DE69025008T2 - Verfahren für direkte chemische Bindung des D-Dimers aus einer biologischen Probe zwecks Diagnostik und Überwachung von thrombolytischen und hyperkoagulablen Zuständen - Google Patents
Verfahren für direkte chemische Bindung des D-Dimers aus einer biologischen Probe zwecks Diagnostik und Überwachung von thrombolytischen und hyperkoagulablen ZuständenInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von D-Dimer, einem Fibrinabbauprodukt, das ein Indikator für Störungen des Blutgerinnungssystems sein kann, wobei ein neues Fragment E-Reagenz verwendet wird, das in einer biologischen Probe chemisch direkt an D-Dimer bindet.
- Die am häufigsten auftretende Störung des Blutgerinnungssystems beim Menschen ist die Bildung von Thrombi, Blutgerinnseln, die, wenn sie in Gefäßen wie beispielsweise dem Herz gebildet werden, den Blutfluß einschränken können und zu schweren Herzattacken führen können. Darüber hinaus kann die Bewegung des Thrombus oder eines Teils davon im Kreislauf system durch ein plötzliches Blockieren des Blutstroms zu Thromboembolien führen. Bei Patienten, die aufgrund von hyperkoagulablen Zuständen bzw. Hyperkoagulabilität eine fibrinolytische Therapie erhalten, ist eine sorgfältige Überwachung der Auflösung des Gerinnsels erforderlich. Es ist daher wichtig, empfindliche und spezielle Mittel zum Bestimmen der Fibrinolyse der Auflösung der Blutgerinnsel, zu besitzen.
- Fibrin besteht aus einem Gewebe sich verzweigender Fasern adhäsiver Natur mit der Fähigkeit, Vollblut, in dem es suspendiert ist, zu koagulieren. Fibrinolyse ist ein zum Koagulationsprozeß komplementäres System und befindet sich normalerweise mit diesem im Gleichgewicht wobei Fibrinablagerungen beseitigt werden. Die Spaltung von Fibrin durch das Enzym Plasmin erzeugt Spaltprodukte einschließlich D-Dimer.
- Bei pathologischer Fibrinolyse nehmen Plasmakonzentrationen von Plasmin-Abbauprodukten von Fibrinogen und Fibrin zu. Das Vorliegen von Fibrinogen-Abbauprodukten (FDP) in menschlichem Blut oder Urin ist daher ein Indikator für thrombotische Erkrankungen. FDP sind traditionell durch Agglutinationstests gemessen worden. Zum Beispiel: durch Staphylokokken- Clumping; durch Hämagglutination-Immunoassay; durch die Verwendung von Latexpartikeln, an die ein Antiserum gebunden wurde.
- Hawiger et al., "Measurement of Fibrinogen and Fibrin Degradation Products in Serum by Staphylococcal Clumping Test", J. Lab. Clin. Med. 75: 93 - 108 (1970), beschrieben einen Test, der auf der Tatsache beruht, daß ein spezifischer Stamm von Staphylococcus in Gegenwart von monomerem Fibrin oder FDP mit höherem Molekulargewicht verklumpt. Bei diesem Verfahren werden serielle Verdünnungen von Serum- oder Urinproben mit Suspensionen von Staphylococcus-Zellen gemischt, und das Vorliegen oder das Nicht-Vorliegen einer Verklumpung wird aufgezeichnet.
- Merskey et al., "A Rapid, Simple, Sensitive Method for Measuring Fibrinolytic Split Products in Human Serum", Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 131: 871 - 875 (1969), beschrieben einen zweistufigen Hämagglutinations- Inhibierungstest. In der ersten Stufe werden Verdünnungen der Serumtestprobe mit einer verdünnten Lösung von Antikörpern gegen menschliches Fibrinogen inkubiert. In der zweiten Stufe wird nicht umgesetzter Antikörper nachgewiesen, indem mit menschlichem Plasma beschichtete, Tannin-behandelte rote Blutkörperchen zugegeben wurden. Wenn keine Agglutination eintritt, enthielt die Probe ausreichend FDP, um den Antikörper zu neutralisieren.
- Carney et al., "A Sensitive Latex Slide Assay for Fibrin(ogen) Fragment E", Clinical Chimica Acta 147: 173 - 177 (1985), beschrieben einen Latex- Agglutinationstest, bei dem Latexpartikel mit Antikörpern überzogen wurden, die direkt mit FDP in Serum reagieren. Durch die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers DD-3B6/22 gegen D-Dimer wurde die erforderliche Spezifität eingeführt, um zwischen Fibrin- und Fibrinogen-Abbauprodukten zu differenzieren. Dies war eine bedeutende Verbesserung, da der Nachweis von D-Dimer, einem Fibrin-Abbauprodukt, für das Vorliegen von Gerinnseln spezifischer ist, was den Nachweis von Thrombose oder hyperkoagulablen Zuständen mit größerer Empfindlichkeit und Spezifität erlaubt, als dies mit anderen Techniken möglich war. Wie in einem Artikel von Elms et al., "Rapid Detection of Cross-Linked Fibrin Degradation Products in Plasma Using Monoclonal Antibody Coated Latex Particles", A.J.C.P. 85(3): 360 - 364 (März 1986), beschrieben ist, führte der Nachweis von Konformations- und Strukturänderungen bei der Konversion von Fibrinogen zu Fibrin und ihrer Quervernetzung durch Faktor XIIIA in dem Prozeß der Gerinnselbildung zu der Entwicklung neuer antigener Determinanten, die eine Differenzierung zwischen ihren plasminolytischen Spaltprodukten erlauben. Insbesondere ein monoklonaler Antikörper (DD-3B6/22), der für quervernetzte Fibrinderivate, die die D-Dimer-Konfiguration enthalten, spezifisch ist, wurde bei der Entwicklung eines Latex-Agglutinationsverfahrens verwendet, das in der Lage ist, Fibrin-Abbauprodukte in Plasma oder Serum nachzuweisen. Die Empfindlichkeit dieses Tests scheint bei etwa 250 ng/ml des D-Dimeren zu liegen.
- Greenberg et al. beschrieben in einem Artikel "Measurement of Plasma Fibrin D-dimer Levels with the Use of a Monoclonal Antibody Coupled to Latex Beads", A.J.C.P. 87(1) 94 - 100 (Januar 1987), einen monoklonalen Antikörper (DD-3B6) gegen Fibrin-D-Dimer, der mit Latexkügelchen gekuppelt wurde, um einen spezifischen Test (Dimertest) für Fibrinolyse bereitzustellen. Mit der Dimertest-Untersuchung wurden 2 µg/ml gereinigtes Fibrin-D-Dimer oder Fibrin-D-Dimer/Fragment E-Komplex, die zu afibrinogenem Plasma zugegeben wurden, spezifisch nachgewiesen.
- In der US-A-4,090,846 wird ein indirekter Test für das Vorliegen von Fibrinogen-Abbauprodukten in menschlichem Serum oder Urin beschrieben, bei dem D- und E-Fragmente, die an Latexträgerprodukte gekoppelt sind, und ein Antikörper, der für die D- und E-Fragmente spezifisch ist, verwendet werden.
- In der EP-A-0 122 478 wird ein Verfahren zum Herstellen von monoklonalem Antikörper mit einer Spezifität für quervernetzte Fibrinderivate und ein Testverfahren, bei dem der Antikörper verwendet wird, beschrieben.
- Obwohl die Agglutinationstesttechniken für FDP einschließlich D-Dimer verbessert worden sind, ist die Stabilität und Empfindlichkeit dieser Techniken nicht optimiert worden.
- Die vorliegende Erfindung ist ein einfacher Nachweistest für D-Dimer, wobei Fragment E gebunden an eine feste Phase verwendet wird, um D-Dimer aus einer biologischen Probe, wie Plasma, Urin oder anderen Geweben oder Körperflüssigkeiten, die das D-Dimer-Fragment enthalten können, direkt zu binden. Demgemäß ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein direktes Verfahren zum Nachweis von D-Dimer in einer biologischen Probe bereitzustellen, um thrombolytische und hyperkoagulable Zustände unter Verwendung eines neuen Fragment E-Reagenzes zu diagnostizieren und zu überwachen.
- Diese und andere Ziele der Erfindung sind aus der folgenden detaillierteren Beschreibung ersichtlich.
- Die Matrix eines Blutgerinnsels oder Thrombus wird durch Fibrin gebildet. Fibrin kann durch Faktor XIIIA quervernetzt werden, wobei ein stabilisiertes Gerinnsel gebildet wird. Menschliches quervernetztes Fibrin wird durch das Enzym Plasmin abgebaut. Der D-Dimer/Fragment E-Komplex (DD)E ist das primäre lösliche Plasmin-Abbauprodukt, das aus quervernetztem Fibrin freigesetzt wird. Dieser Komplex kann durch Plasmin weiter abgebaut werden. Der anfängliche (DD)E-Komplex enthält die Fragmente D-Dimer und E&sub1;. Bei weiterer enzymatischer Spaltung wird Fragment E&sub1; zu Fragment E&sub2; gespalten, ohne daß es die Fähigkeit verliert, an das D-Dimer-Fragment zu binden. Spaltung von Fragment E&sub2; zu E&sub3; führt zur Dissoziation des Komplexes, wobei die Spaltendprodukte von Fibrin die Fragmente DD und E&sub3; sind. Die Fragmente E&sub1; und E&sub2; können an Fragment DD aus quervernetztem Fibrin binden, binden jedoch nicht mit dem DD-E-Komplex, Fibrinogen oder einem der Plasmin-Abbauprodukte von Fibrinogen oder von nicht quervernetztem Fibrin.
- Die vorliegende Erfindung stellt bereit:
- Ein Testverfahren zum direkten Nachweis des Fibrin-Abbauprodukt D-Dimer in einer biologischen Probe, die D-Dimer enthalten kann, um thrombolytische und hyperkoagulable Zustände zu diagnostizieren und zu überwachen, das umfaßt:
- Mischen einer Probe des biologischen Materials, das D-Dimer enthalten kann, mit einem Reagenz, das gereinigtes Fragment E von Humanfibrinogen enthält. Weitere Aspekte der Erfindung, die geschützt werden soll, sind in den beigefügten Ansprüchen charakterisiert.
- Vorzugsweise ist das gereinigte Fragment E an Latexträgerpartikel gebunden, und zwar durch:
- Dialysieren des gereinigten Fragments E;
- Konzentrieren der Latexträgerpartikel;
- Mischen des dialysierten Fragments E mit den Latexträgerpartikeln;
- Inkubieren des Gemischs; und Trennen des erhaltenen Latexreagenzes, das Fragment E gebunden an die Latexträgerpartikel enthält.
- Gereinigtes Fragment E kann gemäß den von Olexa und Budzynski in Biochemistry 19, 991 (1979) und in J. Biol. Chem. 254, 4925 (1979) beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Der in diesen Veröffentlichungen beschriebene zugrundeliegende Prozeß beginnt mit der Bildung eines Fibringerinnsels aus mit Faktor XIII angereichertem Fibrinogen. Das Gerinnsel wird mit Plasmin hydrolysiert, und das erhaltene Verdauungsprodukt wird zentrifugiert, um große Gerinnselpartikel zu entfernen. Der Überstand, der lösliche Abbauprodukte einschließlich des (DD)E-Komplexes enthält, wird dann auf einer Agarosegelbead-Säule getrennt. Der abgetrennte (DD)E-Komplex wird dann in einer konzentrierten Salzlösung inkubiert, um das D-Dimer und E&sub1;- oder E&sub2;-Fragmente zu dissoziieren. Die Fragmente werden dann mittels einer Agarosegelbead-Säule aufgetrennt und gereinigte Fragmente E&sub1; oder E&sub2; erhalten.
- Das erfindungsgemäße, direkt bindende Verfahren zum Testen für D-Dimer kann auf viele Weisen durchgeführt werden. In einer Ausführungsform der Erfindung wird gereinigtes Fragment E an Latexträgerpartikel konjugiert und ein Agglutinationstest durchgeführt. Im Zusammenhang mit dieser Erfindung verwendete Latexträgerpartikel umfassen Latexpolymere, die wasserunlöslich sind, eine Partikelgröße (Durchmesser) im Bereich von etwa 0,2 bis 1,0 Micron aufweisen und in Bezug auf immunologische Reaktionen inert sind. Typische geeignete Latexträgerpartikel sind solche, die als eine wäßrige Latexsuspension üblicherweise in Konzentrationen von etwa 1 bis 20 % Feststoffe im Handel erhältlich sind. Viele Latexarten sind zur Verwendung in dieser Erfindung geeignet, solange sie die zuvor angeführten Kriterien erfüllen. Typische geeignete Latexträgerpolymere sind carboxylierte Polystyrole, Acrylsäurepolymere, Methacrylsäurepolymere, Acrylnitrilbutadienstyrole, Polyvinylacetatacrylate, Polyvinylpyridine und Vinylchloridacrylate. Die Latexkonzentration in dem Fragment E-Latex-Reagenz liegt im Bereich zwischen 0,5 bis 2 %.
- In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird gereinigtes Fragment E mit amidinmodifizierten Latexbeads konjugiert (Interfacial Dynamics Corporation; 2,4 % Feststoffe), indem gleiche Teile der amidinmodifizierten Latexbeads (AML) und gereinigtes Fragment E zu einer Endkonzentration von zwischen 0,1 bis 10 mg/ml, und am meisten bevorzugt 2 mg/ml, gemischt werden. Das Gemisch wird über Nacht bei 4 ºC inkubiert und anschließend in einer Phosphatpufferlösung (PBS) gewaschen. Das erhaltene Fragment Eamidinmodifizierte Latex-Reagenz wird dann in einem geeigneten physiologischen Puffer, wie PBS mit Rinderserumalbumin (BSA) oder BSA mit Glycin resuspendiert.
- Ein Latex-Agglutinationstest kann mit diesem Reagenz durchgeführt werden, indem etwa 25 µl des Fragment E-AML-Reagenzes mit etwa 10 µl Plasma, Urin oder anderem Gewebe, das D-Dimer enthalten kann, auf einem Glasobjektträger vereinigt werden. Nach Rotieren des Objektträgers für etwa 2 Minuten kann Agglutination beobachtet werden. Wenn Agglutination eintritt, liegt D-Dimer in der Probe vor. Agglutination kann auch mittels aus dem Stand der Technik gut bekannten Techniken nachgewiesen werden, wie Hämagglutinationstechniken, wobei z. B. Mikrotiterplatten, Flowcytometrie verwendet wird.
- In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Nicht-Antikörper-Test durch Verknüpfen eines Konjugats mit Fragment E, vorzugsweise Fragment E&sub1;, jedoch einschließlich E&sub2; und/oder E&sub3;, durchgeführt. Das Konjugat- Fragment E-Reagenz wird dann mit einer biologischen Probe inkubiert, wie beispielsweise Plasma, Urin, Serum, und dann gewaschen, um überschüssiges Fragment E, das nicht an die Probe gebunden ist, zu entfernen, und das Konjugat wird für die Bildung von gebundenem Fragment E-D-Dimer quantitativ bestimmt. Dieses Verfahren kann auf einem Filtersystem zum Nachweis von D-Dimer durchgeführt werden, oder gebundenes D-Dimer kann gegenüber ungehundenem durch Molekularausschluß oder ionisch-kovalente Bindungstechniken getrennt werden und dann in dem flüssigen Zustand nachgewiesen werden. Geeignete Konjugate umfassen Peroxidase, Urease, Beta-Galactosidase.
- In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann eine modifizierte ELISA-Technik verwendet werden, um die Konzentration von Fragment E&sub1;/E&sub2; quantitativ zu bestimmen, das als Fängermolekül für D-Dimer verwendet wird. In diesem Verfahren wird Fragment E&sub1;/E&sub2; an einem festen Träger adsorbiert. Eine biologische Probe, wie beispielsweise Plasma, Urin oder eine andere D-Dimer enthaltende Körperflüssigkeit, wird dann zugegeben, um an Fragment E&sub1;/E&sub2; zu binden. Ein für D-Dimer spezifischer monoklonaler oder polyklonaler Antikörper wird dann mit einem Enzyin wie Peroxidase, Urease, Beta-Galactosidase konjugiert. Das Konjugat (anti-D-Dimer/Enzym) läßt man dann an das D-Dimer binden, das direkt an das Fragment E&sub1;/E&sub2; gebunden ist. Zugabe eines für das Enzym spezifischen Substrats ermöglicht eine quantitative Bestimmung des D-Dimers.
- Nachdem die Erfindung allgemein beschrieben worden ist, kann ein besseres Verständnis durch Bezugnahme auf bestimmte spezielle Beispiele erreicht werden, die hier lediglich zur Veranschaulichung angegeben sind und keine einschränkende Wirkung aufweisen sollen.
- 2 mg gereinigtes Fragment E&sub1; wurden gegen 3 x 500 ml Aliquote von 0,02 M PBS 6 Stunden lang dialysiert, d. h. jeweils 3 x 2 Stunden. Die Absorption (A280) wurde auf einem Gilford-Spektrophotometer gemessen. Die Anfangsablesung für ein Volumen von 1 ml dialysierter Probe betrug 3,333 Absorptionseinheiten. 1 ml (0,489 µ) amidinmodifizierter Latexbeads (AML), (Partie 10-43-57A, Interfacial Dynamics Corporation) wurde in ein 1 x 75 mm Polypropylenröhrchen gegeben und 15 Minuten lang bei 3000 UpM zentrifugiert, um die Beads zu pelletieren. Der Überstand wurde von den pelletierten AML-Beads abdekantiert, und 1 ml dialysiertes Fragment E&sub1; wurde zugefügt. Das Röhrchen wurde leicht verwirbelt, um die Beads zu resuspendieren. Das Gemisch aus Fragment E&sub1;/AML-Bead wurde bei 4 ºC 12 Stunden lang inkubiert. Das Röhrchen wurde dann zentrifugiert, um die AML-Beads zu pelletisieren. Der Überstand wurde verworfen. Die Absorption wurde bei 2,920 Absorptionseinheiten gemessen (Absorption 280). 218 µg von Fragment E&sub1; wurden pro ml AML gebunden, d. h. es wurden 10,9 % gebunden.
- 25 µl von AML-Fragment E&sub1;-Latexbead-Reagenz wurden mit 10 µl jeder Probe (Plasma), Standard (gereinigtes D-Dimer) oder Kontrolle (Puffer oder Salzlösung) auf einem Objektträger gemischt. Der Objektträger wurde 2 Minuten lang rotiert und auf Agglutination beobachtet. Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten: Probe Salzlösung Partie Nr. Reaktion negativ Gereinigtes D-Dimer (80 µg/ml) Positive American Diagnostic-Kontrolle Positive Stago-Kontrolle (D-Dimer-Kit) Stago-Puffer für negative Kontrolle (D-Dimer-Kit) Positive Wellcome FDP-Kontrolle (nicht-spezifisch für D-Dimer) Negative Wellcome Kontrolle (FDP-Kit) Gereinigtes Fibrogen (Sigma, Rinderfraktion I) Humanfibrinogen (gereinigt bei Ortho) positiv negativ
- Bewertung der Empfindlichkeit des Fragments E&sub1;/AML-Reagenz: Probe Stago D-Dimer-Kit Fragment E&sub1;/AML-Reagenz 80 µg/ml D-Dimer positiv negativ
Claims (13)
1. Testverfahren zum direkten Nachweis des Fibrinabbauproduktes
D-Dimer in einer biologischen Probe, die D-Dimer enthalten kann, zur Diagnose
und Überwachung thrombolytischer und hyperkoagulabler Zustände, das umfaßt:
Mischen einer Probe des biologischen Materials, das D-Dimer enthalten
kann, mit einem Reagenz, das gereinigtes Fragment E von Humanfibrinogen
enthält.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Reagenz das gereinigte
Fragment E gebunden an einen festen Träger umfaßt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem der feste Träger
Latexträgerpartikel umfaßt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem das gereinigte Fragment E
dadurch an die Latexträgerpartikel gebunden wird, daß man:
das gereinigte Fragment E dialysiert;
die Latexträgerpartikel konzentriert;
das dialysierte Fragment E mit den Latexträgerpartikeln mischt;
das Gemisch inkubiert; und
das erhaltene Latexreagenz, das an die Latexträgerpartikel gebundenes
Fragment E enthält, abtrennt.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, bei dem die
Latexträgerpartikel amidinmodifizierte Latexbeads umfassen.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, bei dem das Gemisch der
Probe der biologischen Flüssigkeit und des Reagenzes, das Fragment E gebunden
an Latexträgerpartikel enthält, auf Agglutination untersucht wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, das die Schritte
umfaßt: Zugeben eines für D-Dimer spezifischen Antikörpers, der an einen
Marker konjugiert ist, zu dem Gemisch der Probe aus biologischem Material und
dem Reagenz, das das gereinigte Fragment E gebunden an einen festen Träger
enthält, und Nachweisen von an den festen Träger gebundenem Marker.
8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem der Marker ein Enzym ist und der
Nachweisschritt die Zugabe eines für das Enzym spezifischen Substrats umfaßt.
9. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Reagenz ein Konjugat von
gereinigtem Fragment E und einem Protein umfaßt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem das Protein Peroxidase ist.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, bei dem das Gemisch aus der
Probe von biologischem Material und dem Reagenz behandelt wird, um an D-Dimer
gebundenes Konjugat von ungebundenem Konjugat abzutrennen und die Menge von
gebundenem oder ungebundenem Konjugat bestimmt wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, bei dem die
Endkonzentration des Fragments E in dem Reagenz 0,1 mg/ml bis 10 mg/ml,
vorzugsweise etwa 2 mg/ml beträgt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, bei dem das Fragment E
Fragment E&sub1; umfaßt.
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