DE69112727T2

DE69112727T2 - Physiologisch wirksame Peptide, die eine immunoregulierende Aktivität besitzen.

Info

Publication number: DE69112727T2
Application number: DE69112727T
Authority: DE
Inventors: Naoyoshi Suzuki
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1990-07-12
Filing date: 1991-07-12
Publication date: 1996-05-02
Anticipated expiration: 2011-07-13
Also published as: EP0466498A1; ATE127475T1; US5464819A; DE69112727D1; EP0466498B1; JPH05279383A; JP2973621B2; DK0466498T3; JPH0474197A

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Peptide mit physiologischer Aktivität. Die Peptide weisen immunoregulatorische Aktivität, einschließlich der Aktivität die Vermehrung von Toxoplasma (Toxoplasma gondii) im Zellinneren zu inhibieren, und Antitumor-Aktivität auf. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Arzneimittelzusammensetzungen, die diese und andere Peptide als aktive Komponenten enthalten. Von diesen Zusammensetzungen wird gesagt, daß sie als antiprotozoenes, antibakterielles, antivirales oder Antitumor-Mittel gut verwendbar sind.
In der vorliegenden Beschreibung werden die Aminosäurereste unter Verwendung der untenstehend gezeigten Abkürzungen, die von der IUPAC-IUB-Kommission für Biochemische Nomenclatur (CBN) genehmigt wurden, dargestellt. Bezüglich der Aminosäuren und anderen Verbindungen, die Isomere aufweisen, liegen die durch die folgenden Abkürzungen dargestellten in der L-Konfiguration vor, sofern nichts anderes gesagt wird.
Gln: Glutaminrest
Asp: Asparaginsäurerest
Pro: Prolinrest
Tyr: Tyrosinrest
Val: Valinrest
Lys: Lysinrest
Glu: Glutaminsäurerest
Ala: Alaninrest
Asn: Asparaginrest
Leu: Leucinrest
Phe: Phenylalaninrest
Gly: Glycinrest
His: Histidinrest
Ser: Serinrest
Thr: Threoninrest
Ile: Isoleucinrest
Trp: Tryptophanrest
Arg: Argininrest
Met: Methioninrest
Cys: Cysteinrest.

Stand der Technik

Toxoplasma ist ein Protozoen-Parasit, der sich hauptsächlich in den Endothelzellen von Säugern vermehrt. Ferner ist Toxoplasma gefürchtet, da es nicht nur ein patogener Protozoen ist, der bei Haustieren zu verschiedenen Krankheiten führt, sondern auch ein Erreger von Encephalomyelitis bei Menschen ist. Toxoplasma umgeht die Tötungswirkung eines Makrophagen und setzt, im Gegensatz zu anderen Mikroorganismen, die Vermehrung durch binäre Teilung mittels endogener Keimung in einem Makrophagen eines normalen Wirts fort.
In Toxoplasma-hyperimmunen Lebewesen wurde beobachtet, daß Makrophagen eine Aktivität zum Töten und Verdauen von Protozoen besitzen. Es wurde berichtet, daß die Seren solcher Toxoplasma-hyperimmunen Lebewesen einen humoralen Vermittler (allgemein bekannt als "Cytokin") enthalten, der in der Lage ist, die Vermehrung von Toxoplasma in den normalen Zellen eines Lebewesens zu inhibieren (siehe Sethi, K.K. et al., J. Immunol., Vol. 131, Seiten 1151-1558, 1975).
Ferner wurde berichtet, daß ein Cytokin, das in der Lage ist die Vermehrung von Toxoplasma in normalen Zellen zu inhibieren, im Überstand einer Kultur vorkommt, die erhalten wurde durch Züchtung von aus einem Toxoplasma-hyperimmunen Lebewesen entfernten Milzzellen in Gegenwart eines Toxoplasma-Lysat-Antigens (im folgenden als "TLA" bezeichnet) (siehe Shirahata, T., Shimizu, K., und Suzuki, N., Z. Parasiten kd, Vol. 49, Seiten 11-23, 1976).
Das oben erwähnte Cytokin ist ein Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von 30.000 bis 40.000, von dem man annimmt, daß es sich um eine Substanz handelt, die durch sensibilisierte T-Lymphozyten hergestellt wird. Diese Verbindung ist im allgemeinen bekannt als "Toxoplasma-Wachstumshemmungsfaktor" (im folgenden einfach als "Toxo-GIF" bezeichnet) (siehe Shirahata, T., Shimizu, K., und Suzuki, N., Z. Parasiten kd, Vol. 49, Seiten 11-23, 1976 und Nagasawa, H., et al., Immunobiol., Vol. 156, Seiten 307-319, 1980). Dieses Toxo-GIF inhibiert die Vermehrung von Toxoplasma nicht nur in Makrophagen, sondern auch in anderen somatischen Zellen. In diesem Zusammenhang sollte beachtet werden, daß Toxo-GIF lediglich die Vermehrung von Toxoplasma in Zellen der gleichen Lebewesen-Art wie der Wirt inhibiert und nicht in der Lage ist, die Vermehrung von Toxoplasma in Zellen anderer Lebewesen-Arten zu inhibieren (siehe Nagasawa, H., et al., Immunobiol., Vol. 156, Seiten 307-319, 1980 und Matsumoto, Y., et al., Zbl. Bakt. Hyg., Vol. A 250, Seiten 383-391, 1981). Bedingt durch diese Artenspezifizität kann Toxo-GIF nicht zur Verhinderung oder Heilung von Toxoplasmose im Menschen oder verschiedenen Lebewesen, die verschieden vom Wirt sind, verwendet werden.
In dieser Situation haben die Erfinder bereits vorher gefunden, daß eine niedermolekulare Verbindung, die erhalten wurde durch Hydrolyse eines Serums eines Toxoplasma-immunen Lebewesens nicht nur eine nicht-artenspezifische Aktivität bezüglich der Inhibierung der Vermehrung voll Toxoplasma aufweist, sondern auch Antimikroorganismus-Aktivitäten gegen Protozoen, Bakterien und Viren, sowie Antitumor-Aktivität aufweist (siehe offengelegte japanische Patentanmeldungen Nr. 57-J42922/1982 und 57-144983/1982 sowie US-Patent Nr. 4,482,543). Das ausgehend vom Serum eines Toxoplasma-immunen Lebewesens erhaltene Hydrolysat wurde als "Obioactin" bezeichnet (siehe Suzuki, N., et al., Zbl. Bact. Hyg. I. Abt. Orig., Vol. A256, Seiten 356-366, 1984). Dieses Obioactin ist eine Polypeptidverbindung mit einem Molekulargewicht von nicht mehr als 500 und ist in der Lage die Vermehrung von Toxoplasma nicht nur in homologen Zellen, sondern auch in heterologen Zellen zu inhibieren (siehe Suzuki, N., et al., Zbl. Bact. Hyg. I. Abt. Orig., Vol. A256, Seiten 367-380, 1984).
Von diesem nativen Obioactin wird angenommen, daß es sich um ein Aggregat oder ein Gemisch einer großen Anzahl von verschiedenen Peptid-Typen handelt. Die Verwendungsmöglichkeiten von Obioactin würden sich merklich verbessern, sofern es möglich wäre, Obioactin zu synthetisieren und dabei die aktiven Stellen jedes einzelnen Peptids zu identifizieren. Da jedoch angenommen wird, daß es sich bei Obioactin um ein Aggregat oder ein Gemisch einer großen Zahl verschiedener Peptid-Typen handelt, wie oben erwähnt, ist es außerordentlich schwierig die Aminosäuresequenz für jedes der Vielzahl von verschiedenen Peptid-Typen, die das Aggregat oder Gemisch darstellen, festzustellen, indem man eine Aminosäureanalyse der gereinigten Obioactin-Fraktionen, wie sie durch chromatographische Arbeitsgänge erhalten werden, durchführt. Dies führt dazu, daß die Synthese von Obioactin nicht durchführbar ist.
Die Erfinder versuchten bereits früher eine Aminosäureanalyse eines in einer durch Umkehrphasen-Chromatographie unter Verwendung einer ODS-120T-Säule gereinigten Obioactin- Fraktion enthaltenen Peptids durchzuführen. Dabei wurde eine Vielzahl von Aminosäuren jeweils für die erste Position, die zweite Position, die dritte Position usw., ausgehend vom N- Terminus des in der Fraktion enthaltenen Peptids gefunden, und es war aus diesem Grunde unmöglich, ausgehend von den detektierten Aminosäuren, eine Aminosäuresequenz für das Peptid direkt zu bestimmen. Dennoch wurde in diesen Versuchen überraschenderweise gefunden, daß bestimmte spezifische Aminosäuresequenzen die gewünschten Aktivitäten aufwiesen (siehe US-Patent Nr. 4,897,463). Demgemäß offenbart die Patentschrift Nr. 4,897,463 ein im wesentlichen reines Peptid, das eine Aminosäuresequenz enthält, die durch eine Formel dargestellt wird, die aus der Gruppe bestehend aus den Formeln (7) bis (10) ausgewählt wird:
Gly-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu (7),
Glu-Glu-Glu-Glu-Glu (8),
Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (9), und
Ala-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu (10).
Unter diesen Peptiden mit den durch die obigen Formeln (7) bis (10) dargestellten Aminosäuresequenzen weist das Peptid mit der durch die Formel (7) dargestellten Aminosäuresequenz die höchste Aktivität bezüglich der Inhibierung der Vermehrung von Toxoplasma im Zellinneren auf. Das Peptid mit der durch die Formel (7) dargestellten Aminosäuresequenz wurde durch die Erfinder als Obiopeptid-I (im folgenden einfach als "Obio-1") bezeichnet.
Unter den im europäischen Recherchenbericht zitierten Literaturstellen beschreiben Neuroscience Letters, 70(2), S. 228-233 vom 8. Oktober 1986 das Dipeptid Glycin-Glutaminsäure, Cell, 59(4), S. 603-614 vom 17. November 1989 das Tripeptid Prolin-Valin-Valin, und EP-A-324270 (entspricht dem oben diskutierten US-Patent Nr. 4,897,463) Peptide, die aus der Obioactin-Fraktion 3-4 erhalten wurden.

Zusammenfassung der Erfindung

Unter der Annahme, daß es auch andere Peptide, die aktive Stellen in Peptiden bilden, unter der Vielzahl von verschiedenen Typen an Peptiden, die Obioactin aufbauen und die andere Aminosäuresequenzen als die durch die obigen Formeln (7) bis (10) dargestellten aufweisen, geben müßte, haben die Erfinder weitere umfangreiche und tiefgehende Studien zur Entwicklung von neuen und nützlichen Peptiden durch Bestätigung des Vorhandenseins, Bestimmung der Struktur und Messung der Aktivität solcher anderer Peptide durchgeführt. Als Ergebnis haben die Erfinder erfolgreich sechs Peptide isoliert, einschließlich vier neuer Peptide, von denen angenommen wird, daß sie jeweils für sich die oben erwähnte aktive Stelle darstellen, isoliert und deren immunoregulatorische Aktivitäten bestimmt. Ferner wurde überraschenderweise gefunden, daß eine Peptid-Zusammensetzung, die mindestens zwei unter diesen sechs Peptiden ausgewählten Peptide enthält, und eine Peptid-Zusammensetzung, die mindestens ein unter diesen sechs Peptiden ausgewähltes Peptid und mindestens ein zusätzliches Peptid, das ausgewählt wird unter denen, die Aminosäuresequenzen aufweisen, die durch die obigen Formeln (7) bis (10) dargestellt werden, enthält, einen Synergieeffekt besitzen. Auf der Grundlage dieser Beobachtungen wurde die vorliegende Erfindung fertiggestellt.
Das Vorgesagte und andere Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der folgenden detaillierten Beschreibung und der anliegenden Ansprüche im Zusammenhang mit den Zeichnungen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

In den Zeichnungen zeigt Fig. 1 ein durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie von ungereinigtem Obioactin erhaltenes Chromatogramm, das vier Fraktionen anzeigt;
Fig. 2 zeigt ein durch Umkehrphasen-Chromatographie der in Fig. 1 gezeigten dritten Fraktion erhaltenes Chromatogramm; und
Fig. 3 ist ein Diagramm, das die Wirkung des erfindungsgemäßen, physiologisch aktiven Peptids auf die Vermehrung von Tumorzellen in Mäusen, zeigt.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch eine Formel, die aus der aus den Formeln (3) bis (6) bestehenden Gruppe ausgewählt wird, dargestellt wird, bereitgestellt:
Glu-Pro-Val-Val (3).
Glu-Glu-Pro-Val-Val (4).
Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val (5). und
Gly-Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val (6).
Ferner wird eine Peptid-Zusammensetzung, die mindestens zwei Peptide enthält, die aus der aus Peptiden mit den Aminosäuresequenzen der Formeln (1) bis (6) bestehenden Gruppe ausgewählt wird, bereitgestellt:
Gly-Glu (1),
Pro-Val-Val (2),
Glu-Pro-Val-Val (3),
Glu-Glu-Pro-Val-Val (4),
Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val (5), und
Gly-Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val (6).
Gemäß eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung wird eine Peptid-Zusammensetzung bereitgestellt, die mindestens ein Peptid, das aus der aus Peptiden mit den Aminosäuresequenzen der Formeln (1) bis (6) bestehenden Gruppe ausgewählt wird:
Gly-Glu (1),
Pro-Val-Val (2),
Glu-Pro-Val-Val (3),
Glu-Glu-Pro-Val-Val (4),
Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val (5), und
Gly-Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val (6);
und mindestens ein Peptid, das aus der aus Peptiden mit den Aminosäuresequenzen der Formeln (7) bis (10) bestehenden Gruppe ausgewählt wird, enthält:
Gly-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu (7),
Glu-Glu-Glu-Glu-G)u (8),
Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (9), und
Ala-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu (10).
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung eine Arzneimittel- Zusammensetzung bereit, die ein Peptid, das unter den Formeln (2) bis (6) ausgewählt wird, oder eine Peptid-Zusammensetzung, die mindestens zwei Peptide, die aus der Gruppe bestehend aus Peptiden mit den Aminosäuresequenzen der Formeln (1) bis (6) ausgewählt wird, oder eine Peptid- Zusammensetzung, die mindestens ein Peptid enthält, das ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Peptiden mit den Aminosäuresequenzen der Formeln (1) bis (6) und mindestens einem Peptid, das ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Peptiden mit den Aminosäuresequenzen der Formeln (7) bis (10), und mindestens einen pharmazeutisch geeigneten Träger, ein pharmazeutisch geeignetes Verdünnungsmittel oder ein pharmazeutisch geeignetes Vehikel enthält.
Gemäß einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Peptids, das durch eine aus der Gruppe bestehend aus den Formeln (2) bis (6) ausgewählten Formel dargestellt wird:
Pro-Val-Val (2),
Glu-Pro-Va)-Val (3),
Glu-Glu-Pro-Val-Val (4),
Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val (5), und
Gly-Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val (6):
oder eines Peptidgemisches, das mindestens zwei Peptide enthält, die aus der aus Peptiden mit den Aminosäuresequenzen der Formeln (1) bis (6) bestehenden Gruppe ausgewählt werden:
Gly-Glu (1),
Pro-Val-Val (2),
Glu-Pro-Val-Val (3),
Glu-Glu-Pro-Val-Val (4),
Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val (5), und
Gly-Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val (6): oder eines Peptidgemisches, das mindestens ein Peptid enthält, das aus der Gruppe bestehend aus Peptiden mit den Aminosäuresequenzen der Formeln (1) bis (6) bestehenden Gruppe ausgewählt wird, und
mindestens eines Peptids, das ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Peptiden mit den Aminosäuresequenzen der Formeln (7) bis (10):
Gly-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu (7),
Glu-Glu-Glu-Glu-Glu (8),
Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (9), und
Ala-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu (10);
zur Herstellung eines Arzneimittels mit immunoregulatorischer Aktivität, protozoenvernichtender Aktivität oder Antitumor- Aktivität.
In jeder der obigen Aminosäuresequenzen mit den Formeln (1) bis (10) bedeutet der sich auf der linken Seite befindliche Aminosäurerest einen N-terminalen Aminosäurerest und der sich auf der rechten Seite befindliche Aminosäurerest einen C- terminalen Aminosäurerest.
Für therapeutische Zwecke werden diese Peptide vorzugsweise in im wesentlichen reiner Form verabreicht.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird die Aktivität der Inhibierung der Vermehrung von Toxoplasma durch zwei Charakteristika bewertet, nämlich "Prozentsatz der Toxoplasma enthaltenden Zellen" und "Toxoplasma-Wachstumshemmungsfaktor- Aktivität" (im folgenden als "Toxo-GIF-Aktivität" bezeichnet). Diese Charakteristika wurden gemäß den von Nagasawa, H., et al. in Jpn. J. Vet. Sci., Vol. 43, Seiten 307-319, 1981 und von Sakurai, H., et al. in Jpn. J. Trop. Med. Hyg., Vol. 10, Seiten 183-195, 1982 beschriebenen Verfahren bestimmt.
(1) Bestimmung des Prozentsatzes von Toxoplasma enthaltenden Zellen:
(a) Aktivität in Mäuse-Makrophagen und Hundemonozyten:
Einer erwachsenen BALB/c weiblichen Maus wurde 1 ml einer sterilisierten Salzlösung, die 0,2% Glycogen enthielt, intraperitoneal injiziert und 5 Tage später die Bauchhöhle der Maus mit kalter, sich im Gleichgewicht befindlichen Hank's Gleichgewicht-Salzlösung (im folgenden als "ABSS" bezeichnet) gewaschen, wobei peritoneale Exsudatzellen mitgenommen wurden. Diese Zellen wurden durch zweimaliges 5-minütiges Zentrifugieren bei 250 x G gewaschen und in einem Tc 100 Kulturmedium, das 10% eines durch Hitze inaktivierten Kälberserums (im folgenden als "10%-HICS-Tc199 Kulturmedium" bezeichnet, siehe Igaku No Ayumi (Fortschritt in der Medizin), 62, Nr. 6, veröffentlicht am 5. August 1967) in einer Konzentration von 1 x 10&sup6; Zellen/ml enthielt, suspendiert. Diese Zellsuspension wurde portionsweise in jeweils 1 ml in Züchtungsmulden (Platte mit mehreren Schalen, FB-16-24-TC, hergestellt und verkauft von Limblo Chemical Co., USA), die durch ein rundes Abdeckglas mit einem Durchmesser von 15 mm bedeckt waren, gegeben und in einem 5% CO&sub2;-Inkubator gezüchtet. Zur Entfernung kontaminierter Erythrozyten und Lymphozyten wurde jede der Züchtungsmulden vorsichtig jeweils dreimal in Intervallen von 2 Stunden mit HBSS gespült und anschließend über Nacht in dem CO&sub2;-Inkubator gezüchtet, wobei eine Maus-Makrophagen-Monoschicht auf dem Abdeckglas gebildet wurde.
Andererseits wurden bei der Herstellung von Hundemonozyten 5 ml Blut aus zervikalen Venen als periphären Blut gesammelt und diesem 0,05% Heparin zugegeben. Dieses Blut wurde gemäß der Conray 400-Ficoll-Methode fraktioniert (siehe Tsuji, H., Men-eki Jikken Sosaho (Arbeitsverfahren für Immunologische Tests), 4. Auflage, Immunocells I-4, Seiten 443-446, publiziert von Maeda Printing Co., Ltd., 1979), wobei eine mononukleare Zellfraktion erhalten wurde. Die erhaltene mononukleare Zellfraktion wurde mit HBSS und anschließend mit 10%-HICS-Tc199-Züchtungsmedium zentrifugiert (800 x G, 5 min., 4ºC) und in dem 10%-HICS-Tc199-Züchtungsmedium in einer Konzentration von ungefähr 1 x 10&sup6; Zellen/ml suspendiert. Die resultierende Zellsuspension wurde portionsweise zu jeweils 1 ml in die oben genannten Züchtungsmulden, die mit einem runden Abdeckglas mit einem Durchmesser von 15 mm abgedeckt waren, gegossen und in einem 5%-CO&sub2;-Inkubator gezüchtet. Die Züchtung wurde 12 Stunden lang durchgeführt und jede der Züchtungsmulden wurde dreimal mit HBSS vorsichtig gespült. Anschließend wurde über Nacht im CO&sub2;-Inkubator gezüchtet, wobei eine Hundemonozyten-Monoschicht auf dem Abdeckglas gebildet wurde.
Jede der oben genannten Monoschichten wurde nochmals mit 10%- HICS-Tc199-Züchtungsmedium gespült und mit 1 x 10&sup5; Tachizoiten des Toxoplasmastammes RH, bezogen auf 1 x 10&sup6; Mäuse-Makrophagen oder Hundemonozyten angeimpft, wodurch die Makrophagen infiziert wurden. Nicht in die Zellen eingedrungene, freie Toxoplasma-Organismen wurden durch Waschen mit HBSS eine Stunde nach der Einimpfung entfernt.
Ein 10%-HICS-Tc199-Züchtungsmedium, das eine Peptidprobe enthielt, wurde auf das Abdeckglas in einer Menge von 1 ml, bezogen auf 1 x 10&sup6; Zellen der Mäuse-Makrophagen bzw. der Hundemonozyten, aufgebracht. Es wurde 48 Stunden lang gezüchtet und anschließend mit May-Grunwald-Giemsa angefärbt und die Zahl der Toxoplasma-Organismen in den Zellen gezählt. Innerhalb eines bestimmten Sichtfeldes des Abdeckglases wurden 100 Zellen überprüft um die Anzahl der Zellen, die kein Texeplasma, die 1 bis 5 Toxoplasma-Organismen und die 6 oder mehr Toxoplasma-Organismen enthielten, zu zählen. Die Ergebnisse der Zählung wurden in % ausgedrückt. Eine ähnliche Überprüfung und Zählung wurde innerhalb vier weiterer Sichtfenster auf dem Abdeckglas durchgeführt. Aus den aus allen fünf Sichtfenstern erhaltenen Daten wurde der Mittelwert und die Standardabweichung berechnet und so der %-Satz an Toxoplasma enthaltenden Zellen bestimmt.
(b) Aktivität in menschlichen Myocardzellen (Giardi-Herzzellen) und menschlichen Zerebralzellen (Flow 3000-Zellen):
Die Zellen wurden in einem MEM-M-Züchtungsmedium, das 10% eines durch Hitze inaktivierten Kälberserums enthielt, in einer Konzentration von 1 x 10&sup6; Zellen/ml suspendiert. Diese Zellsuspension wurde portionsweise zu jeweils 1 ml in Kulturmulden gegossen (Mehrschalenplatte, FR-16-24-TC, hergestellt und verkauft von Limblo Chemical Co., USA), die mit einem runden Abdeckglas mit einem Durchmesser von 15 mm abgedeckt wurden. Es wurde in einem 5%-CO&sub2;-Inkubator über Nacht gezüchtet, wobei eine Zellmonoschicht (eine Monoschicht menschlicher Myocardzellen und eine Monoschicht menschlicher Zerebralzellen) auf dem Abdeckglas erhalten wurde.
Die erhaltene Zellmonoschicht wurde mit MEM-M-Züchtungsmedium gespült und mit 1 x 10&sup5; Tachizoiten des Toxoplasma-Stammes RH, jeweils bezogen auf 1 x 10&sup6; menschliche Myocardzellen und menschliche Gehirnzellen, angeimpft. Nicht in die Zellen eingedrungene, freie Toxoplasma-Organismen wurden durch Waschen mit HBSS eine Stunde nach der Animpfung entfernt.
Ein MEM-M-Züchtungsmedium, das eine Peptidprobe enthält, wurde auf das Abdeckglas in einer Menge von 1 ml, bezogen auf 1 x 10&sup6; Zellen aufgetragen. Danach wurde 48 Stunden lang gezüchtet und anschließend mit May-Grunwald-Giemsa angefärbt, und die Anzahl der Toxoplasma-Organismen in der Zelle gezählt. Per Prozentsatz von Toxoplasma-Organismen enthaltenden Zellen wurde in der gleichen Weise wie oben bezüglich der Mäuse-Makrophagen beschrieben, bestimmt.

(2) Bestimmung der Toxo-GIF-Aktivität:

Die Toxo-GIF-Aktivität, die eine andere nützliche Aktivität zur Bewertung der Aktivität bezüglich der Inhibierung der Vermehrung von Toxoplasma ist, ist als der Anteil der Abnahme von Toxoplasma (Tp) enthaltenden Zellen (in %), der durch die Zugabe einer Peptidprobe bedingt ist, ausgedrückt als Prozentsatz definiert, und wird gemäß der folgenden Formel berechnet:
Toxo-GIF-Aktivität (%) =
(1- Prozentsatz der Tp enthaltenden Zellen in Gegenwart einer Peptidprobe/Prozentsatz an Tp enthaltenden Zellen in Abwesenheit einer Peptidprobe) x 100.
Eine durch Auflösung eines pulverförmigen Peptids in 3 ml 10%-HICS-Tc199-Züchtungsmedium und anschließendes Abfiltrieren und Sterilisieren der resultierenden Lösung mittels eines Membranfilters mit einem Porengröße von 0,46 um erhaltene Probe wird als Peptidprobe verwendet.
In den obigen Messungen (1) und (2) beträgt die Konzentration der Peptidprobe 5,0 mg/ml für die unten beschriebenen Fraktionen von rohem Obioactin und gereinigtem Obioactin und jeweils 0,5 mg/ml bezüglich der erfindungsgemäßen synthetischen Peptide.
Im folgenden wird die Herstellung und Reinigung der Fraktion des rohen Obioactins durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Umkehrphasen-Chromatographie, die zu dem Auffinden des neuen, erfindungsgemäßen, physiologisch aktiven Peptids, von denen man annimmt, daß sie Peptide sind, die die aktiven Stellen des Obioactins bilden, führten, beschrieben.

(I) Herstellung von rohem Obioactin

Unter den Verfahren gemäß der offengelegten japanischen Patentanmeldungen Nr. 57-142922 und 57-144983 und dem Verfahren von Suzuki et al. (Suzuki, N., et al., Zbl. Bakt. Gyg. I. Abt. Orig., Vol. A 256, Seiten 356-366, 1984), die für die Herstellung von rohem Obioactin bekannt waren, wurde das Verfahren von Suzuki et al. gewählt. Gemäß dieses Verfahrens werden Tachiozoiten (1 x 10&sup8;) des Toxoplasma- Stammes RH (erhältlich von der Obihiro Universität für Landwirtschaft und Tiermedizin, Abteilung für Protozoologie und dem Forschungsinstitut für Mikrobiologische Krankheiten der Osaka Universität und dem Nationalen Gesundheitsamt Japan) wurden einem normalen Holstein-Rind (6 bis 8 Monate alt) intravenös injiziert. 5 Wochen nach dieser anfänglichen Infektion wurden die gleichen Tachizoiten (1 x 10&sup8; des Toxoplasma-Stammes RH als Verstärkung (Booster) injiziert. Zwei Wochen nach der Verstärkung wurde TLA (1 ug/kg Körpergewicht; hergestellt durch das Verfahren von Igarashi, I. et al., Zbl. Bakt. Hyg. I. Abt. Orig., Vol. A244, Seiten 374- 382, 1979) intravenös injiziert und 24 Stunden nach der TLA- Injektion Blut gesammelt. Ausgehend von dem Blut wurde ein Serum erhalten und dem Latex-Agglutinations-Test unterworfen. Die Ergebnisse dieses Tests zeigten, daß das Serum einen Anitkörper-Titer von nicht weniger als 1:3200 aufwies. Ausgehend von diesem Serum wurde Obioactin wie folgt hergestellt.
Als Protease wurde Pronase in einer Menge von 0,1 g pro 100 ml Serum zugegeben, dann wurde 12 Stunden lang bei 37ºC inkubiert, und anschließend wurde eine 10 N wäßrige Natriumhydroxidlösung in einer Menge von 10 ml pro 100 ml Serum tropfenweise zugegeben. Alkali-Hydrolyse wurde 1 Stunde lang bei 100ºC durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 4ºC abgekühlt und dessen pH-Wert durch tropfenweise Zugabe von 10 N Chlorwasserstoffsäure auf 7,0 ± 0,1 eingestellt.
Das resultierende, hydrolysierte Serum wurde bei 10.000 U/min (10.700 x G) 20 Minuten lang zentrifugiert, und die Reste wurden entfernt. Das resultierende Serum wurde einer Gel- Filtration durch Sephacryl S-200 (Handelsname eines von Pharmacia Fine Chemicals Co., Schweden hergestellten und verkauften Gels) und anschließend durch Toyo-Pearl HW-40 (Handelsname eines von Tosoh Co., Japan hergestellten und verkauften Gels) unterworfen, wobei eine Fraktion mit Toxo- GIF-Aktivität erhalten wurde. Diese Fraktion wurde lyophilisiert, wobei rohes Obioactin erhalten wurde.

(II) Reinigung des Obioactins

(1) Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer DEAM-5PW-Säule.

Das so erhaltene Obioactin wurde mittels einer DEAM-5PW-Säule (hergestellt und verkauft von Tosoh Co., Japan) mit einem Innendurchmesser von 21,5 mm und einer Länge von 15 cm mittels Ionenaustausch-Chromatographie mit einem NaCl-Konzentrationsgradienten, wobei ein NaCl-Konzentrationsgradient von 0 M bis 1 M in 0,02 M Ammoniumacetat als basische Lösung hergestellt wurde, fraktioniert. Das erhaltene Chromatogramm ist in Figur 1 gezeigt. Jede der Fraktionen wurde lyophilisiert, durch Gelfiltration mittels Sephadex G-15 (Handelsname eines von Pharmacia Fine Chemicals Co., Schweden hergestellten und verkauften Gels) entsalzt und nochmals lyophilisiert. Ein Teil des resultierenden Pulvers einer jeden Fraktion wurde in einer Konzentration von 5 mg/ml im 10 %-HICS-Tc199- Kulturmedium gelöst und deren Toxo-GIF-Aktivität unter Verwendung peritonealer Maus-Makrophagen gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Aktivitäten der DEAE-5PW-Fraktionen bezüglich der Inhibierung der Vermehrung von Toxoplasma Prozentsatz der Toxoplasma (Tp) enthaltenden Zellen (%) Probe Toxo-GIF Aktivität (%) Cytotoxizität Kontrolle Fraktion (*: Mittelwert ± Standardabweichung)
Wie in Tabelle 1 gezeigt, beträgt die Toxo-GIF-Aktivität - 38,2 % für die erste, 10,8 % für die zweite, 23,1 % für die dritte und 16,1 % für die vierte Fraktion. Angesichts dieser Ergebnisse wurde die dritte Fraktion als die aktivste Fraktion gesammelt und gemäß dem folgenden Reinigungsverfahren gereinigt.
(2) ODS-120T Umkehrphasen-Chromatograpie
Die oben erhaltene dritte Fraktion wurde einer Umkehrphasen- Chromatographie unter Verwendung einer ODS-120T-Säule (hergestellt und verkauft von Tosoh Co., Japan) mit einem Konzentrationgradienten von 10 % bis 100 % Acetonitril in einer 0,1 % Trifluoressigsäurelösung unterworfen, wobei ein in Figur 2 gezeigtes Chromatogramm erhalten wurde. Die Toxo- GIF-Aktivität einer jeden Fraktion wurde gemessen, und die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Aktivitäten der ODS-120T-Fraktionen bezüglich der Inhibierung der Vermehrung von Toxoplasma Prozentsatz der Toxoplasma (Tp) enthaltenden Zellen (%) Probe Toxo-GIF Aktivität (%) Cytotoxizität Kontrolle Fraktion (*: Mittelwert ± Standardabweichung)
Wie in Tabelle 2 gezeigt, betragen die Toxoaktivitäten 97,6 % für Fraktion 3-1, 96,8 % für Fraktion 3-2, 97,3 % für Fraktion 3-3 und 99,2 % für Fraktion 3-4.
Wie vorstehend erwähnt, haben die Erfinder bereits früher die Aminosäuresequenz der Fraktion 3-4 untersucht und ein physiologisch aktives Peptid entwickelt (siehe US-Patent No. 4,897,463).
Bei den anschließenden Untersuchungen zu der vorliegenden Erfindung analysierten die Erfinder die Aminosäuresequenz der Fraktion 3-3.

(III) Analyse der Aminosäuresequenz der Fraktion 3-3

Die gereinigt Obioactin-Fraktion [ODS-120T-Fraktion 3-3, 800 pMol] wurde zusammen mit 0,2 ml einer Chlorwasserstoffsäure-Lösung (6 N) mit 0,1 % Thioglycol, die einen konstanten Siedepunkt aufwies, in eine Röhrchen gegeben, und das Röhrchen wurde verschloßen. Der Inhalt des Röhrchens wurde bei 110ºC 24 Stunden lang erwärmt, wobei die Obioactin- Fraktion hydrolysiert wurde, Die Aminosäurezusammensetzung des resultierenden Hydrolysats wurde durch das OPA-Verfahren unter Verwendung eines Hitachi Model 83-Amid-Säure- Analysators analysiert (siehe Benson, R.J., et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA., Vol. 72, Seiten 619-622, 1975; und Bohlen, P., Verfahren in der Enzymologie, Vol. 91, Seiten 17- 23, 1984).
Die Aminosäuresequenz wurde durch Edman-Abbau unter Verwendung einer Protein-Sequenziervorrichtung (hergestellt und verkauft von Applied Biosystems, USA) analysiert. Die gesammelten Edman-Zyklen wurden in Derivate von 3-Phenyl-2- thiohydantoin (PTH) umgewandelt, und die PTH-Aminosäuren wurden durch Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie identifiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Aminosäurezusammensetzung (Einheit: pMol) des gereinigten Obioactin (800 pMol) (ODS-120T-Fraktion-3-3) Aminosäure
(Die Zahlen nach der ersten Dezimalen wurden vernachlässigt)
Wie in obiger Tabelle 3 gezeigt, schließen die Aminosäuren, die bezüglich der Fraktion 3-3 als, vom N-Terminus gesehen, erster Aminosäure-Rest der Aminosäuresequenz gefunden wurden, Alanin (Ala, 140 pMol), Valin (Val, 55 pMol), Glutaminsäure (Glu, 62 pMol), Glycin (Gly, 90 pMol) und Prolin (Pro, 100 pMol) ; die als zweiter Aminosäurerest gefunden wurden, Val (112 pMol), Glu (100 pMol) und Ala (70 pMol); die als dritter Aminosäurerest gefunden wurden, Val (103 pMol) und Glu (100 pMol), als vierter, fünfter und sechster Aminosäurerest gefunden wurden, jeweils Pro (101 pMol), Val (100 pMol) und Val (112 pMol); und die als siebter Aminosäurerest gefunden wurden, Tyrosin (Tyr, 51 pMol) und Pro (10 pMol) ein.
Die obigen Ergebnisse geben deutliche Hinweise dafür, daß dieses gereinigte Obioactin aus einem Gemisch von mindestens 5 Peptiden, die jeweils Ala, Pro, Gly, und Val als ersten Aminosäurerest aufweisen, zusammengesetzt ist.
Ferner kann die oben erhaltene, gereinigte Obioactin-Fraktion 3-3 trotz wiederholter Behandlung durch Chromatographie nicht weiter gereinigt werden. Es wird angenommen, daß der Grund dafür darin liegt, daß die Fraktion 3-3 ein Gemisch ähnlicher Peptide mit heterologen N-Termini ist.
Aus obigen Resultaten wurde lediglich geschlossen, daß die Peptide, die die Fraktion 3-3 des gereinigten Obioactins ausmachen, an den jeweiligen N-Termini Ala, Pro, Gly oder Glu und zwei bis sechs unter Glu, Ala, Pro und Val ausgewählte Moleküle als die darauf folgenden Aminosäurereste aufweisen. Aus diesem Grund ist es nicht möglich, die Aminosäuresequenz der Peptide, die die aktiven Stellen der Obioactin-Fraktion 3-3 bilden, direkt zu bestimmen.
In Anbetracht dieser Tatsache haben die Erfinder eine außerordentlich große Anzahl Peptide synthetisiert, die den möglichen Aminosäuresequenzen der Obioactin-Fraktion 3-3 entsprechen, und haben die Aktivität dieser Peptide bezüglich der Inhibierung der Vermehrung von Toxoplasma bestimmt. Als Ergebnis haben die Erfinder ein im wesentlichen reines, physiologisch aktives Peptid erfolgreich entwickelt, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus durch die folgenden Formeln (2) bis (6) dargestellten Aminosäuresequenzen:
Pro-Val-Val (2),
Glu-Pro-Val-Val (3),
Glu-Glu-Pro-Val-Val (4),
Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val (5), und
Gly-Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val (6).
Ferner haben die Erfinder weitere Untersuchungen an der in Figur 2 gezeigten Fraktion 3-4 durchgeführt, um ein neues Peptid zu entwickeln, das die Aktivität zur Inhibierung von Toxoplasma und eine einfachere Aminosäurestruktur aufweist. Als Resultat wurde überraschenderweise gefunden, daß ein Peptid mit einer lediglich aus zwei Aminosäuren, d.h., Gly und Glu, zusammengesetzten Aminosäuresequenz immunoregulatorische Aktivitäten aufweist, die mit denen der obigen Peptide der Formeln (2) bis (6) vergleichbar sind. Dieses neue Peptid besitzt eine durch die Formel Gly-Glu (1) dargestellte Aminosäuresequenz.
Die Erfinder haben ebenfalls gefunden, daß unter den Peptiden, die jeweils die Aminosäuresequenzen der Formeln (1) bis (6) enthalten, diejenigen, die die Aminosäuresequenzen der Formeln (5), (6) und (1) enthalten, höhere Toxo-GIF- Aktivitäten als die anderen Peptide aufweisen. Die Erfinder haben die Peptide, die die Aminosäuresequenzen der Formeln (5), (6) und (1) enthalten, als "Obio-2", "Obio-3" und "Obio- 4" bezeichnet.
Überraschenderweise haben die Erfinder ferner gefunden, daß eine physiologisch aktive Peptid-Zusammensetzung, die mindestens zwei Peptide enthält, die aus der aus Peptiden mit den Aminosäuresequenzen der Formel (1) bis (6) bestehenden Gruppe ausgewählt werden, und eine physiologisch aktive Peptid-Zusammensetzung, die mindestens ein Peptid, das unter diesen Peptiden (1) bis (6) ausgewählt wird, und mindestens ein zusätzliches Peptid, das unter den in der US-Patentschrift Nr. 4 897 463 beschriebenen Peptiden ausgewählt wird, d.h. Peptiden, die die durch die Formeln (7) bis (10) dargestellten Aminosäuresequenzen, wie oben beschrieben, enthält, synergistisch verbesserte, außerordentlich hohe Toxo-GIF-Aktivitäten aufweisen.
Bezüglich der oben genannten, physiologisch aktiven Peptid- Zusammensetzungen, sind die Anteile der individuellen Peptid- Komponenten nicht besonders begrenzt. Sie können je nach Verwendungszweck und der gewünschten Wirkung variiert werden. Im allgemeinen werden jedoch die individuellen Peptid-Komponenten vorzugsweise in gleichen Mengen oder in Mengen, die nicht geringer sind als die Hälfte der der gleichen Menge entsprechenden Menge, verwendet.
Das erfindungsgemäße, physiologisch aktive Peptid kann durch herkömmliche Verfahren zur Peptidsynthese hergestellt werden (siehe beispielsweise. Kent, S.B, et al. "Peptides 1984", Seite 185, Herausgeber: U. Ragnarsen, veröffentlicht von Almquist und Weksell, Stockholm, Schweden 1984).
Ferner kann, falls dies erwünscht ist, das erfindungsgemäße, physiologisch aktive Peptid durch eine rekombinante DNA- Technik unter Verwendung einer DNA-Kodierung für jedes Peptid in Kombination mit einem geeigneten Wirtsvektor-System hergestellt werden.
Auf diese Arten kann das erfindungsgemäße, physiologisch aktive Peptid in einer im wesentlichen reinen Form erhalten werden.
Wie oben erwähnt, besitzt das erfindungsgemäße, physiologisch aktive Peptid nicht nur immunoregulatorische Aktivitäten, d.h., Aktivitäten bezüglich der Inhibierung der Vermehrung von verschiedenen Typen von Mikroorganismen, wie z. B. Protozoen, Bakterien und Viren und der Unterdrückung von Tumoren, sondern weist ebenfalls niedrige Toxizität auf. Deshalb ist das vorliegenden Peptid als aktiver Bestandteil einer Arzneimittel-Zusammensetzung für Menschen und andere Säuger gut verwendbar. In diesem Zusammenhang ist zu beachten, daß im Experiment gefunden wurde, daß bei der Verabreichung des erfindungsgemäßen, physiologisch aktiven Peptids in Kombination mit einem herkömmlichen Antitumor- Arzneimittel, beispielsweise Futraful (FT207) (hergestellt und verkauft durch Taiho Pharmaceutical Co., Ltd., Japan) an Mäuse deren Überlebenszeitraum verlängert werden kann.
Bei der Verwendung des erfindungsgemäßen, physiologisch aktiven Peptids zur Behandlung von menschlichen und tierischen Patienten kann das erfindungsgemäße, physiologisch aktive Peptid in Form einer Arzneimittelzusammensetzung verwendet werden, die eine Menge des physiologisch aktiven Peptids, die antiprotozoen, antibakteriell, antiviral oder antitumoral wirksam ist, und mindestens einen pharmazeutisch geeigneten Träger, ein pharmazeutisch geeignetes Verdünnungsmittel oder pharmazeutisch geeignetes Vehikel enthält, verwendet werden. Falls erwünscht kann diese Arzneimittel- Zusammensetzung herkömmliche Additive, wie z. B. einen Stabilisator, einen Löslichkeitsverbesserer, einen Puffer, ein Beruhigungsmittel, ein Konservierungsmittel und ein Färbemittel enthalten. Ferner können wahlweise andere Arzneimittel dem erfindungsgemäßen Peptid beigemischt werden.
Das erfindungsgemäße Peptid kann vorzugsweise in Form einer Injektion (z. B. einer flüssigen Zubereitung, einer Suspension und einer Emulsion) eingesetzt werden, jedoch ist die Verwendungsform des Peptids nicht auf Injektion beschränkt. Als Injekticn kann die erfindungsgemäße Arzneimittel-Zusammensetzung in herkömmlicher Weise verabreicht werden. D.h., die Injektion kann entweder alleine oder in Kombination mit einer normalerweise als Auffüllmittel verwendeten Flüssigkeit, wie z. B. Glucose, einer Aminosäure und ähnlichen intravenös verabreicht werden. Falls erwünscht, kann die Injektion intramuskulär, subcutan, intracutan oder intraperitoneal verabreicht werden. Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Peptid auch eine andere Form als die der Injektion, beispielsweise in einer Form, die für orale Verabreichung geeignet ist, vorliegen.
Die Menge des in der erfindungsgemäßen Arzneimittel- Zusammensetzung verwendeten physiologisch aktiven Peptids und die Dosierung der erfindungsgemäßen Arzneimittel-Zusammensetzung kann je nach Art der Verabreichung, der Dosierungsform, dem Verwendungszweck, den Bedingungen des Patienten und ähnlichen in geeigneter Weise gewählt werden. Beispielsweise ist es bei einer 1 bis 80 Gew.-% aktiver Bestandteil enthaltenden Injektion im allgemeinen bevorzugt, die Injektion so zu verabreichen, daß die Menge des dem Patienten verabreichten, aktiven Bestandteils im Bereich von 0,001 bis mg/kg/Tag liegt. Die tägliche Dosis wird nicht notwendigerweise auf einmal verabreicht, sondern kann auch portionsweise in drei bis vier Dosierungen verabreicht werden. In den Fällen einer anderen Dosierung als der Injektion, kann diese unter Verwendung der obigen allgemeinen Beschreibung der Injektionsdosis als Kriterium in geeigneter Weise ausgewählt werden.

Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die vorliegende Erfindung wird nun detaillierter unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, Bezugsbeispiele und Anwendungsbeispiele, die keine Einschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung darstellen, erläutert.

Beispiel 1

(Synthese und Reinigung eines Peptids, das eine durch Formel (5) (Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val) dargestellte Aminosäuresequenz enthält)
(1) Festphasen-Synthese des Peptids durch das tert.-Boc(tert.-Butoxycarbonylgruppen)-Verfahren.
Es wurden die folgenden Vorrichtungen und Reagenzien verwendet.
Vorrichtung: Vorrichtung zur Peptidsynthese, Modell 9600 (hergestellt und verkauft von Milligen/Biosearch Co., Ltd., USA)
Reagenzien: Nach dem Eingeben der Aminosäuresequenz in die Vorrichtung und der Simulation der Synthese des Peptids stellt die Vorrichtung Anweisungen bezüglich der Arten und Mengen der notwendigen Reagenzien bereit.
Harz: Boc-Val-Harz
Aminosäure:
Boc-Ala
Boc-Glu (OBzl)
Boc-Pro
Boc-Val
Hilfsreagenzien:
DCM (Dichlormethan)
DMF (Dimethylformamid)
DCM/DMF = 1/1
Schutzmittel:
I-Acetylimidazol in DMF
Basische Waschlösung:
DIPEA (Diisopropylethylamin) in DCM
entschützendes Reagenz
45,0% TFA (Trifluoressigsäure)
2.5% Anisol
52,5% DCM
Aktivierungsmittel:
DIPCDI (Diisopropylcarbodiimid) in DCM.
Die oben genannten notwendigen Reagenzien (die allesamt von Watanabe Chemical Co., Ltd., Japan hergestellte Reagenzien für die Peptidsynthese sind) wurden in mit der Vorrichtung verbundene Flaschen gegeben und anschließend die Synthese gestartet.

(Syntheseverfahren)

Die Synthese schreitet ausgehend vom C-Terminus zum N- Terminus voran. Die Schutzgruppe des N-Terminus des in das Reaktionsgefäß gegebenen Boc-Val-Harzes (der Aminosäure, die den C-Terminus der Sequenz bildet) wurde durch eine Entschützungsreaktion entfernt. Anschließend wurde das resultierende Harz unter Argongas zusammen mit einer Aminosäure (Boc-Val) als zweitem Aminosäurerest, die ausreichend mittels eines Aktivierungsmittels aktiviert worden war, gerührt, wodurch das Ankoppeln derselben bewirkt wurde. Die Kupplungsreaktion ließ man fortschreiten, bis eine zufriedenstellende Bindung zwischen dem ersten und zweiten Aminosäurerest auf der Seite des C-Terminus erreicht wurde (die für diesen Vorgang notwendige Zeit kann mittels der oben genannten Synthesesimulation berechnet werden). Anschließend wurde die Schutzgruppe der Aminosäure für den zweiten Aminosäurerest einer Entschützungsreaktion unterworfen.
Anschließend wurde der Anteil des ersten Aminosäurerests, der keine Kupplungsreaktion eingegangen war, (d.h. der erste Aminosäurerest der keinen daran gebundenen zweiten Rest aufwies) einer Schutzreaktion unterworfen. Bedingt durch dieses Schützen kann verhindert werden, daß dieser, nicht an den zweiten Aminosäurerest gebundene Anteil in der folgenden Umsetzung innerhalb der Synthese teilnimmt, was dazu führt, daß das endgültige, synthetische Peptid vorteilhafterweise keine unerwünschten Peptid-Erzeugnisse, in denen ein oder mehrere Reste fehlen, enthält.
Anschließend wurde im wesentlichen die gleiche Prozedur wie oben erwähnt, d.h. entschützen, aktivieren, kuppeln und schützen automatisch wiederholt, wobei das gewünschte synthetische Peptid erhalten wurde.
(2) Abtrennen des synthetischen Peptids von der Festphase (Harz).
Bei der Beendigung der Synthese war der C-Terminus der Peptidkette an das Harz gebunden. Zusätzlich besaß die Peptidkette eine Schutzgruppe in ihrer Seitenkette. Um das Peptid verwenden zu können, war es deshalb nötig, das synthetische Peptid vom Harz abzutrennen und die an dessen Seitenkette gebundene Schutzgruppe zu entfernen, wobei die Seitenkette entschützt wurde.
Bei dem t-Boc-Verfahren wird im allgemeinen HF (Chlorwasserstoff) zum Abtrennen und Entschützen verwendet. Anschaulich ausgedrückt wurde eine gleiche Menge Anisol dem hergestellten synthetischen Peptid (das an das Harz gebunden ist) zugegeben und das resultierende Gemisch bei 0ºC in HF eine Stunde lang unter Verwendung einer Abtrenn-Vorrichtung umgesetzt. Als Ergebnis wurde das synthetische Peptid vom Harz abgetrennt.

(3) Extraktion des Peptids

Nach der Beendigung der Abtrennung wurde HF entfernt, TFA zugegeben und das resultierende Gemisch durch einen Glasfilter (3G3) in einen gekühlten Äther enthaltenden Kolben filtriert. Das Harz blieb nach der Filtration auf dem Filter.
Der im Äther produzierte weiße Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und der Überstand verworfen. Dem abgetrennten Niederschlag wurde weiterer gekühlter Äther zugegeben und anschließend gerührt und zentrifugiert. Diese Arbeitsschritte wurden zwei oder drei Mal wiederholt, wobei unpolare, mit dem Peptid vermischte Verunreinigungen entfernt wurden. Der resultierende Niederschlag wurde gesammelt und getrocknet.

(4) Reinigung durch Chromatographie

Das so abgetrennte und entschützte rohe Peptid wurde unter Verwendung der folgenden Säule, Eluationsmittel und Bedingungen analysiert und fraktioniert:
Säule ODS
Umkehrphasensäule (TSK-Gel ODS-BOTm, Tosoh Co., Japan)
für die Analyse 4,8 x 15 cm
für die Fraktionierung 21,5 x 30 cm
Elutionsmittel A: reines Wasser, das 0,1% TFA enthielt
B: Acetonitril, das 0,1% TFA enthielt
A:B 95,5 - 30:70 linearer Gradient
bei der Analyse 30 Minuten
bei der Fraktionierung 90 - 120 Minuten
Detektion durch UV mit einer Wellenlänge von 230 nm.
Das gewünschte Peptid kann als deutlicher Hauptpeak (die ungefähre Retentionszeit kann durch Berücksichtigung der Art der Aminosäure-Bestandteile, d.h., der hydrophoben Eigenschaften derselben, des Ionisierungsgrades in 0,1% TFA (ungefähr pH-Wert 2,0) und ähnliches geschätzt werden) bestätigt werden. Dennoch wird empfohlen die den anderen Peaks entsprechenden Fraktionen aus Sicherheitsgründen ebenfalls zurückzubehalten. Falls es aus irgendeinem Grund nicht möglich ist, irgendeinen einzelnen Hauptpeak zu identifizieren, wird eine nochmalige Analyse, wie z. B. Aminosäureanalyse, Analyse unter Verwendung einer Protein-Sequenziervorrichtung oder manueller Edman-Abbau an dem gereinigten Peptid durchgeführt
Das synthetische Peptid der Formel (5) wurde wie oben beschrieben erhalten und dessen Aminosäuresequenz bestimmt.

Beispiele 2 bis 5

Jedes der durch die Formeln (1), (2), (3), (4) und (6) dargestellten Peptide wurde einzeln in im wesentlichen der gleichen Weise wie in Beispiel 1 synthetisiert, außer daß die Aminosäure-Rohsubstanzen entsprechend dem jeweiligen Peptid ausgetauscht wurden, und es wurde deren Aminosäure-Struktur bestätigt.

Bezugsbeispiel 1

Das Peptid Obio-1 wurde in im wesentlichen gleicher Weise wie in Beispiel synthetisiert, außer daß die Aminosäure-Rohsubstanzen entsprechend dem durch Formel (7) dargestellten Peptid Obio-1 ausgewechselt wurden, und es wurde dessen Aminosäure-Struktur bestätigt.

Anwendungsbeispiel

Die Aktivitäten der erfindungsgemäßen, physiologisch aktiven Peptide (im folgenden öfter als "synthetische Peptide" bezeichnet) wurden bestimmt.

(A) Toxo-GIF-Aktivität in Mäuse-Makrophagen

Die synthetischen Peptide wurden einzeln in einem Züchtungsmedium in einer Menge gelöst, daß die Konzentration derselben 0,7 mM betrug. Unter Verwendung peritonealer Mäuse-Makrophagen wurden die Toxo-GIF-Aktivitäten der Peptide bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 Aktivität der synthetischen Peptide bezüglich der Inhibierung der Vermehrung von Toxoplasma. Prozentsatz der Toxoplasma (Tp) enthaltenden Zellen (%) Toxo-GIF Cytotoxizität Notiz (Negativkontrolle) (bekanntes Peptid) (Positivkontrolle) Natives Obioactin Synthetisches Peptid Für die Aminosäuren wurden folgende Abkürzungen verwendet: E: Glu, G: Gly, A: Ala, D: Asp, P: Pro und V: Val
Wie in Tabelle 4 gezeigt, betrugen die Toxo-GIF-Aktivitäten der synthetischen Peptide 47,6% für Peptid Nr. 1 (Obio-4), 30,2% für Peptid Nr. 2, 27,4% für Peptid Nr. 3, 30,2% für Peptid Nr. 4, 61,6% für Peptid Nr. 5 (Obio-2) und 51,7% für Peptid Nr. 6 (Obio-3). Keines der getesteten Peptide zeigte Zytotoxizität bei der oben genannten, im Test verwendeten Konzentration (0,7 mM).
Peptid Nr. 1 (Obio-4), Peptid Nr. 5 (Obio-2) und Peptid Nr. 6 (Obio-3) wiesen hohe Aktivitäten auf. Die Molekulargewichte der Peptide Nr. 5 (Obio-2) und 6 (Obio-3) betrugen jeweils ungefähr 642 und ungefähr 699. Ferner kann jedes der synthetischen Peptide Nr. 2, 3 und 4 als Arzneimittel mit der Fähigkeit zur Inhibierung der Vermehrung von Toxoplasma und zur Aktivierung des Immunsystems verwendet werden.
Rohes Obioactin weist eine nennenswerte Toxo-GIF-Aktivität bei einer Konzentration von ungefähr 5 mg/ml auf. Im Gegensatz dazu wurde selbst bei einer Konzentration von 0,25 mg/ml eine ausreichende Toxo-GIF-Aktivität des erfindungsgemäßen synthetischen Peptids, beispielsweise Peptid Nr. 5 (Obio-2) festgestellt. Ausgehend von dem obigen schätzt man, daß die Aktivität des erfindungsgemäßen, synthetischen Peptids, bezogen auf das Gewicht, dem 10- bis 20-fachen und, bezogen auf die Molzahl, dem 40- bis 140-fachen der Aktivität von rohem Obioactin entspricht.

(B) Toxo-GIF-Aktivitäten in Mäuse-Makrophagen, Hundemonozyten, menschlichen Myocardialzellen und menschlichen Zerebralzellen

Die Wirkung des Peptids Nr. 5 (Obio-2) wurde bestimmt. Wie in Tabelle 5 gezeigt, wurden signifikante Toxo-GIF-Aktivitäten in jeder der Zellen beobachtet. Von daher wurde bestätigt, daß das erfindungsgemäße, synthetische Peptid keine Artenspezifizität wie das rohe Obioactin aufweist. Tabelle 5 Aktivität des synthetischen Peptids Nr. 5 (Ala-Glu-Glu-Pro- Val-Val; Obio-2) bezüglich der Inhibierung der Vermehrung von Toxoplasma in Mäusen, Hunden und menschlichen Zellen. Prozentsatz der Toxoplasma (Tp) enthaltenden Zellen (%) Obio-2 Probe Zelle Toxo-GIF Cytotoxizität Mäusemakrophage Hundemonozytzelle menschliche Myocardzelle menschliche Zerebralzelle

(C) Wirkung der Injektion des neuen synthetischen Peptids auf eine Maus, die einen durch Methylcholanthren induzierten Tumor (MC-Tumor) trägt.

Methylcholanthren induzierte Tumorzellen, die aus einer MC- induzierten Tumorschwellung einer BALB/c-Maus ausgeschnitten worden waren, und darin injiziert 0,5 mg von 20-Methylcholanthren (hergestellt und verkauft von Wako Pure Chemical Industries Ltd.) wurden in einem RPMI-1640-Züchtungsmedium suspendiert, wobei eine Zellsuspension mit 2 x 10&sup7; Zellen/ml erhalten wurde. 0,025 ml (5 x 10&sup5; MC-Tumorzellen/Maus) der Zellsuspension wurden intramuskulär unter die Haut in den Rücken einer sechs Wochen alten männlichen Maus injiziert um diese mit MC-Tumorzellen zu injizieren, wobei eine einen Tumor tragende Maus erhalten wurde.
Sowohl Obio-2 als auch Obio-3 wurden jede Woche nach der Injektion der obigen MC-Tumorzellen-Suspension intramuskulär in einer Menge von 30 ug/Maus unter die Haus in den Rücken derselben injiziert, um die Inhibitorwirkung derselben auf die Vermehrung des Tumors zu bestimmen. Fünf Tumor tragende Mäuse wurden für jeden Test verwendet und der Mittelwert genommen. Die Ergebnisse, zusammen mit den Kontrolldaten von mit Ohio nicht-induzierten Mäusen sind in Figur 3 gezeigt.
Wie in Figur 3 gezeigt, beträgt die mittlere gemessene Tumorfläche 28 Tage nach der Inoculation mit Tumorzellen 432 ± 10,5 mm² für die erste Gruppe (Kontrolle), wobei physiologische Salzlösung als Kontrolle injiziert wurde, 208 ± 40,1 mm² für die zweite Gruppe, in die Obio-2 injiziert wurde und 219 ± 40,1 mm² für die dritte Gruppe, in die Obio-3 injiziert wurde. Dies zeigt, daß die Vermehrung der Tumore in bemerkenswerter Weise in den mit Obio-2 und Obio-3 injizierten Gruppen, verglichen mit der mit diesen nicht-injizierten Kontrollgruppe, inhibiert wurde.

(D) Synergieeffekt der Verwendung von Peptiden in Kombination

Es wurde eine Untersuchung bezüglich der synergistischen Wirkung der Verwendung der synthetischen Peptide Obio-2 und Obio-3, die bereits hohe Toxo-GIF-Aktivitäten zeigten, in Kombination und ihre jeweilige Verwendung in Kombination mit dem Peptid Obio-1 durchgeführt. Wie in Tabelle 6 gezeigt, wird die Toxo-GIF-Aktivität durch die Verwendung der Peptide in Kombination synergistisch vergrößert. Tabelle 6 Anstieg der Toxo-GIF-Aktivität durch die Verwendung individueller synthetischer Peptide (Obio-2 und 3) in Kombination und deren jeweilige Verwendung in Kombination mit Peptid (Obio-1). Prozentsatz der Toxoplasma (Tp) enthaltenden Zellen (%) Probe Toxo-GIF Cytotoxizität Kontrolle Natives Obioactin bekanntes Peptid

(E) Veränderung der Anzahl mononuklearer Zellen in der Milz einer MC-Tumor tragenden Maus

Wie in der unten stehenden Tabelle 7 gezeigt, verringerte sich die Zahl der mononuklearen Zellen in der Milz der Tumor tragenden Mäuse als Kontrolle, die weder mit Obio-2 noch mit Obio-3 injiziert wurden auf 10% der Anzahl bei normalen Mäusen. Andererseits verringerte sich die Zahl der mononuklearen Zellen in der Milz von Tumor tragenden Mäusen, die mit Obio-2 und Obio-3 injiziert wurden, nur leicht, und es wurde eine Anzahl beibehalten, die 65 bis 70% der von normalen Mäusen entsprach. Die histopatologischen Befunde dieser Milzen zeigten keine signifikante Änderung in den Milz-Follikeln sowohl der Tumor tragenden Mäusegruppen, die mit Obio-2 und Obio-3 injiziert wurden und den Tumor tragenden Mäusegruppen, die mit keinem der beiden injiziert wurden. Trotzdem fiel auf, daß sich bei den Mäusegruppen, die mit Obio-2 und Obio-3 injiziert wurden, kleine mononukleare Zellen (kleine Lymphozyten) und große Monozyten im roten Inneren der Milz im Inneren ansammelten, insbesondere um die Gefäße herum, während die Mäuse-Kontrollgruppe, die nicht mit dem Peptid injiziert wurde, lediglich kleine Lymphozyten im Inneren aufwies. Ferner wurde große blutende Kolonien an den Tumor-Gewebeteilen der weder mit Obio-2 noch mit Obio-3 injizierten Mäuse beobachtet, während keine blutenden Kolonien in den mit Obio-2 und Obio-3 injizierten Mäusen beobachtet wurden.
Die obige Injektion einer sehr geringen Menge (39 ug, einmal pro Woche) der jeweiligen synthetischen Peptide Obio-2 und Obio-3 in Tumor tragende Mäuse zeigte, daß diese synthetischen Peptide Substanzen sind, die in vivo stark auf die mononuklearen Zellen in der Milz wirken, insbesondere auf die großen runden Zellen (monozytäre Makrophagen). Tabelle 7 Wirkung der Injizierung von synthetischen Peptiden auf die Anzahl mononuklearer Zellen der Milz in MC-Tumor tragenden Mäusen. Organ Maus Zahl der mononuklearen Zellen pro Maus Verhältnis der Tumor tragenden Zellen zu normalen Zellen Milz Normale Maus Tumor tragende Maus 1. Injektion physiologischer Kochsalzlösung 2. Injektion von Obio-2 3. Injektion von Obio-3

Claims

1. Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch eine Formel, die aus der aus den Formeln (3) bis (6) bestehenden Gruppe ausgewählt ist, dargestellt wird:

Glu-Pro-Val-Val (3),

Glu-Glu-Pro-Val-Val (4),

Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val (5), und

Gly-Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val (6).

2. Peptid-Zusammensetzung, die mindestens zwei Peptide enthält, die aus der aus Peptiden mit den Aminosäuresequenzen der Formeln (1) bis (6) bestehenden Gruppe ausgewählt sind:

Gly-Glu (1),

Pro-Val-Val (2),

Glu-Pro-Val-Val (3),

Glu-Glu-Pro-Val-Val (4),

Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val (5), und

Gly-Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val (6).

3. Peptid-Zusammensetzung, die mindestens ein Peptid, das aus der aus Peptiden mit den Aminosäuresequenzen der Formeln (1) bis (6) bestehenden Gruppe ausgewählt ist:

Gly-Glu (1),

Pro-Val-Val (2),

Glu-Pro-Val-Val (3),

Glu-Glu-Pro-Val-Val (4),

Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val (5), und

Gly-Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val (6):

und mindestens ein Peptid, das aus der aus Peptiden mit den Aminosäuresequenzen der Formeln (7) bis (10) bestehenden Gruppe ausgewählt ist, enthält:

Gly-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu (7),

Glu-Glu-Glu-Glu-Glu (8),

Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (9), und

Ala-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu (10).

4. Arzneimittelzusammensetzung, die ein Peptid, das durch eine Formel dargestellt wird, die aus der aus den Formeln (2) bis (6) bestehenden Gruppe ausgewählt ist,

Pro-Val-Val (2),

Glu-Pro-Val-Val (3),

Glu-Glu-Pro-Val-Val (4),

Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val (5), und

Gly-Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val (6),

und mindestens einen pharmazeutisch geeigneten Träger, ein pharmazeutisch geeignetes Verdünnungsmittel oder ein pharmazeutisch geeignetes Vehikel enthält.

5. Arzneimittelzusammensetzung, die eine Peptid-Zusammensetzung gemäß Anspruch 2 oder 3 und mindestens einen pharmazeutisch geeigneten Träger, ein pharmazeutisch geeignetes Verdünnungsmittel oder ein pharmazeutisch geeignetes Vehikel enthält.

6. Verwendung eines Peptids, das durch eine Formel dargestellt wird, die aus der aus den Formeln (2) bis (6) bestehenden Gruppe ausgewählt ist,

Pro-Val-Val (2),

Glu-Pro-Val-Val (3),

Glu-Glu-Pro-Val-Val (4),

Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val (5), und

Gly-Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val (6):

zur Herstellung eines Arzneimittels mit immunoregulatorischer Aktivität.

7. Verwendung einer Peptid-Zusammensetzung gemäß Anspruch 2 oder 3 zur Herstellung eines Arzneimittels mit immunoregulatorischer Aktivität.

8. Verwendung gemäß Anspruch 6 oder 7, wobei das Arzneimittel eine protozoenvernichtende- oder Antitumor-Aktivität aufweist.