst. Diese wäßrige Lösung wurde mit 20 ml zu 80% gesättigter Ammoniumsulfatlösung versetzt. Das erhaltene Gemisch wurde auf eine Butyl-Toyopearl 650M Säule (25 · 30 cm), die vorher mit 0,05 M Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 7,7) äquilibriert worden war, aufgesetzt. Eine stufenweise Verringerung der Konzentration an Ammoniumsulfat und eine anschließende Elution mit 30% Ethanol ergab aktive Fraktionen mit der die Differenzierung induzierenden Substanz. Fig. 1 zeigt das Elutionsmuster bei der hydrophoben Chromatographie an Butyl-Toyopearl. Die gewonnenen aktiven Fraktionen wurden zur Entfernung von Ethanol unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde gegen 0,05 m Tris-HCl- Puffer (pH-Wert 7,7) dialysiert. Das Dialysat wurde der Gelfiltration an Superlose (Pharmacia-Gelfiltrationsäule) unterworfen. Das Gelfiltrationselutionsmuster ist in Fig. 2 gezeigt. Wie aus dieser Figur ersichtlich ist, beträgt die Elutionszeit für die F5-5 aktive Substanz 56,0 Minuten, woraus das Molekulargewicht von BUF-3 durch Vergleich mit einem Standardprotein berechnet werden kann, wobei sich ein Wert von 10 ± 0,5 Kd ergibt. Diese Probe wurde gegen 0,05 M Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 8,0) dialysiert und mit dem Pharmacia-FPLC (Fast Protein Peptide Polynucleotide Liquid Chromatography)-System unter Verwendung einer Mono QHR 5/5 Säule (Pharmacia-Anionenaustauscher), die mit dem vorstehend genannten Puffer äquilibriert worden war, weiter gereinigt. Eine Gradientenelution wurde unter Verwendung von Natriumchloridlösungen in Konzentrationen von 0,05 M bis 0,1 M durchgeführt. Die aktive Fraktion wurde bei einer Salzkonzentration von etwa 0,1 M erhalten. Der Reinigungsfaktor dieser Stufe betrug etwa 5, wobei man fast nur ein einziges Protein erhielt. Dieses wurde sodann der Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie unter Verwendung von Hipore RP304 (C-4-Umkehrphasensäule; Bio-Rad Laboratories) unterzogen. 0,1% Trifluoressigsäure wurde als Entwicklerlösung verwendet. Die Elution wurde mit einer n-Propanolkonzentration, die linear von 0 bis 80% anstieg, durchgeführt. Das Elutionsmuster ist in Fig. 3 gezeigt. In dieser Figur stimmte der Proteinpeak genau mit dem Aktivitätspeak überein. 100 ug an reiner Probe wurden aus dieser aktiven Fraktion erhalten. Diese Probe wurde einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Gelkonzentration: 15,0%, in Gegenwart von 1,0% Mercaptoethanol) unterworfen. Es ergab sich eine einzige Proteinbande von 16 Kd (Silber-Färbeverfahren), ohne irgendwelche andere Proteinbanden. Ein Wert von 25 Kd wurde bei Messung in Abwesenheit von Mercaptoethanol erzielt. Die spezifische Aktivität der auf diese Weise erhaltenen reinen Probe betrug etwa 2 · 10&sup6; U/mg.
Diese gereinigte Probe (10 ug) wurde dem Edman-Abbau unter Verwendung eines Gasphasen-Aminosäure-Sequenziergerätes (Modell 470A; Applied Biosystem) unterworfen, wobei die nacheinander freigesetzten Phenylthiohydantoin-Aminosäuren durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC Modell SP8100 der Firma Spectrophysics Co.; Säule: Solvax ODS der Firma Du Pont) analysiert wurden. Dabei wurde folgende Aminosäuresequenz am Amino-Ende von BUF-3 gefunden:
Gly-Leu-Glu-X-Asp-Gly-Lys-Val-Asn-Ile-X-X-Lys-Lys- Gln-Phe-Phe-Val-Ser-Phe-Lys-Asp-Ile-Gly-Trp-Asn-Asp- Trp-Ile-Ile-Ala-Pro-Ser-Gly-Tyr (X in der vorstehenden Formel ist ein Aminosäurerest, der durch den Gasphasen-Aminosäure-Analysator nicht analysiert werden konnte).
Die Probe (100 ug) wurde in 70% Ameisensäure gelöst. Eine kleine Menge an Bromcyan wurde zugesetzt. Die Bromcyan-Spaltung wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach der Reaktion wurde das erhaltene Peptidfragment durch Hochleistungsflüssigchromatographie (Shimadzu HPLC Modell LC-4A; Säule: Beckmann ALTEX ULTRA PORE TM RPSC; Gradientenelution mit einer Veränderung des Elutionsmittels von 0,1% Trifluoressigsäure zu 80% Acetonitril) isoliert. Dessen Aminosäuresequenz wurde durch das vorgenannte Aminosäure-Sequenziergerät bestimmt. Folgendes Ergebnis wurde erzielt:
Leu-Tyr-Tyr-Asp-Asp-Gly-Gln-Asn-Ile-Ile-Lys-Lys-Asp Ile-Gln-Asn
Nachstehend sind der isoelektrische Punkt, die pH-Stabilität und weitere Eigenschaften dieser Probe aufgeführt:

(1) Isoelektrischer Punkt

pI 6,3 ± 0,2 (Chromatofokussierung)
pI 7,3 ± 0,2 (Elektrofokussierung)

(2) pH-Stabilität

Stabil im pH-Bereich zwischen 2,0 und 10,0 (7 Stunden bei 4ºC)

(3) Wärmestabilität

Stabil gegen 60-minütiges Erwärmen auf 65ºC (beim pH-Wert 7,4)

(4) Beständigkeit gegen organische Lösungsmittel

Beständig gegen niedere Alkohole und Acetonitril (bei 25ºC)

(5) Protease-Beständigkeit

Wird durch Behandlung mit Pronase vollständig desaktiviert (eine bestimmt Menge an BUF-3 wurde in 1% NaHCO&sub3;-Lösung gelöst, Pronase wurde in einer Menge von 1/10, bezogen auf BUF-3, zugesetzt, und das Gemisch wurde über Nacht bei 37ºC stehen gelassen).
Die Messung des isoelektrischen Punktes durch Chromatofokussierung erfolgte gemäß dem nachstehend angegebenen Verfahren. Eine gereinigte Probe wurde gegen 25 millimolaren Bis-Tris-HCL- Puffer (pH-Wert 7,0) dialysiert. Das Dialysat wurde auf eine Polybuffer Austauscher-PBE94-Säule (1,0 · 40 cm; Pharmacia Fine Chemicals) aufgesetzt. Der adsorbierte Bereich wurde mit 1 : 10- verdünntem Polybuffer (pH-Wert 5,0) eluiert. Der isoelektrische Punkt wird durch den pH-Wert wiedergegeben, bei dem die aktiven Fraktionen eluiert werden.
Die Messung des isoelektrischen Punktes durch Elektrofokussierung erfolgte unter Verwendung einer Elektrofokussierungsvorrichtung (LKB-Multiphore) und eines Reagenz hierfür (Ampholine), beides Produkte der LKB Inc., Schweden, gemäß dem LKB- Ampholine PAG-Plattenverfahren. Eine Probe wurde auf eine Gelplatte (LKB 1804-101, pH-Wert: 3,5-9,5) aufgesetzt. Die Elektrophorese wurde 2,5 Stunden bei einer angelegten Spannung von 1500 V durchgeführt. Der isoelektrische Punkt wurde unter Verwendung des Kits zur Bestimmung des isoelektrischen Punkts von Pharmacia als Marker (pH-Wert 3-10) gemessen. Es ergab sich ein isoelektrischer Punkt von 7,3. Der gleiche Wert wurde in Gegenwart von β-Mercaptoethanol erzielt.
Die erfindungsgemäß verwendeten THP-1-Zellen wurden von den Autoren von Int. J. Cancer, Bd. 26 (1980), S. 171-176 zur Verfügung gestellt. THP-1-Zellen sind darüber hinaus in Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Bd. 80 (1983), S. 5397-5401 sowie in Cancer Research, Bd. 42 (1982), S. 484-489 beschrieben. Proben wurden diesen Forschungsorganisationen zur Verfügung gestellt. Wir sind bereit, THP-1-Zellen allen autorisierten Forschungsinstituten auf Anfrage zur Verfügung zu stellen.

Beispiel 3

Ein Tierversuch wurde unter Verwendung von ddy-Mäusen (männlich, Alter 5 Wochen; Tokyo Experimental Animal Co., Ltd.) durchgeführt, wobei jede Gruppe aus jeweils 5 Mäusen bestand. Mäuse-Friend-Leukämiezellen F5-5 wurden seriell einer Subkultur in Mäuse-Aszites unterworfen und dann in das Abdomen der einzelnen Testtiere (jeweils 2 · 10&sup6; Zellen) transplantiert. BUF-3 (gefriergetrocknete Probe) wurde in steriler physiologischer Kochsalzlösung gelöst, wodurch man eine parenterale Injektionsflüssigkeit mit 5000 U/ml erhielt. Dieses Präparat wurde abdominal oder intravenös den Migliedern der Testgruppe an drei aufeinanderfolgenden Tagen, beginnend vom Tag nach der Transplantation injiziert (jeweils 0,2 ml = 1000 U). Blutproben wurden 14 Tage und 21 Tage nach der Transplantation der F5-5- Zellen aus der Schwanzvene entnommen. Die Hämatokritwerte wurden auf übliche Weise nach 5-minütiger Zentrifugation bei 12000 U/min gemessen. Der Kontrollgruppe wurde anstelle von BUF-3 physiologische Kochsalzlösung injiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengestellt. Tabelle 3 Hämatokritwerte Vor der Transplantation Nach 14 Tagen Kontrollgruppe Testgruppe: Intravenös Abdominal (*.*) (**.**): Signifikante Differenz bei 95%-Wahrscheinlichkeit.
Getrennt davon wurde einer weiteren Gruppe von Mäusen 14 Tage nach Transplantation von F5-5-Zellen 0,2 ml des parenteralen BUF-3-Präparats intravenös injiziert. Die Hämatokritwerte wurden nach 21 Tagen gemessen. Es ergibt sich ein Wert von 35 ± 8,0, was klar einen Anstieg des Hämatokritwertes bei der Testgruppe zeigt.
Normale Mäuse, die eine intravenöse Injektion von 50 ug (2,5 mg/kg) an BUF-3 erhalten hatten, wurden 2 Monate gehalten, um die Toxizität des Produkts zu prüfen. Sämtliche Mäuse wuchsen normal, wobei keinerlei Abnormalitäten beobachtet wurden.

Erfindungsgemäß erzielte Wirkungen

Das erfindungsgemäße Arzneimittel zur Behandlung von Anämie ist bei der Prophylaxe und Therapie von durch Friend- Leukämie verursachter Anämie wirksam. Es kann daher zur Linderung von Anämie, die auf einen Mangel an Erythrozyten und Hämoglobin aufgrund von malignen Tumoren, wie Leukämie, multiples Myelom und Lymphom, zurückzuführen ist, verwendet werden.

Claims

1. Polypeptid BUF-3, das befähigt ist, die Differenzierung und Reifung von Mäuse-Leukämiezellen in normale Zellen zu bewirken, und das folgende Eigenschaften besitzt:

(a) Molekulargewicht

16±1 Kd (SDS-Elektrophorese in Gegenwart von 1,0% Mercaptoethanol)

25±1 XD (SDS-Elektrophorese in Abwesenheit von Mercaptoethanol)

(b) Aminosäuresequenz am Amino-Ende

(c) Aminosäuresequenz des durch Bromcyan-Spaltung gebildeten Peptidfragments

Leu-Tyr-Tyr-Asp-Asp-Gly-Gln-Asn-lle-Ile-Lys-Lys-Asp- Ile-Gln-Asn

(d) pH-Stabilität

Stabil im pH-Bereich von 2,0 bis 10,0 (7 h bei 4ºC).

(e) Wärmebeständigkeit

Beständig gegenüber 60-minütigem Erwärmen auf 65ºC (bei pH 7,4).

(f) Beständigkeit gegen organische Lösungsmittel

Beständig gegen niedere Alkohole und Acetonitril (bei 25ºC).

(g) protease-Beständigkeit

Wird durch Behandlung mit Pronase vollständig desaktiviert.

2. Polypeptid gemäß Anspruch 1, erhältlich durch Züchten von menschlichen Leukämiezellen in Gegenwart mindestens einer die Differenzierung induzierenden Substanz und Isolieren des angereicherten Polypeptids aus dem Kulturmedium.

3. Polypeptid gemäß Anspruch 2, wobei die Differenzierung induzierende Substanz Actinomycin D, Mitomycin C, Concanavalin A oder ein Phorbolester ist.

4. Pharmazeutische Zubereitung zur Behandlung der Anämie, die Polypeptid BUF-3 gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 enthält.