DE2624814A1 - Verfahren zum nachweis von antikoerpern in koerperfluessigkeiten mit hilfe bekannter antigene oder zur bestimmung von antigenen mit hilfe bekannter antikoerper aus koerperfluessigkeiten - Google Patents

Verfahren zum nachweis von antikoerpern in koerperfluessigkeiten mit hilfe bekannter antigene oder zur bestimmung von antigenen mit hilfe bekannter antikoerper aus koerperfluessigkeiten

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Description

"Verfahren zum Nachweis von Antikörpern in Körperflüssigkeiten mit Hilfe bekannter Antigene oder zur Bestimmung von Antigenen mit Hilfe bekannter Antikörper aus Körperflüssigkeiten"
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern in Körperflüssigkeiten mit Hilfe bekannter Antigene oder zur Bestimmung von Antigenen mit Hilfe bekannter Antikörper
aus Körperflüssigkeiten, wobei eine Probe der Körperflüssigkeit auf ein Antigene enthaltendes Adsorptionsmittel aufgetragen wird, wonach die mit den Antigenen gekuppelten spezifischen Antikörper mit Hilfe markierter Antikörper bestimmt
werden.
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Der Nachweis von spezifischen Antikörpern in Körperflüssigkeiten durch Verfahren der oben angegebenen Art ist bereits bekannt. In der DK-PS 120 109 wird beispielsweise ein Verfahren zur Herstellung in Wasser nicht löslicher, chemisch oder biologisch aktiver Derivate von Peptiden vorgeschlagen, die durch Brücken mit konvalenten Bindungen mit den Molekülketten in Wasser unlöslicher polymerer Stoffe gekuppelt werden. Bei dem aus dieser Patentschrift bekannten Verfahren wird ein Halogenzyan, beispielsweise Bromzyan, zur Bildung der Brücken verwendet. Ein polymerer Stoff, beispielsweise Dextran, Zellulose, zum Beispiel Papier oder Agarose, wird mit der Halogenzyanverbindung zur Bildung von Seitengruppen an den Molekülketten behandelt. Diese Seitengruppen können mit den Aminogruppen von Peptiden reagieren. Verschiedene ausgewählte Antigene lassen sich mit den erwähnten Seitengruppen kuppeln, wodurch man Adsorptionsmittel erhält, die aus den Körperflüssigkeiten selektiv spezifische Antikörper, nämlich die den betreffenden Antigenen entsprechenden Antikörper adsorbieren.
In der Praxis läßt sich der Polymere mit beliebigen spezifischen Antigenen kuppeln, so daß man Adsorptionsmittel mit selektivem Adsorptionsvermögen bezüglich der entsprechenden Antikörper erhält. Dieses Verfahren kann dazu dienen, nachzuweisen, ob in einer Körperflüssigkeit einem bestimmten Antigen bzw. mehreren bestimmten Antigenen entsprechende Antikörper vorhanden sind. Der Nachweis der adsorbierten Antikörper kann durch Ankuppeln von markierten Anti-Antikörpern, beispielsweise radioaktiven Isotopen markierter Antikörper erfolgen, die dann mit Hilfe eines Isotopenzählers bestimmt werden. Eine derartige in der Praxis entwickelte Analysemethode
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ist unter der Bezeichnung RAST bekannt, einer Verkürzung von Radio-Allergo-Sorbent Test. Diese Methode wird zur Diagnose allergischer Reaktionen benutzt, indem man den Inhalt der einzelnen allergenspezifischen Antikörper in Flüssigkeiten, vorzugsweise Blutserum bestimmt. Diese Antikörper sind Immunglobuline und können des Typs IgE, IgG, IgA, IgM und IgD sein.
Die vorstehend beschriebene bekannte Analysier- oder Diagnostizierde hat verschiedene Nachteile. Die Herstellung und Vorbehandlung des Adsorptionsmittels ist umständlich und zeitraubend, da nach komplizierten synthetischen Methoden Seitenketten an die Molekülketten des Polymers anzukuppeln sind. DieBenutzung eines Halogenzyans für diesen Zweck ist wegen der geringen Stabilität und Giftigkeit dieser Reagenzien unangenehm und riskant. Außerdem ist die erforderliche Allergenmenge groß.
Die vorliegende Erfindung fußt auf der Erkenntnis, daß es nicht erforderlich ist, die Antigene über brückenbildende Seitengruppen mit polymeren Ketten zu kuppeln, sondern daß mit Hilfe des an sich bekannten Adsorptionsmittels Aluminiumhydroxydgel eine so wirksame Bindung an die Antigene erreichbar ist, daß dadurch in einfacher Weise quantitative Bestimmungen durchführbar sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß eine Probe der Körperflüssigkeit mit Aluminiumhydroxydgel behandelt wird, an welchem die Antigene adsorbiert sind, und daß dann die mit den Antigenen gekuppelten spezifischen Antikörper mit Hilfe markierter Anti-Antikörper nachgewiesen oder bestimmt werden.
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Das Aluminiumhydroxydgel ist auf dem Markt preisgünstig erhältlich, ungiftig und gefahrlos benutzbar. Das Ankuppeln oder Adsorbieren der Antigene an Gel ist leicht durchführbar und erfolgt wesentlich schneller als bei den bekannten Adsorptionsmitteln auf der Grundlage von Papier oder Sephadex. Es hat sich desweiteren herausgestellt, daß die erfindungsgemäße Methode allergensparsam ist, da pro Gewichteinheit Allergen im Vergleich zur bekannten RAST-Methode die 50-- lOOfache Anzahl von Analysen durchgeführt werden kann. Die erfindungsgemäße Methode ist flexibel, und es werden die gleichen Allergene benutzt, die bei anderen Diagnosen verwendet werden, beispielsweise als Hautproben in die Haut eingebracht oder dem kranken Organ bei Provokationsproben einverleibt werden. Das mit den Allergenen gekuppelte Aluminiumhydroxydgel kann gewünschtenfalls nach erfolgter Sterilisation und toxikologischen Untersuchungen für Hyposensibilisierungsbehandlungen verwendet werden.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden die Antikörper vorzugsweise mittels durch Isotopen markierte Anti-Antikörper bestimmt, da diese Methode schnell und bequem durchführbar sowie recht genau ist. Es kann jedoch auch in anderer Weise markiert, beispielsweise eine Fluoreszensmarkierung oder Enzymkupplung verwendet werden.
Es ist zwar bekannt, daß Aluminiumhydroxydgele auf viele organische Verbindungen, beispielsweise Polypeptide, hierunter auch Allergene eine stark adsorbierende Wirkung ausüben, und daß das Gel als Adjuvans wirkt (vergl. DK-PS 123 690). Aus der US-PS 3 798 319 ist desweiteren die Herstellung von therapeutischen und diagnostischen Antigenen oder Allergenenextrakten bekannt, die in der Form eines trockenen Pulvers iso-
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liert werden, daß dann gewünschtenfalls zur Bildung eines langsam oder verzögert wirkenden Präparats auf Aluminiumhydroxyd fixiert wird. Man hat bisher jedoch nicht erkannt, daß man mit Gelen dieser Art antigenhaltige Adsorptionsmittel erhalten kann, die zum Kuppeln mit spezifischen Antikörpern in Körperflüssigkeiten geeignet sind, und daß man dadurch über eine sichere Analysenmethode zur Diagnose von Allergie in Körperflüssigkeiten und zur Qualitätskontrolle von Allergenextrakten verfügt.
Zum Nachweis von Antikörpern in Körperflüssigkeiten werden wie erwähnt Gele benutzt, an denen das oder die spezifischen Antigene adsorbiert sind, mit Bezug auf welche der Nachweise einer allergischen Reaktion des Patienten erwünscht ist. Es ist dadurch möglich, in kurzer Zeit hinsichtlich einer großen Anzahl verschiedener Antigene auf allergische Reaktionen zu prüfen.
Die Methode ist auch zur Bestimmung der Art und Menge von Antigenen mittels Flüssigkeitsproben verwendbar, die bekannte Antikörper enthalten. Die Methode ist dadurch als Hilfsmittel zur Auswahl oder Kontrolle der Stärke und Qualität von Präparaten verwendbar, die gegen spezifische Allergien therapeutisch benutzt werden sollen.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachstehend anhand einiger Beispiele veranschaulicht.
BEISPIEL 1
0,2 ml Allergenextrakt von Hundehaaren, Konzentration 1 : (hergestellt durch Extraktion von einem Teil Hundehaaren und
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20 Teilen Salzwasser, Gewicht/Volumen) werden mit 0,05 ml Aluminiumhydroxydgel 2 % und 1,75 ml Azetat-Essigsäure-Puffer, pH = 7, 0,1 M/l (nachstehend als A/E-Puffer bezeichnet) vermischt. Das Gemisch wird in einer Blutrührvorrichtung mechanisch etwa 30 mal in der Minute etwa 15 Minuten lang bei Zimmertemperatur bewegt. Danach wird das Gemisch bei 3000 Umdrehungen/Min, (entsprechend ca 2000 g) zwei Minuten zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird vorsichtig abgesaugt und durch 2,5 ml A/S-Puffer ersetzt. Die Flüssigkeit wird erneut abgesaugt und mit einer neuen Portion 2,5 ml A/E-Puffer ersetzt. Dieser Prozeß wird insgesamt viermal wiederholt. Nach dem letzten Absaugen wird der Niederschlag in 2 ml A/E-Puffer mit einem Zusatz von 0,3 % bovinem Serumalbumin (Sigma) und 1 % tween 20, einem Sorbat (nachstehend wie folgt verkürzt: A/E-Puffer+BSA+Tw) wieder gelöst. Dieses Gemisch wird sofort benutzt oder bei 4 C zur späteren Verwendung aufbewahrt. Zur Verwendung werden 0,1 ml Gemisch entnommen, und in ein Kunststoffrohr eingeführt. Es werden 0,1 ml Serum eines Patienten zugesetzt. Das Gemisch wird mindestens 6 Stunden bei Zimmertemperatur abgestellt, darauf bei 2000 g zwei Minuten zentrifugiert, überstehende Flüssigkeit wird abgesaugt und mit 2,5 ml A/E-Puffer+BSA+Tw ersetzt. Nach dem Mischen wird zentrifugiert, überstehende Flüssigkeit abgesaugt und Puffer zugesetzt. Dieser Vorgang wird insgesamt viermal wieder-
125 holt. Nach dem letzten Absaugen werden 0,05 ml I-markiertes Anti IgE (entsprechend ca. 5 nannoCi einer Lösung mit 2,5 mCi per mg anti IgE) zugesetzt. Das Gemisch steht bei Zimmertemperatur mindestens 20 Stunden, wonach die nicht gebundene Aktivität durch Zentrifugieren bei 2000 g für die Dauer von zwei Minuten entfernt, überstehende Flüssigkeit abgesaugt und 2,5 ml A/S-Puffer+BSA+Tw zugesetzt werden, wonach insgesamt viermal zentrifugiert, abgesaugt und Puffer zugesetzt wird.
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125 Nach dem letzten Absaugen wird die gebundene I Aktivität mit Hilfe eines Gammazählers gemessen, wobei man bei einem positiven Serum mit spezifischen Antikörpern eine Zählerzahl um 10.000, und bei einem normalen Serum eine Zählerzahl um 1000 anstrebt. Dies ist oft der Fall bei zugesetzter totaler Zählzahl 50.000. Der Gehalt nicht bekannter Sera an spezifischen Antikörpern gegen Hundehaare wird ausgedrückt als die Aktivität bei der vorerwähnten Analyse im Verhältnis zur Aktivität eines normalen Serums (Hintergrundaufnahme) und eines Serums mit bekanntem Antikörpergehalt.
Die Untersuchungen einer Reihe von Patientensera gegenüber verschiedenen Allergenextrakten zeigen Übereinstimmung zwischen den Ergebnissen der erfindungsgemäßen Methode und der bekannten RAST-Methode, bei der die gleichen Allergene an Papierscheiben gekuppelt waren.
BEISPIEL 2
2 Allergenextrakte von Graspollen phleum pratense, Konzentration 1 : 20 (Gewicht des Pollenausgangsmaterxals: Volumen Salzwasser 0,9 %) werden an Aluminiumhydroxydgel absorbiert und mit dem bekannten Gehalt an Graspollen-Antikörpern eines von einem gegenüber Graspollen allergischen Patienten stammenden Serums verglichen.
0,2 ml Extrakt jeweils A und B (Verkürzung für die beiden Graspollenextrakte) werden wie im Beispiel 1 angegeben 0,05 ml 2 % Alhydrogel und 1,75 ml A/E-Puffer zugesetzt. Das Gemisch wird 15 Minuten in der Blutrührvorrichtung bei ca. 30 Um-
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drehungen per Minute und Zimmertemperatur bewegt. Danach wird zwei Minuten bei 3000 Umdrehungen per Minute (ca. 2000 g) zentrifugiert, wonach überstehende Flüssigkeit vorsichtig abgesaugt wird usw. Diese Maßnahmen werden insgesamt viermal wiederholt. Nach dem letzten Absaugen wird der Niederschlag in 2 ml A/E-Puffer+BSA+Tw wieder gelöst. Es werden mehrere Verdünnungen dieser Lösungen hergestellt, u.z. wird mit A/E-Puffer+BSA+Tw jeweils 1, 10, 100, 1000 und lO.OOOmal verdünnt. Von der unverdünnten Lösung und den verdünnten Lösungen werden 0,1 ml Proben auf Kunststoffglaser gefüllt und mit 0,1 ml Serum mit bekanntem Inhalt von Antikörpern gegen phleum pratense gemischt. Wie im Beispiel 1 reagiert das Gemisch mindestens sechs Stunden bei Zimmertemperatur (18-24 C), wonach insgesamt viermal zentrifugiert wird. Nach dem letzten
125
Absaugen werden 0,05 ml I-anti IgE oder eines in entsprechender Weise radioaktiv markierten Antikörpers zugesetzt. Die Gläser stehen mindestens 20 Stunden bei Zimmtertemperatur. Danach werden die Gemische zwei Minuten bei 2000 g zentrifugiert. Nicht gebundene Aktivität wird durch Absaugen entfernt, und es wird insgesamt viermal gemäß Beispiel 4 gespült
125 und zentrifugiert. Die verbleibende gebundene I-Aktivität wird mit Hilfe eines Gammazählers gezählt. Auf der Grundlage der Zählzahlen der einzelnen Verdünnungen der Extrakte A und B können diese verglichen werden. Auch hier wird als Hintergrundwert bei der Analyse eh einer normalen Person entstammendes Serum ohne spezifischen Antikörper gegen phleum pratense mitverwendet.
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Andrejewski, Honke, Gesthuysen & Masch, Patentanwälte in Essen BEISPIEL 3
Ausgehend von einem Allergenextrakt von Roßhaar und Schuppen, Konzentration 1 : 10 (Gewicht Roßhaar-Schuppen: Volumen Salzwasser 0,9 %) werden mehrere verdünnte Lösungen hergestellt, die an Aluminiumhydroxydgel adsorbiert werden. Mit Hilfe des Serums eines gegenüber Roßhaar allergischen Patienten wird eine charakteristische S-fömige Kurve bestimmt, aus der die Stärke gebundenen Allergens aus dem Extrakt beurteilt werden kann.
Aus einem Extrakt von Roßhaar-Schuppen 1 : 10 werden mit 0,9 % Natriumchlorid mehrere zehnfache Verdünnungen hergestellt. 0,05 ml der hergestellten Lösungen werden jeweils mit 0,05 ml 2 % Alhydrogel und 1,9 ml 0,9 % Natriumchloridlösung gemischt. Die Gemische werden 15 Minuten bei 30 Umdrehungen per Minute und Zimmertemperatur in der Blutrührvorrichtung umgerührt. Danach wird zwei Minuten bei 3000 Umdrehungen/Minute (ca. 20000 g) zentrifugiert und die überstehenden Flüssigkeiten vorsichtig abgesaugt und mit 2,5 ml 0,9 % Natriumchloridlösung ersetzt, die wiederum abgesaugt wird usw. Nach dem letzten Absaugen wird der Niederschlag in 5 ml 0,9 % Natriumchloridlösung wieder gelöst. 0,05 ml jeder dieser Lösungen werden mit 0,05 ml Serum eines gegenüber Roßhaar allergischen Patienten, und zur Kontrolle mit Serum eines nicht allergischen Patienten (Hintergrund) gemischt.
Die Gemische reagieren mindestens 6 Stunden bei Zimmertemperatur (18 - 24° C), wonach insgesamt viermal gemäß Beispiel 1 zentrifugiert wird usw. Nach dem letzten Absaugen werden 0,05 ml 125I-anti-IgE oder eines entsprechenden, radioaktiv
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markierten Antikörpers zugesetzt. Abstellen für die Dauer von mindestens 20 Stunden bei Zimmertemperatur. Darauf werden die Gemische zwei Minuten mit 2000 g zentrifugiert, nicht gebundene Radioaktivität durch Absaugen entfernt, gespült und
zentrifugiert wie im Beispiel 1 beschrieben, was viermal
125
wiederholt wird, wonach die verbleibende -Isotopenaktivität mit Hilfe eines Gammazählers gezählt wird.
Auf der Grundlage der Zählzahlen der verschiedenen Verdünnungen der Extrakte und des Verdünnungswertes wird eine
für den Extrakt aus Roßhaar und Schuppen charakteristische
Kurve gezeichnet. Auch hier dient als Hintergrundwert bei
der Analyse ein Serum einer normalen Person ohne spezifische Roßhaar/Schuppen-Antikörpers.
Die in diesem Beispiel beschriebene Analyse ist zur Charakterisierung eines bestimmten Extraktes gut geeignet, wobei ermittelt wird, wie weit der Allergenextrakt vor Gebrauch verdünnt werden kann und dabei nach wie vor eine maximale Bindung spezifischer Antikörper ergibt (Zählzahl). Die Analyse ist auch zum Vergleich der Stärke von unterschiedlich hergestellten Allergenextrakten gleichen Typs gut geeignet.
Auch die Haltbarkeit der Allergenextrakte kann mit dieser
Methode beurteilt werden.
BEISPIEL 4
Ein Bezugssystem mit einem Extrakt von Roßhaaren und Schuppen und Verdünnungen eines Serums eines gegenüber Roßhaar aller-
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gischen Patienten werden in einem doppelten logarithmischen Koordinatensystem als eine lineare Funktion abgebildet, die als Bezugskurve bei der Durchführung des Verfahrens gut geeigent ist.
0,05 ml Extrakt von Roßhaaren und Schuppen werden in ein Kunststoffrohr eingeführt mit 0,05 ml 2 %igem Aluminiumhydroxyd und 2 ml TRIS 0,1 M, pH = 7,5 mit 1 % Tween 20 (nachstehend verkürzt: TRIS-T) gemischt.
Nach dem Mischen wird das Gemisch bei Zimmertemperatur 15 Minuten abgestellt. Nicht gebundene Bestandteile werden daraufhin durch Zentrifugieren bei 2000 g für die Dauer von zwei Minuten und anschließendes vorsichtiges Absaugen des größten Teils der überstehenden Flüssigkeit entfernt, wobei der letzte Teil am besten dadurch entfernt wird, daß man vorsichtig das Kunststoffrohr auf den Kopf stellt und die freie Flüssigkeit abgießt. Diese Prozedur wird dreimal wiederholt, indem 2,50 ml TRIS-T zugesetzt werden und zentrifugiert, abgesaugt und wie beschrieben abgegossen wird.
Der nach dem letzten Abgießen verbleibende "gewaschene" Niederschlag wird in 5 ml TRIS-T wieder gelöst, wonach 0,05 ml auf Kunststoffröhrchen verteilt und 0,05 ml Serumverdünnungen zugesetzt werden.
Die Serumverdünnungen werden durch Mischen des positiven Serums des gegenüber Roßhaar allergischen Patienten (im Bezugssystem gleich 100 % gesetzt) mit normalem Serum einer oder mehrerer nicht allergischer Personen (im Bezugssystem gleich 0 % gesetzt) in den Verhältnissen (V/V):l+0, 1+4 und 1+49
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(entsprechend den Konzentrationen spezifischer Antikörper: 100 %, 20 %, 4 % und 2 %) hergestellt.
Die Serumreaktion erfolgt drei Stunden lang bei Zimmertemperatur (oder die Nacht über, d.h. 18 - 22 Stunden lang). Danach werden nichtgebundene Serumkomponenten durch Zusatz von 2,5 ml TRIS-T, zwei Minuten zentrifugiert (bei 2000 g) und vorsichtiges Absaugen der überstehenden Flüssigkeit entfernt, wobei jedoch 0,2 bis 0,3 ml freie überstehende Flüssigkeit zurückbleiben, um ein Aufwirbeln des Niederschlags beim Absaugen zu vermeiden. Es werden erneut 2,5 ml TRIS-T zugesetzt, und es wird erneut zentrifugiert und abgesaugt. Diese Behandlung wird dreimal wiederholt. Nach dem letzten vorsichtigen Absaugen wird die restliche frei überstehende Flüssigkeit durch vorsichtiges Umkehren aller Röhrchen abgegossen.
125 Dem "gewaschenen" Niederschlag werden 0,05 ml I-anti-IgE oder eh entsprechend markierter Antikörper zugesetzt. Das Gemisch wird für eine mindestens 20-stündige Reaktion bei Zimmertemperatur abgestellt. Nach dem Zusatz von 2,5 ml TRIS-T zum Inhalt sämtlicher Röhrchen werden die Gemische zwei Minuten bei 2000 g zentrifugiert. Nicht gebundene Aktivität wird durch Absaugen, Spülen und Zentrifugieren wie vorstehend beschrieben entfernt. Diese Waschprozedur wird insgesamt viermal wieder-
125 holt, wonach die verbleibende gebundene I-Aktivität mit Hilfe eines Gammazählers gezählt wird.
Auf der Grundlage der Zählzahlen (y-Werte) und der Serumverdünnungen (x-Werte) wird in einem doppelten logarithmischen
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Koordinatensystem die lineare Relation nach dem Prinzip des kleinsten Abstandes hergestellt. Unbekannte Sera sind aus
den Zählzahlen als spezifische Antikörper bestimmbar. Auch andere Allergen/Serum-Systeme können im Verhältnis zu diesem Roßhaar- und Schuppen/Patienten-Bezugssystem angegeben werden.
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Claims (2)

  1. Andrejewski, Honke, Gesthuysen & Masch, Patentanwälte in Essen
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    Patentansprüche :
    IJ Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung von Antikörpern xn Körperflüssigkeiten mit Hilfe bekannter Antigene oder zur Bestimmung von Antigenen mit Hilfe bekannter Antikörper aus Körperflüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß eine Probe der Körperflüssigkeit mit Aluminiumhydroxydgel behandelt wird, an welchem die Antigene adsorbiert sind, und daß dann die mit den Antigenen gekuppelten spezifischen Antikörper mit Hilfe markierter Anti-Antikörper nachgewiesen oder bestimmt werden.
  2. 2. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem Aluminiumhydroxydgel besteht, an welchem Antigene in einer im Voraus bestimmten oder zu bestimmenden Menge adsorbiert sind.
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DE2624814A 1975-06-10 1976-06-02 Verfahren und Mittel zum Nachweis oder zur Bestimmung von Antikörpern in Körperflüssigkeiten Expired DE2624814C2 (de)

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