DE2851150C2 - Verfahren zur immunologischen Untersuchung einer Serumprobe - Google Patents

Description

(a) gleichzeitiges Eintauchen aer beiden Oberflächen in dieselbe aliquote Teilmenge der Probe,

(b) anzuschließendes gleichzeitiges Eintauchen der beiden Oberflächen in dieselbe aliquote Teilmenge einer mit einem fluoreszierenden Stoff markierten Substanz, und daraufhin Messung der Differenz der Mengen der von der ersten und von der zweiten Oberfläche ausgesendeten fluoreszierenden Strahlung.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß jeweils nach den Schritten (a) und (b) die beiden Oberflächen gleichzeitig in eine Salzlösung zur Waschung eingetaucht werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die immunologische Analyse an der unbekannten Serumprobe durchgeführt wird, indem die beiden Oberflächen jeweils in verschiedene gleiche Mengen derselben unbekannten Scrumprobe und verschiedene gleiche Mengen der markierten Substanz eingetaucht werden.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die markierte Substanz ein Antihuman-Antikörper ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche I bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen ein Virus-Antigen ist

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen ein Antigen des Rubellavirus, ein Cytomegalovirus-Amigen oder ein Antigen des Herpes-Simplex-Virus ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen ein bakterielles Antigen ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen das Antigen von Treponema-pallidum-Bakterien, ein Antigen eines parasitären Organismus oder ein Antigen von Toxoplasma Gondii ist.

10. Verfahren nach Anspruchs, dadurch gekennzeichnet, daß der Antihuman-Antikörper ein Antihuman-lmmunoglobulin ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Antihuinan-Antikörper Antihuman-Immunoglobulin M ist.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur immunologischen Untersuchung einer Serumprobe, die eine unbekannte Menge eines Störstoffs enthalten kann, auf

ίο das Vorhandensein eines bestimmten, nachzuweisenden Antikörpers mit Hilfe einer Oberfläche, an die ein Antigen für den nachzuweisenden Antikörper gebunden ist, und einer markierten Substanz, die zur Bindung an den Antikörper befähigt ist

Solche Untersuchungsverfahren sind bereits bekannt (DE-OS 25 09 215). Ihre Durchführung war aber bisher, wie nachstehend anhand von Beispielen geschildert wird, etwas umständlich.

Rubella oder Röteln sind eine harmlose Kinderkrank-

heit von kurzer Dauer. Sie wäre von geringer Bedeutung, gäbe es nicht die schweren Schäden bei Neugeborenen, die aus einer Rötelinfektion im Mutterleib im ersten Vierteljahr der Schwangerschaft resultieren. Somit ist die Bestimmung des Immunitätszustandes bei einzelnen Personen als Mittel zur Verhütung dieser Geburtsschäden wichtig. Serologische Bestimmungen von Röteln werden zur Feststellung des Immunitätszustandes bei einzelnen Personen in einer vorgegebenen Population (insbesondere Frauen im gebärfähigen Alter) eingesetzt, so daß diejenigen geimpft werden können, die ohne Schutz sind. Die Bestimmungen werden zur Einschätzung des Immunitätszustandes bei Schwangeren herangezogen, um ihnen bei der Möglichkeit von Infektionen im Mutterleib helfen zu können.

Schließlich dient die serologische Rubella-Bestimmung als diagnostisches Hilfsmittel zur Erkennung von Krankheiten mit Exanthemen oder Ausschlagbildung.

Gegenwärtig steht eine Anzahl von Verfahren der Erkennung von Antikörpern des Rubellavirus zur Verfugung. Das gebräuchlichste ist die Probe auf eine Haemagglutinations-Inhibition (HAI), die Serum-Neutralisationsprobe, die Complement-Fixierungsprobe (CF) und die indirekte Immunofluoreszenzprobe (IF). Bestimmte Viren, die Rubella einschließen, besitzen die Fähigkeit, sich mit roten Blutkörperchen zu verbinden und diese zum Verkleben zu bringen (Haemagglutination). Wenn sich nun Rubella-Antikörper mit dem Virus verbinden, so verhindern sie die Verklebung roter Blutkörperchen. Stewart u.a. (Ste wart, G. L.; Parkmann, P. D.; Hop,«, H. E; Dougals, R. D.; Hamilton, J. P.; und Meyer, H. M. in New Eng. J. Med. 276: 554 (1967)) verwendeten diese Eigenschaft des Rubellavirus zur Entwicklung der Probe auf Haemagglutinations-Inhibition (HAI oder HI). Da die HI-Probe als erste beschrieben worden war, sind viele Abwandlungen dieses Verfahrens hervorgebracht worden. Dies hat die Zentralstelle für Krankheitsüberwachung des US-Gesundheitsministeriums (CDC — Center for Disease Control) veranlaßt, ein standardisier tes Verfahren anzubieten, nämlich den standardisierten Haefnägglutinations-Inhibitionstest (Bezeichnung: »Immunology Series No. 3 U.S.D. H.E.W.«, C.D.C, Atlanta, Georgia, V. St. A, Oktober 1970). Die Serum-Neutralisationsprobe auf Rubella, die zuerst von Parkman u. a. (Parkman, P. D.; Buescher, E. L; Artenstein, M. S. in Proc. So. Exp. Biol. Med. 3:225 (1962)) beschrieben worden ist, beruht auf der Tatsache, daß mit Antikörpern kombinierte Viren nicht mehr

infektionserzeugend sind.

Für Rubella ist ebenfalls eine Complement-Fixierungsprobe von Linette, E H, in »Diagnostic Procedures for Viral and Ricketisial Diseases«, 3. Auflage, New York 1964, American Public Health Association, Seite 1 bis 66, beschrieben worden. Diese beruht auf der Fähigkeit des Antikörper/Rubellavirus-Komplexes, ein Komplement zu binden oder zu fixieren.

Brown u. a. (Brown, G. C; Massab, H. F.; Veronelli, J. A.; und Francis, T, Jr.) haben nach Science 145: 943 (iS64) und Schaeffer u. a. (Schaeffer, M.; Orsi, E. V.; und Widelock D.;) nach Bact Rev. 28: 402 (1964) eine indirekte Immunofluoreszenzprobe auf Rubella entwikkelL Bei dieser Probe wurden mit Rubella infizierte Zellen auf Mikroskopschiebern fixiert Die fixierten Zellen wurden einer Inkubation mit aufgelösten Serumproben unterzogen. Rubella-Antikörper in der Serumprobe verbinden sich dabei mit Rubella-Antigenen in den fixierten Zellen. Die Rubella-Antikörper auf den Zellen wurden dabei mit einem mit fluoreszierendem Anhängerstolf markierten Antihuman-Immunoglobuün-Antikörper festgestellt.

Diese bekannten Rubella-Tests weisen wegen ihrer klinischen Komplexität, des großen Kostenaufwandes und Zeitbedarfs und wegen ihrer mangelnden quantitativen Zuverlässigkeit eine Anzahl von Nachteilen auf. Aus diesem Grund war es wünschenswert einen neuen Rubella-Test zu entwickeln, bei dem Rubella durch eine fluoreszenz-immunologische Untersuchung rasch, wirtschaftlich und mit verläßlichen quantitativen Ergebnissen nachgewiesen werden kann.

Es sind Fluoroirr.Tiiinoassays entwickelt worden, mit denen Patienten auf das Vorhandensein einer bestimmten Komponente in einem Körperrnedium bzw. einer Körperflüssigkeit dadurch getestet werden können, daß man

(a) eine bekannte Probe dieser Komponente an eine Trägeroberfläche bindet

(b) die Trägeroberfläche mit einer Probe des Körpermediums bzw. der Körperflüssigkeit in Berührung bringt derart daß die darin befindlichen Antikörper von der Komponente auf der Trägeroberfläche angezogen werden können, und

(c) die Oberfläche mit einem fluoreszierend markierten zweiten Antikörper zu dem ersten Antikörper in Berührung bringt und die Fluoreszenz der resultierenden Oberfläche mißt.

Beispiele solcher Fluoroimmunoassays sind beschrieben in den US-PS 39 92 631, 39 99 948, 40 20 151, 40 25 310 und 40 56 724.

Eine Anpassung dieser Fluoroimmunoassayverfahren an einen Rubella-Test wäre erwünscht und ist auch grundsätzlich möglich. Es ist aber mit Schwierigkeiten verbunden, auf diesem Weg zuverlässige quantitative Ergebnisse zu erhalten. Offenbar wirken viele gleichzeitig wirksame Substanzen störend auf das eigentliche Immunoassayverfahren ein, wenn diese als Testverfahren auf Rubella angewendet werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der eingangs genannten Gattung zu schaffen, das dem Einfluß störender Stoffe weitgehend entzogen ist quantitativ verläßliche Ergebnisse liefert und dabei rasch und einfach ohne großen Kostenaufwand ausführbar ist. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die in dem Patentanspruch I genannten Merkmale gelöst.

Verschiedene Möglichkeiten zur vorteilhaften weiteren Ausgestaltung dieses Verfahrens sind in den Ansprüchen 2 bis 11 angegeben.

Das Verfahren gemäß der Erfindung zur immunologisehen Untersuchung von Serumproben eignet sich besonders für Antirubella-Antikörper. Bei diesen zwei Oberflächen-Testverfahren ist das Virusantigen direkt an die Testoberfläche gebunden. Dieses immunologische Untersuchungsverfahren kann mit Antigen-Auszü- gen von Bakterien oder Protozoen ausgeführt werden, die an die Testoberfläche gebunden sind. Vergleichbare frühere immunologische Untersuchungen konnten nur mit vollständigen Organismen ausgeführt werden.

Der neue Zweioberflächen-Test ermöglicht durch die

is Aufhebung konkurrierender Reaktionen immunologische Untersuchungen, die bisher nicht möglich waren. Der Mechanismus, mit dem die Reaktionen während des Verfahrens ablaufen, ist noch nicht vollständig geklärt Es wird angenommen, daß der Fluoroimmunoassay für AntirubeUa-Antikörper durch konkurrierende Reaktionen mit Immunoglobuline!! oder anderen SerumbestandteUen kompliziert wird. Diese konkurrierenden Reaktionen werden von dem eigentlichen Endergebnis des Assay dadurch getrennt daß zwei Testoberflächen statt einer einzigen zusammen verwendet werden, wobei die erste Oberfläche den nachzuweisenden Antikörper bindet nämlich Antirubella-Antikörper, während die zweite Oberfläche die konkurrierenden Proteine bindet die sonst störend auf die Zuverlässig keit des Assay einwirken würden; dagegen bindet die zweite Oberfläche praktisch nichts von dem nachzuweisenden Antikörper. Schließlich werden die beiden Testoberflächen quantitativ auf eine Markierungssubstanz, vorzugsweise eine fluoreszierende Substanz, untersucht und das Ergebnis des Assay wird als Differenz zwischen den Mengen der markierten Substanz an der ersten und der zweiten Oberfläche gemessen.

Die erste und die zweite Testoberfläche können

grundsätzlich auf verschiedene Weist präpariert werden, vorzugsweise beide aus dem gleichen Material, was aus herstellungstechnischen Gründen von Vorteil ist. Beide Testoberflächen können an einem Trägerkörper vorgesehen sein, mit dem die Oberflächen bei der Durchführung der Untersuchung gemeinsam bewegt werden können. Die Testoberfläche kann aus einem porösen Copolymer hergestellt werden, an das sich die Testsubstanz (z. B. das Antigen des Rubellavirus) nach der Trocknung bindet. Zur Bindung einer geeigneten

so Oberfläche eignet sich ein Copolymer aus Zellulosenitrat und Zelluloseazetat das unter der Handelsbezeichnung »Millipore« erhältlich ist. Unter bestimmten Bedingungen können ferner die folgenden Stoffe als Trägermaterialien verwendet werden:

Polymere Kohlenwasserstoffe wie Polystyrol, Polyäthylen, Polypropylen, Polybutylen, Butylkautschuk und andere synthetische Kautschukarten, Silikon-Kautschuk, Polyester, Polyamide, Zellulose und Zellulosederivate, Acrylate, Methacrylate und polymere Vinylver- bindungen wie Vinylchlorid und Polyvinylfluorid. Copolymere wie aufgepfropfte Copolymere von Polystyrol sind ebenfalls geeignet. Außerdem kann die feste Trägeroberfläche Kieselerdegel, Siliziumplättchen. Glas, unlösliches Eiweiß und metallische Oberflächen, wie beispielsweise mit Tantal beschichtetes Glas umfassen.

An die zweite Oberfläche kann ein anderer immunologisch aktiver Stoff (z. B. ein Antigen zur

Kontrolle aus nicht infizierten Zellen) gebunden sein, der die gleichzeitig reagierenden Proteine des Blutserums, wie Lipoproteine und Immunoglobuline bindet. Rs wurde gefunden, daß die zweite Testoberfläehe ».us demselben Material, z. B. »Millipore«, wie die Tesiober fläche für den Rubeliavirus-Test bestehen kann, ohne daß ircendfcine Proteinsubstanz von vornhei^m as sie gebunden wird.

Wie bereits erwähnt, sind die beiden Testoberflächen vorzugsweise auf Probenträgern angebracht, die den Transport der Testoberflächen während der Untersuchung erleichtern. Vorzugsweise sind beide Testoberflächen auf einem einzigen Probenträger angebracht Dies ist besonders vorteilhaft beim Antinibella-Test, wo eine unbeschichtete Oberfläche als zweite Oberfläche eingesetzt wird, so daß die Verfahrensschritte zur Bindung eines Rubellavirus an die erste Oberfläche nicht die Präparierung der zweiten Testoberfläche erschweren. Die Antirubella-Testoberfläche kann nach der intensiven Trocknung und Vorwäsche präpariert werden. Zusätzliche Vorteile ergeben sich, wenn die intensive Trocknung bei starker Abkühlung, d.h. bei Temperaturen im Bereich von etwa 0 bis 10°C, vorzugsweise 2 bis 6° C, ausgeführt wird.

Der Probenträger, bei dem ein Virusantigen an einen polymeren Träger gebunden ist, kann auch vorteilhaft bei immunologischen Untersuchungen eingesetzt werden, die andere als die in den nachstehend beschriebenen Ausführungsbeispielen behandelten sind. Dies gilt beispielsweise dann, wenn ein Probenträger mit dem Virusantigen, das an ihn gebunden ist, Untersuchungen durch radio-immunologische oder mit Enzym-Markierung arbeitende Verfahren statt einem Fluoroimmunoassay unterzogen wird. Außerdem können die Probenträger mit einem an einen polymeren Träger gebundenen Virusantigen, mit Antigenen von anderen Viren als dem Rubellavirus, beispielsweise dem Virus »Herpes Simplex I« und dem Cytomegalovirus (dem Erreger der Cytomegalie) ausgeführt werden. Das Material kann auch mit Antigenen von Protozoen-Parasiten, wie Toxoplasma Gondii, und Bakterien vom Stamm »Treponema pallidum« ausgeführt werden. Schließlich kann das Verfahren, bei dem zw^i Oberflächen derselben Behandlung einschließlich Inkubation mit einer unbekannten Serumprobe und anschließender Messung der Differenz an zur Markierung dienenden Substanzen auf beiden Oberflächen unterworfen werden, bei einer breiten Vielfalt von immunologischen Untersuchungen angewendet werden, um zusammenhängende verläßliche Ergebnisse trotz der Anwesenheit störender Stoffe an dem Probenträger mit dem unbekannten Serum zu erhalten, die normalerweise die Eindeutigkeit der Ergebnisse der Untersuchung beeinträchtigen würden. So kann beispielsweise ein Immunoassay auf die quantitative Feststellung von Antikörpern gegen den Syphiliserreger Treponema pallidum in Seren ausgeführt werden, wie es in einem der nachfolgend beschriebenen Ausführungsbeispiele gezeigt wird.

Sind die Oberflächen für den Test vorbereitet, so wird die Untersuchung durch Bewegen beider Testoberflächen nacheinander durch die folgenden Medien ausgeführt:

(a) eine verdünnte, z. B. auf Antirubella-Antikörper zu testende Se rumprobe,

(b) eine Waschlösung, hergestellt aus einer gepuffarten Salzlösung,

(c) eint: gepufferte Salzlösung, die markierte Antihuman-Immunogbbuüsie enihälr und schließlich

(d) eine abschließe;*..; eir.jr.seii»" W&atitt'-iwUng.

Dann werden die beiden Oberflächen auf das quantitative Vorhandensein von markiertem Stoff ausgc-messen. Dabei können z. B. bei fluoridierender Markierung übliche Fluoreszenzmeßgeräte verwendet werden. Die Fluoreszenzmeßwerte der beiden Oberflächen werden voneinander subtrahiert, urn die Meßwertdifferenz zu bilden. Schließlich wird die Meßwertdifferenz mit einer Kennlinie aus den aus Koiitroiteerumlosungen mit bekannten Mengen erkannter Antirubella-Antikörper verglichen. Diese Berechnungen können, sofern in geeigneter Weise programmiert, mit einem Mikroprozessor durchgeführt werden. Das Verfahren kann auf verschiedene Weise abgewandelt werden. Die nachstehend an erster Stelle ?Js Ausführungsbeispiel beschriebene Verfahrensweise hat besonders gut reproduzierbare und für praktische Zwecke brauchbare Ergebnisse hervorgebracht

Ausführungsbeispi''¹! i
Die Vorbereitung der Probenträger

Für das im folgenden beschriebene Ausführungsbeispiel wurden Probenträger präpariert, die eine kreisrunde Scheibe mit einem Durchmesser von 6,6 mm aus dem Material mit der US-Handelsbezeichnung »Millipore« Typ »HAMK« enthielten. Dieses Material ist ein

Copolymer aus Zellulosenitrat und Zelluloseazetat, das als Sperrfiltermaterial zur Ausfilterung von Teilchen einer Größe von über 0,45 μΐη ausgelegt ist Eine große Anzahl von Probenträgern wurde in der folgenden Weise präpariert:

Eine im Handel verfügbare Rubella-Antigenlösung wurde zum präparieren der Probenträger verwendet Eine annehmbare Substanz muß einen Haemagglutinationstiter bei Verwendung von Erythrozyten eines einen Tag alten Kükens als Indikatorzellen von mehr als 1 :128 und eine Proteinkonzentration von weniger als 11 Milligramm/Milliliter aufweisen. Das Diagnose-Antigen für die Haemagglutinations-Inhibitionsprotoe (HI) aus der Charge Nr. C 96 1296 wurde von den Flow-Laboratorien Rockville, Maryland, V.StA., erworben, erfüllte diese Anforderungen und wurde im weiteren verwendet.

Eine Menge von 25 μΐ der Antigenlösung wurde auf jeden der Probenträger aufgebracht. Die feuchten Probenträger wurden in eine Trocknungskammer bei 0

so bis 10° C eingelegt. Andere Experimente zeigen an, daß Temperaturen von 0 bis 25° C annehmbare Ergebnisse lieferten. Durch eine Menge von Calciumchlorid mit der US-Handelsbezeichnung »Drierite« wurde die Trocknungskammer trockengehalten, dieses Calciumchlorid wurde alle 24 Stunden ersetzt.

Die Probent'äger wurden in der Trocknungskammer 48 Stunden gehalten, nach dieser Zeit waren die Probenträger mit der Trocknungsluft bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von weniger als etwa 10% im Gleichgewicluszustand. Dann wurden die Probenträger aus der Trocknungskammer entnommen.

Dann wurde eine Waschlösung bereitet, die 0,05 ΐι,οΐ »Tris« (Hydroxymethyl)-Aniinomethan-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 8,6 mit 0,15 mol

Natriumc; .-IiJ, 0,1% NaN₃ und 035% »Tween 20« oder Pc'iyoxyaethy'ensorbitan-Monolaurr.. e.-jths·.:!* Die getrockneten Probenträger wurden zehn Mir. <;n lang in der Waschlösung getränkt, und dann wurde die

Waschlösung von den Probenträgern abgeschüttelt, die Probenlräger in die Trocknungskammer zurückgebracht und dort 18 Stunden lang getrocknet, nach dieser Zeit erschienen sie bei der Sichtprüfung trocken.

Ausführungsbeispiel 2
Fluorimetrische immunologische Probe

Eine Wasch-Pufferlösung wurde mit 0,35% »Tween 20« oder Polyoxyaethylensorbitan-Monolaurat, das einer mit »Tris« oder Hydroxymethylaminomethan gepufferten Salzlösung beigefügt worden war, gelagert

Tabelle I

und abgekühlt. Es wurde eine Pufferlösung zur Verdünnung bereitet, die 0,35% »Tween 20« oder Polyoxyaethylensorbitan-Monolaurat und 2,5% Albumin aus Rinderserum in mit »Tris« oder Hydroxymethylaminomethan gepufferter Salzlösung enthielt. Vier Lösungen, 1 bis IV, wurden zur Eichung aus rekalzifiziertem und entfettetem Humanplasma mit aus der Probe auf Rubella durch Haemagglutinations-Inhibition bekannten Titern zubereitet. Der angenäherte Rubella-Titer jeder Eichungslösung wird in der nachfolgenden Tabelle !gegeben:

Eichungslösung

Angenäherter Rubella-Titer (Kehrwert der stärksten Verdünnung, die noch eine Haemagglutinations-Inhibition ergibt)

I
i;

III
IV

512
64

io

Ein Reagensröhrengestell wurde mit 12-75 Reagensröhren mit Kulturen vorgesehen. Ein Milliliter der Verdünnungs-Pufferlösung wurde den Reagensröhren in der ersten Reihe zugesetzt, und ein Milliliter der Wasch-Pufferlösung in der zweiten und vierten Reihe. In die Röhren der dritten Reihe wurd ein Milliliter eines fluoreszierenden Reagens eingebracht, das aus Antikörpern der Ziege auf Human-Immunoglobulin bestand, wobei diese Antikörper mit Fiuoreszein-Isothiozyanat als Anhängerstoff versehen und in einer mit »Tris« gepufferten Salzlösung, mit einem pH-Wert von 8,4, mit 2^% Albumin aus Rinderserum und 0,35% »Tween 20« verdünnt worden war. Bei der ersten Reihe von Reagensröhren wurde eine Menge von 25 Millilitern einer unbekannten Probe oder eine Eichlösung jeder Röhre zugesetzt. Eine Reagensröhre wurde für jede der Eichlösungen und eine Röhre für jede der Serumproben verwendet.

Das Reagensröhrengestell wurde auf eine Horizontal-Schüttelvorrichtung bei Raumtemperatur gestellt, dabei waren die Reagensröhren unter einem Winkel von 45° aufgestellt, so daß diese während der gesamten Probendurchführung bewegt werden konnten.

Die wie oben erläutert präparierten Probenträger wurden in die erste Reihe von Reagensröhren eingebracht, wobei jede Röhre eine Oberfläche mit dem gebundenen Rubella-Antigen und eine Oberfläche zur Kontrolle enthielt, und man ließ die Probenträger dreißig Minuten lang Jer Bewegung ausgesetzt Dann wurden die Prob-intrager zu den Reagensröhren in der zweiten Reihe verlegt, und es wurde ein Schüttelvorgang von fünfminütiger Dauer ermöglicht, um von den Testoberflächen jegliche überschüssigen Serumbestandteile abzuwaschen, die nicht an die Testoberflächen gebunv-in waren. Dann wurden die Probenträger in die dritte Reihe der Reagensröhren gebracht, und ein Schüttelvorgang von 30 Minuten Dauer ermöglicht, während irgendwelche auf den Probenträgern vorhandenen Antikörper zu Rubellaviren und jegliche gleichzeitig mit diesen in Reaktionen tretenden Serumproteine mit den fluoreszierend markierten Antihuman-Immunoglobulinen reagieren konnten. Schließlich wurden die Proberiträger in die vierte Reagensröhrenreihe gebracht, und es wurde zur abschließenden Waschung ein zehnminütiger Schüttelvorgang ermöglicht. Bei jeder Verlegung der Probenträger wurde sowohl jeweils die an den Anti-Rubella-Antikörper gebundene Oberfläche, als auch die zugehörige Oberfläche zur Kontrolle transferiert, derart, daß jeweils ein Testoberflächenpaar jedes Reagenzglas durchlief.

Die wie oben beschrieben behandelten Testoberflä chen wurden auf fluoreszierende Substanz in einem Fluoreszenzmeßgerät vom Typ FIAX 100 der Anmelderin gemessen, und die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgend?"! Tabelle H niedergelegt, wobei die Abkürzung »FSE« die Fluoreszenz-Signaleinheiten des Fluoreszenzme-.sers angibt.

Tabelle Π

Ein typisches Experiment: die Probe wurde ausgeführt, wie in den Anmerkungen angegeben.

Proben-	Riibella-	Kontroll-	Meß-	FIAX-	FIAX-	Haemagglutina-
Kennzahl	Oberfl.-	Oberfl.-	wertdiff.	Titer	Ti ter	tions-Inhibitions-
	Proben träger	Proben träger	JFSE	(Zwei-	(Nur Rub.-	Titer(HAI)
	FSE	FSE		oberfl.)	Oberfl.-	(C)
				(A)	Proben-
					träger)
					(B)
EichLI	100	25	75			1024
EkfaLII	69	26	43	—	—	320
Eichl. m	56	23	32	—	—	64
Ekhl.IV	32	24	8	—	—	16

	9	28	51 1	50	FIAX-	10
					Titer
Fortsetzung	Rubella-				(Nur Rub-	llaemagglutina-
Proben-	Oberfl-	Kon trol I-	Meß-	FIAX-	Oberd,-	tions-Inhibitions-
Kennzahl	Probenträger	Oberd-	wertdifT.	Titer	Proben-	Titer(HAI)
	FSE	Probenträger	JRE	(Zwei-	iräger)	(C)
		FSE		oberll.)	(B)
				(A)	6,5
					9,5 +
	25				5,0	<8
1 (R 140)	29	35	-10	<5	10,0 +	<8
2 (R 142)	22	31	- 2	<5	14,0 +	<8
3(R 143)	30	26	- 4	<5	6,5	<8
4 (R 144)	33	33	- 3	<5	20,0	<8
5 (R 145)	25	40	- 7	<5	22,0	<8
6 (R 146)	38	33	- 8	<5	(JV/,U ί	16
7 (R 161)	?9	23	15	20	22,0	16
S (R 162)	53	26	13	17	68,0	11 Jt
y (K i65)	39	32	2i	"» 4 JH	40,0	32
10 (R !67)	52	22	17	24	190,0	64
11 (R 178)	46	24	28	60	54,0	64
12 (R 179)	64	21	25	47		128
13 (R 195)	49	26	38	145	128
14 (R 196)	25	24	427

Änmerkun£|e;i.

(A) Werte bestimmt aus einer Eichkurve, die durch Auftragen des HAI-Titers über der Meßwertdiflerenz A FSE = FSE fur Rubella-StiQ'-Probenträger abzüglich FSE fur Kontroll-StiQ'-Probenträger erzeugt worden war.

(B) Werte bestimmt aus einer Eichkurve, die durch Auftragen des HAI-Titers über den FSE-Werten für RubeUa-StiQ'-Probenträger erzeugt worden war.

(C) HAI-Titer: bestimmt durch die Haemagglutinations-Inhibition (siehe standardisierter HAI-Test auf Rubella. Immunol. Reihe Nr. 2, US-Gesundheitsministerium, Zentralstelle fur Krankheitsüberwachung, Atlanta, Georgia, Oktober 1970). Die Titerwerte sind die Kehrwerte der stärksten Verbindung derSerumprobe, die noch die Haemagglutination zu verhindern vermag. Dieser Test wird als Referenzverfahren für Rubellabestimmungen angesehen.

Hinweis: Die Proben mit den Kennzahlen 2,4,5 haben falsche positive Titer (>8) beim Einzel-StiQ'-Verfahren, jedoch negative Titer (< 8) beim DoppeA-StiQ'-Verfahren. Es liegt auch eine allgemein bessere Übereinstimmung zwischen dem FIAX-Titer und dem HAI-Titerbei dem Doppel-StiQ'-Verfahren als bei dem Einzel-StiQ'-Verfahren vor.

Ausführungsbeispiel 3
Zweioberflächen-Verfahren mit
Anti-Treponema-Antikörpern

In einer der oben beschriebenen Vorgehensweise ähnlichen Verfahrensweise wurden Probenträger präpariert, mit aus »Millipore« Typ »HAMK« hergestellten aktiven Oberflächen. Eine Gruppe von Probenträgern wurde mit einer Menge von 10 μΐ an speziell gereinigten FTA-ABS-Antigenen (Beckmann, Katalog-Nr. 251041 - Charge Nr. E6 00315) betupft und bei 0 bis 8° zv. i;::?r ^tvnden lang bei einer relativen Feuchtigkeit von weniger als 1«.. ^ -. .~ck-?t

Es wurde eine Gruppe von Proben vorbereitet, durch Verdünnung reaktionsfähiger »Treponema pallidum«- Seren (d.h. Seren, die Antikörper zu Treponema pailidum enthielten) und nicht mit Treponema pallidum reaktionsfähiger Seren (d. h. Seren, die keine Antikörper zu Treponema pallidum enthielten). Diese verdünnten Proben wurden mit normalem Kaninchenserum

hergestellt. Weitere Verdünnungen der reaktionsfähigen und nicht reaktionsfähigen Seren wurden mit einer Pufferlösung bereitet, die 0,05 mol »Tris« HCl, pH-Wert 8,2, 0,15 mol NaCI, 0,005 mol EDTA, 0,1% »Tween 20« und 2% Albumin aus Rinderserum enthielt.

Diese Verdünnungen wurden hergestellt, um die unten angegebenen endgültigen Probenlösungen zu schaffen. Ein Paar aus je einem behandelten und einem unbehandelten Probenträger wurde in jede der Serumproben eingebracht und 30 Minuten geschüttelt Dann wurden die Probenträger zehn Minuten lang in einer Pufferlösung gewaschen und dann 30 Minuten in einer Verdünnung im Verhältnis 1 :50 von mit Fluoreszin-Isothiozyanat als Anhängerstoff markiertem Antihuman-Immunoglobulin geschüttelt und schließlich zehn Minuten lang gewaschen. Die beiden Probenträger wurden dann in einem Fluoreszenzmeßgerät, Typ FIAX 100, der Anmelderin auf fluoreszierenden Stoff mit den j folgenden Ergebnissen (in Tabelle III) gemessen:

If

Tabelle ΠΙ	(	reaktionsfähig	Endgültige Lösung	Antigen	Kontra
Probe (Serum)	reaktionsfähig	Verd.)	FSE	FSE
reaktionsfähig	:10	56	30
nicht reaktionsfähig	:20	46	28
nicht reaktionsfähig	:40	37	28
nicht reaktionsfähig	:10	89	120
	:20	52	61
■40	34	41

MeßwertdifTerenz A FSE

-31

- 9

- 7

Dadurch, daß gerade die Antigen-Probenträger Verwendung fanden, zeigen die nicht reaktionsfähigen Seren eine höhere Fluoreszenz als die Antigun-Probenträger mit reaktionsfähigen Seren. Die Meßwertdifferenz Δ FSE (die Fluoreszenz-Signaleinheiten des Antigen-Probenträgers abzüglich der Fluoreszenz-Signaleinheiten des leeren Probenträgers zur Kontrolle) war bei reaktionsfähigen Seren viel höher als bei nicht reaktionsfähigen Seren.

Ausführungsbeispiel 4
Zweiseitiger oder Zweioberflächen-Probenträger

In derselben Weise wie oben beschrieben, wurde eine Testreihe durchgeführt, dabei wurde für jede unbekannte Substanz der Test einmal mit zwei Probenträgern und ein zweites Mal mit einem einzigen Probenträger mit zwei Testoberflächen auf seinen einander gegenüberliegenden Seiten mit den nachfolgend in Tabelle IV aufgestellten Ergebnissen durchgeführt, die anzeigen, daß annehmbare Ergebnisse mit den beiden Testoberflächen auf einem einzigen Probenträger erhalten werden.

Die Testverfahren stimmten überein bis auf den Unterschied, daß bei jedem Test mit zwei Probenträgern die verwendete Serumprobe 15 μΙ Serum in 600 μΐ einer Pufferlösung darstellte, während bei den Tests mit den doppelseitigen Probenträgern die verwendeten Serumproben 25 μΙ Serum in 1000 μΙ Pufferlösung umfaßten. Es kann also bei dem doppelseitigen Probenträger weniger Lösung verwendet werden, um die aktiven Oberflächen mit der Lösung bedeckt zu halten.

Tabelle IV

Prnbe

F.rwarteler
Tilcr

Probe Erwarteter
Nr. Titer

Titer mit Titer mit zwei

doppelseitigem Probenträgem
Proben träger

1	8	5	5
2	8	5	5
3	8	6	6
4	8	7	7
5	8	5	5
6	8	10	13
7	8	9	8
8	8	6	8
9	8	8	10
10	8	19	18
11	8	19	21
12	8	11	14
13	OO	12	17
14	8	12	12
15	8	14	12

Tiler mil

doppelseitigem

Probenlräger

Tiier mit zwei
Probenlrägern

17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27

16

Io

16

32

32

64

64

128

128

256

512

20
34
22
52
52

476
52

106
73

249

202

29
36
31
56
94

232
44

150
81

240

280

Ausführungsbeispiel 5

Zweioberflächen-Probe auf den Virustyp

»Herpes Simplex Iw(HSV-I) und den

Cytomegalovirus (CMV)

Es wurde eine Testreihe durchgeführt, um zu demonstrieren, daß das Verfahren nach der Erfindung für Proben auf HSV-I und CMV geeignet ist. Diese Tests wurden, wie oben beschrieben, unter Einsatz von zwei Probenträgern und in Pufferlösung im Verhältnis 40 :1 aufgelösten Serumproben ausgeführt. Für die Probe auf HSV-I wurden die Probenträger wie folgt präpariert:

Eine kreisförmige Scheibe mit einem Durchmesser von 6,6 mm, aus »Millipore«, Typ »HAMK«, ein Copolymer aus Zellulosenitrat und Zelluloseazetat, wurde durch einen doppelseitig klebenden Streifen an einem Probenträger befestigt, und dann wurden 25 μΙ eines im Handel verfügbaren H V-CF-Antigens (Flow Laboratories, Katalog-Nr. 40-607-44, Charge Nr. V 948036) auf die Scheibe getupft. Zur Kontrolle wurde eine andere Menge von 25 μΐ HV-CF-GewebekontrolI-Antigen (Flow Laboratories, Katalog-Nr. 41-607-44, Charge Nr. V 948035 C) auf eine andere Oberfläche desselben Typs getupfL Sowohl der Probenträger mit dem Antigen, als auch der Probenträger zur Kontrolle wurden bei 10% rristiver Feuchtigkeit bei 0 bis 8° C 24 Stunden ianggetrocknet.

Für die Probe auf Cytomegaloviren (CMV — Erreger der Zytomegalie) wurden die Probenträger mit den gleichen Scheiben präpariert, die in ähnlicher Weise an einem Probenträger befestigt waren. Auf eine Oberfläehe wurde eine Menge von 25 μΐ eines im Handel verfügbaren CMV-CF-Antigens (Flow Laboraties, Katalog-Nr. 40-613-44, Charge Nr. W 94*078) auf die Oberfläche getupft, und zur Kontrolle wurde eine

gleiche Oberfläche mit 25 μΙ eines CMV-CF-GewebekontroM-Antigens (Flow Laboratories, Katalog-Nr. 41-613-44, Charge Nr. W 946078 C) betupft. Wieder wurden beide Probenträger bei 10% relativer Feuchtigkeit bei 0 bis 8°C 24 Stunden lang getrocknet. Die Proben wurden ausgeführt, wie beim Ausführuiigsbeispiel I und 2 beschrieben. Die Ergebnisse wurden mit Proben verglichen, die nach dein Haemagglutir.-jibns-Inhibiiionsverfahien ausgeführt worden waren (siehe tabelle V).

Tabelle V

Probe Nr.	HSV-I	(ΗΛΙ)	Doppel-Probenträger	CMV(HAI)	Doppel-Probenlräger
			(HSV-I)		(CMV)
1	8;	<8	9	128;256	140
2	1024;	2048	500	64; 64	500 +
3	256		280	128;128	140
			1 I	IT· if.	17
5	12:	64	198	32; 64	132
6	<8;	<8	6	<8;<8	6
7	8;	8	11	<8;<8	13
8	128;	256	500	<8;	8.5
9	<8		8	1024	500 +
10	256;	128	210	64;128	5(K) +
11	128		90	16; 32	48
12	128;	256	210	128	16
13	32		290	128	310
14	<8		6,5	<8	7
15	8		7	8	7
16	<8		26	256	500
17	<8		7,6	<8	7
18	<8		6	<8	50
19	128		145	8; 16	8.5
20	256		500	128	500
21	16		11	'256:512	500
22	16		12	NSR	8.5
23	<8		15	32	170
24	128:	;256	310	<8	10
25	16:	; 32	10	32	7
26	<8		<5	<8
27	<8		<5	<8	<2

Ausfühs ungsbeispiei 6 Zweioberfläcrienverfahren für IgM, IgG

Er. wurde eine Testreihe durchgeführt, um_die Konzentration von Anti-Rubeiia-Antikörpem des ; yps IgM im Serum von Patienten in dem Verlauf der Zeit abzuschätzen. Diese Proben wurden durchgeführt wie beim Ausführungsbeispiel 1 und 2 beschrieben. Bei den Tests mit IgG war die Lösung in dem dritten Reagenzglas mit Fiijorsj-eiH-isothiozyanat (FITC) als Aiihäiigerstoff markiertes Ämihuman-IgG (aus der Ziege), für die Tests mit IgM enthielt das dritte Reagensglas monospezitisches, snit FITC als Anhängerstoif versehenes Antihuman-IgM (aus der Ziege). Zusätzlich wurden die Proben im Reagensglas i im Verhältnis 1 :10 für die IgM-Tests verdünnt. Die IgM-S'findardJsierung wurde «rrhsHe™. durch Verwendung von Serum aus einer kürzlich aufgetretenen Rubeiia-Infektion als Eichwert für den oberen oder hohen Wert Die Gegenwart von IgM-Antikörpern wurde nach dem sogenannten ELISA-Verfahren nachgeprüft (Vosier, A. und Bidwell, D. E. in Brit J. Exptl. Pathol. 57: 243 (3976)). Vergleichende Tests wurden an einer Anzahl von Serumproben von verschiedenen Patienten vollzogen, wobei auf das Vorhandensein von IgG wie nach den Ausführungsbeispielen 1 und 2 und das Vorhandensein von IgNi in. derselben Weise wie nach dem Ausführungsi: rspiel 1 getestet wurde, jedoch mit dem IgM-Antikörper wie oben beschrieben, und zwar durch das standardisierte Haemaggbtinations-Ιη-hibitionsverfahren. Diese Proben wurden auch nach einem für \gG sp-ezifi-jehen FLISA-Vcrfahr«: und nacis ei?em für JgM spezifischer. HLISA-Verfahren getestet. Die cigebr.jjse sind im folgenden (Tabelle Vi) tabeüisrt.

	Tabelle VI	HAI	28 51	150	16	IgM	IgM
15	Patienten-Probe	(Titer)				ELISA	(Titer)
und Zeit				(log. Absorb)
		IgG	IgG
P, 8 Tge	< 10	(Titer)	ELISA		3,0
nach Immunisierung			0*/ml)
P, 11 Tge	< 10				5,0
nach Immunisierung		4,2
P, 27 Tge	20				16,0
nach Immunisierung		4,7
P, 34 Tge	20				34,0
nach Immunisierung		6,8
M, VOr	< 10				5,2
Immunisierung		TS
M, 27 Tge	80				78,0
nach Immunisierung	8« 4)	4,2		2,4	<2
R 3/4	512			25	2.0
R 3/23	16	64,0		1,543	160
V/ 3/4	128	3,8	22,4	0,865	60
W 3/23	32	190,0	447	2,144	12
Ch 3/4 16/8	128	9,5	8,9	1,202	<2
Ch 3/22 64		40,8	141,2
Ca 11/4	32/64	13,33	8,9		12
8 durch CF	32/64	11,16	89,0		10
CA 11/14
	27
	22

Das oben beschriebene Oberflächentestverfahren ist auch bei fluorimetrischen immunologischen Proben auf den Epstein-Barr-Virus und aufToxoplasma angewendet worden.

Ausführungsbeispiel 7 Toxoplasma

Es wurde eine Testreihe ausgeführt, um die Einsatzmöglichkeit des erfindungsgemäßen Zweioberflächen-Vefahrens bei fluorimetrischen immunologischen Proben auf Toxoplasma zu demonstrieren. Im wesentlichen wurde dieser Test ausgeführt, wie nach Ausführungsbeispiel 1 und 2 beschrieben, bis auf die Ausnahme, daß die beiden Probenträger für jede Probe wie folgt präpariert wurden:

Eine kreisförmige Scheibe aus »Millipore« Typ »HAMK«, einem Copolymer aus Zellulosenitrat und Zelluloseazetat, wurde an einem Probenträger durch doppelseitig klebendes Band befestigt Eine Menge von 10 μΙ lösbarem Antigen zu Toxoplasma gondii, das nach dem Verfahren vor Walls u.a. bereitet worden war, (K. W. Walls; S. L Bullock; D. K. English; in J. Clin. Microbiol. 5:273 (1977)) wurde auf die Scheibe aufgetupfL Die Probenträger wurden bis auf eine relative Feuchtigkeit von etwa 10% bei 0 bis 8" C 24 Stunden lang getrocknet

Bei einer Gruppe von Serumproben wurden Tests nach dem Verfahren von Kelen u. a. ausgeführt (Kelen, A. E.; Ayllon-Leindl, N. A.; Labzoffsky, in Can. J. Microbiol. 8: 545 (1962)), um die »erwarteten Titer« festzulegen. Die Proben wurden dann, wie im Ausfiihrungsbeispiel 1 und 2 beschrieben, durchgeführt, und die folgenden Ergebnisse (Tabelle VII) erhalten.

Tabelle VlI	Erwarteter Titer	Antigen-Probe	Kontroll-Probe	Differenz	230 247/437
Probe, Kennziffer	512	147	35	112
Eichlösg. I	512	171	40	Ol
Eichlösg. I	256	101	28	73
Eichlösg. II	256	101	28	73
Eichlösg. II	64	65	20	45
Eichlösg. III	64	45	21	24
Eichlösg. HI	16	36	20	16
Eichlösg. IV	16	33	19	14
Eichlösg. IV	16	84	72	12
Nassau i	16	41	17	24
Nassau 2	16	53	35	18
Nassau 3	64	65	26	39
Nassau 4	64	100	28	72
Nassau 5	64	74	29	45
Nassau 6	256	109	36	73
Nassau 7	256	112	30	82
Nassau 8

Fortsetzung Probe, Kennziffer Erwarteter Titer Antigen-Probe Kontroll-Probe

Differenz

Nassau 9	256	112	28	84
Nassau 10	1024	91	38	53
Nassau 11	1024	100	57	43
Nassau 12	1024	81	30	51
Nassau 13	4096	87	27	60
Nassau 14	4096	234	51	183
Nassau 15	4096	104	34	70
Nassau 16	16384	205	24	181

In allen diesen Beispielen wird das Verfahren als Fluoroimmunoassay dargestellt Das Zweioberflächen-Verfahren gemäß der Erfindung kann aber auch bei radioaktiven und mit Enzymen arbeitenden immunologischen Untersuchungen eingesetzt werden. Es kann also, wie in den Ausführungsbeispeilen 1 und 2 gezeigt, ein Immunoassay auf Rubella mit einem mit radioaktivem Anhängerstoff versehenen Antikörper statt mit einem fluoreszierenden Antikörper ausgeführt werden; abschließend werden die Oberflächen mit einem Zähler für radioaktive Strahlung statt eines Fluoreszenzmessers gemessen. Bei Verwendung radioaktiver Anhängerstoffe gibt es allerdings einen wichtigen Unterschied: Die beiden Oberflächen, die beide der Serumprobe ausgesetzt werden, sind nicht, wie im Ausführungsbeispiel 4 beschrieben, auf einem einzigen Probenträger angebracht, weil die Möglichkeit besteht, daß die Strahlung von einer Oberfläche die Messung der Strahlung von der anderen Oberfläche beeinflußt Es ist vorstellbar, daß ein Probenträger mit zwei Oberflächen für Radioimmunoassay mit hinreichender Schirmung oder räumlicher Trennung zwischen den Oberflächen entwickelt werden könnte. Aber bei einem Radioimmunoassay ist die Schaffung von zwei Testoberflächen auf demselben, d. h. einem einzigen Probenträger nicht so gut geeignet wie bei Fluoreszenztests.

Soweit das Zweioberflächen-Verfahrer nach der Erfindung bei immunologischen Untersuchungen mit Enzymen eingesetzt wird, kann es erforderlich sein, beide Oberflächen in verschiedenen aliquoten Teilmengen desselben Serums zu behandeln, um störende Reaktionen zu unterbinden. Jedoch kann es unter gewissen Umständen vorteilhaft sein, einen Zweioberflächen-Probenträger für immunologische Proben in derselben Weise zu behandeln wie den Probenträger in den oben gezeigten Ausführungsbeispielen. Außer diesen Unterschieden zwischen immunologischen Untersuchungen mit radioaktiven Substanzen, Enzymen und fluoreszierenden Anhängerstoffen kann das erfin dungsgemäße Verfahren in allen drei Fällen verwendet werden, wo die beiden Oberflächen auf verschiedene Weise auf das Serum reagieren, wobei eine Oberfläche mit einem breiten Spektrum von Bestandteilen unter Ausschluß des gewünschten Bestandteils reagiert, so daß beide Oberflächen .mit demselben Serum in Berührung gebracht und eine quantitative Messung für einen bestimmten Antikörper als Meßwertdifferenz bei der Messung an beiden Oberflächen erhalten werden kann.

40

Claims (2)

1. Patentansprüche:

   t. Verfahren zur immunologischen Untersuchung einer Serumprobe, die eine unbekannte Menge eine Störstoffs enthalten kann, auf das Vorhandensein eines bestimmten, nachzuweisenden Antikörpers mit Hilfe einer Oberfläche, an die ein Antigen für den nachzuweisenden Antikörper gebunden ist, und einer markierten Substanz, die zur Bindung an den Antikörper befähigt ist, dadurch gekennzeichnet, daß eine zweite Oberfläche verwendet wird, die ein breites Spektrum von Proteinsubstanzen einschließlich des Störstoffes, aber keine erhebliche Menge des nachzuweisenden Antikörpers zu binden vermag, und daß die immunologische Analyse der unbekannten Serumprobe durchgeführt wird, indem beide Oberflächen zuerst in die Probe und danach in die markierte Substanz eingetaucht werden und schließlich die Differenz zwischen den Mengen der markierten Substanz an der ersten und an der zweiten Oberfläche gemessen wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die immunologische Analyse der unbekannten Serumprobe wie folgt ausgeführt wird: