DE3421789C2

DE3421789C2 -

Info

Publication number: DE3421789C2
Application number: DE3421789A
Authority: DE
Inventors: Vjaceslav Grigor'evic Morozov; Vladimir Chatskelevic Leningrad Su Chavinson
Original assignee: Leningradskij Gosudarstvennyj Pedagogiceskij Institut Imeni Ai Gercena Leningrad Su
Current assignee: Leningradskij Gosudarstvennyj Pedagogiceskij Institut Imeni Ai Gercena Leningrad Su
Priority date: 1985-07-02
Filing date: 1984-06-12
Publication date: 1988-10-06
Also published as: CH659586A5; FR2583982A1; FR2583982B1; GB8516697D0; JPH0247966B2; JPS60258120A; DE3421789A1; GB2177402A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Medizin, insbesondere auf ein Arzneimittel auf der Basis einer Thymusfraktion und auf ein Verfahren zu dessen Herstellung und kann zur Wiederherstellung der gestörten Prozesse der Immunogenese, Regenerierung, Hämopoese, Hämokoagulation und zur Normalisierung des Kohlehydrat-, Fett- und Eiweißstoffwechsels beim Menschen verwendet werden.

Es ist bekannt, daß in Extrakten aus der Thymusdrüse von Mensch und Tier physiologisch wirksame Stoffe enthalten sind, die das Wachstum und die Entwicklung des Organismus sowie einige immunologische und metabolische Prozesse beeinflussen (Comsa T., Amer. J. Med. Sci. 250, 79, 1965; Goldstein A. et al., J. Immunol. 140, 359, 1970; SU-PS 4 59 227, US-PS 41 20 951).

Nach den Literaturangaben wird ein Extrakt aus dem Thymusgewebe von Kälbern (Thymozin) zur therapeutischen Wiederherstellung der Funktion des Immunitätssystems beim Menschen bei einigen onkologischen Erkrankungen und Erkrankungen mit angeborener Insuffizienz des immunologischen Systems verwendet (Goldstein A. et al., Transplant Proc. 7. 1 (suppl.I), 681, 1975, Sakai et al., Cancer 36, 3, 973, 1975).

Die Verabreichung von Thymozin führte zur Wiederherstellung der gestörten immunologischen Reaktivität des Organismus. Nichtsdestoweniger sind bis heute die therapeutische Effektivität der physiologisch wirksamen Stoffe aus dem Thymusgewebe sowie die Indikationen zu deren Verwendung in der medizinischen Praxis nicht genügend untersucht worden.

Es ist ein Arzneimittel aus dem Thymusgewebe - Thymozin bekannt (Goldstein A. et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 69, 7, 1800, 1972), das einen Komplex (etwa 30 Komponenten) der sauren Polypeptide von 1000 bis 14 000 Dalton Molekularmasse darstellt (Hooper et al., Ann. N.-Y. Acad. Sci., 249, 125, 1975). Thymozin wird folgenderweise hergestellt (Hooper et al., 1975). Man homogenisiert den Kälberthymus in einer 0,15 molaren NaCl-Lösung, zentrifugiert bei 14 000 g, isoliert die Flüssigkeit über dem Niederschlag, erwärmt diese bei einer Temperatur von 80°C, filtriert den ausgefallenen Niederschlag ab und gibt der zurückgebliebenen Lösung 5 Volumina Aceton hinzu. Man trocknet den erhaltenen Niederschlag auf einem Filter, löst dann wieder auf und salzt mit Ammoniumsulfat zuerst bei 25%iger Sättigung und dann bei 50%iger Sättigung aus. Man filtriert das nach dem Aussalzen erhaltene Präzipitat, entsalzt auf einer Kolonne mit Sephadex G-25 und lyophilisiert. In der gegebenen Reinigungsstufe besitzt der erhaltene Komplex der im Arzneimittel enthaltenen Polypeptide die am deutlichsten ausgeprägte biologische Wirksamkeit - die Fähigkeit, die Zellenimmunität anzuregen (Hooper et al., 1975).

Eine weitere Präparatreinigung führt zur Herabsetzung der biologischen Wirksamkeit.

Das nach dem bekannten Verfahren erhaltene Thymozin besitzt einen Komplex der sauren Polypeptide mit einem isoelektrischen Punkt von 3,5 bis 6,7 und der Molekularmasse von 1000 bis 14 000 Dalton unter deutlichem Vorherrschen der Asparagin- und Glutaminsäure, die insgesamt 50 Masse-%, bezogen auf die Thymozinmasse, betragen.

Das Herstellungsverfahren von Thymozin ist somit kompliziert und mehrstufig (10 Stufen). Die Anwendung dieses Verfahrens unter großtechnischen Bedingungen ist mit bestimmten Schwierigkeiten wie Ultrazentrifugieren, Verwendung von Sephadex etc. verbunden. Das Verfahren sichert keine genügend hohe Ausbeute an Thymozin. Bei einer Reihe von Kranken ruft Thymozin Nebeneffekte und allergische Reaktionen hervor. Die therapeutische Wirksamkeit von Thymozin und die Möglichkeit, dieses in der medizinischen Praxis zu verwenden, sind nicht vollständig untersucht worden.

Aus der DE 30 40 427 ist ein das T-System der Immunität regulierendes Präparat und Verfahren zu seiner Herstellung bekannt, wobei als Wirkstoff Peptide von der Molekularmasse 1500 bis 6000 Dalton, die ein Adsorptionsmaximum im Ultraviolettlicht bei 208 und 275 nm und eine elektrophoretische Wanderung im Polyacrylamidgel gegenüber dem Bromphenolblau von 0,062 bis 0,102; 0,156 bis 0,236; 0,354 bis 0,374; 0,382 bis 0,422; 0,432 bis 0,472; 0,485 bis 0,545; 0,850 bis 0,930 aufweisen, und ein pharmazeutisches Vehikel für den Wirkstoff enthalten sind.

Gegenstand der EP 00 80 518 ist ein Verfahren zur Gewinnung von therapeutisch wirksamen Wirkstoffen aus der Thymusdrüse von frisch geschlachteten Kälbern durch Wasserextraktion, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Thymusdrüse von etwa 12 bis 16 Wochen alten Kälbern unter sterilen Kautelen entnommen, die entnommene Masse auf tiefe Temperaturen von wenigstens -30°C abgekühlt wird, nach dem Auftauen unter Zusatz von destilliertem Wasser homogenisiert wird, die homogenisierte Flüssigkeit einige Tage bei etwa +4°C abgestellt und anschließend schnell abzentrifugiert und gefiltert wird, daß der Überstand über dem Sediment des Filtrats dekantiert, einige Tage bei ca. +4°C abgestellt und erneut schnell zentrifugiert und gefiltert wird, und der Überstand aus dem zweiten Filtrat zu einem applizierbaren Präparat verarbeitet wird.

Schließlich ist aus der WO 84/01 090 ein Immunstabilisierungsfaktor aus Kälberthymus bekannt, der ein Peptid darstellt, das gekennzeichnet ist durch:

A) starkes Haftvermögen gegenüber Sephadex und BioGel-P bei pH 4,5 bis 8,
B) einen isoelektrischen Punkt von ca. 7,0 bis 7,8,
C) Stimulierung der DNA-Synthesereaktion von Mäuselymphozyten und menschlichen Lymphozyten auf die alloantigene Stimulierung in einer Zweiweg-Kultur (MLC),
D) keinen signifikanten Anstieg der Stimulierung von Mäusemilzlymphozyten durch β-Lipopolysaccharide,
E) Fähigkeit zur Steigerung der immunstimulierenden Reaktion selbst in Anwesenheit von 2-Mercaptoethanol,
F) vollständige Umkehrbarkeit der Wirkung in einer MLC bei Entfernung 72 Stunden nach der Initiierung der MLC,
G) höhere Wirkung in einer MLC, die 10% menschliches Serum enthält, als in einem MLC-Medium, das 10% fötales Kalbsserum enthält,
H) Fähigkeit zur Steigerung der immunstimulierenden Reaktion in einer MLC selbst in Anwesenheit von Mäuseserum,
I) Fähigkeit zur Beschleunigung des Abstoßens gewebeunverträglicher Hauttransplantate bei Mäusen,
J) Fähigkeit zur Passage durch ein Dialyserohr mit einer Grenzdurchlässigkeit für Stoffe mit einem Molekulargewicht von 3500 Dalton und
K) Aufspaltung in zwei Immunstimulatorfraktionen, von denen eine ein Molekulargewicht von ca. 1400 Dalton und die andere ein Molekulargewicht von unter 1400 Dalton bei Gelfiltration bei pH 10,2 und 0,05 M Ammoniumhydroxid aufweisen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Arzneimittel aus dem Thymusgewebe, das Polypeptide alkalischer Natur enthält, durch die Auswahl entsprechender technologischer Herstellungsvorgänge zu entwickeln, das ein breiteres pharmakologisches Wirkungsspektrum unter Ausbleiben der Nebeneffekte und allergischen Reaktionen bei dessen Anwendung besitzt.

Diese Aufgabe wird wie aus den vorstehenden Ansprüchen ersichtlich gelöst.

Die Verwendung des erfindungsgemäßen Arzneimittels gestattet, die herabgesetzte immunologische Reaktivität des Organismus anzuregen, die Aktivität der Reparationsprozesse und der Hämopoese zu fördern sowie der Entwicklung der Infektions- und Destruktionsprozesses im Organismus vorzubeugen, was es ermöglicht, eine Reihe von Erkrankungen effektiver zu kurieren oder deren Entwicklung beim Menschen vorzubeugen. Die Verwendung unter stationären Bedingungen gestattet es, die Behandlungsdauer der Kranken mit chronischen Erkrankungen und gestörten Regenerierungsprozessen wesentlich herabzusetzen, was ausschlaggebend sein kann.

Zum Unterschied von den bekannten Präparaten regt das erfindungsgemäße Arzneimittel dank dem Vorliegen von Polypeptiden alkalischer Natur die Regenerierung der verletzten Gewebe an, was sich in der Verminderung der Dauer der Wunden- und Geschwürheilung äußert. Es regt auch die Blutbildung an, was sich in der Erhöhung der Menge von Leukozyten, Thrombozyten und Erythrozyten im Falle eines erniedrigten Gehalts im peripheren Blut äußert.

Das erfindungsgemäße Arzneimittel ruft keine Nebenerscheinungen und allergischen Reaktionen hervor, während es nach den Literaturangaben bekannt ist, daß die Verwendung von Thymozin bei 20 bis 30% der Kranken von allergischen Reaktionen begleitet wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich durch eine einfache Technologie aus und ist großtechnisch leicht reproduzierbar. Es können Proteine hoher Molekularmasse und andere hochmolekulare Verbindungen hydrolisiert werden. Das Arzneimittel ist mit einer hohen Ausbeute und von einem hohen Reinheitsgrad zu erhalten, so daß es bei der Einführung in den Organismus keine Nebenerscheinungen und keine allergischen Reaktionen hervorruft.

Eine langwierige Extraktion mit Essigsäure in Gegenwart katalytischer Mengen von Zinkchlorid trägt zum Entzug der Polypeptide von alkalischer Natur bei, deren Vorliegen im Arzneimittel die Erweiterung seines pharmakologischen Wirkungsspektrums bewirkt.

Es ist zweckmäßig, zur maximalen Isolierung der Polypeptide mit dem isoelektrischen Punkt von 7 bis 9 und einer Molekularmasse von 2000 bis 4000 Dalton, welche die höchste biologische Wirksamkeit besitzen, die Extraktion innerhalb von 48 bis 72 Stunden bei einem pH-Wert von 2,5 bis 4 und einer Temperatur von 5 bis 15°C in Gegenwart von Zinkchlorid durchzuführen, das in einer Menge von 0,2 bis 2 g/l Essigsäure genommen wird.

Um die biologisch wirksamen Stoffe - Polypeptide alkalischer Natur - vollständiger zu isolieren und die Rohstoffkonservierung zu bewirken, wird das Thymusgewebe vor der Homogenisierung vorzugsweise bei einer Temperatur von -30 bis -50°C mindestens während 100 Stunden stehengelassen.

Die Eigenschaften des Arzneimittels wurden nach der Methode der Ionenaustauschchromatografie auf dem Carboxylkationenaustauscher "Biokarb" in der H⁺-Form (N.N. Kusnecova und andere, Hochmolekulare Verbindungen, 18a, 2, 355, 1976), der Gel-Filtration (Fish et al., J. Biol. Chem., 244, 4989, 1969), der zonalen Papierelektrophorese und der Elektrophorese im Polyacrylamidgel (nach üblichen Methoden) und der Aminosäurenanalyse (nach der Methode von Stein und Mur, J. Biol. Chem., 176, 307, 1948) untersucht. Mit Hilfe der Ionenaustauschchromatografie wurde festgestellt, daß die isolierten Stoffe 3 Fraktionen in einem bestimmten Prozentverhältnis enthalten, die sich durch ihre elektrochemischen Eigenschaften unterscheiden.

Nachstehend wird die Tabelle 1 angeführt, in der die physikalisch- chemischen Charakteristiken der Fraktionen dargestellt werden.

Tabelle 1

Die Fraktionen I, II, III bestehen aus einer Reihe von Komponenten, die nach der Methode der zonalen Elektrophorese analysiert wurden. Die Molekularmasse jeder Fraktion wurde mit Hilfe der Gel-Filtration auf Sephadex G-25 bestimmt.

Zur Festlegung des Aminosäurebestands der Peptide der oben genannten Fraktionen wurde der automatische Aminosäurenanalysator "LKB-3210" (Schweden) nach der Methode von Spackman D.H. et al., Anal. Chem., 1958, 30, 1190-1206 angewandt.

Nachstehend wird in Tabelle 2 der Aminosäurengehalt des erfindungsgemäßen Arzneimittels angeführt.

Tabelle 2

Die biologische Wirksamkeit und ein breites pharmakologisches Wirkungsspektrum des erfindungsgemäßen Arzneimittels von 600 bis 6000 Dalton Molekularmasse sind auf das Vorliegen von 10 bis 20 Gew.-% Polypeptide mit einem isoelektrischen Punkt von 7 bis 9 und einer Molekularmasse von 2000 bis 4000 Dalton zurückzuführen, die durch den Gehalt an Hauptaminosäureresten, beispielsweise Lysin, gekennzeichnet werden. Den physikalisch-chemischen Eigenschaften und dem Aminosäurengehalt nach unterscheidet sich das Arzneimittel wesentlich von Thymozin, das aus einem Komplex der sauren Polypeptide (der isoelektrische Punkt von 3,5 bis 6,7) von 1000 bis 14 000 Dalton Molekularmasse unter deutlichem Vorherrschen der Asparagin- und Glutaminsäure besteht, die insgesamt gegen 50 Gew.-% des Präparats betragen (Hooper et al., Ann. N.-Y. Acad. Sci., 249, 125, 1975).

Das erfindungsgemäße Arzneimittel wird folgendermaßen hergestellt.

Das Thymusgewebe wird von Gefäßen, Blutkuchen und vom Fettzellgewebe gereinigt, mit Wasser gewaschen und der Homogenisierung unterzogen.

Um den Rohstoff zu konservieren und die Ausbeute an biologisch wirksamen Stoffen, Polypeptiden mit isoelektrischen Punkten von 3,5 bis 6,7 und von 7 bis 9 zu erhöhen, empfiehlt es sich, das Thymusgewebe vor der Homogenisierung bei einer Temperatur von -50 bis -30°C stehenzulassen oder dieses mit einem organischen Lösungsmittel wie Aceton, Chloroform, Ethylalkohol bei einer Temperatur von -20 bis -1°C zu behandeln.

Das Homogenat des Thymusgewebes wird der Extraktion mit einer 1 bis 10%igen wässerigen Essigsäurelösung in Gegenwart von Zinkchlorid mindestens während 24 Stunden unterzogen. Die Durchführung der Extraktion unter solchen Bedingungen trägt zur vollständigsten Isolierung der Polypeptide von 2000 bis 4000 Dalton Molekularmasse mit einem isoelektrischen Punkt von 7 bis 9 bei und sichert die Entfernung der Proteine und der hochmolekularen Verbindungen, die allergische Reaktionen bei der Verabreichung des Arzneimittels hervorrufen. Das optimale Verhältnis der Extraktionsdurchführung ist ein pH-Wert von 2,5 bis 4, eine Temperatur von 5 bis 15°C und eine Dauer von 48 bis 72 Stunden bei einem Gehalt an Zinkchlorid von 0,2 bis 2 g/l Essigsäure.

Nach der Beendigung der Extraktion wird das erhaltene Substrat in den Niederschlag und in die Flüssigkeit über dem Niederschlag getrennt, die mit einem organischen Lösungsmittel wie Aceton, Chloroform, Ethylalkohol mit darauffolgender Isolierung des sich gebildeten Niederschlags behandelt wird. Der Niederschlag wird zum Pulver getrocknet, das biologisch wirksame Stoffe, Polypeptide, enthält.

Das Pulver wird in Essigsäure gelöst, die Lösung wird durch Filtration sterilisiert und in sterile Flaschen zu je 1 ml abgefüllt, dann lyophilisiert und mit sterilen Gummipfropfen verschlossen. Eine Flasche enthält 10 mg der aus dem Thymus isolierten Stoffe.

Das erfindungsgemäße Arzneimittel enthält biologisch wirksame Stoffe, Polypeptide von 600 bis 6000 Dalton Molekularmasse, bei deren folgendem Verhältnis (Gew.-%):

Polypeptide mit einem isoelektrischen Punkt von 3,5 bis 6,790 bis 80 Polypeptide mit einem isoelektrischen Punkt von 7 bis 910 bis 20

Das erfindungsgemäße Arzneimittel stellt ein amorphes weißes Pulver oder ein weißes Pulver mit gelblicher Schattierung dar, ist in 5%iger Essigsäurelösung, in Wasser löslich, ist im Alkohol praktisch unlöslich und enthält kein Protein. Der pH-Wert der 1%igen wässerigen Lösung beträgt 5 bis 5,8.

Es soll an trockener, lichtgeschützter Stelle bei einer Temperatur von höchstens +20°C und nur für längstens 2 Jahre aufbewahrt werden.

Es wird intramuskulär eingeführt. Der Flascheninhalt wird vor der Injektion in 1 bis 2 ml physiologischer Lösung oder Novokainlösung aufgelöst. Die Behandlung beträgt 5 bis 20 Tage zu 10 bis 30 mg täglich.

Es wurden breite klinische Untersuchungen des erfindungsgemäßen Arzneimittels bei einer Reihe menschlicher Erkrankungen unternommen, die gezeigt haben, daß es ein breiteres pharmakologisches Wirkungsspektum besitzt als das nach den Literaturangaben bekannte Präparat aus dem Thymus, ohne Nebenerscheinungen und allergische Reaktionen hervorzurufen.

Das erfindungsgemäße Arzneimittel wird empfohlen zur Behandlung von akuten und chronischen eitrigen Entzündungserkrankungen der Knochen und der Weichgewebe, von der chronischen posttraumatischen und hämatogenen Osteomyelitis, von Knochenbrüchen, von Brandwunden, von trophischen Geschwüren, Wundliegen, Strahlennekrose der Gewebe, von Atherosklerosis obliterans, von chronischen Pneumonien, von peptischen Geschwüren; von den Zuständen, die mit der Hypofunktion des Thymus, mit der Immunitäts- und Blutbildungshemmung nach der durchgeführten Strahlentherapie oder Chemotherapie bei onkologischen Kranken verbunden sind. Es wird empfohlen, das Arzneimittel zur Prophylaxe der Infektionskomplikationen, Hemmung der Immunität, Blutbildung, Regenerationsprozesse in der posttraumatischen und postoperativen Periode, während der Durchführung der Strahlentherapie oder Chemotherapie und beim Gebrauch massiver Antibiotikadosen zu verwenden. Es empfiehlt sich, das Arzneimittel bei Unverträglichkeit der antibakteriellen Therapie oder beim Ausbleiben des Effekts sowie als Normalisierungsmittel bei funktionellen Störungen des Kohlenhydrat-, Fett- und Eiweißstoffwechsels im Organismus zu verwenden.

Bei der Herstellung des erfindungsgemäßen Arzneimittels wird eine einfache, billige Technologie benutzt, die unter großtechnischen Bedingungen leicht reproduzierbar ist und es gestattet, ein Präparat von hoher Qualität, in einer hohen Ausbeute zu erhalten, die die Ausbeute, beispielsweise von Thymozin um das 5fache übersteigt.

Beispiel 1

500 g Thymusgewebe, das von Gefäßen, Blutkuchen und Fettzellgewebe gereinigt wurde, werden mit Wasser und Aceton gewaschen und dann in Aceton, das in einem Gewichtsverhältnis zum Thymusgewebe von 4 : 1 genommen wird, bei einer Temperatur von -1°C innerhalb 24 Stunden stehengelassen und danach der Homogenisierung unterzogen. Das erhaltene Homogenat des Thymusgewebes wird in eine 3%ige wässerige Essigsäurelösung bei einem Gewichtsverhältnis von 1 : 6 eingebracht. Die Extraktion wird bei einem pH-Wert von 3,2, einer Temperatur von 10°C während 72 Stunden in Gegenwart von Zinkchlorid durchgeführt, das in einer Menge von 1 g/l der genannten Essigsäure genommen wird. Nach der Beendigung der Extraktion wird das Substrat bei 3000 U/min während 20 min zentrifugiert, die Flüssigkeit über dem Niederschlag wird isoliert und dazu wird Aceton bei deren Gewichtsverhältnis von 1 : 5 zugegossen. Der sich bildende Niederschlag wird abfiltriert, mit Aceton gewaschen und auf dem Filter getrocknet. Man erhält 5 g weißes Pulver, das biologisch wirksame Stoffe, Polypeptide von 600 bis 6000 Dalton Molekularmasse bei deren folgendem Verhältnis (Gew.-%) enthält:

Polypeptide mit einem isoelektrischen Punkt von 3,5 bis 6,780 Polypeptide mit einem isoelektrischen Punkt von 7 bis 920

Das erhaltene Arzneimittel stellt ein weißes Pulver dar, das in 5%iger Essigsäure und in Wasser löslich ist. Der pH-Wert der 1%igen wässerigen Lösung beträgt 5,5.

Zur Herstellung der Arzneiform des Arzneimittels wird das erhaltene Pulver in 500 ml 1%iger Essigsäure gelöst. Die Präparatlösung wird durch Filtration sterilisiert und in sterile Flaschen zu je 1 ml abgefüllt, dann lyophilisiert und mit Gummipfropfen verschlossen. Im Ergebnis enthält eine Flasche 10 mg Stoffe, die aus dem Thymusgewebe isoliert worden sind.

Beispiel 2

500 g Thymusgewebe, das von Gefäßen, Blutkuchen und Fettzellgewebe gereinigt wurde, werden mit Wasser und Chloroform gewaschen und dann in Chloroform, das in einem Gewichtsverhältnis zum Thymusgewebe von 8 : 1 genommen wird, bei einer Temperatur von -10°C innerhalb von 48 Stunden stehengelassen und danach der Homogenisierung unterzogen. Das erhaltene Homogenat des Thymusgewebes wird in eine 1%ige wässerige Essigsäurelösung bei einem Gewichtsverhältnis von 1 : 10 eingebracht. Die Extraktion wird bei einem pH-Wert von 4, einer Temperatur von 15°C während 48 Stunden in Gegenwart von Zinkchlorid durchgeführt, das in einer Menge von 2 g/l der genannten Essigsäure genommen wird. Nach der Beendigung der Extraktion wird das Substrat während 24 Stunden filtriert, die Flüssigkeit über dem Niederschlag wird isoliert und dazu wird Chloroform bei deren Gewichtsverhältnis von 1 : 8 zugegossen. Der sich bildende Niederschlag wird abfiltriert, mit Chloroform gewaschen und auf dem Filter getrocknet. Man erhält 3 g weißes Pulver, das biologisch wirksame Stoffe, Polypeptide von 600 bis 6000 Dalton Molekularmasse bei deren folgendem Verhältnis (Gew.-%) enthält:

Polypeptide mit einem isoelektrischen Punkt von 3,5 bis 6,790 Polypeptide mit einem isoelektrischen Punkt von 7 bis 910

Das erhaltene Arzneimittel stellt ein weißes Pulver dar, das in 5%iger Essigsäure und in Wasser löslich ist. Der pH-Wert der 1%igen wässerigen Lösung beträgt 5,8.

Zur Herstellung der Arzneiform des Arzneimittels aus dem Thymus wird das erhaltene Pulver in 300 ml 5%iger Essigsäure gelöst. Die Präparatlösung wird durch Filtration sterilisiert und in sterile Flaschen zu je 1 ml abgefüllt, dann lyophilisiert und mit Gummipfropfen verschlossen. Im Ergebnis enthält eine Flasche 10 mg Stoffe, die aus dem Thymusgewebe isoliert worden sind.

Beispiel 3

500 g Thymusgewebe, das von Gefäßen, Blutkuchen und Fettzellgewebe gereinigt wurde, werden mit Wasser gewaschen und der Homogenisierung unterzogen. Das erhaltene Homogenat des Thymusgewebes wird in eine 10%ige wässerige Essigsäurelösung bei einem Gewichtsverhältnis von 1 : 4 eingebracht. Die Extraktion wird bei einem pH-Wert von 2,5, einer Temperatur von 5°C innerhalb von 24 Stunden in Gegenwart von Zinkchlorid durchgeführt, das in einer Menge von 0,2 g/l der genannten Essigsäure genommen wird.

Nach der Beendigung der Extraktion wird das Substrat bei 5000 U/min während 10 min zentrifugiert, die Flüssigkeit über dem Niederschlag wird isoliert und dazu wird Ethylalkohol bei deren Gewichtsverhältnis von 1 : 10 zugegossen. Der sich bildende Niederschlag wird abfiltriert, mit Ethylalkohol gewaschen und auf dem Filter getrocknet. Man erhält 4 g weißes Pulver, das biologisch wirksame Stoffe, Polypeptide von 600 bis 6000 Dalton Molekularmasse bei deren folgendem Verhältnis (Gew.-%) enthält:

Polypeptide mit einem isoelektrischen Punkt von 3,5 bis 6,787 Polypeptide mit einem isoelektrischen Punkt von 7 bis 913

Das erhaltene Arzneimittel stellt ein weißes Pulver dar, das in 5%iger Essigsäure löslich ist; der pH-Wert der 1%igen wässerigen Lösung beträgt 5,3.

Zur Herstellung der Arzneiform des Arzneimittels wird das erhaltene Pulver in 400 ml 3%iger Essigsäure gelöst. Die Präparatlösung wird durch Filtration sterilisiert und in sterile Flaschen zu je 1 ml abgefüllt, dann lyophilisiert und mit Gummipfropfen verschlossen. Im Ergebnis enthält eine Flasche 10 mg Stoffe, die aus dem Thymusgewebe isoliert worden sind.

Beispiel 4

500 g Thymusgewebe, das von Gefäßen, Blutkuchen und Fettzellgewebe gereinigt wurde, werden mit Wasser gewaschen, bei einer Temperatur von -30°C während 200 Stunden stehengelassen und danach der Homogenisierung unterzogen. Das erhaltene Homognat des Thymusgewebes wird in eine 5%ige wässerige Essigsäurelösung bei einem Gewichtsverhältnis von 1 : 5 eingebracht. Die Extraktion wird bei einem pH-Wert von 4, einer Temperatur von 12°C innerhalb von 56 Stunden in Gegenwart von Zinkchlorid durchgeführt, das in einer Menge von 0,5 g/l der genannten Essigsäure genommen wird. Nach der Beendigung der Extraktion wird das Substrat bei 4000 U/min während 20 min zentrifugiert, die Flüssigkeit über dem Niederschlag wird isoliert und dazu wird Aceton bei deren Gewichtsverhältnis von 1 : 6 zugegossen. Der sich bildende Niederschlag wird durch Zentrifugieren isoliert, mit Aceton gewaschen und auf dem Filter getrocknet. Man erhält 5,5 g weißes Pulver, das biologisch wirksame Stoffe, Polypeptide von 600 bis 6000 Dalton Molekularmasse bei folgendem Verhältnis (Gew.-%) enthält:

Polypeptide mit einem isoelektrischen Punkt von 3,5 bis 6,782 Polypeptide mit einem isoelektrischen Punkt von 7 bis 918

Das erhaltene Arzneimittel stellt ein weißes Pulver mit gelblicher Schattierung dar, das in 5%iger Essigsäure löslich ist; der pH-Wert der 1%igen wässerigen Lösung beträgt 5,2.

Zur Herstellung der Arzneiform des Arzneimittels wird das erhaltene Pulver in 550 ml 4%iger Essigsäure gelöst. Die Präparatlösung wird durch Filtration sterilisiert und in sterile Flaschen zu je 1 ml abgefüllt, dann lyophilisiert und mit Gummipfropfen verschlossen. Im Ergebnis enthält eine Flasche 10 mg Stoffe, die aus dem Thymusgewebe isoliert worden sind.

Beispiel 5

500 g Thymusgewebe, das von Gefäßen, Blutkuchen und Fettzellgewebe gereinigt wurde, werden mit Wasser gewaschen, bei einer Temperatur von -50°C während 100 Stunden stehengelassen und danach der Homogenisierung unterzogen. Das erhaltene Homogenat des Thymusgewebes wird in eine 2%ige wässerige Essigsäurelösung bei deren Gewichtsverhältnis von 1 : 7 eingebracht. Die Extraktion wird bei einem pH-Wert von 3,0 einer Temperatur von 8°C während 60 Stunden in Gegenwart von Zinkchlorid durchgeführt, das in einer Menge von 1,5 g/l der genannten Essigsäure genommen wird. Nach Beendigung der Extraktion wird das Substrat bei 6000 U/min während 10 min zentrifugiert, die Flüssigkeit über dem Niederschlag wird isoliert und dazu wird Ethylalkohol bei einem Gewichtsverhältnis von 1 : 10 zugegossen. Der sich bildende Niederschlag wird abfiltriert, mit Ethylalkohol gewaschen, auf dem Filter getrocknet. Man erhält 5,6 g weißes Pulver, das biologisch wirksame Stoffe, Polypeptide von 600 bis 6000 Dalton Molekularmasse bei folgendem Verhältnis (Gew.-%) enthält:

Das erhaltene weiße Pulver ist in 5%iger Essigsäure, in Wasser löslich; der pH-Wert der 1%igen wässerigen Lösung beträgt 5,4.

Zur Herstellung der Arzneiform des Arzneimittels wird das erhaltene Pulver in 570 ml 2%iger Essigsäure gelöst. Die Präparatlösung wird durch Filtration sterilisiert und in sterile Flaschen zu je 1 ml abgefüllt, dann lyophilisiert und mit Gummipfropfen verschlossen. Im Ergebnis enthält eine Flasche 10 mg Stoffe, die aus dem Thymusgewebe isoliert worden sind.

Claims

1. Arzneimittel auf der Basis einer Thymusfraktion, das Polypeptide mit einem isoelektrischen Punkt von 3,5 bis 6,7 enthält, dadurch gekennzeichnet, daß es Polypeptide von 600 bis 6000 Dalton Molekularmasse enthält, von welchen 10 bis 20 Gew-% einen isoelektrischen Punkt von 7 bis 9 und eine Molekularmasse von 2000 bis 4000 Dalton haben.

2. Verfahren zur Herstellung des Arzneimittels nach Anspruch 1, das
die Homogenisierung des Thymusgewebes,
die Trennung des erhaltenen Homogenats in den Niederschlag und die Flüssigkeit über den Niederschlag,
die Behandlung der Flüssigkeit über dem Niederschlag mit einem organischen Lösungsmittel und die Isolierung des Endproduktes
vorsieht, dadurch gekennzeichnet, daß man das Homogenat des Thymusgewebes vor der Trennung mit einer 1 bis 10%igen wässerigen Essigsäurelösung in Gegenwart von 0,2 bis 2 g Zinkchlorid auf 1 Liter Essigsäure mindestens während 24 Stunden extrahiert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion im Verlaufe von 48 bis 72 Stunden durchführt.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion bei einem pH- Wert von 2,5 bis 4 und einer Temperatur von 5 bis 15°C durchführt.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Thymusgewebe vor der Homogenisierung bei einer Temperatur von -50 bis -30°C mindestens während 100 Stunden stehenläßt.