DE2851150C2 - Verfahren zur immunologischen Untersuchung einer Serumprobe - Google Patents
Verfahren zur immunologischen Untersuchung einer SerumprobeInfo
- Publication number
- DE2851150C2 DE2851150C2 DE2851150A DE2851150A DE2851150C2 DE 2851150 C2 DE2851150 C2 DE 2851150C2 DE 2851150 A DE2851150 A DE 2851150A DE 2851150 A DE2851150 A DE 2851150A DE 2851150 C2 DE2851150 C2 DE 2851150C2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- sample
- test
- rubella
- antigen
- serum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/962—Prevention or removal of interfering materials or reactants or other treatment to enhance results, e.g. determining or preventing nonspecific binding
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
(a) gleichzeitiges Eintauchen aer beiden Oberflächen in dieselbe aliquote Teilmenge der Probe,
(b) anzuschließendes gleichzeitiges Eintauchen der beiden Oberflächen in dieselbe aliquote Teilmenge einer mit einem fluoreszierenden Stoff
markierten Substanz, und daraufhin Messung der Differenz der Mengen der von der ersten
und von der zweiten Oberfläche ausgesendeten fluoreszierenden Strahlung.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß jeweils nach den Schritten (a) und (b)
die beiden Oberflächen gleichzeitig in eine Salzlösung zur Waschung eingetaucht werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die immunologische Analyse an der
unbekannten Serumprobe durchgeführt wird, indem die beiden Oberflächen jeweils in verschiedene
gleiche Mengen derselben unbekannten Scrumprobe und verschiedene gleiche Mengen der markierten
Substanz eingetaucht werden.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die markierte Substanz ein Antihuman-Antikörper ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche I bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen ein
Virus-Antigen ist
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen ein Antigen des
Rubellavirus, ein Cytomegalovirus-Amigen oder ein
Antigen des Herpes-Simplex-Virus ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen ein
bakterielles Antigen ist.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen das Antigen von
Treponema-pallidum-Bakterien, ein Antigen eines parasitären Organismus oder ein Antigen von
Toxoplasma Gondii ist.
10. Verfahren nach Anspruchs, dadurch gekennzeichnet, daß der Antihuman-Antikörper ein Antihuman-lmmunoglobulin ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Antihuinan-Antikörper Antihuman-Immunoglobulin M ist.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur immunologischen Untersuchung einer Serumprobe, die eine
unbekannte Menge eines Störstoffs enthalten kann, auf
ίο das Vorhandensein eines bestimmten, nachzuweisenden
Antikörpers mit Hilfe einer Oberfläche, an die ein Antigen für den nachzuweisenden Antikörper gebunden
ist, und einer markierten Substanz, die zur Bindung an
den Antikörper befähigt ist
Solche Untersuchungsverfahren sind bereits bekannt (DE-OS 25 09 215). Ihre Durchführung war aber bisher,
wie nachstehend anhand von Beispielen geschildert wird, etwas umständlich.
heit von kurzer Dauer. Sie wäre von geringer Bedeutung, gäbe es nicht die schweren Schäden bei
Neugeborenen, die aus einer Rötelinfektion im Mutterleib im ersten Vierteljahr der Schwangerschaft resultieren. Somit ist die Bestimmung des Immunitätszustandes
bei einzelnen Personen als Mittel zur Verhütung dieser Geburtsschäden wichtig. Serologische Bestimmungen
von Röteln werden zur Feststellung des Immunitätszustandes bei einzelnen Personen in einer vorgegebenen
Population (insbesondere Frauen im gebärfähigen
Alter) eingesetzt, so daß diejenigen geimpft werden
können, die ohne Schutz sind. Die Bestimmungen werden zur Einschätzung des Immunitätszustandes bei
Schwangeren herangezogen, um ihnen bei der Möglichkeit von Infektionen im Mutterleib helfen zu können.
Schließlich dient die serologische Rubella-Bestimmung
als diagnostisches Hilfsmittel zur Erkennung von Krankheiten mit Exanthemen oder Ausschlagbildung.
Gegenwärtig steht eine Anzahl von Verfahren der Erkennung von Antikörpern des Rubellavirus zur
Verfugung. Das gebräuchlichste ist die Probe auf eine Haemagglutinations-Inhibition (HAI), die Serum-Neutralisationsprobe, die Complement-Fixierungsprobe
(CF) und die indirekte Immunofluoreszenzprobe (IF).
Bestimmte Viren, die Rubella einschließen, besitzen
die Fähigkeit, sich mit roten Blutkörperchen zu
verbinden und diese zum Verkleben zu bringen (Haemagglutination). Wenn sich nun Rubella-Antikörper mit dem Virus verbinden, so verhindern sie die
Verklebung roter Blutkörperchen. Stewart u.a. (Ste
wart, G. L.; Parkmann, P. D.; Hop,«, H. E; Dougals,
R. D.; Hamilton, J. P.; und Meyer, H. M. in New Eng. J. Med. 276: 554 (1967)) verwendeten diese Eigenschaft
des Rubellavirus zur Entwicklung der Probe auf Haemagglutinations-Inhibition (HAI oder HI). Da die
HI-Probe als erste beschrieben worden war, sind viele Abwandlungen dieses Verfahrens hervorgebracht worden. Dies hat die Zentralstelle für Krankheitsüberwachung des US-Gesundheitsministeriums (CDC —
Center for Disease Control) veranlaßt, ein standardisier
tes Verfahren anzubieten, nämlich den standardisierten
Haefnägglutinations-Inhibitionstest (Bezeichnung: »Immunology Series No. 3 U.S.D. H.E.W.«, C.D.C, Atlanta,
Georgia, V. St. A, Oktober 1970).
Die Serum-Neutralisationsprobe auf Rubella, die
zuerst von Parkman u. a. (Parkman, P. D.; Buescher,
E. L; Artenstein, M. S. in Proc. So. Exp. Biol. Med. 3:225
(1962)) beschrieben worden ist, beruht auf der Tatsache, daß mit Antikörpern kombinierte Viren nicht mehr
infektionserzeugend sind.
Für Rubella ist ebenfalls eine Complement-Fixierungsprobe von Linette, E H, in »Diagnostic Procedures for Viral and Ricketisial Diseases«, 3. Auflage, New
York 1964, American Public Health Association, Seite 1 bis 66, beschrieben worden. Diese beruht auf der
Fähigkeit des Antikörper/Rubellavirus-Komplexes, ein
Komplement zu binden oder zu fixieren.
Brown u. a. (Brown, G. C; Massab, H. F.; Veronelli,
J. A.; und Francis, T, Jr.) haben nach Science 145: 943
(iS64) und Schaeffer u. a. (Schaeffer, M.; Orsi, E. V.; und
Widelock D.;) nach Bact Rev. 28: 402 (1964) eine indirekte Immunofluoreszenzprobe auf Rubella entwikkelL Bei dieser Probe wurden mit Rubella infizierte
Zellen auf Mikroskopschiebern fixiert Die fixierten Zellen wurden einer Inkubation mit aufgelösten
Serumproben unterzogen. Rubella-Antikörper in der Serumprobe verbinden sich dabei mit Rubella-Antigenen in den fixierten Zellen. Die Rubella-Antikörper auf
den Zellen wurden dabei mit einem mit fluoreszierendem Anhängerstolf markierten Antihuman-Immunoglobuün-Antikörper festgestellt.
Diese bekannten Rubella-Tests weisen wegen ihrer
klinischen Komplexität, des großen Kostenaufwandes und Zeitbedarfs und wegen ihrer mangelnden quantitativen Zuverlässigkeit eine Anzahl von Nachteilen auf.
Aus diesem Grund war es wünschenswert einen neuen Rubella-Test zu entwickeln, bei dem Rubella durch eine
fluoreszenz-immunologische Untersuchung rasch, wirtschaftlich und mit verläßlichen quantitativen Ergebnissen nachgewiesen werden kann.
Es sind Fluoroirr.Tiiinoassays entwickelt worden, mit
denen Patienten auf das Vorhandensein einer bestimmten Komponente in einem Körperrnedium bzw. einer
Körperflüssigkeit dadurch getestet werden können, daß man
(a) eine bekannte Probe dieser Komponente an eine Trägeroberfläche bindet
(b) die Trägeroberfläche mit einer Probe des Körpermediums bzw. der Körperflüssigkeit in Berührung
bringt derart daß die darin befindlichen Antikörper von der Komponente auf der Trägeroberfläche
angezogen werden können, und
(c) die Oberfläche mit einem fluoreszierend markierten zweiten Antikörper zu dem ersten Antikörper
in Berührung bringt und die Fluoreszenz der resultierenden Oberfläche mißt.
Beispiele solcher Fluoroimmunoassays sind beschrieben in den US-PS 39 92 631, 39 99 948, 40 20 151,
40 25 310 und 40 56 724.
Eine Anpassung dieser Fluoroimmunoassayverfahren
an einen Rubella-Test wäre erwünscht und ist auch grundsätzlich möglich. Es ist aber mit Schwierigkeiten
verbunden, auf diesem Weg zuverlässige quantitative Ergebnisse zu erhalten. Offenbar wirken viele gleichzeitig wirksame Substanzen störend auf das eigentliche
Immunoassayverfahren ein, wenn diese als Testverfahren auf Rubella angewendet werden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der eingangs genannten Gattung zu schaffen,
das dem Einfluß störender Stoffe weitgehend entzogen ist quantitativ verläßliche Ergebnisse liefert und dabei
rasch und einfach ohne großen Kostenaufwand ausführbar ist. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß
durch die in dem Patentanspruch I genannten Merkmale gelöst.
Verschiedene Möglichkeiten zur vorteilhaften weiteren Ausgestaltung dieses Verfahrens sind in den
Ansprüchen 2 bis 11 angegeben.
Das Verfahren gemäß der Erfindung zur immunologisehen Untersuchung von Serumproben eignet sich
besonders für Antirubella-Antikörper. Bei diesen zwei
Oberflächen-Testverfahren ist das Virusantigen direkt an die Testoberfläche gebunden. Dieses immunologische Untersuchungsverfahren kann mit Antigen-Auszü-
gen von Bakterien oder Protozoen ausgeführt werden,
die an die Testoberfläche gebunden sind. Vergleichbare
frühere immunologische Untersuchungen konnten nur
mit vollständigen Organismen ausgeführt werden.
is Aufhebung konkurrierender Reaktionen immunologische Untersuchungen, die bisher nicht möglich waren.
Der Mechanismus, mit dem die Reaktionen während des Verfahrens ablaufen, ist noch nicht vollständig geklärt
Es wird angenommen, daß der Fluoroimmunoassay für
AntirubeUa-Antikörper durch konkurrierende Reaktionen mit Immunoglobuline!! oder anderen SerumbestandteUen kompliziert wird. Diese konkurrierenden
Reaktionen werden von dem eigentlichen Endergebnis des Assay dadurch getrennt daß zwei Testoberflächen
statt einer einzigen zusammen verwendet werden, wobei die erste Oberfläche den nachzuweisenden
Antikörper bindet nämlich Antirubella-Antikörper, während die zweite Oberfläche die konkurrierenden
Proteine bindet die sonst störend auf die Zuverlässig
keit des Assay einwirken würden; dagegen bindet die
zweite Oberfläche praktisch nichts von dem nachzuweisenden Antikörper. Schließlich werden die beiden
Testoberflächen quantitativ auf eine Markierungssubstanz, vorzugsweise eine fluoreszierende Substanz,
untersucht und das Ergebnis des Assay wird als Differenz zwischen den Mengen der markierten
Substanz an der ersten und der zweiten Oberfläche gemessen.
grundsätzlich auf verschiedene Weist präpariert werden, vorzugsweise beide aus dem gleichen Material, was
aus herstellungstechnischen Gründen von Vorteil ist. Beide Testoberflächen können an einem Trägerkörper
vorgesehen sein, mit dem die Oberflächen bei der
Durchführung der Untersuchung gemeinsam bewegt
werden können. Die Testoberfläche kann aus einem porösen Copolymer hergestellt werden, an das sich die
Testsubstanz (z. B. das Antigen des Rubellavirus) nach der Trocknung bindet. Zur Bindung einer geeigneten
so Oberfläche eignet sich ein Copolymer aus Zellulosenitrat und Zelluloseazetat das unter der Handelsbezeichnung »Millipore« erhältlich ist. Unter bestimmten
Bedingungen können ferner die folgenden Stoffe als Trägermaterialien verwendet werden:
Polymere Kohlenwasserstoffe wie Polystyrol, Polyäthylen, Polypropylen, Polybutylen, Butylkautschuk und
andere synthetische Kautschukarten, Silikon-Kautschuk, Polyester, Polyamide, Zellulose und Zellulosederivate, Acrylate, Methacrylate und polymere Vinylver-
bindungen wie Vinylchlorid und Polyvinylfluorid. Copolymere wie aufgepfropfte Copolymere von Polystyrol sind ebenfalls geeignet. Außerdem kann die feste
Trägeroberfläche Kieselerdegel, Siliziumplättchen. Glas, unlösliches Eiweiß und metallische Oberflächen,
wie beispielsweise mit Tantal beschichtetes Glas umfassen.
An die zweite Oberfläche kann ein anderer immunologisch aktiver Stoff (z. B. ein Antigen zur
Kontrolle aus nicht infizierten Zellen) gebunden sein, der die gleichzeitig reagierenden Proteine des Blutserums,
wie Lipoproteine und Immunoglobuline bindet. Rs wurde gefunden, daß die zweite Testoberfläehe ».us
demselben Material, z. B. »Millipore«, wie die Tesiober
fläche für den Rubeliavirus-Test bestehen kann, ohne
daß ircendfcine Proteinsubstanz von vornhei^m as sie
gebunden wird.
Wie bereits erwähnt, sind die beiden Testoberflächen
vorzugsweise auf Probenträgern angebracht, die den
Transport der Testoberflächen während der Untersuchung erleichtern. Vorzugsweise sind beide Testoberflächen
auf einem einzigen Probenträger angebracht Dies ist besonders vorteilhaft beim Antinibella-Test, wo eine
unbeschichtete Oberfläche als zweite Oberfläche eingesetzt wird, so daß die Verfahrensschritte zur
Bindung eines Rubellavirus an die erste Oberfläche nicht die Präparierung der zweiten Testoberfläche
erschweren. Die Antirubella-Testoberfläche kann nach der intensiven Trocknung und Vorwäsche präpariert
werden. Zusätzliche Vorteile ergeben sich, wenn die intensive Trocknung bei starker Abkühlung, d.h. bei
Temperaturen im Bereich von etwa 0 bis 10°C, vorzugsweise 2 bis 6° C, ausgeführt wird.
Der Probenträger, bei dem ein Virusantigen an einen polymeren Träger gebunden ist, kann auch vorteilhaft
bei immunologischen Untersuchungen eingesetzt werden, die andere als die in den nachstehend beschriebenen
Ausführungsbeispielen behandelten sind. Dies gilt beispielsweise dann, wenn ein Probenträger mit dem
Virusantigen, das an ihn gebunden ist, Untersuchungen durch radio-immunologische oder mit Enzym-Markierung
arbeitende Verfahren statt einem Fluoroimmunoassay unterzogen wird. Außerdem können die Probenträger
mit einem an einen polymeren Träger gebundenen Virusantigen, mit Antigenen von anderen Viren als
dem Rubellavirus, beispielsweise dem Virus »Herpes Simplex I« und dem Cytomegalovirus (dem Erreger der
Cytomegalie) ausgeführt werden. Das Material kann auch mit Antigenen von Protozoen-Parasiten, wie
Toxoplasma Gondii, und Bakterien vom Stamm »Treponema pallidum« ausgeführt werden. Schließlich
kann das Verfahren, bei dem zw^i Oberflächen
derselben Behandlung einschließlich Inkubation mit einer unbekannten Serumprobe und anschließender
Messung der Differenz an zur Markierung dienenden Substanzen auf beiden Oberflächen unterworfen werden,
bei einer breiten Vielfalt von immunologischen Untersuchungen angewendet werden, um zusammenhängende
verläßliche Ergebnisse trotz der Anwesenheit störender Stoffe an dem Probenträger mit dem
unbekannten Serum zu erhalten, die normalerweise die Eindeutigkeit der Ergebnisse der Untersuchung beeinträchtigen
würden. So kann beispielsweise ein Immunoassay auf die quantitative Feststellung von Antikörpern
gegen den Syphiliserreger Treponema pallidum in Seren ausgeführt werden, wie es in einem der
nachfolgend beschriebenen Ausführungsbeispiele gezeigt wird.
Sind die Oberflächen für den Test vorbereitet, so wird die Untersuchung durch Bewegen beider Testoberflächen
nacheinander durch die folgenden Medien ausgeführt:
(a) eine verdünnte, z. B. auf Antirubella-Antikörper zu testende Se rumprobe,
(b) eine Waschlösung, hergestellt aus einer gepuffarten
Salzlösung,
(c) eint: gepufferte Salzlösung, die markierte Antihuman-Immunogbbuüsie
enihälr und schließlich
(d) eine abschließe;*..; eir.jr.seii»" W&atitt'-iwUng.
Dann werden die beiden Oberflächen auf das quantitative Vorhandensein von markiertem Stoff
ausgc-messen. Dabei können z. B. bei fluoridierender
Markierung übliche Fluoreszenzmeßgeräte verwendet werden. Die Fluoreszenzmeßwerte der beiden Oberflächen
werden voneinander subtrahiert, urn die Meßwertdifferenz zu bilden. Schließlich wird die Meßwertdifferenz
mit einer Kennlinie aus den aus Koiitroiteerumlosungen
mit bekannten Mengen erkannter Antirubella-Antikörper verglichen. Diese Berechnungen können,
sofern in geeigneter Weise programmiert, mit einem Mikroprozessor durchgeführt werden. Das Verfahren
kann auf verschiedene Weise abgewandelt werden. Die nachstehend an erster Stelle ?Js Ausführungsbeispiel
beschriebene Verfahrensweise hat besonders gut reproduzierbare und für praktische Zwecke brauchbare
Ergebnisse hervorgebracht
Ausführungsbeispi''1! i
Die Vorbereitung der Probenträger
Die Vorbereitung der Probenträger
Für das im folgenden beschriebene Ausführungsbeispiel
wurden Probenträger präpariert, die eine kreisrunde Scheibe mit einem Durchmesser von 6,6 mm aus dem
Material mit der US-Handelsbezeichnung »Millipore« Typ »HAMK« enthielten. Dieses Material ist ein
Copolymer aus Zellulosenitrat und Zelluloseazetat, das
als Sperrfiltermaterial zur Ausfilterung von Teilchen einer Größe von über 0,45 μΐη ausgelegt ist Eine große
Anzahl von Probenträgern wurde in der folgenden Weise präpariert:
Eine im Handel verfügbare Rubella-Antigenlösung wurde zum präparieren der Probenträger verwendet
Eine annehmbare Substanz muß einen Haemagglutinationstiter bei Verwendung von Erythrozyten eines einen
Tag alten Kükens als Indikatorzellen von mehr als 1 :128 und eine Proteinkonzentration von weniger als
11 Milligramm/Milliliter aufweisen. Das Diagnose-Antigen
für die Haemagglutinations-Inhibitionsprotoe (HI) aus der Charge Nr. C 96 1296 wurde von den
Flow-Laboratorien Rockville, Maryland, V.StA., erworben,
erfüllte diese Anforderungen und wurde im weiteren verwendet.
Eine Menge von 25 μΐ der Antigenlösung wurde auf
jeden der Probenträger aufgebracht. Die feuchten Probenträger wurden in eine Trocknungskammer bei 0
so bis 10° C eingelegt. Andere Experimente zeigen an, daß
Temperaturen von 0 bis 25° C annehmbare Ergebnisse lieferten. Durch eine Menge von Calciumchlorid mit der
US-Handelsbezeichnung »Drierite« wurde die Trocknungskammer trockengehalten, dieses Calciumchlorid
wurde alle 24 Stunden ersetzt.
Die Probent'äger wurden in der Trocknungskammer
48 Stunden gehalten, nach dieser Zeit waren die Probenträger mit der Trocknungsluft bei einer relativen
Luftfeuchtigkeit von weniger als etwa 10% im Gleichgewicluszustand. Dann wurden die Probenträger
aus der Trocknungskammer entnommen.
Dann wurde eine Waschlösung bereitet, die 0,05 ΐι,οΐ »Tris« (Hydroxymethyl)-Aniinomethan-Pufferlösung
mit einem pH-Wert von 8,6 mit 0,15 mol
Natriumc; .-IiJ, 0,1% NaN3 und 035% »Tween 20«
oder Pc'iyoxyaethy'ensorbitan-Monolaurr.. e.-jths·.:!* Die
getrockneten Probenträger wurden zehn Mir. <;n lang
in der Waschlösung getränkt, und dann wurde die
Waschlösung von den Probenträgern abgeschüttelt, die Probenlräger in die Trocknungskammer zurückgebracht
und dort 18 Stunden lang getrocknet, nach dieser Zeit erschienen sie bei der Sichtprüfung trocken.
Ausführungsbeispiel 2
Fluorimetrische immunologische Probe
Fluorimetrische immunologische Probe
Eine Wasch-Pufferlösung wurde mit 0,35% »Tween 20« oder Polyoxyaethylensorbitan-Monolaurat,
das einer mit »Tris« oder Hydroxymethylaminomethan gepufferten Salzlösung beigefügt worden war, gelagert
und abgekühlt. Es wurde eine Pufferlösung zur Verdünnung bereitet, die 0,35% »Tween 20« oder
Polyoxyaethylensorbitan-Monolaurat und 2,5% Albumin aus Rinderserum in mit »Tris« oder Hydroxymethylaminomethan
gepufferter Salzlösung enthielt. Vier Lösungen, 1 bis IV, wurden zur Eichung aus rekalzifiziertem
und entfettetem Humanplasma mit aus der Probe auf Rubella durch Haemagglutinations-Inhibition bekannten
Titern zubereitet. Der angenäherte Rubella-Titer jeder Eichungslösung wird in der nachfolgenden
Tabelle !gegeben:
Angenäherter Rubella-Titer (Kehrwert der stärksten
Verdünnung, die noch eine Haemagglutinations-Inhibition ergibt)
I
i;
i;
III
IV
IV
512
64
64
io
Ein Reagensröhrengestell wurde mit 12-75 Reagensröhren
mit Kulturen vorgesehen. Ein Milliliter der Verdünnungs-Pufferlösung wurde den Reagensröhren
in der ersten Reihe zugesetzt, und ein Milliliter der Wasch-Pufferlösung in der zweiten und vierten Reihe.
In die Röhren der dritten Reihe wurd ein Milliliter eines fluoreszierenden Reagens eingebracht, das aus Antikörpern
der Ziege auf Human-Immunoglobulin bestand,
wobei diese Antikörper mit Fiuoreszein-Isothiozyanat als Anhängerstoff versehen und in einer mit »Tris«
gepufferten Salzlösung, mit einem pH-Wert von 8,4, mit 2^% Albumin aus Rinderserum und 0,35% »Tween 20«
verdünnt worden war. Bei der ersten Reihe von Reagensröhren wurde eine Menge von 25 Millilitern
einer unbekannten Probe oder eine Eichlösung jeder Röhre zugesetzt. Eine Reagensröhre wurde für jede der
Eichlösungen und eine Röhre für jede der Serumproben verwendet.
Das Reagensröhrengestell wurde auf eine Horizontal-Schüttelvorrichtung
bei Raumtemperatur gestellt, dabei waren die Reagensröhren unter einem Winkel von 45° aufgestellt, so daß diese während der gesamten
Probendurchführung bewegt werden konnten.
Die wie oben erläutert präparierten Probenträger wurden in die erste Reihe von Reagensröhren
eingebracht, wobei jede Röhre eine Oberfläche mit dem gebundenen Rubella-Antigen und eine Oberfläche zur
Kontrolle enthielt, und man ließ die Probenträger dreißig Minuten lang Jer Bewegung ausgesetzt Dann
wurden die Prob-intrager zu den Reagensröhren in der
zweiten Reihe verlegt, und es wurde ein Schüttelvorgang von fünfminütiger Dauer ermöglicht, um von den
Testoberflächen jegliche überschüssigen Serumbestandteile abzuwaschen, die nicht an die Testoberflächen
gebunv-in waren. Dann wurden die Probenträger in die dritte Reihe der Reagensröhren gebracht, und ein
Schüttelvorgang von 30 Minuten Dauer ermöglicht, während irgendwelche auf den Probenträgern vorhandenen
Antikörper zu Rubellaviren und jegliche gleichzeitig mit diesen in Reaktionen tretenden Serumproteine
mit den fluoreszierend markierten Antihuman-Immunoglobulinen reagieren konnten. Schließlich wurden
die Proberiträger in die vierte Reagensröhrenreihe
gebracht, und es wurde zur abschließenden Waschung ein zehnminütiger Schüttelvorgang ermöglicht. Bei
jeder Verlegung der Probenträger wurde sowohl jeweils die an den Anti-Rubella-Antikörper gebundene
Oberfläche, als auch die zugehörige Oberfläche zur Kontrolle transferiert, derart, daß jeweils ein Testoberflächenpaar
jedes Reagenzglas durchlief.
Die wie oben beschrieben behandelten Testoberflä
chen wurden auf fluoreszierende Substanz in einem Fluoreszenzmeßgerät vom Typ FIAX 100 der Anmelderin
gemessen, und die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgend?"! Tabelle H niedergelegt, wobei die
Abkürzung »FSE« die Fluoreszenz-Signaleinheiten des Fluoreszenzme-.sers angibt.
Tabelle Π
Ein typisches Experiment: die Probe wurde ausgeführt, wie in den Anmerkungen angegeben.
Proben- | Riibella- | Kontroll- | Meß- | FIAX- | FIAX- | Haemagglutina- |
Kennzahl | Oberfl.- | Oberfl.- | wertdiff. | Titer | Ti ter | tions-Inhibitions- |
Proben träger | Proben träger | JFSE | (Zwei- | (Nur Rub.- | Titer(HAI) | |
FSE | FSE | oberfl.) | Oberfl.- | (C) | ||
(A) | Proben- | |||||
träger) | ||||||
(B) | ||||||
EichLI | 100 | 25 | 75 | 1024 | ||
EkfaLII | 69 | 26 | 43 | — | — | 320 |
Eichl. m | 56 | 23 | 32 | — | — | 64 |
Ekhl.IV | 32 | 24 | 8 | — | — | 16 |
9 | 28 | 51 1 | 50 | FIAX- | 10 | |
Titer | ||||||
Fortsetzung | Rubella- | (Nur Rub- | llaemagglutina- | |||
Proben- | Oberfl- | Kon trol I- | Meß- | FIAX- | Oberd,- | tions-Inhibitions- |
Kennzahl | Probenträger | Oberd- | wertdifT. | Titer | Proben- | Titer(HAI) |
FSE | Probenträger | JRE | (Zwei- | iräger) | (C) | |
FSE | oberll.) | (B) | ||||
(A) | 6,5 | |||||
9,5 + | ||||||
25 | 5,0 | <8 | ||||
1 (R 140) | 29 | 35 | -10 | <5 | 10,0 + | <8 |
2 (R 142) | 22 | 31 | - 2 | <5 | 14,0 + | <8 |
3(R 143) | 30 | 26 | - 4 | <5 | 6,5 | <8 |
4 (R 144) | 33 | 33 | - 3 | <5 | 20,0 | <8 |
5 (R 145) | 25 | 40 | - 7 | <5 | 22,0 | <8 |
6 (R 146) | 38 | 33 | - 8 | <5 | (JV/,U ί | 16 |
7 (R 161) | ?9 | 23 | 15 | 20 | 22,0 | 16 |
S (R 162) | 53 | 26 | 13 | 17 | 68,0 | 11 Jt |
y (K i65) | 39 | 32 | 2i | "» 4 JH |
40,0 | 32 |
10 (R !67) | 52 | 22 | 17 | 24 | 190,0 | 64 |
11 (R 178) | 46 | 24 | 28 | 60 | 54,0 | 64 |
12 (R 179) | 64 | 21 | 25 | 47 | 128 | |
13 (R 195) | 49 | 26 | 38 | 145 | 128 | |
14 (R 196) | 25 | 24 | 427 | |||
(A) Werte bestimmt aus einer Eichkurve, die durch Auftragen des HAI-Titers über der Meßwertdiflerenz
A FSE = FSE fur Rubella-StiQ'-Probenträger abzüglich FSE fur Kontroll-StiQ'-Probenträger erzeugt
worden war.
(B) Werte bestimmt aus einer Eichkurve, die durch Auftragen des HAI-Titers über den FSE-Werten für
RubeUa-StiQ'-Probenträger erzeugt worden war.
(C) HAI-Titer: bestimmt durch die Haemagglutinations-Inhibition (siehe standardisierter HAI-Test auf
Rubella. Immunol. Reihe Nr. 2, US-Gesundheitsministerium, Zentralstelle fur Krankheitsüberwachung,
Atlanta, Georgia, Oktober 1970). Die Titerwerte sind die Kehrwerte der stärksten Verbindung derSerumprobe, die noch die Haemagglutination zu verhindern vermag. Dieser Test wird als Referenzverfahren für
Rubellabestimmungen angesehen.
Hinweis: Die Proben mit den Kennzahlen 2,4,5 haben falsche positive Titer (>8) beim Einzel-StiQ'-Verfahren, jedoch negative Titer (<
8) beim DoppeA-StiQ'-Verfahren. Es liegt auch eine allgemein bessere
Übereinstimmung zwischen dem FIAX-Titer und dem HAI-Titerbei dem Doppel-StiQ'-Verfahren
als bei dem Einzel-StiQ'-Verfahren vor.
Ausführungsbeispiel 3
Zweioberflächen-Verfahren mit
Anti-Treponema-Antikörpern
Zweioberflächen-Verfahren mit
Anti-Treponema-Antikörpern
In einer der oben beschriebenen Vorgehensweise ähnlichen Verfahrensweise wurden Probenträger präpariert,
mit aus »Millipore« Typ »HAMK« hergestellten aktiven Oberflächen. Eine Gruppe von Probenträgern
wurde mit einer Menge von 10 μΐ an speziell gereinigten
FTA-ABS-Antigenen (Beckmann, Katalog-Nr. 251041 - Charge Nr. E6 00315) betupft und bei 0 bis 8°
zv. i;::?r ^tvnden lang bei einer relativen Feuchtigkeit
von weniger als 1«.. ^ -. .~ck-?t
Es wurde eine Gruppe von Proben vorbereitet, durch
Verdünnung reaktionsfähiger »Treponema pallidum«- Seren (d.h. Seren, die Antikörper zu Treponema
pailidum enthielten) und nicht mit Treponema pallidum
reaktionsfähiger Seren (d. h. Seren, die keine Antikörper
zu Treponema pallidum enthielten). Diese verdünnten Proben wurden mit normalem Kaninchenserum
hergestellt. Weitere Verdünnungen der reaktionsfähigen und nicht reaktionsfähigen Seren wurden mit einer
Pufferlösung bereitet, die 0,05 mol »Tris« HCl, pH-Wert
8,2, 0,15 mol NaCI, 0,005 mol EDTA, 0,1% »Tween 20« und 2% Albumin aus Rinderserum enthielt.
Diese Verdünnungen wurden hergestellt, um die
unten angegebenen endgültigen Probenlösungen zu schaffen. Ein Paar aus je einem behandelten und einem
unbehandelten Probenträger wurde in jede der Serumproben eingebracht und 30 Minuten geschüttelt
Dann wurden die Probenträger zehn Minuten lang in einer Pufferlösung gewaschen und dann 30 Minuten in
einer Verdünnung im Verhältnis 1 :50 von mit Fluoreszin-Isothiozyanat als Anhängerstoff markiertem
Antihuman-Immunoglobulin geschüttelt und schließlich
zehn Minuten lang gewaschen. Die beiden Probenträger wurden dann in einem Fluoreszenzmeßgerät, Typ FIAX
100, der Anmelderin auf fluoreszierenden Stoff mit den j folgenden Ergebnissen (in Tabelle III) gemessen:
If
Tabelle ΠΙ | ( | reaktionsfähig | Endgültige Lösung | Antigen | Kontra |
Probe (Serum) | reaktionsfähig | Verd.) | FSE | FSE | |
reaktionsfähig | :10 | 56 | 30 | ||
nicht reaktionsfähig | :20 | 46 | 28 | ||
nicht reaktionsfähig | :40 | 37 | 28 | ||
nicht reaktionsfähig | :10 | 89 | 120 | ||
:20 | 52 | 61 | |||
■40 | 34 | 41 | |||
MeßwertdifTerenz A FSE
-31
- 9
- 7
Dadurch, daß gerade die Antigen-Probenträger Verwendung fanden, zeigen die nicht reaktionsfähigen
Seren eine höhere Fluoreszenz als die Antigun-Probenträger mit reaktionsfähigen Seren. Die Meßwertdifferenz
Δ FSE (die Fluoreszenz-Signaleinheiten des Antigen-Probenträgers
abzüglich der Fluoreszenz-Signaleinheiten des leeren Probenträgers zur Kontrolle) war
bei reaktionsfähigen Seren viel höher als bei nicht reaktionsfähigen Seren.
Ausführungsbeispiel 4
Zweiseitiger oder Zweioberflächen-Probenträger
Zweiseitiger oder Zweioberflächen-Probenträger
In derselben Weise wie oben beschrieben, wurde eine Testreihe durchgeführt, dabei wurde für jede unbekannte
Substanz der Test einmal mit zwei Probenträgern und ein zweites Mal mit einem einzigen Probenträger mit
zwei Testoberflächen auf seinen einander gegenüberliegenden Seiten mit den nachfolgend in Tabelle IV
aufgestellten Ergebnissen durchgeführt, die anzeigen, daß annehmbare Ergebnisse mit den beiden Testoberflächen
auf einem einzigen Probenträger erhalten werden.
Die Testverfahren stimmten überein bis auf den Unterschied, daß bei jedem Test mit zwei Probenträgern
die verwendete Serumprobe 15 μΙ Serum in 600 μΐ
einer Pufferlösung darstellte, während bei den Tests mit den doppelseitigen Probenträgern die verwendeten
Serumproben 25 μΙ Serum in 1000 μΙ Pufferlösung
umfaßten. Es kann also bei dem doppelseitigen Probenträger weniger Lösung verwendet werden, um
die aktiven Oberflächen mit der Lösung bedeckt zu halten.
Prnbe
F.rwarteler
Tilcr
Tilcr
Probe Erwarteter
Nr. Titer
Nr. Titer
Titer mit Titer mit zwei
doppelseitigem Probenträgem
Proben träger
Proben träger
1 | 8 | 5 | 5 |
2 | 8 | 5 | 5 |
3 | 8 | 6 | 6 |
4 | 8 | 7 | 7 |
5 | 8 | 5 | 5 |
6 | 8 | 10 | 13 |
7 | 8 | 9 | 8 |
8 | 8 | 6 | 8 |
9 | 8 | 8 | 10 |
10 | 8 | 19 | 18 |
11 | 8 | 19 | 21 |
12 | 8 | 11 | 14 |
13 | OO | 12 | 17 |
14 | 8 | 12 | 12 |
15 | 8 | 14 | 12 |
Tiler mil
doppelseitigem
Probenlräger
Tiier mit zwei
Probenlrägern
Probenlrägern
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
16
Io
16
32
32
64
64
128
128
256
512
20
34
22
52
52
34
22
52
52
476
52
52
106
73
73
249
202
29
36
31
56
94
36
31
56
94
232
44
44
150
81
81
240
280
Ausführungsbeispiel 5
Zweioberflächen-Probe auf den Virustyp
»Herpes Simplex Iw(HSV-I) und den
Cytomegalovirus (CMV)
Es wurde eine Testreihe durchgeführt, um zu demonstrieren, daß das Verfahren nach der Erfindung
für Proben auf HSV-I und CMV geeignet ist. Diese Tests wurden, wie oben beschrieben, unter Einsatz von
zwei Probenträgern und in Pufferlösung im Verhältnis 40 :1 aufgelösten Serumproben ausgeführt. Für die
Probe auf HSV-I wurden die Probenträger wie folgt präpariert:
Eine kreisförmige Scheibe mit einem Durchmesser von 6,6 mm, aus »Millipore«, Typ »HAMK«, ein
Copolymer aus Zellulosenitrat und Zelluloseazetat, wurde durch einen doppelseitig klebenden Streifen an
einem Probenträger befestigt, und dann wurden 25 μΙ eines im Handel verfügbaren H V-CF-Antigens (Flow
Laboratories, Katalog-Nr. 40-607-44, Charge Nr. V 948036) auf die Scheibe getupft. Zur Kontrolle wurde
eine andere Menge von 25 μΐ HV-CF-GewebekontrolI-Antigen
(Flow Laboratories, Katalog-Nr. 41-607-44, Charge Nr. V 948035 C) auf eine andere Oberfläche
desselben Typs getupfL Sowohl der Probenträger mit dem Antigen, als auch der Probenträger zur Kontrolle
wurden bei 10% rristiver Feuchtigkeit bei 0 bis 8° C
24 Stunden ianggetrocknet.
Für die Probe auf Cytomegaloviren (CMV — Erreger der Zytomegalie) wurden die Probenträger mit den
gleichen Scheiben präpariert, die in ähnlicher Weise an einem Probenträger befestigt waren. Auf eine Oberfläehe
wurde eine Menge von 25 μΐ eines im Handel verfügbaren CMV-CF-Antigens (Flow Laboraties, Katalog-Nr.
40-613-44, Charge Nr. W 94*078) auf
die Oberfläche getupft, und zur Kontrolle wurde eine
gleiche Oberfläche mit 25 μΙ eines CMV-CF-GewebekontroM-Antigens
(Flow Laboratories, Katalog-Nr. 41-613-44, Charge Nr. W 946078 C) betupft. Wieder
wurden beide Probenträger bei 10% relativer Feuchtigkeit bei 0 bis 8°C 24 Stunden lang getrocknet. Die
Proben wurden ausgeführt, wie beim Ausführuiigsbeispiel
I und 2 beschrieben. Die Ergebnisse wurden mit Proben verglichen, die nach dein Haemagglutir.-jibns-Inhibiiionsverfahien
ausgeführt worden waren (siehe tabelle V).
Probe Nr. | HSV-I | (ΗΛΙ) | Doppel-Probenträger | CMV(HAI) | Doppel-Probenlräger |
(HSV-I) | (CMV) | ||||
1 | 8; | <8 | 9 | 128;256 | 140 |
2 | 1024; | 2048 | 500 | 64; 64 | 500 + |
3 | 256 | 280 | 128;128 | 140 | |
1 I | IT· if. | 17 | |||
5 | 12: | 64 | 198 | 32; 64 | 132 |
6 | <8; | <8 | 6 | <8;<8 | 6 |
7 | 8; | 8 | 11 | <8;<8 | 13 |
8 | 128; | 256 | 500 | <8; | 8.5 |
9 | <8 | 8 | 1024 | 500 + | |
10 | 256; | 128 | 210 | 64;128 | 5(K) + |
11 | 128 | 90 | 16; 32 | 48 | |
12 | 128; | 256 | 210 | 128 | 16 |
13 | 32 | 290 | 128 | 310 | |
14 | <8 | 6,5 | <8 | 7 | |
15 | 8 | 7 | 8 | 7 | |
16 | <8 | 26 | 256 | 500 | |
17 | <8 | 7,6 | <8 | 7 | |
18 | <8 | 6 | <8 | 50 | |
19 | 128 | 145 | 8; 16 | 8.5 | |
20 | 256 | 500 | 128 | 500 | |
21 | 16 | 11 | '256:512 | 500 | |
22 | 16 | 12 | NSR | 8.5 | |
23 | <8 | 15 | 32 | 170 | |
24 | 128: | ;256 | 310 | <8 | 10 |
25 | 16: | ; 32 | 10 | 32 | 7 |
26 | <8 | <5 | <8 | ||
27 | <8 | <5 | <8 | <2 |
Ausfühs ungsbeispiei 6
Zweioberfläcrienverfahren für IgM, IgG
Er. wurde eine Testreihe durchgeführt, um_die
Konzentration von Anti-Rubeiia-Antikörpem des ; yps
IgM im Serum von Patienten in dem Verlauf der Zeit abzuschätzen. Diese Proben wurden durchgeführt wie
beim Ausführungsbeispiel 1 und 2 beschrieben. Bei den Tests mit IgG war die Lösung in dem dritten
Reagenzglas mit Fiijorsj-eiH-isothiozyanat (FITC) als
Aiihäiigerstoff markiertes Ämihuman-IgG (aus der
Ziege), für die Tests mit IgM enthielt das dritte Reagensglas monospezitisches, snit FITC als Anhängerstoif
versehenes Antihuman-IgM (aus der Ziege). Zusätzlich wurden die Proben im Reagensglas i im
Verhältnis 1 :10 für die IgM-Tests verdünnt.
Die IgM-S'findardJsierung wurde «rrhsHe™. durch
Verwendung von Serum aus einer kürzlich aufgetretenen Rubeiia-Infektion als Eichwert für den oberen oder
hohen Wert Die Gegenwart von IgM-Antikörpern
wurde nach dem sogenannten ELISA-Verfahren nachgeprüft (Vosier, A. und Bidwell, D. E. in Brit J. Exptl. Pathol.
57: 243 (3976)). Vergleichende Tests wurden an einer Anzahl von Serumproben von verschiedenen
Patienten vollzogen, wobei auf das Vorhandensein von IgG wie nach den Ausführungsbeispielen 1 und 2 und
das Vorhandensein von IgNi in. derselben Weise wie
nach dem Ausführungsi: rspiel 1 getestet wurde, jedoch
mit dem IgM-Antikörper wie oben beschrieben, und
zwar durch das standardisierte Haemaggbtinations-Ιη-hibitionsverfahren.
Diese Proben wurden auch nach
einem für \gG sp-ezifi-jehen FLISA-Vcrfahr«: und nacis
ei?em für JgM spezifischer. HLISA-Verfahren getestet.
Die cigebr.jjse sind im folgenden (Tabelle Vi) tabeüisrt.
Tabelle VI | HAI | 28 51 | 150 | 16 | IgM | IgM | |
15 | Patienten-Probe | (Titer) | ELISA | (Titer) | |||
und Zeit | (log. Absorb) | ||||||
IgG | IgG | ||||||
P, 8 Tge | < 10 | (Titer) | ELISA | 3,0 | |||
nach Immunisierung | 0*/ml) | ||||||
P, 11 Tge | < 10 | 5,0 | |||||
nach Immunisierung | 4,2 | ||||||
P, 27 Tge | 20 | 16,0 | |||||
nach Immunisierung | 4,7 | ||||||
P, 34 Tge | 20 | 34,0 | |||||
nach Immunisierung | 6,8 | ||||||
M, VOr | < 10 | 5,2 | |||||
Immunisierung | TS | ||||||
M, 27 Tge | 80 | 78,0 | |||||
nach Immunisierung | 8« 4) | 4,2 | 2,4 | <2 | |||
R 3/4 | 512 | 25 | 2.0 | ||||
R 3/23 | 16 | 64,0 | 1,543 | 160 | |||
V/ 3/4 | 128 | 3,8 | 22,4 | 0,865 | 60 | ||
W 3/23 | 32 | 190,0 | 447 | 2,144 | 12 | ||
Ch 3/4 16/8 | 128 | 9,5 | 8,9 | 1,202 | <2 | ||
Ch 3/22 64 | 40,8 | 141,2 | |||||
Ca 11/4 | 32/64 | 13,33 | 8,9 | 12 | |||
8 durch CF | 32/64 | 11,16 | 89,0 | 10 | |||
CA 11/14 | |||||||
27 | |||||||
22 | |||||||
Das oben beschriebene Oberflächentestverfahren ist
auch bei fluorimetrischen immunologischen Proben auf den Epstein-Barr-Virus und aufToxoplasma angewendet
worden.
Ausführungsbeispiel 7
Toxoplasma
Es wurde eine Testreihe ausgeführt, um die Einsatzmöglichkeit des erfindungsgemäßen Zweioberflächen-Vefahrens bei fluorimetrischen immunologischen Proben auf Toxoplasma zu demonstrieren. Im
wesentlichen wurde dieser Test ausgeführt, wie nach Ausführungsbeispiel 1 und 2 beschrieben, bis auf die
Ausnahme, daß die beiden Probenträger für jede Probe wie folgt präpariert wurden:
Eine kreisförmige Scheibe aus »Millipore« Typ »HAMK«, einem Copolymer aus Zellulosenitrat und
Zelluloseazetat, wurde an einem Probenträger durch doppelseitig klebendes Band befestigt Eine Menge von
10 μΙ lösbarem Antigen zu Toxoplasma gondii, das nach
dem Verfahren vor Walls u.a. bereitet worden war,
(K. W. Walls; S. L Bullock; D. K. English; in J. Clin. Microbiol. 5:273 (1977)) wurde auf die Scheibe aufgetupfL
Die Probenträger wurden bis auf eine relative Feuchtigkeit von etwa 10% bei 0 bis 8" C 24 Stunden
lang getrocknet
Bei einer Gruppe von Serumproben wurden Tests nach dem Verfahren von Kelen u. a. ausgeführt (Kelen,
A. E.; Ayllon-Leindl, N. A.; Labzoffsky, in Can. J. Microbiol. 8: 545 (1962)), um die »erwarteten Titer« festzulegen. Die Proben wurden dann, wie im Ausfiihrungsbeispiel 1 und 2 beschrieben, durchgeführt, und die
folgenden Ergebnisse (Tabelle VII) erhalten.
Tabelle VlI | Erwarteter Titer | Antigen-Probe | Kontroll-Probe | Differenz | 230 247/437 |
Probe, Kennziffer | 512 | 147 | 35 | 112 | |
Eichlösg. I | 512 | 171 | 40 | Ol | |
Eichlösg. I | 256 | 101 | 28 | 73 | |
Eichlösg. II | 256 | 101 | 28 | 73 | |
Eichlösg. II | 64 | 65 | 20 | 45 | |
Eichlösg. III | 64 | 45 | 21 | 24 | |
Eichlösg. HI | 16 | 36 | 20 | 16 | |
Eichlösg. IV | 16 | 33 | 19 | 14 | |
Eichlösg. IV | 16 | 84 | 72 | 12 | |
Nassau i | 16 | 41 | 17 | 24 | |
Nassau 2 | 16 | 53 | 35 | 18 | |
Nassau 3 | 64 | 65 | 26 | 39 | |
Nassau 4 | 64 | 100 | 28 | 72 | |
Nassau 5 | 64 | 74 | 29 | 45 | |
Nassau 6 | 256 | 109 | 36 | 73 | |
Nassau 7 | 256 | 112 | 30 | 82 | |
Nassau 8 | |||||
Differenz
Nassau 9 | 256 | 112 | 28 | 84 |
Nassau 10 | 1024 | 91 | 38 | 53 |
Nassau 11 | 1024 | 100 | 57 | 43 |
Nassau 12 | 1024 | 81 | 30 | 51 |
Nassau 13 | 4096 | 87 | 27 | 60 |
Nassau 14 | 4096 | 234 | 51 | 183 |
Nassau 15 | 4096 | 104 | 34 | 70 |
Nassau 16 | 16384 | 205 | 24 | 181 |
In allen diesen Beispielen wird das Verfahren als Fluoroimmunoassay dargestellt Das Zweioberflächen-Verfahren gemäß der Erfindung kann aber auch bei
radioaktiven und mit Enzymen arbeitenden immunologischen Untersuchungen eingesetzt werden. Es kann
also, wie in den Ausführungsbeispeilen 1 und 2 gezeigt, ein Immunoassay auf Rubella mit einem mit radioaktivem Anhängerstoff versehenen Antikörper statt mit
einem fluoreszierenden Antikörper ausgeführt werden; abschließend werden die Oberflächen mit einem Zähler
für radioaktive Strahlung statt eines Fluoreszenzmessers gemessen. Bei Verwendung radioaktiver Anhängerstoffe gibt es allerdings einen wichtigen Unterschied: Die beiden Oberflächen, die beide der
Serumprobe ausgesetzt werden, sind nicht, wie im Ausführungsbeispiel 4 beschrieben, auf einem einzigen
Probenträger angebracht, weil die Möglichkeit besteht, daß die Strahlung von einer Oberfläche die Messung der
Strahlung von der anderen Oberfläche beeinflußt Es ist vorstellbar, daß ein Probenträger mit zwei Oberflächen
für Radioimmunoassay mit hinreichender Schirmung oder räumlicher Trennung zwischen den Oberflächen
entwickelt werden könnte. Aber bei einem Radioimmunoassay ist die Schaffung von zwei Testoberflächen auf
demselben, d. h. einem einzigen Probenträger nicht so
gut geeignet wie bei Fluoreszenztests.
Soweit das Zweioberflächen-Verfahrer nach der
Erfindung bei immunologischen Untersuchungen mit Enzymen eingesetzt wird, kann es erforderlich sein,
beide Oberflächen in verschiedenen aliquoten Teilmengen desselben Serums zu behandeln, um störende
Reaktionen zu unterbinden. Jedoch kann es unter gewissen Umständen vorteilhaft sein, einen Zweioberflächen-Probenträger für immunologische Proben in
derselben Weise zu behandeln wie den Probenträger in den oben gezeigten Ausführungsbeispielen. Außer
diesen Unterschieden zwischen immunologischen Untersuchungen mit radioaktiven Substanzen, Enzymen
und fluoreszierenden Anhängerstoffen kann das erfin
dungsgemäße Verfahren in allen drei Fällen verwendet
werden, wo die beiden Oberflächen auf verschiedene Weise auf das Serum reagieren, wobei eine Oberfläche
mit einem breiten Spektrum von Bestandteilen unter Ausschluß des gewünschten Bestandteils reagiert, so
daß beide Oberflächen .mit demselben Serum in Berührung gebracht und eine quantitative Messung für
einen bestimmten Antikörper als Meßwertdifferenz bei der Messung an beiden Oberflächen erhalten werden
kann.
40
Claims (2)
- Patentansprüche:t. Verfahren zur immunologischen Untersuchung einer Serumprobe, die eine unbekannte Menge eine Störstoffs enthalten kann, auf das Vorhandensein eines bestimmten, nachzuweisenden Antikörpers mit Hilfe einer Oberfläche, an die ein Antigen für den nachzuweisenden Antikörper gebunden ist, und einer markierten Substanz, die zur Bindung an den Antikörper befähigt ist, dadurch gekennzeichnet, daß eine zweite Oberfläche verwendet wird, die ein breites Spektrum von Proteinsubstanzen einschließlich des Störstoffes, aber keine erhebliche Menge des nachzuweisenden Antikörpers zu binden vermag, und daß die immunologische Analyse der unbekannten Serumprobe durchgeführt wird, indem beide Oberflächen zuerst in die Probe und danach in die markierte Substanz eingetaucht werden und schließlich die Differenz zwischen den Mengen der markierten Substanz an der ersten und an der zweiten Oberfläche gemessen wird.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die immunologische Analyse der unbekannten Serumprobe wie folgt ausgeführt wird:
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US85461377A | 1977-11-25 | 1977-11-25 | |
US05/943,314 US4294817A (en) | 1977-11-25 | 1978-09-18 | Method of fluoro immunoassay |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2851150A1 DE2851150A1 (de) | 1979-06-07 |
DE2851150C2 true DE2851150C2 (de) | 1982-11-25 |
Family
ID=27127243
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE2851150A Expired DE2851150C2 (de) | 1977-11-25 | 1978-11-25 | Verfahren zur immunologischen Untersuchung einer Serumprobe |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4294817A (de) |
JP (1) | JPS5486611A (de) |
CA (1) | CA1111346A (de) |
DE (1) | DE2851150C2 (de) |
FR (1) | FR2410278A1 (de) |
GB (1) | GB2008747B (de) |
Families Citing this family (43)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5156953A (en) * | 1979-12-26 | 1992-10-20 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Simultaneous calibration heterogeneous immunoassay |
US4299916A (en) * | 1979-12-26 | 1981-11-10 | Syva Company | Preferential signal production on a surface in immunoassays |
US4540659A (en) * | 1981-04-17 | 1985-09-10 | Syva Company | Simultaneous calibration heterogeneous immunoassay |
US5432057A (en) * | 1979-12-26 | 1995-07-11 | Syva Company | Simultaneous calibration heterogeneous immunoassay |
NL8000173A (nl) * | 1980-01-11 | 1981-08-03 | Akzo Nv | Toepassing van in water dispergeerbare, hydrofobe kleurstoffen als label in immunochemische testen. |
BR8108820A (pt) * | 1980-09-24 | 1982-08-24 | Cetus Corp | Processo e sonda de diagnostico |
JPS58206966A (ja) * | 1982-05-04 | 1983-12-02 | シバ・カンパニ− | 同時較正不均質イムノアツセイ |
IL68506A (en) * | 1982-05-04 | 1988-06-30 | Syva Co | Simultaneous calibration heterogeneous immunoassay method and device and kit for use therein |
JPS58209994A (ja) * | 1982-05-10 | 1983-12-07 | Fujirebio Inc | 活性蛋白等固定化物を用いた抗原の測定方法 |
JPS5934154A (ja) * | 1982-08-19 | 1984-02-24 | Konishiroku Photo Ind Co Ltd | 免疫分析素子測定法 |
GB2157696A (en) * | 1982-11-12 | 1985-10-30 | California The Regents Of The | Recombinant dna derived antigens of treponema pallidum |
US4614722A (en) * | 1983-11-01 | 1986-09-30 | Pasula Mark J | Method and apparatus for measuring the degree of reaction between antigens and leukocyte cellular antibodies |
FR2563630B1 (fr) * | 1984-04-27 | 1988-02-19 | Pasteur Institut | Anticorps monoclonaux anticytomegalovirus et procedes pour le diagnostic in vitro des infections par les cytomegalovirus humains et d'une proteine-kinase inductible par les cytomegalovirus et susceptible d'etre reconnue par les susdits anticorps monoclonaux |
SE458643B (sv) * | 1984-12-07 | 1989-04-17 | Pharmacia Ab | Anordning med kolonnelement uppdelat i provparti och referenspatri |
US5879881A (en) * | 1985-04-04 | 1999-03-09 | Hybritech, Incorporated | Solid phase system for use in ligand-receptor assays |
JPH0672883B2 (ja) * | 1985-06-19 | 1994-09-14 | コニカ株式会社 | 分析素子 |
IT1206532B (it) * | 1985-10-15 | 1989-04-27 | Marcucci Francesco | Metodo allergodiagnostico mucosale e relativo dispositivo per il rilievo in vivo delle ige specifiche e totali |
DK531185A (da) * | 1985-11-18 | 1987-05-19 | Radiometer As | Sensor til bestemmelse af koncentrationen af en biokemisk species |
US4940670A (en) * | 1986-01-24 | 1990-07-10 | Rhodes Buck A | Method for compounding and testing patient specific monoclonal antibodies and monoclonal antibody fragments for in vivo use |
DE3609217A1 (de) * | 1986-03-19 | 1987-09-24 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagenz zur bestimmung eines reaktionspartners einer immunologischen reaktion |
SE454465B (sv) * | 1986-04-15 | 1988-05-02 | Biopool Ab | Non kompetitiv fast-fas immunanalys med kompensation for ospecifik adsorption |
US4863869A (en) * | 1986-11-21 | 1989-09-05 | Imre Cororation | Anti-human IGM immunoadsorbent and process for producing said immunoadsorbent |
US4762787A (en) * | 1986-11-21 | 1988-08-09 | Imre Corporation | Anti-human IGM immunoadsorbent and process for producing said immunoadsorbent |
US5250410A (en) * | 1987-01-27 | 1993-10-05 | Allegheny-Singer Research Institute | Rapid detection of herpes virus with lectin |
US5447837A (en) * | 1987-08-05 | 1995-09-05 | Calypte, Inc. | Multi-immunoassay diagnostic system for antigens or antibodies or both |
US4987086A (en) * | 1987-11-30 | 1991-01-22 | Becton, Dickinson And Company | Method for analysis of subpopulations of cells |
US5064616A (en) * | 1987-11-30 | 1991-11-12 | Becton Dickinson And Company | Kit for analysis of subsets of subpopulations of leukocytes |
JPH0743381B2 (ja) * | 1988-10-28 | 1995-05-15 | 株式会社日立製作所 | 光音響免疫分析方法及び装置 |
US5420013A (en) * | 1991-05-10 | 1995-05-30 | Sangstat Medical Corporation | HLA typing |
DE4434093A1 (de) * | 1994-09-23 | 1996-03-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum qualitativen oder/und quantitativen Nachweis einer zu bestimmenden Substanz |
US6908770B1 (en) | 1998-07-16 | 2005-06-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Fluid based analysis of multiple analytes by a sensor array |
US7022517B1 (en) | 1999-07-16 | 2006-04-04 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Method and apparatus for the delivery of samples to a chemical sensor array |
US6589779B1 (en) | 1999-07-16 | 2003-07-08 | Board Of Regents, The University Of Texas System | General signaling protocol for chemical receptors in immobilized matrices |
CA2401782A1 (en) * | 2000-01-31 | 2001-08-02 | John T. Mcdevitt | Portable sensor array system |
EP1502097A2 (de) * | 2002-04-26 | 2005-02-02 | Board of Regents, The University of Texas System | Verfahren und system zur detektion von kardialen risikofaktoren |
WO2005059551A2 (en) | 2003-12-11 | 2005-06-30 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Method and system for the analysis of saliva using a sensor array |
EP1724281B1 (de) * | 2003-12-23 | 2013-02-13 | Biokit S.A. | Zusammensetzungen und verfahren zum nachweis einer pathogenen infektion |
US8101431B2 (en) | 2004-02-27 | 2012-01-24 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing sensor elements and reagent delivery systems |
US8105849B2 (en) | 2004-02-27 | 2012-01-31 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing sensor elements |
CA2610793A1 (en) | 2005-05-31 | 2007-05-10 | Labnow, Inc. | Methods and compositions related to determination and use of white blood cell counts |
US7947274B2 (en) | 2007-01-04 | 2011-05-24 | Humabs, LLC. | Human cytomegalovirus neutralising antibodies and use thereof |
GB0700133D0 (en) | 2007-01-04 | 2007-02-14 | Humabs Llc | Human cytomegalovirus neutralising antibodies and use thereof |
DK3009449T3 (en) | 2008-07-16 | 2018-08-06 | Inst Res Biomedicine | Human cytomegalovirus neutralizing antibodies and their use |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3777014A (en) * | 1971-02-02 | 1973-12-04 | Beckman Instruments Inc | Method and reagents for the diagnosis of viral diseases |
US4011308A (en) * | 1974-01-04 | 1977-03-08 | General Electric Company | Method for surface immunological detection of biological particles by the use of tagged antibodies |
GB1506017A (en) * | 1974-03-04 | 1978-04-05 | Int Diagnostic Tech | Fluorometric system and method for the detection of biologically derived substances |
US3951748A (en) * | 1974-11-11 | 1976-04-20 | Medical Products, Inc. | Sensitized matrix for detection of disease |
US3992631A (en) * | 1975-02-27 | 1976-11-16 | International Diagnostic Technology, Inc. | Fluorometric system, method and test article |
US4056724A (en) * | 1975-02-27 | 1977-11-01 | International Diagnostic Technology | Fluorometric system, method and test article |
JPS51114985A (en) * | 1975-04-01 | 1976-10-09 | Kyoto Daiichi Kagaku:Kk | Mothod to analyse urine, etc. |
JPS605899B2 (ja) * | 1975-04-10 | 1985-02-14 | 中外製薬株式会社 | 免疫化学的定量法 |
US3999948A (en) * | 1975-11-03 | 1976-12-28 | International Diagnostic Technology | Diagnostic reagent holder and method |
JPS5819066B2 (ja) * | 1975-11-17 | 1983-04-15 | 武田薬品工業株式会社 | トガウ イルス hi反応方法 |
US4020151A (en) * | 1976-02-17 | 1977-04-26 | International Diagnostic Technology, Inc. | Method for quantitation of antigens or antibodies on a solid surface |
US4067959A (en) * | 1976-05-10 | 1978-01-10 | International Diagnostic Technology, Inc. | Indirect solid surface test for antigens or antibodies |
US4025310A (en) * | 1976-05-28 | 1977-05-24 | International Diagnostic Technology, Inc. | Method for reading a wet fluorescent surface |
US4135884A (en) * | 1977-08-29 | 1979-01-23 | Shen James T | Gamma stick |
US4163779A (en) * | 1978-01-09 | 1979-08-07 | International Diagnostic Technology, Inc. | Test for quantitation of immunoglobulin and identification of abnormal immunoglobulin |
-
1978
- 1978-09-18 US US05/943,314 patent/US4294817A/en not_active Expired - Lifetime
- 1978-10-27 CA CA314,577A patent/CA1111346A/en not_active Expired
- 1978-11-22 JP JP14494278A patent/JPS5486611A/ja active Granted
- 1978-11-23 GB GB7845832A patent/GB2008747B/en not_active Expired
- 1978-11-24 FR FR7833216A patent/FR2410278A1/fr active Granted
- 1978-11-25 DE DE2851150A patent/DE2851150C2/de not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FR2410278B1 (de) | 1983-08-19 |
JPH0220944B2 (de) | 1990-05-11 |
US4294817A (en) | 1981-10-13 |
GB2008747A (en) | 1979-06-06 |
FR2410278A1 (fr) | 1979-06-22 |
DE2851150A1 (de) | 1979-06-07 |
CA1111346A (en) | 1981-10-27 |
GB2008747B (en) | 1982-09-02 |
JPS5486611A (en) | 1979-07-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE2851150C2 (de) | Verfahren zur immunologischen Untersuchung einer Serumprobe | |
DE69816339T2 (de) | Chromatographische vorrichtung und verfahren zum nachweis eines analyts in einer vollblutprobe | |
DE68924878T2 (de) | Bestimmung eines felinen pathogen-specifischen Antikörpers und eines felinen pathogenen Antigens in einem Immuntest. | |
DE69424700T2 (de) | Verfahren zum selektiven Nachweis von perinuklearen anti-neutrophilen cytoplasmischen Antikörpern bei ulzerativen Kolitis oder primärer sclerotischer Cholangitis | |
DE3882705T3 (de) | Immunoglobulin-bestimmungsverfahren. | |
DE2930562A1 (de) | Immuntest zur bestimmung von klassenspezifischen antikoerpern | |
DE69114394T2 (de) | Analytisches Element mit biologisch aktivem Reagens und Verfahren zur Verwendung des Reagens. | |
EP0292810B1 (de) | Einschritt-Immuntest zur Bestimmung von antigen-spezifischen Antikörpern aus einer der Immunglobulin-Klassen A, M, D oder E und dazu geeignetes Mittel | |
DE69223955T2 (de) | Verfahren für das screening von plasma-proben für einen effektiven antikörpernachweis gegen respiratorische viren | |
DE68917613T2 (de) | Natriumdecylsulfat enthaltende Waschlösung, Testsatz und Verfahren zur Bestimmung eines immunologischen Liganden. | |
DE68907996T2 (de) | Verfahren zur Erhöhung der Spezifizität in kompetitiven Immuntests. | |
DE69008743T2 (de) | Extraktionszusammensetzung, Testsatz und deren Verwendung zum Nachweis von Herpes-Simplex-Antigen. | |
WO2004040310A1 (de) | Mittel und verfahren zur diagnose einer treponemainfektion | |
DE60025605T2 (de) | Synthetische antigene zum nachweis von syphilis | |
DE3636540A1 (de) | Verfahren zur bestimmung von anti-hiv, mittel dazu und ihre verwendung in diesem verfahren | |
AT395076B (de) | Vorrichtung und verfahren fuer die diagnostische bestimmung klinischer parameter | |
EP0379216B1 (de) | Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von immunologisch nachweisbaren Substanzen | |
DE2037507A1 (de) | ||
EP0366092B1 (de) | Verfahren zur Bestimmung von für ein Antigen klassenspezifischen Antikörpern und dazu geeignetes Reagenz | |
DE69016617T2 (de) | Gepufferte Waschzusammensetzung, Zusammensetzung zur Unlöslichmachung, Testsätze und Verfahren zu ihrer Verwendung. | |
DE69612099T2 (de) | Elisa-serodiagnose von schweinpleuropneumonie der serotypen 1,9 und 11 | |
DE2530621A1 (de) | Verfahren zum bestimmen der anwesenheit von antigenen oder ihren antikoerpern in unbekannten proben | |
EP0554657B1 (de) | Verfahren zur Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern in Gegenwart eines Immunkomplexes | |
DE69119445T2 (de) | Analysemethode für infektiöse Pferdeanämie-Viren (EIA-Virus) | |
DE60038557T2 (de) | Assay |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
OD | Request for examination | ||
8128 | New person/name/address of the agent |
Representative=s name: LAUDIEN, D., DIPL.-CHEM. DR.PHIL.NAT., PAT.-ASS., |
|
D2 | Grant after examination | ||
8327 | Change in the person/name/address of the patent owner |
Owner name: WHITTAKER CORP., LOS ANGELES, CALIF., US |
|
8328 | Change in the person/name/address of the agent |
Free format text: HANSMANN, A., DIPL.-WIRTSCH.-ING. VOGESER, W., DIPL.-ING., PAT.-ANW., 8000 MUENCHEN |
|
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |