DE69124511T2 - Verfahren für den nachweis und/oder die bestimmung von hormonen - Google Patents
Verfahren für den nachweis und/oder die bestimmung von hormonenInfo
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Description
- Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren für den Nachweis und/oder die Bestimmung von Hormonen unter Einschluß der Plazentahormone.
- Unter Hormonen versteht man die Substanzen, die von den verschiedenen menschlichen und tierischen endokrinen Drüsen gebildet werden und insbesondere die Hypophysenhormone (FSH, LH, TSH, GH, ACTH, Prolactin, Ocytocin, MSH, ADH), den Plazentahormonen verwandte Hormone [menschliches (hCG) und equines (eCG) choriogonadotropines Hormon, choriosomatomammotropines Hormon (CS), plazentäres GH], die Schilddrüsenhormone, die Nebennierenhormone, die Keimdrüsenhormone und die Hormone der Bauchspeicheldrüse.
- Je nach ihrer chemischen Struktur gehören diese Hormone zu unterschiediichen Kategorien: die Hormone, die sich von Aminosäuren ableiten (Schilddrüsenhormone, Hormone des Nebennierenmarkes), die Peptid- und Proteinhormone (Hormone der Bauchspeicheldrüse, GH, ACTH, Prolactin, MSH, ADH, Ocytocin), die Steroidhormone (Hormone der Keimdrüsen, Hormone der Nebennierenrinde) und die Glycoproteinhormone (LH, TSH, TSH, hCG, eCG).
- Die Glycoproteinhormone werden durch eine gleiche strukturelle Organisation charakterisiert: sie werden aus der Assoziation von zwei Untereinheiten α und β gebildet. Die Untereinheit α ist für alle Glycoproteinhormone der gleichen Tierart identisch. Im Gegensatz dazu unterscheidet sich die Untereinheit β von einem Hormon zum anderen und führt zur Wirkungsspezifität. Ebenso besitzen die Peptidhormone wie auch die Polypeptinhormone (Beispiel: GH und Prolactin) eine strukturelle Verwandtschaft.
- Im allgemeinen werden diese Hormone nicht in konstanten Spiegeln sekretiert, sondern weisen im Gegenteil Variationen der zirkulierenden konzentration von schwacher Amplitude (Mikropulsierung) oder in anderen Fällen von starker Amplitude (Beispiel: Sekretionsgipfel des FSH, gefolgt von dem des LH im Zeitraum vor dem Eisprung) auf. Es ist deshalb notwendig, über Bestimmungsmethoden zu verfügen, die es ermöglichen, auf genaue und spezifische Art den zirkulierenden Spiegel dieser unterschiediichen Hormone im Blut oder in allen anderen möglichen biologischen Flüssigkeiten zu bestimmen.
- Diese Bestimmungsmethoden müssen außerdem, wenn die basalen Konzentrationen dieser verschiedenen Hormone außerhalb von allen pathologischen Zuständen relativ niedrig sind (z.B. für Hypophysenhormone von 0,1 ng/ml bis einige ng/ml), sehr sensitiv sein.
- Als Beispiel ist die Detektion und/oder die Bestimmung der gonatotropen Hormone LH und FSH bei der Untersuchung der Physiologie der mannlichen und weiblichen Reproduktion bei Tieren und bei Menschen von besonderer Bedeutung. Z.B. hat bei den Säugetieren das Funktionieren des Eierstockes während des Zeitraumes der geschlechtlichen Aktivität (je nach Art kontinuierlich oder saisonal) eine Folge von ovariellen Zyklen zur Folge, in deren Verlauf die weiblichen Gameten in regelmäßigen Intervallen reifen.
- Der ovarielle Zyklus besteht aus zwei Phasen: der follikulären Phase (Wachstum des Follikels und Reifung des Oocyten) führt zum Eisprung, ein für die Befruchtung günstiger Zeitraum, und die luteale Phase (Bildung des Gelbkörpers). FSH ist für das Wachstum und die Reifung des vorovulatorischen Follikels verantwortlich; LH greift im besonderen in das terminale follikuläre Wachstum des letzteren und in das Auslösen des Eisprungs ein. Als Folge findet der Eisprung zu einem für jede Tierart sehr genauen und konstanten Zeitpunkt nach dem Gipfel des LH (von 17 bis 24 h je nach Tierart) statt. Sowohl für das Labor zur sehr genauen Bestimmung als auch für das Terrain oder das Domizil zur Detektion des präovulatorischen Gipfels des LH (z.B. um den besten Zeitpunkt für eine künstliche Insemination vorherzusagen), erscheint es däher nützlich und wichtig, über spezifische Nachweismittel für LH bei verschiedenen Tieren und beim Menschen zu verfügen.
- Ebenso ist die Möglichkeit, sehr niedrige zirkulierende Spiegel des Choriogonadotropins (CG) zu bestimmen, für die Entwicklung von Kits zum Schwangerschaftsnachweis zum frühest möglichen Zeitpunkt, insbesondere bei der Frau, besonders wichtig.
- Für den Menschen wurde eine bestimmte Anzahl von Tests für LH und hCG entwickelt und kommerzialisiert, die sich zuhause, ausgehend von Urin, durchführen lassen.
- Was LH betrifft, sind mittlerweile eine bestimmte Anzahl von Kits verfügbar und ermöglichen es, auf genaue Weise den Zeitpunkt des Eisprungs zu bestimmen. Diese Tests verwenden monoclonale Antikörper und basieren entweder auf einer Agglutinationsreaktion ("DISCRETEST", Chefaro von Organon; "HI GEONADO TEST", Moshida) oder auf einer immunenzymatischen Reaktion ("OVUSTICK", Monoclonal Antibodies; "OVUTEST", Clonatec; "FIRST REPONSE"; REVELATEST O", Arley-Diagnostic).
- Was das hCG betrifft, sind mehrere Schwangerschaftstests verfügbar und werden, ausgehend von polyclonalen Antikörpern oder häufiger monoclonalen Antikörpern realisiert. Nach ihrem Prinzip kann man unterschieden:
- - Hämagglutinationstest (oder Ringtests) ("PRIMOTEST RAPIDE" von Fumouze; "BETA-TEST 100 UI" von Soekami-Lefrancq; "G-TEST" von Theranol; "ELLE-TEST BETA" von Deglaude);
- - Goldpartikel-Agglutinationstests ("PREDICTOR COLOR" von Nicholas);
- - indirekt ablesbare (Erscheinen einer blauen Farbe auf einem Streifen: "BLUE TEST" von Clonatec) oder direkt lesbare [Erscheinen eines besonderen Zeichens (Punkt, Strich oder +-Zeichen): "BLUE POINT" von Clonatec; "G-TEST LOGIC" von Theranol; "PREVISION" von Pharmygiene] immunenzymatische Tests;
- - die Tests, bei den monoclonale Antikörper und eine Wanderung auf einer Membran verbunden sind, ohne daß ein Entwicklungsenzym beteiligt ist: "CLEAR BLUE EVIDENCE" von Polive-Tricosteril; "PRIMOTEST MINUTE" von Fumouze; "G-TEST PRO" von Theranol; "FIRST RESPONSE" von Talco; "TEST PACK PLUS hCG" von Abbott). Sie werden durch das Erscheinen eines gefärbten Zeichens (rosa Bande, blauer Strich etc.) gekennzeichnet.
- Im allgemeinen sind die Bestimmungsmethoden, die augenblicklich in Krankenhäusern für unterschiedliche Hormone verwendet werden zum einen Teil radioimmunologische Methoden (z.B. System "AMERLEX-M" von Amersham, System "MAIAclon" von Serono für hLH, hFSH, hTSH, hCG etc.) und zum anderen Teil enzymimmunometrische oder immunometrische Methoden (unter Verwendung eines nichtenzymatischen Markers: Latexpartikel, Europiumchelat). Bei den enzymimmunometrischen Systemen verwenden einige ein fluoreszierendes Signal (enzymmikropartikuläres System "IMx" von Abbott; "STRATUS SYSTEM" von American Dade für LH, FSH, hCG ...) oder luminszierendes Signal (System "AMBERLITE" von Amersham für LH, TSH, FSH, hCG; System "MAGIC LITE" von Ciba Corning für TSH, Prolactin ...). Bei den immunometrischen Systemen kann insbesondere das Bestimmungsverfähren "DELFIA" von Pharmacia genannt werden, welches Europium als fluoreszierenden Märker für hLH, hFSH, hTSH, hCG etc. verwendet.
- Bei den Tieren sind die Bestimmungsmethoden für LH insbesondere:
- - Die Bestimmung von LH im Urin beim Gorilla (N.M. Czekala et al., J. Reprod. Fert., 1988, 82, 255-261), bei der zwei monoclonale Antikörper verwendet werden, von denen einer auf einer Miktrotiterplatte fixiert ist und der andere an die alkalische Phosphatase gekoppelt ist. Die Gesamtinkubationszeit beträgt bei diesem Test 4 h (2 h: Inkubation der Probe mit dem gebundenen Antikörper; 1 h: Inkubation des zweiten gekoppelten Antikörpers; 30 bis 50 min: enzymatische Entwicklung). Die Sensitivität dieser Bestimmung ist 0,5 ng/ml.
- - Die Bestimmung des bovinen plasmatischen LH (Serum oder Kulturmedium) durch eine radioimmunologische Methode (R. Hoier et al., Theriogenology., 1988, 30, 235-243). Diese Bestimmung wird in Anwesenheit von zwei Antikörpern (AC&sub1;: Kaninchen-Anti-LH, AC&sub2;: Kaninchen-Anti-IgG) und radioaktiven LH (mit Iod-125 markiert) durchgeführt.
- Es handelt sich um eine kompetitive Methode, bei der der erste Antikörper (AC&sub1;) an das LH der Probe oder an das zugefügte radioaktive LH* bindet (Inkubationsdauer von 36 bis 48 h). Die Trennung des Anti- körper-LH-Komplexes von freiem LH* wird unter Verwendung des zweiten Antikörpers (AC&sub2;), der an der Wand eines Röhrchens immobilisiert ist (Inkubation: 3 h unter Schütteln bei 37ºC) bewerkstelligt.
- Die Sensitivität dieser Methode ist im Bereich von 1,5 ng/ml.
- - Eine ELISA-Bestimmung des Mäuse, Ratten-, Schaf- und Rinder-LHs, welche im Serum, im Zellkulturmedium und in Puffern (J.L. Spearow et al., Biol. Reprod., 1987, 37, 595-605) angewendet werden kann, und die das Prinzip der Kompetition zwischen einem an die Peroxidase gekoppelten LH und einem LH aus der Probe im Hinblick auf einen Antikörper (AC&sub1;) verwendet, der entweder ein Anti-Schaf-LH-Immunserum, welches vom Kaninchen produziert wurde, oder ein Anti-Rind-LHβ-monoclonaler Antikörper oder ein Anti-Schaf-LHβ-Immunserum, welches vom Huhn hergestellt wurde, ist.
- Für einen Antikörper, welcher vom Kaninchen gebildet wurde, beträgt die Inkubation von AC&sub1;-Probe 16 bis 24 h bei 20ºC unter Schütteln; die Zugabe von LH-Peroxidase macht eine neue Inkubation von 16 bis 24 h bei 4ºC nötig. Die Entwicklungsreaktion wird mit Hilfe von TMB (30 min bei 2 h) durchgeführt.
- Unter diesen Bedingungen ist die Sensitivität der Methode 79 pg/ml.
- - Eine ELISA-Bestimmungsmethode von plasmatischem Rinder-LH (W.G. Abdul-Ahad et al., J. Reprod. Fert., 1987, 80, 1-9). Es handelt sich um eine Sandwich-Methode in Mlkrotiterplatten. Der erste Antikörper (AC&sub1;) ist ein Anti-Rind-LH-IgG des Kaninchens und der zweite Antikörper (AC&sub2;) ist das Fab'-Fragment, welches, ausgehend vom ersten Antikörper hergestellt wird und an eine Peroxidase gekoppelt ist.
- Es gibt ein kurzes Protokoll (4 h) und ein langes Protokoll (20 h). Die mit dem kurzen Protokoll erhaltene Nachweisgrenze ist 260 pg/ml und diejenige, welche mit dem langen Protokoll erhalten wird, ist 70 pg/ml.
- Die Entwicklung der Peroxidase geschieht mit OPD.
- Eine weitere Publikation der gleichen Autoren (620th Meeting Dublin, Biochem. Soc. Transactions, 1985, 15, 277-278) bezieht sich auf das gleiche Nachweisverfähren unter Verwendung eines Fab'-β-Lactamasekonjugates als AC&sub2;.
- In diesem Artikel wird spezifiziert, daß die Bestimmungsdauer 4,5 h ist und daß die Nachweisgrenze bei 420 pg/ml liegt.
- - Es muß ebenfalls die LH-Bestimmung beim Rhesusaffen mit Hilfe eines RIA zitiert werden, der markiertes Schaf-LH und ein Anti-Schaf-LH- Antiserum, welches mit dem LH zahlreicher Arten reagiert, verwendet.
- Die Bestimmungamethoden für FSH und ebenso für die anderen Hormone bei den Tieren sind im wesentlichen vom radioimmunologischen Typ.
- Die immunenzymatische Bestimmung des Prolactins der Ratte wurde beschrieben (A.P. Signorella et al., Anal. Biochem., 1984, 136, 372-381). Diese Bestimmung vom kompetitiven Typ führt zu einer fixierten Nachweisgrenze von 0,6 ng/ml unter Verwendung eines langen Protokolls (24 h).
- Jedoch erwähnen viele Arbeiten im allgemeinen in Bezug auf die Bestimmung von Hormonen, egal ob beim Menschen oder bei Tier, trotz der Verschiedenheit der vorgeschlagenen und angewandten Bestimmungsmethoden, das Problem der nichtspezifischen Interferenz in den Bestimmungen, was dazu führt, daß fehlerhafte Ergebnisse erhalten werden (Fall der "falsch positiven" oder der "falsch negativen" Ergebnisse) [J.P. Gosling, Clin. Chem., 1990, 36, 1408-1427; K.A. Brensing, Horm. Metabol. Res., 1989, 21, 697-698; P.E. Garrett, J. Clin. Immunoassay, 1989, 12, 18-19]. Dieses Problem der nichtspezifischen Interferenz führt zu einem Verlust der Sensitivität und der Nachweisgrenze der Bestimmung. Insbesondere kann der Fall der immunenzymatischen Bestimmung von hCG zitiert werden (B. Longhi et al., 1986, J. Immun. Meth., 92, 89-95) für das die Nachweisgrenze in einem Medium ohne Serum mit 2,2 IE/l und in einem Medium, welches 20 % menschliches "HCG negatives" Serum enthielt, mit 10,4 IE/l bestimmt wurde.
- Für diese Interferenzprobleme wurden einige Lösungen vorgeschlagen, aber sie führten in allen Fällen zu einem Sensititivitätsverlust der Bestimmung. Es handelt sich im besonderen:
- - um das Wegfallen des Fc-Teils des zweiten Antikörpers und der direkten Bindung des Enzyms an ein Fab'-Fragment [W.G. Abdul-Ahad et al., J. Reprod. Fert., 1987, 80, 1-9]. In diesem Fall muß die Inkubationszeit und die Zeit der enzymatischen Entwicklung länger gewählt werden, um den Verlust der Sensitivität aufgrund der Behandlung des zweiten Antikörpers auszugleichen: eine Nachweisgrenze von 70 pg/ml für das Rinder-LH macht ein Protokoll von 20 h notwendig, ein kurzes Protokoll von 4 h führt lediglich zu einer Nachweisgrenze von 260 pg/ml.
- - um die Anwendung eines Tests, der es erlaubt das Niveau der nichtspezifischen Signale, die auf die Probe zurückzuführen sind, zu bestimmen; zu diesem Zweck wird der nichtmarkierte spezifische Antikörper (AC&sub1;) durch einen anderen dem AC&sub1; ähnlichen Antikörper, aber einer gänzlich anderen Spezifität ersetzt (P. Kaspar et al., J. Immun. Meth., 1988, 108, 61-69). Dieses ermöglicht die Bestimmung der nichtspezifischen Signalstärke, die eine Eigenschaft jeder Probe ist und ermöglicht die Eichung der Bestimmung, jedoch beseitigt dies in keiner Weise das Problem.
- - um das Absättigen des spezifischen Antikörpers mit Avidin im Falle eines ELISA-Tests von Oestradiol-17β vom kompetitiven Typ unter Verwendung von Avidin-Biotin-Komplexen (D.M. Bodmer und L.X. Tiefenauer, 1990, J. Immunoassay, 11, 139-145).
- Somit haben alle oben zitierten Methoden eine bestimmte Anzahl von Nachteilen:
- - insbesondere im Fall von tierischem LH lange Inkubationszeiten, die der Bestimmung und der Detektion im Terrain nicht angemessen sind (4 h bis zu 24 h);
- - Bestimmungen, die manchmal nicht mit Vollblut durchgeführt werden können;
- - das Fehlen einer Polyspezifität für Arten bei diesen Bestimmungen;
- - das Vorhandensein von starken nichtspezifischen Signalen beim Lesen der Resultate, die besonders Schwierigkeiten bei der Interpretation der letzteren zur Folge haben können;
- - eine daraus entstehende erhöhte Nachweisgrenze, die z.B. im Fall des tierischen LH von 100 pg bis zu 1500 pg/ml variiert.
- Daher hat sich die Anmelderin zum Ziel gesetzt, ein Verfähren zur Bestimmung der von den verschiedenen endokrinen Drüsen gebildeten Hormone zur Verfügung zu stellen, das für eine Vielzahl von Tierarten unter Einschluß des Menschen angewendet werden kann und welches den Bedürfnissen der Praxis besser entspricht als die Verfähren im Stand der Technik:
- - insbesondere deshalb da es in weniger als 3 h gemäß einem einfachen Protokoll unter Bedingungen, die man als einfach bezeichnen kann, durchgeführt werden kann,
- - da es ein nicht zweideutiges Ablesen des Resultats vom "alles oder nichts"-Typ durch das Erhalten einer Farbe im Falle der Detektion eines scharfen Sekretionsgipfels eines Hormons (Beispiel: präovulatorischer Gipfel des LH) ermöglicht, während alle Testverfahren im Stand der Technik, wenn sie auf einer kolorimetrischen Reaktion beruhen, eine Interpretation des Resultats notwendig machen, welche für eine wenig erfahrene Person ziemlich heikel ist (z.B. die Unterscheidung von einem hellen oder dunklen Blau oder jede andere Farbnuance, wobei diese Farbnuancen zusätzlich in direkter Weise von der Tepperatur abhängig sein können, was einen weiteren Fehlerfaktor hinzufügt).
- - da es ohne Notwendigkeit von irgendeinem Leseapparat semiquantitativ sein kann, wenn zusätzlich zu den zu testenden Proben ein Eichsatz für das zu bestimmende Hormon vorhanden ist, insbesondere, um für ein gleiches Tier den Probengehalt z.B. für LH, an Beginn des LH-Gipfels, den Gehalt am Höhepunkt des Gipfels (Maximalwert) und den Gehalt an Ende des Gipfels (ahnebmender Wert) zu unterscheiden; im Falle des LH ermöglicht ein solches Verfähren somit die künstliche Insemination in Bezug auf den Beginn des Gipfels oder in Bezug auf den Höhepunkt des Gipfels zu synchronisieren und ermöglicht ebenso eine Unterscheidung der Sekretionspulse von LH beim männlichen und beim weiblichen Tier nach einer ggf. notwendigen Inkubation von Substrat während 15 bis 30 min für eine Untersuchung der Mikropulsierung.
- - da es gleichzeitig eine Polyspezifität für Arten und eine Substratspezifität darstellt,
- - da es reproduzierbar ist,
- - da es im Terrain (Ablesen mit bloßem Auge) angewendet werden kann und
- - da es dadurch in perfekter Weise quantitativ sein kann, daß es auf beträchtliche Weise die Sensitivität der Bestimmung erhöht und die Nachweisgrenze herabsenkt.
- Gegenstand der Erfindung ist ein Verfähren zur Detektion und/oder quantitativen immunologischen Bestimmung von Hormonen der Hypophyse von Mensch oder Tier in Kulturmedien oder in biologischen Flüssigkeiten, bei dem mindestens zwei Antikörper eingesetzt werden, die für das quantitativ zu bestimmende Hormon spezifisch sind, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erhöhung der Sensibilität und der Spezifität der Detektion und/oder der quantitativen Bestimmung die Antikörper vor ihrem Einsatz für die Detektion oder die quantitative Bestimmung in einem Medium vorinkubiert werden, welches Plasma oder Serum, das frei von dem zu detektierenden und/oder quantitativ zu bestimmenden Hormon und durch Hypophysektomie erhalten worden ist (INC-Medium), enthält.
- Im Sinne der Erfindung wird unter präinkubiertem Antikörper ein Antikörper verstanden, der durch Inkontaktbringen oder Passage auf einer geeigneten Chromatographiesäule von allen Substanzen, welche eine nichthormonale und nichtspezifische Seruminterferenz induzieren, erschöpft ist.
- Erfindungsgemäß ist die biologische Flüssigkeit vorteilhafterweise Serum, Plasma, Vollblut, Milch oder Urin.
- Im folgenden der Erfindung wird Medium, welches Serum oder Plasma, das frei ist von den zu detektierenden und/oder quantitativ zu bestimmenden Hormon ist, mit INC-Medium benannt.
- Nach einer vorteilhaften Ausführungsform dieses Verfahrens ist das genannte INC-Milieu mit einem Puffer mit neutralem pH und einer oberflächenaktiven Verbindung assoziiert.
- Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform dieses Verfahrens enthält das INC-Medium ein Serum oder ein Plasma, das frei von Hypophysenhormonen ist und durch Hypophysektomie von einem Tier erhalten wurde sowie einen Puffer mit neutralem pH und einer oberflächenaktiven Verbindung.
- Als geeigneten Puffer kann man insbesondere einen Puffer mit neutralem pH nennen, der eine oberflächenaktive Verbindung enthält, und insbesondere einen PBS-Tween-BSA-Puffer.
- Gemäß einer vorteilhaften Variante dieser Ausführungsform enthält das INC-Medium ein Serum oder Plasma von einem hypophysektomierten Widder und einen Puffer mit neutralem pH, der eine oberflächenaktive Verbindung enthält.
- Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform dieses Verfahrens ist das Verhältnis von Plasma oder Serum, welches frei vom zu bestimmenden Hormon ist, und dem Puffer 1:1.
- Erfindungsgemäß ist das genannte Verfähren vorteilhafterweise ein hochspezifischer und sensibler enzymimmunometrischer Test zur Detektion wenigstens eines Hormons.
- Gemäß einer vorteilhaften Anwendungsform für den genannten Enzymimmunometrischen Test werden der erste Antikörper, der auf einer festen Unterlage fixiert ist und im INC-Medium gesättigt ist, und der zweite Antikörper, der ggf. an ein geeignetes Enzym gekoppelt ist und der im INC-Medium inkubiert worden ist, in Kontakt mit der zu testenden biologischen Flüssigkeit gebracht und dann die enzymatische Aktivität, die mit der festen Phase und/oder der freien Phase assoziiert ist, mit jeglichem geeigneten Mittel bestimmt.
- Gemäß einer vorteilhaften Variation dieser Ausführungsform wird, wenn der zweite Antikörper, der in dem genannten INC-Medium inkubiert wurde, nicht an ein Enzym gekoppelt ist, die Entwicklung der Reaktion dann dadurch durchgeführt, daß ein dritter Antikörper, der an ein geeignetes Enzym angekoppelt ist und der im genannten INC-Medium vorinkubiert wurde und der spezifisch an den zweiten Antikörper bindet, durchgeführt.
- In Übereinstimmung mit dieser Ausführungsform werden der erste und zweite Antikörper vorteilhafterweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus den polyclonalen Antikörpern Anti-FSH, Anti-LH, Anti-TSH, Anti-GH, Anti- ACTH, Antiprolactin, Antiocytocin, Anti-ADH, Anti-MSH und den polyclonalen Antikörpern Anti-FSH, Anti-LH, Anti-TSH, Anti-GH, Anti-ACTH, Antiprolactin, Antiocytocin, Anti-ADH und Anti-MSH besteht.
- Gemäß einer vorteilhaften Modalität dieser Ausführungsform werden die polyclonalen Anti-LH-Antikörper, insbesondere durch die Immunisierung eines geeigneten Tieres, mit Hilfe eines Antigens erhalten, welches ein äquimolares Gemisch von verschiedenen gereinigten Fraktionen des Schaf- LH-Repertories 1051, 1055, 1072, 1063, 1085 und 1086 enthält, gefolgt von der Reinigung des Immunserums, welches durch Ionenaustauschchromatographie oder durch Affinitätschromatographie erhalten wurde, wobei diese polyclonalen Antikörper mit den anderen Glycoproteinhormonen, wie z.B. dem FSH, einen Prozentsatz der Kreuzreaktion von unter 4 % aufweisen, d.h. eine Spezifität in Bezug auf LH aufweisen, dadurch, daß sie eine Erkennungspolyspezifität für das LH von vielen Tierarten aufweisen, insbesondere wenigstens von Schafen, Rindern, Ziegen, Schweinen, Hunden, Kamelen, Mäusen ebenso wie Hirscharten, und dadurch, daß sie gegenüber dem Schaf-LH bzw. in zwei verschiedenen Tierarten eine Affinität in der Größenordnung von 10&sup9;M&supmin;¹ besitzen.
- Gemäß dieser vorteilhaften Ausführungsform werden der erste und zweite Antikörper vorteilhafterweise aus der Gruppe ausgewählt, die polyclonale Anti-Schaf-LH-Antikörper aus dem Kaninchen und polyclonale Anti-Schaf-LH-Antikörper aus dem Pferd umfaßt und der dritte Antikörper wird vorteilhafterweise aus der Gruppe ausgewählt, die die Anti-IgG aus dem Pferd und die Anti-IgG aus dem Kaninchen, welche an ein geeignetes Enzym gebunden sind, umfaßt.
- Ebenso in Übereinstimmung mit dieser vorteilhaften Ausführungsform ist der erste Antikörper ein polyclonaler Anti-Schaf-LH-Antikörper aus dem Kaninchen, der zweite Antikörper ist ein polyclonaler Anti-Schaf-LH- Antikörper aus dem Pferd und der dritte Antikörper ist ein Anti-IgG aus dem Pferd, welcher an ein geeignetes Enzym gebunden ist, insbesondere an eine Peroxidase oder an eine β-Galactosidase.
- Die verschiedenen Isoformen des Schaf-LH liegen vorzugsweise in äquimolaren Mengen vor.
- Eine geeignete Reinigung der genannten polyclonalen Anti-LH-Antikörper kann je nach Fall entweder durch Affinitätschromatographie oder durch Ionenaustauschchromatographie durchgeführt werden.
- Auf unerwartete Weise ermöglicht es die Präinkubation mit dem INC- Medium, wie es oben definiert wurde:
- - Probleme mit nichtspezifischen Signalen, die üblicherweise mit diesem Typ von Bestimmungsverfähren angetroffen werden, dadurch zu beseitigen, daß jede nichtspezifische Seruminterferenz, die zu einer Verringerung der Sensitivität der Bestimmung führen könnte, neutralisiert wird,
- - deshalb die Sensitivität dieses Bestimmungstyps beträchtlich zu erhöhen, was insbesondere im Fall der Hormone mit schwachen zirkulierenden Spiegel wichtig ist,
- - daher die Gesamtheit der Hormone, insbesondere geeignete Hypophysen- und Plazentahormone zu bestimmen und Resultate zu erhalten, die richtig und bequem zu interpretieren sind.
- Folglich zeigt die erfindungsgemäße immunologische Bestimmung und insbesondere die enzymimmunometrische Hormonbestimmung gleichzeitig Charakteristika einer quantitativen Bestimmung dadurch, daß sie eine sehr gute Sensitivität als auch eine sehr gute Reproduzierbarkeit liefert und einer qualitativen Bestimmung, bedingt durch die Einfachneit der Durchführung und der Interpretation.
- Die Effizienz und die Vorteile des oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens werden im besonderen durch die enzymimmunometrische Bestimmung des luteinisierenden Hormons (LH) dargestellt. Tatsächlich zeigt diese Bestimmung gleichzeitig die Charakteristika einer quantitativen Bestimmung dadurch, daß sie eine sehr gute Sensitivität (Nachweisgrenze: 60 pg/ml) sowie eine sehr gute Reproduzierbarkeit zeigt und einer qualitativen Bestimmung durch die Einfachheit der Durchführung und der Interpretation. Es kann daher ebenso gut im Labor zur sehr genauen Bestimmung (Beispiel: Messung der Mikropulsierung der LH-Sekretion) verwendet werden wie auch im Terrain (Bestimmung des präovulatorischen LH-Gipfels für die künstliche Insemination von synchronisierten Weibchen und/oder superovulierender Weibchen, die Eibryonen spenden).
- Diese LH-Bestimmung, die bei vielen Arten: Rind, Schaf, Ziege, Schwein, Kamel, Hund, Maus, Hirsch nützlich ist, ermöglicht die genaue Bestimmung des präovulatorischen LH-Gipfels beim Weibchen und hat einen offensichtlichen physiologischen und agronomischen Nutzen. Sie wird außerdem ein gutes Abschätzen des für eine künstliche Insemination in jeder der betroffenen Arten optimal gewählten Zeitpunktes ermöglichen. Tatsächlich ist für jede Art der Zeitraum zwischen dem LH-Gipfel und dem Eisprung konstant; im Gegensatz dazu ist das Zeitintervall, welches den Temperaturanstieg (bis heute verwendeter Anhaltspunkt) und den LH-Gipfel trennt, bei den Individuen der gleichen Rasse schwankend.
- Der erfindungsgemäße Test erweist sich daher als ein unverzichtbares Mittel, um diese Variabilitätsfaktoren, die für den Erfolg der Befruchtung von Cvocyten und das Samneln von Embryonen guter Qualität wichtig sind, zu meistern. In der Tat, kann man in Kenntnis des genauen Zeitpunkts des Eisprungs infolge der Bestimmung des LH-Gipfels und der künstlichen Insemination, ableiten, in welchen Entwicklungsstadien die Embryonen, die man sammeln möchte, sich befinden. Dieser Punkt ist deshalb wichtig, da zu junge oder zu weit entwickelte Embryonen nicht kommerziell verwendet werden können (z.B. mit gerissener Pelikularmembran).
- Schließlich ist dieser Test zur Bestimmung des tierischen LH im Rahmen der Entwicklung von neuen Behandlungsverfahren (Synchronisierung, Superovulation) oder für die Ausdehnung dieser Behandlungsverfähren auf eine Rasse, z.B. einer Art, bei der die präovulatorische Physiologie wenig bekannt ist (z.B. bei Hirschen) interessant.
- Ebenso zeigt die enzymimmunometrische Bestimmung des menschlichen LH, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt wird, gleichzeitig die Charakteristika einer quantitativen Bestimmung, bedingt durch die sehr gute Sensitivität, die aufgrund des genannten Verfährens entsteht, und einer qualitativen Bestimmung, bedingt durch die Einfachheit der Durchführung und der Interpretation, die ebenfalls durch das erfindungsgemäße Verfahren bedingt ist. Es kann daher im Labor oder zuhause, für eine individuelle Nutzung verwendet werden ("Home-Test"); im letzteren Fall wird hierzu ein Detektions-Kit für den präovulatorischen LH- Gipfel dienen, der dadurch charakterisiert ist, daß eine nichtzweideutige grüne Farbe erscheint und der es erlaubt, den Moment des Eisprungs bei der Frau vorherzusehen.
- Wenn man im übrigen eine Bestimmung durchführen möchte, die eine Artenpolyspezifität zeigt, müssen die Antikörper besondere Eigenschaften besitzen; in diesem Fall ist die Auswähl der Antikörper für eine geeignete Entwicklung des erfindungsgemäßen Verfährens wichtig. Zu diesem Zweck hat die Anmelderin ebenso besondere Antikörper entwickelt, die dem erfindungsgemäßen Verfahren angepaßt sind.
- Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein erfindungsgemäßes Reagens für die Entwicklung eines Verfährens zur Detektion und/oder immunologischen Bestimmung von Hormonen beim Tier unter Einschluß des Menschen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es einen Antihormon-Antikörper enthält, der für eine Verwendung als zweiter und/oder dritter Antikörper im genannten Verfähren verwendbar ist, wobei der Antikörper in INC-Medium präinkubiert wird.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso ein erfindungsgemäßes Reagens für die Entwicklung eines Verfahrens zur Detektion und/oder immunologischen Bestimmung von Hormonen beim Tier unter Einschluß des Menschen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es einen Antihormon-Antikörper enthält, der als erster Antikörper im genannten Verfähren verwendbar ist, wobei dieser erste Antikörper auf einer festen Unterlage fixiert und in INC-Medium abgesättigt ist.
- Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Kit zur Detektion und/oder der diagnostischen Bestimmungen von Hypophysenhormonen (FSH, LH, TSH, GH, ACTH, Prolactin, Ocytocin, ADH, MS) beim Menschen oder beim Tier oder ein Kit zur Entwicklung eines erfindungsgemäßen Tests, dadurch gekennzeichnet, daß es außer nützlichen Puffermengen für die Durchführung der genannten Detektion enthält:
- - einen ersten Antikörper, der spezifisch für das zu bestimmende Hormon ist und der aus den gegen das zu bestimmende Hormon gerichteten Antikörpern ausgewählt ist, der auf einer festen Unterlage fixiert ist und der mit dem erfindungsgemäßen INC-Medium abgesättigt ist;
- - einen zweiten Antikörper, der für das zu bestimmende Hormon spezifisch ist, der aus den gegen das zu Bestimmende Hormon gerichteten Antikörpern ausgewählt ist, der an ein geeignetes Enzym gebunden ist und im genannten erfindungsgemäßen INC-Medium präinkubiert wurde;
- - ein Entwicklungssubstrat für das Enzym und
- - ein INC-Medium.
- Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform des genannten Kits enthalt er, wenn er für die Bestimmung von LH entwickelt wird:
- - einen ersten polyclonalen Antikörper, der auf einer festen Unterlage fixiert ist, mit INC-Medium gesättigt ist, aus den polyclonalen Anti-Schaf-LH-Antikörpern aus dem Kaninchen und den polyclonalen Anti- Schaf-LH-Antikörpern aus dem Pferd ausgewählt wurde;
- - ein Enzymantikörperkonjugat, in welchem der Antikörper aus der Gruppe ausgewählt wurde, die aus den polyclonalen Anti-Schaf-LH-Antikörpern des Kaninchens, den polyclonalen Anti-Schaf-LH-Antikörpern des Pfer- des ausgewählt wurde, wobei die Konjugate in INC-Medium präinkubiert werden;
- - ein Enzymentwicklungssübstrat;
- - eine Entnahmekapillare und
- - INC-Medium.
- Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform dieses Kits wird das Enzym aus der Gruppe ausgewählt, die die Peroxidasen und die -Galactosidase umfaßt.
- Die Entwicklungssubstrate für die Peroxidase sind vorteilhafterweise OPD und ABTS; Entwicklungssubstrate für die β-Galactosidase sind vorteilhafterweise 4-Methylumbelliferyl-β-D-galactopyranosid (MUG) und ortho-Nitrophenyl-β-O-galactopyranosid (ONPG).
- Die festen Träger werden vorteilhafterweise aus den bekannten Trägern, wie z.B. Mikrotiterplatten, Stänchen, Streifen, Kugeln oder Membranen, ausgewählt.
- Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform dieses Kits enthält es:
- - eine Reihe von geeigneten festen Trägern, die mit einem ersten Antikörper belegt sind, der aus den Antikörpern, die gegen das zu bestimmende Hormon gerichtet sind, ausgewählt ist, wobei diese festen Träger in INC-Medium gesättigt sind;
- - ein zweiter Antikörper, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Anti-FSH-, Anti-LH-, Anti-TSH-, Anti-GH-, Anti-ACTH-, Antiprolactin-, Antiocytocin- und Anti-ADH-Antikörpern besteht, die vom ersten Antikörper unterschiediich sind und die in INC-Medium präinkubiert wurden;
- - ein Peroxidase-Anti-IgG-Konjugat, das in INC-Medium präinkubiert wurde;
- - ein Entwicklungssübstrat für die Peroxidase; und
- - INC-Medium.
- Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform besteht es aus:
- - einer Reihe von festen Trägern, die mit einem ersten Antikörper belegt sind, der aus der Gruppe ausgewählt wurde, welcher die polyclonalen Anti-Schaf-LH-Antikörper aus dem Kaninchen umfaßt, wobei die festen Träger in INC-Medium gesättigt wurden;
- - ein zweiter Antikörper, der aus der Gruppe ausgewählt wurde, welche die polyclonalen Anti-LH-Antikörper aus dem Pferd umfassen;
- - ein Peroxidase-Pferd-Anti-IgG-Konjugat, das in INC-Medium präinkubiert wurde;
- - ein Entwicklungssubstrat für die Peroxidase;
- - eine Entnahmekapillare; und
- - INC-Medium.
- Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform enthält es:
- - eine Serie fester Träger, die mit einem ersten Antikörper belegt sind, der aus der Gruppe ausgewählt ist, welche die polyclonalen Anti- Schaf-LH-Antikörper aus dem Kaninchen umfaßt, wobei die festen Träger in INC-Medium gesättigt wurden;
- - ein Konjugat aus β-Galactosidase und polyclonalem Anti-Schaf-LH Serum aus dem Pferd, welches in INC-Medium präinkubiert wurde;
- - ein Entwicklungssubstrat für die β-Galactosidase;
- - eine Entnahmekapillare; und
- - INC-Medium.
- Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform enthält es:
- - eine Reihe von festen Trägern, die in geeigneter Weise mit einem Antikörper belegt sind, der aus der Gruppe, welche die erfindungsgemäßen polyclonalen Anti-Schaf-LH-Antikörper aus dem Kaninchen umfaßt sowie die erfindungsgemäßen Reagentien, welche den bereits zitierten polyclonalen Kaninchen-Antikörper enthalten, wobei die festen Träger ggf. in INC- Medium abgesättigt wurden;
- - geeigneten Dosen eines Antikörpers, welcher aus der Gruppe ausgewählt wurde, die polyclonale Anti-Schaf-LH Antikörper des Pferdes umfassen und die erfindungsgemäßen Reagentien, welche den genannten polyclonalen Pferde-Antikörper enthalten;
- - geeignete Dosierungen des Konjugates aus Peroxidase und Pferde- Anti-IgG, welche in INC-Medium entsprechend dem oben beschriebenen Reagens präinkubiert wurden;
- - geeignete Mengen eines Entwicklungssubstrats für die Peroxidase; und
- - eine Entnahmekapillare.
- Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform umfaßt es:
- - eine Reihe von festen Trägern, die in geeigneter Weise mit einem Antikörper belegt sind, welcher aus der Gruppe ausgewählt wurde, welche die erfindungsgemäßen polyclonalen Schaf-Anti-LH-Antikörper aus Kaninchen umfaßt und die erfindungsgemäßen Reagentien, welche den genannten polyclonalen Kaninchen-Antikörper enthalten, wobei die festen Träger ggf. in INC-Medium abgesättigt wurden;
- - geeignete Dosen des Konjugates aus β-Galactosidase und polyclonalen Anti-Schaf-LH-Antikörpern aus dem Pferd, welche entsprechend dem oben beschriebenen Reagens in INC-Medium präinkubiert wurden;
- - geeignete Mengen eines Entwicklungssubstrats für die β-Galactosidase; und
- - eine Entnahmekapillare.
- Außer den vorangegangenen Ausführungsformen beinhaltet die Erfindung außerdem andere Anwendungsformen, die aus der folgenden Beschreibung hervorgehen werden.
- Die Erfindung wird mit Hilfe der folgenden Ergänzung der Beschreibung, die sich auf Ausführungsbeispiele erfindungsgemäßer polyclonaler Antikörper und erfindungsgemaßer Beispiele für Testentwicklungen bezieht, besser verstanden werden.
- Es versteht sich jedoch von selbst, daß diese Beispiele und Zeichnungen lediglich dazu dienen, den Gegenstand der Erfindung darzustellen; jedoch stellen sie in keiner Art und Weise eine Einschränkung dar.
- Das für die Immunisierung verwendete Antigen ist eine äquimolare Mischung von verschiedenen gereinigten Fraktionen des Schaf-LH (oLH). Diese Fraktionen wurden wie folgt registriert:
- oLH 1051 1083
- 1055 1085
- 1072 1086
- Jede Injektion enthielt 1 mg der oben spezifizierten oLH-Mischung, gelöst in 2,5 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung und als Emulsion in 2,5 ml komplettem Freundachem Adjuvans hergestellt.
- Das Immunisierungsprotokoll besteht aus 6 Injektionen, gefolgt von 8 Auffrischungen, nach denen jeweils zwei Wochen später eine Blutentnahme durchgeführt wurde. Die genaue Reihenfolge der Injektionen wird durch das folgende Schema I dargestellt: Schema I
- Jede Injektion enthielt 0,1 mg des oLH-Gemisches, gelöst in 0,5 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung. Das Ganze wurde als Emulsion in 0,5 ml vollständigem Freundschem Adjuvans hergestellt und an mehreren Stellen entlang des Rückgrades (intradermale Injektionen) injiziert.
- Das Immunisierungsprotokoll bestand aus 4 Injektionen, welche alle zwei Wochen durchgeführt wurden. Dann folgte eine Reihe von 12 Auffrischungen, die gemäß der unten im Schema II gezeigten Reihenfolge durchgeführt wurden: Schema II
- Die Blutentnahmen wurden zwei Wochen nach den angegebenen Auffrischungen durchgeführt, mit der Ausnamme von S&sub5;, welche vier Wochen nach R&sub7; durchgeführt wurde.
- Es wurden drei Kaninchen Immunisiert: zwei erhielten die 12 Auffrischungen, eines erhielt lediglich 6 Auffrischungen.
- Diese Reinigung erfolgt durch Ionenaustauschchromatographie auf DEAE-Trisacryl (IBF-France) in K26/40-Säulen von Pharmacia.
- Das Immunserum (15 ml) wird eine Nacht gegen einen Puffer aus Tris- HCl 0,025 M, NaCl 0,035 M, pH 8,8 bei 4ºC dialysiert. Parallel dazu wird die Säule mit dem gleichen Puffer äquilibriert. Nach der Filtration des dialysierten Serums wird dieses über die Kolonne geleitet, mit einem Durchfluß von 50 ml/h. Die erhaltene eluierte Fraktion, welche am Ausgang der Säule erhalten wurde, enthielt die IgG des Serums und stellt die Fraktion dar, welche in Bezug auf die Antikörper angereichert ist und welche man bei der Bestimmung verwendet. Vor der Verwendung wird diese Fraktion gegen PBS, pH 7,4 (0,01 M KH&sub2;PO&sub4;/K&sub2;HPO&sub4;, NaCl 0,15 M) dialysiert. Sie wird im folgenden durch Ultrafiltration auf einem MINICON- Träger (Amicon, Irland) ultrafiltriert, bis eine Konzentration erreicht wird, welche zwischen 5 und 10 ng/ml liegt. Sie wird in Form von Aliquots bei -20ºC in 50 % doppelt destilliertem Glycerin verdünnt gelagert.
- Die Reinigung erfolgt durch Affinitätschromatographie mit Protein A. Man verwendet die Gel-Protein-A-Sepharose CL-4B (Pharmacia), welche in eine 2 x 10 cm-Säule (Pharmacia) gefüllt wurde. Das Serum (5 ml) wird zuvor gegen Phosphatpuffer 0,1 M, pH 8, dialysiert, filtriert und über die Säule, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert wurde, geleitet (Durchfluß: 15 ml/h).
- Unter Verwendung eines pH-Gradienten von 6 bis 4,5 der mit einem Citronensäurecitrat 0,1 M Puffer und dann mit einem pH 3-Puffer (Essigsäure 0,1 N, NaCl 0,15 M) hergestellt wurde, wurden die Inmunglobuline abgelöst.
- Die eluierten Fraktionen werden mit Phosphatpuffer 1 M, pH 8, neutralisiert und gegen PBS dialysiert, bevor sie durch Ultrafiltration konzentriert (Ref. oben) und bei -20ºC in 50 % bidestilliertem Glycerin gelagert werden.
- Die experimentellen Protokolle, die unter 3 a) und b) verwendet werden, wurden gemaß den Angaben der Hersteller durchgeführt und gemäß "Techniques immunoenzymatiques" Th. Ternynck und S. Avrameas, èditions INSERM, 1987, vervollständigt.
- In allen Fällen wird die genaue Konzentration der gereinigten Fraktionen durch eine Messung der optischen Dichte bei 280 nm durchgeführt, mit der Annähme, daß eine O.D. von 1,4 etwa einer IgG-Lösung von 1 mg/ml entspricht.
- 4) Charakteristika und Spezifität der erfindungsgemäßen Anti-LH- Antikörper:
- Trägt man der strukturellen Ähnlichkeit mit den anderen Glycoproteinhormonen Rechnung, ist es für das Erhalten einer zuverlässigen Bestimmung unverzichtbar, Antikörper zur Verfügung zu stellen, die lediglich das LH erkennen und keine Kreuzreaktion mit dem FSH und dem TSH in den untersuchten Tierarten zeigen. Daher wurden in den Bestimmungstests verschiedene FSH und TSH getestet, um den Prozentsatz der Kreuzreaktion zu bestimmen.
- Gleichermaßen wurden die LH von verschiedenen Tierarten in dem Bestimmungstest getestet und ihr Prozentsatz der Kreuzreaktion wurde berechnet.
- Der Prozentsatz der Kreuzreaktion wird auf klassische Weise durch Vergleich der Dosiswirkungskurven, welche einerseits mit einer Reihe von Konzentrationen jedes getesteten LHs und andererseits mit einer Reihe von Konzentrationen des Schaf-LHs erhalten wurden, berechnet. Ausgehend von der Referenzkurve, welche mit dem Schaf-LH erhalten wurde, sei Y die konzentration, welche 50 % des maximalen optischen Signals (E.D.50) ergibt. Ausgehend von der Kurve, welche mit dem anderen LH erhalten wurde, sei X die entsprechende Konzentration bei der gleichen optischen Dichte wie die, welche für die Definition von Y verwendet wurde:
- Der Prozentsatz der Kreuzreaktion ist gleich X/Y x 100.
- Mit unterschiedlichen getesteten LH erhaltene Kreuzreaktion:
- b) Kreuzreaktion, erhalten mit den ESH und TSR von Tierarten, bei denen LH von den zwei Antikörpern (AP1 und AP2), die für die Bestimmung spezifisch sind, erkannt wird:
- Es muß angemerkt werden, daß der Prozentsatz der Kreuzreaktion mit dem Schaf-TSH erhöht ist (8 %) und währscheinlich auf eine erhöhte Kontamination in der verwendeten Hormonpräparation zurückzuführen ist.
- Die Affinitätskonstante (Ka) wurde gemaß der Methode, welche von B. Friguet et al. ((1985) J. Immunol. Methods, Bd. 77, 305-319) beschrieben wurde, bestimmt und wurde gemäß der Darstellung von Klotz berechnet:
- . Anti-Schaf-LH-Antikörper des Kaninchens,
- Ka = 1,87.10&sup9;M&supmin;¹
- . Anti-Schaf-LH-Antikörper des Pferdes,
- Ka = 2.10&sup9;M&supmin;¹.
- Erfindungsgemäßer immunenzymetrischer Test: Bestimmung tierischer LHs.
- A - Prinzip der Bestimmung:
- Es handelt sich um eine ELISA-Bestimmung (Enzyme-Linked- ImmunoSorband-Assay), d.h. daß die Gesamtheit der Reagentien an eine feste Phase gebunden ist. Die verwendete feste Phase ist in nichteinschränkender Weise eine Miktrotiterplatte mit 96 Vertiefungen aus Luxlon (hydrophober Kunststoff), jedoch kann die Bestimmung mit anderen Plattentypen oder anderen Trägertypen, insbesondere Stäbchen, Streifen, Kugeln oder Membranen, durchgeführt werden.
- Die erfindungsgemäße Bestimmung vom "Sandwich"-Typ verwendet zwei polyclonale Antikörper, wie oben definiert, d.h. ausgehend vom gleichen Antigen, dem Schaf-LH, hergestellt, jedoch von zwei unterschiedlichen Tierarten produziert (das Kaninchen und das Pony):
- - der erste Antikörper (AP1) wird auf dem Boden einer Vertiefung einer Mikrotiterplatte gebunden. Der erste Antikörper wurde vom Kaninchen hergestellt;
- - nach dem Waschen der Platte sättigt man ggf. die Platte mit einem geeigneten Medium, dem Serum oder Plasma, das frei von LH ist, zugefügt wurde. Dieses Medium wird im folgenden INC-Medium genannt;
- - die zu bestimmende Probe wird inkubiert; ein Volumen von 10 µl je Vertiefung ist notwendig, d.h. daß die Bestimmung ausgehend von einem Tropfen Plasma oder Blut durchgeführt werden kann. Die Bestimmung ausgehend von Blut wird in einem modifizierten Medium, welches Heparin enthält, durchgeführt; dieses wird im folgenden Medium S genannt;
- - Waschen der Platte, Inkubation mit dem zweiten Antikörper, der zuvor in INC-Medium verdünnt wurde. Dieser zweite Antikörper wurde vom Pony produziert;
- - Waschen der Platte, Inkubation mit einem dritten Antikörper, welcher an ein Enzym (Ziege-Anti-Pferd-IgG-Antikörper, gekoppelt an die Peroxidase oder an die β-Galactosidase) gebunden ist. Vor der Zugabe wird der Antikörper in INC-Medium verdünnt;
- - nach dem Waschen wird die enzymatische Aktivität, welche an die feste Phase gebunden ist, mit Hilfe eines chromogenen oder fluorogenen Subetrates entwickelt, welches für das verwendete Enzym spezifisch ist. Die Intensität der erhaltenen Farbreaktion oder des Fluoreszenzsignals ist proportional zur Konzentration des LH-Gehaltes in der bestimmten Probe, wie die Kurven der Fig. 1 zeigen. Die notwendige Reaktionszeit liegt bei 5 min für die Detektion des präovulatorischen Gipfels und bei 15 min für eine präzise quantitative Messung des niedrigen zirkulierenden Spiegels.
- Die Rolle der Reihenfolge der Verwendung der beiden spezifischen Antikörper wurde durch Vergleich der beiden möglichen Kembinationen bestimmt:
- . Kurve (- -) : AP1-Kaninchen
- AP2-Pferd und
- . Kurve (-- --) : Ap1-Pferd
- AP2-Kaninchen.
- Die Resultate, die in Fig. 1 dargestellt sind, wurden ausgehend von einer Verdünnungsreihe des Schaf-LH, welche in Phosphatpuffer durchgeführt wurde (Standardreihe), erhalten. Wie man sehr deutlich unterscheiden kann, ergibt die Kombination AP1-Kaninchen/AP2-Pferd (- -) die besseren Ergebnisse sowohl in Bezug auf die Nachweisgrenze als auch in Bezug auf die Sensitivität der Bestimmung.
- Die Tatsache, daß zwei Antikörper verwendet wurden, die von zwei verschiedenen Tierarten hergestellt wurden, ist für das Erhalten der verbesserten Sensitivität des erfindungsgemäßen Tests im Vergleich zu den Tests im Stand der Technik entscheidend. Diese besondere Auswähl der polyclonalen Antikörper steigert im Vergleich zu den Immunseren, welche von der gleichen Art gebildet werden, die Wahrscheinlichkeit, daß ein LH- Molekül von den verschiedenen Epitopen von jedem der Immunseren erkannt wird. Fig. 2 zeigt die Verringerung der Sensitivität der Bestimmung, wenn man zwei Antikörper (AP1 und AP2) verwendet, welche von der gleichen Tierart (z.B. Pferd:AP1 = AP-Pferd in einer Konzentration von 10 µg/ml und AP2 = AP-Pferd-β-Galactosidase in einer Konzentration von 5 µg/ml) hergestellt wurden.
- Die Verwendung des gleichen Antikörpers als AP1 und als AP2 (Kurve -*-) führt zu einem beträchtlichen Verlust der Sensitivität der Bestimmung, wie die Kurven in Fig. 2 belegen. Man beobachtet für die oLH-Konzentration, welche 50 % Bindung ergibt, eine Sensitivität von 250 pg/ml im Falle eines Protokolls gemaß der Erfindung (AP1 Kaninchen, AP2 Pferd, AP3 Anti-Pferd-Peroxidase; Kurve (.. ..)gegenüber 1,8 ng/ml im Falle eines Protokolls unter Verwendung von zwei identischen Antikörpern (Kurve -*-), wie oben präzisiert. Diese letzte Zahl entspricht im Vergleich zu einer Bestimmung, welche unter optimalen Bedingungen durchgeführt wird (erfindungsgemäß siehe z.B. das folgende Beispiel 3) einer Resteffizient von 15 %. Der Prozentsatz an Bindung wurde gemäß der Formel B-NS/T bestimmt, wobei B die optische Dichte, welche für jeden Punkt der Verdünnungsreihe gemessen wurde, ist, NS die optische Dichte ist, welche für den Nullpunkt der Verdünnungsreihe gemessen wurde und T die optische Dichte repräsentiert, welche für den höchsten Punkt der Verdünnungsreihe gemessen wurde.
- Im Falle einer Bestimmung, die direkt aus Blut durchgeführt wird, muß das Medium zur Verdünnung der Probe zusätzliches Heparin enthalten, um eine Koagulation zu vermeiden. Blut wurde daher mit PBS-Tween-BSA, zu weichem 0,2 % Heparin, d.h. 100 µl Heparin für 50 ml PBS-Tween-BSA (siehe Beispiel 3) gegeben wurde, versetzt.
- Dieses Medium setzt sich aus mindestens 50 % Serum oder Plasma von einem durch Hypophysektomie behandelten Widder zusammen, welches in PBS- Tween-BSA verdünnt wurde.
- 48 h vor der Operation wurde das Tier nüchtern gehalten. Diese wurde unter Anästhesie durchgeführt; die Entfernung der Hypophyse erfolgte durch die bukale Platte.
- Blutentnahmen wurden täglich durchgeführt, um die Abnahme des zirkulierenden LHs vom Beginn der Hypophysektomie an zu kontrollieren. Wenn dieses nicht mehr nachweisbar ist, wird das Tier anästhesiert und ausgeblutet. Das Blut wird unter Heparin gesammelt, um das Plasma zu erhalten oder wird zur Koagulation gebracht, um davon das Serum abzutrennen. Plasma und Serum werden bei -20ºC konserviert.
- Dem Tier wird Blut zwischen 5 und 7 Tagen nach der Hypophysektomie entnommen.
- In der plasmatischen Bestimmung ist es unverzichtbar, eine Standardreihe in einem Medium durchzuführen, welches das gleiche Verhältnis an Plasma enthält, wie die Präparationen der zu bestimmenden Proben. Sind diese 10fach verdünnt, so wird die Standardreihe mit dem Serum des durch Hypophysektomie behandelten Tiers (LH&supmin;), welches lofach im normalen Verdünnungspuffer (PBS-BSA-Tween) verdünnt wurde, durchgeführt. Fig. 3 zeigt die Resultate, welche mit einer Standardreihe erhalten wurden, die im Verdünnungspuffer hergestellt wurde (- -) und die Resultate, welche mit einer Reihe erhalten wurden, die in dem gleichen Puffer unter Zugabe von 10 % Serum des mit einer Hypophysektomie behandelten Tiers (-- --) durchgeführt wurden (Bestimmung vom AP3-Peroxidase/OPD-Typ, siehe Beispiel 3). Man beobachtet eine besonders störende Interferenz des LH&supmin;- Serums in der Bestimmung, insbesondere im Bereich der niedrigen Konzentrationen an Schaf-LH (oLH), die die ganze tatsächliche Sensitivität der Bestimmung maskiert.
- Als Konsequenz wurden die beiden Anti-LH-Immunseren an Schaf-IgG erschöpft, um jegliche Interferenz zwischen den IgG, welche von unterschiediichen Tierarten stammen (auf der einen Seite Schaf, auf der anderen Seite Kaninchen und Pferd), zu eliminieren. Die erhaltenen Resultate zeigen nur eine schwache Verringerung des starken nichtspezifischen Signals, das ohne vorherige Erschöpfung beobachtet wurde.
- Es sieht so aus, als ob eine weitere Interferenzquelle wirksam ist, z.B. bedingt durch eine Substanz, die dem LH immunologisch nähe ist und gleichermaßen erkannt wird.
- Vergleichbare Ergebnisse wurden in einem radioimmunologischen Bestimmungstest des LH beim Rhesus-Affen (Neill et al., 1977, Peckham et al., 1977) beschrieben. Unter Verwendung von Schaf-LH als iodiertem Tracer und einem Anti-Schaf-LH-Antikörper beobachteten die Autoren eine sehr starke unspezifische Interferenz bei den niedrigen Konzentrationen der Reihe; im Gegensatz dazu beobachteten sie keine Interferenz bei Verwendung von iodiertem LH des Affen und einem Anti-LH-Antikörper des Affen. Diese "LH-ähnliche" Substanz wurde nicht gereinigt und ihr interferierender Effekt wurde von den Autoren nicht untersucht.
- Das erfindungsgemaße Verfähren hat seinerseits den Vorteil, daß es erlaubt, diese Schwierigkeit zu beseitigen und zwar dank des INC-Mediums, welches es erlaubte, einen sehr genauen verläßlichen und schnelle Bestimmungstests zu entwickeln.
- Diese Bestimmung hängt nicht von dem als Marker verwendeten Enzym ab. Bis jetzt wurden zwei Enzyme verwendet, die Peroxidase und die β-Galactosidase, die erste mit zwei chromogenen Substraten, die zweite mit einem fluorogenen Substrat.
- * für die Peroxidase:
- . OPD (ortho-Phenylendiamin)
- . ABTS (2-2'-Azinobis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure)).
- - Das OPD wird in situ in einer Konzentration von 0,5 mg/ml in Acetatpuffer (0,1 M Natriumacetat), pH 5,6, dem Wasserstoffperoxid zu 0,2 % zugegeben wurde, hergestellt.
- Die Messung der optischen Dichte erfolgt bei 492 nm; die Reaktion führte zum Erscheinen einer orangen bis braunen Farbe und wird mit 50 µl 2 N Schwefelsäure angehalten.
- - ABTS wird in einem Citratpuffer 0,05 M, pH 4, hergestellt: zu 12 ml Citratpuffer gibt man 60 µl ABTS-Stammlösung und 50 µl Wasserstoffperoxid in einer Konzentration von 2 %, die Messung der optischen Dichte erfolgt bei 405 nm.
- Unter der Wirkung der Peroxidase wird das farblose ABTS grün.
- - Citratpuffer: 2 Volumen Citronensäure ((5,3 g/l) C&sub6;H&sub8;O&sub7;, 1H&sub2;O) + ein Volumen Natriumphosphat (Na&sub2;HPO&sub4;, 12 H&sub2;O) (17,73 g/l). Die Reaktion kann mit 20 µl SDS 10 % angehalten werden, wobei dies keinerlei verpflichtenden Charakter hat.
- * Für die β-Galactosidase:
- - 4-Methylumbelliferyl-β-D-galactopyranosid (MUG), Handel sprodukt (Sigma M 1633):
- 2,5 mg werden in 12,5 ml Phosphatpuffer 0,1 M, pH 7,4, (siehe die Zusammensetzung in Beispiel 3) gelöst. Die Reaktion wird mit 50 µl 2 M Natriumcarbonat angehalten.
- Das Lesen des Fiuoreszenzsignals erfolgt mit einem Spektrofluorimeter für FLISA-Platten.
- Wellenlänge des eingestrählen Lichtes = 360 nm, Wellenlänge der Emission = 448 nm.
- * Antikörper, konjugiert an die Peroxidase (AP3): Anti-IgG-Antikörper des Pferdes, welche an die Peroxidase gekoppelt sind, sind kommerziell erhältlich: Jackson Immunoresearch Laboratories Inc., Bestell-Nr. 108-035-003.
- * Antikörper, konjugiert an die β-Galactosidase, werden gemaß zwei Möglichkeiten hergestellt:
- - entweder wird der Anti-Pferd-LH-Antikörper direkt an die β-Galactosidase (AP2-β-Galactosidase) gekoppelt,
- - oder ein Anti-Pferd-IgG-Antikörper wird an die β-Galactosidase (AP3-β-Galactosidase) gekoppelt.
- * Durchführung der Kopplung:
- Sie wird gemäß dem Verfahren der zweistufigen Glutaraldehydkopplung (Techniques Immunoenzymatiques, Th. Ternynck und S. Avrameas, Editions Inserm, 1987, S. 33-34) durchgeführt.
- Der Anti-Pferd-LH-Antikörper wird durch Ionenaustauschchromatographie (DEAE) gereinigt, ebenso wie der Anti-Pferd-IgG-Antikörper (vom Schaf hergestellt).
- D - Puffer:
- * 0,1 M Carbonatpuffer, pH 9,6: 10fache Verdünnung einer molaren Lösung an Natriumcarbonat-Bicarbonat in destilliertem Wasser.
- * PBS: 100fache Verdünnung einer molaren Lösung an Kalium und Bikaliumphosphat, pH 7,4, in einer 0,15 M NaCl-Lösung.
- * PBS-Tween: Zugabe von 0,1 % (1 mil in einem 1) an Tween 20 in PBS.
- * PBS-Tween-BSA: Zugabe von 0,2 % BSA in PBS-Tween.
- Quantitative kolorimetrische Bestimmung mit dem AP3- Peroxidasesystem: Bestimmung von tierischen LHs
- * Sensibilisierung der Platten oder Coating:
- 100 µl an Anti-Schaf-LH-Antikörpern aus dem Kaninchen (AP1), die in 0,1 M Carbonatpuffer, pH 9,6, zu einer Konzentration von 7,5 µg/ml hergestellt wurden, werden in Vertiefungen verteilt. Die Platte wird 1 h bei 37ºC und dann eine Nacht bei 4ºC inkubiert. Anschließend wird die Platte mit PBS-Tween 5mal mit je 300 µl pro Vertiefung entweder manuell oder mit einem automatischen Waschgerät für ELISA-Platten gewaschen.
- AP1 kann in verschiedenen Konzentrationen hergestellt werden: 10 µg/ml oder 5 µg/ml; die extremen Konzentrationen sind 20 µg/ml und 2,5 µg/ml.
- * Coating oder Sättigung der Vertiefung:
- Nach dem Waschen werden die Vertiefungen mit 100 µl INC-Medium gefüllt, und die Platte wird 30 min bei 37ºC inkubiert. Auf dieser Stufe wird die Platte entweder für die folgende Bestimmung verwendet oder geleert, bei 37ºC getrocknet und dann hei trockener Atmosphäre gehalten und unter Plastik versiegelt.
- * Inkubation der Proben und der Verdünnungsreihe:
- Die oLH (Schaf-LH)-Verdünnungsreihe wird in PBS-Tween-BSA hergestellt, das Serum eines Tieres enthält, welches einer Hypophysektomie unterzogen wurde und welches in 10er Schritten verdünnt wurde. Sie enthält die folgenden Konzentrationen: 60 pg/ml, 125 pg/ml, 250 pg/ml, 500 pg/ml, 1 ng/ml, 2 ng/ml, 4 ng/ml, 8 ng/ml und ggf. 40 ng/ml an oLH. Sie werden in doppeltem Ansatz in 100 µl pro Vertiefung zugegeben.
- Die zu bestimmenden Plasmaproben werden 10fach in PBS-Tween-BSA verdünnt. Sie werden in doppeltem oder in dreifachem Ansatz in 100 µl je Loch zugegeben. (Die Verdünnung in 10er Stufen ist nicht verpflichtend und kann höher oder niedriger sein, sollte dies notwendig sein). Das Ganze wird 1 h hei 37ºC inkubiert. Danach wird die Platte 5mal mit PBS- Tween (300 µl/Vertiefung) auf die gleiche Art und Weise, wie oben beschrieben, gewaschen.
- * Inkubation mit dem zweiten Anti-LH (Pferd)-Antikörper:
- Dieser Antikörper (AP2) wird zuvor im INC-Medium hergestellt: er wird zu einer Konzentration von 5 µg/ml in INC-Medium verdünnt und 30 min bei 37ºC inkubiert, bevor er zu den Vertiefungen in 100 µl je Vertiefung zugegeben wird.
- Ist AP2 einmal zugegeben, wird die Platte 1 h bei 37ºC inkubiert. Wie im Falle des AP1 aus dem Kaninchen ist die Konzentration von 5 µg/ml für AP2 nicht verpflichtend, sie muß jedoch in allen Fällen unterhalb der des AP1 sein. Sie kann zwischen 15 µg/ml (wenn AP1 in einer Konzentration von 20 µg/ml vorliegt) bis 2,5 µg/ml, sogar 1 µg/ml (wenn AP1 in einer Konzentration von 2,5 µg/ml vorliegt) sein. Nach der Inkubation wird die Platte 5mal auf die gleiche Weise wie oben mit PBS-Tween gewaschen.
- * Inkubation mit dem dritten Anti-Pferd-IgG-Antikörper, welcher an die Peroxidase gekoppelt ist:
- AP3 wird gleichermaßen 30 min bei 37ºC in INC-Medium in einer 1/5000-Verdünnung (nach den Angaben des Herstellers) präinkubiert, bevor er in die Vertiefungen (100 µl pro Vertiefung) gegeben wird. Man inkubiert 1 h bei 37ºC. Die Platte wird in der Folge 5mal mit PBS-Tween gewaschen.
- * Zugabe des Substrats der Peroxidase:
- Man gibt 100 µl ABTS zu, welches, wie oben angegeben, hergestellt wurde (C): nach 5 min sind die Vertiefungen, welche einer hohen Konzentration an oLH entsprechen, grün gefärbt.
- Nach 15 min Inkubation bei 37ºC wird eine erste Messung der optischen Dichte durchgeführt, um einen ersten Anhaltspunkt der Entwicklung der Reaktion zu erhalten. Danach wird die Platte von neuem 15 min bei 37ºC inkubiert, sofern die Reaktion weitergeführt werden muß, besonders im Falle von Proben, die einen niedrigen Gehalt an LH haben. Dann schreitet man zu einem definitiven Lesen der Resultate. Man kann die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 20 µl 10 % SDS pro Vertiefung anhalten.
- Das Lesen der optischen Dichte erfolgt mit Hilfe eines automatischen Spektrometers für ELISA-Platten, welches mit einem 405 nm Filter ausgestattet ist.
- Fig. 4 zeigt die Ergebnisse einer derartigen Bestimmung, welche in Anwesenheit des INC-Mediums durchgeführt wurde, mit einer Verdünnungsreihe von oLH, die in PBS-BSA-Tween (-- --) durchgeführt wurde und mit einer Verdunnungsreihe, die mit LH&supmin; (Serum aus einem Tier, das einer Hypophysektomie unterzogen wurde) und welches in 10er Schritten mit PBS- BSA-Tween (- -) verdünnt wurde, durchgeführt wurde. Das perfekte Übereinanderlegen der beiden Kurven zeigt an, daß die nichtspezifische Interferenz, die oben beschrieben wurde, vollständig entfernt wurde. Man stellt ebenso eine Verbesserung der Sensitivität der Bestimmung in Bezug auf die Kurve (- -) der Fig. 3 fest.
- Der Effekt des INC-Mediums ist der gleiche, sei es, daß es 50 % Plasma oder Serum eines hypophysektomisierten Tieres enthält.
- Das Verhältnis von 50 % an LH- im INC-Medium ist nicht verpflichtend und kann erhöht werden. Entsprechend ist unterhalb von 50 % die beschriebene nichtspezifische Interferenz nicht vollständig beseitigt.
- Fig. 5 zeigt die Kurve, welche unter diesen Bedingungen mit einer Standardreihe erhalten wurde, die in dem oben genannten Verdünnungsmedium hergestellt wurde. (Die Fig. 5 wurde unter den gleichen experimentellen Bedingungen erhalten wie die Kurve (-- --) der Fig. 4). Die Nachweisgrenze der Bestimmung liegt bei 60 pg/ml. Der Koeffizient der Intra-Bestimmungsvariation liegt bei 2,5 % (n = 10), der Koeffizient der Inter- Bestimmungsvariation liegt bei 6 % (n = 8).
- Das oben dargestellte Protokoll ist eine nichteinschränkende Durchführungsmöglichkeit sowohl was die Antikörperkonzentrationen als auch die Inkubationszeiten des Substrats, welche man variieren kann, betrifft. Die oben gezeigten experimentellen Bedingungen ergeben eine bevorzugte Durchführungsart für die Entwicklung einer sehr genauen und sehr verläßlichen (geringe Intra- und Inter-Bestimmungsvariabilität) und zwar unter Verwendung der geringst möglichen Konzentrationen an Reagentien.
- OPD kann als Substrat mit dem gleichen experimentellen Protokoll verwendet werden. Man gibt 100 µl Substrat in jede Vertiefung. Die enzymatische Entwicklung erfolgt bei Raumtemperatur oder bei 4ºC während 5 bis 20 min; sie wird mit 50 µl saurer Lösung, wie oben präzisiert, gestoppt (C). Das Lesen der optischen Dichte erfolgt bei 492 nm mit Hilfe des gleichen Apparatetyps.
- Diese Bestimmung kann ebenfalls im Zellkulturmedium und insbesondere in der Milch verwendet werden.
- Quantitative fluorimetrische Bestimmung mit dem AP2- - Galactosidasesystem: Bestimmung von tierischen LHs
- * Sensibilisierung der Platten (Coating):
- Der Anti-Kaninchen-LH-Antikörper (AP1) wird in einer Konzentration von 2,5 µg/ml in 0,1 M Carbonatpuffer, pH 9,6, hergestellt. Er wird den Vertiefungen in 100 µl zugegeben. Die Inkubation beträgt 1 h bei 37ºC, dann 18 h bei 4ºC.
- * Coating oder Sättigung der Vertiefung:
- Nach 5 Waschschritten mit PBS-Tween werden in jede Vertiefung 100 µl INC-Medium gegeben. Die Inkubation bei 37ºC beträgt 30 min. Die Platte wird entweder in trockener Umgebung gelagert oder direkt verwendet.
- * Inkubation der Proben:
- Sie erfolgt auf die gleiche Art und Weise wie im Protokoll des Beispiels 3. Die Inkubationsdauer kann von 1 h bis 1 h 30 variieren.
- * Inkubation mit dem zweiten Antikörper (Anti-Pferd-LH, gekoppelt an die β-Galactosidase, AP2):
- Nach dem Waschen der Platte wird AP2-β-Galactosidase in 100 µl pro Vertiefung zugegeben. Zuvor wurde er in INC-Medium zu einer Verdünnung von 1 µg/ml hergestellt und 30 min bei 37ºC präinkubiert.
- Die Inkubation in den Vertiefungen beträgt 1 h bei 37ºC, wonach die Platte 5mal mit PBS-Tween gewaschen wird.
- * Entwicklung der β-Galactosidase mit einem fluorogenen Substrat (4-MUG):
- 200 µl MUG, welches gemaß der unter C oben angegebenen Anweisung hergestellt wurde, werden in jede Vertiefung gegeben. Die Platte wird bei 42ºC während 1 bis 2 h inkubiert. Die Messung der Fluoreszenz erfolgt mit einem automatischen ELISA-Platten-Fluorimeter ("Microfluor" von Dynatech - USA).
- Die eingestrahlte Wellenlänge ist 360 nm; es wird bei einer Wellenlänge von 448 nm aufgezeichnet.
- Die Ergebnisse, welche mit einer Standardreihe erhalten wurde, die in PBS-BSA-Tween-LH&supmin;-Medium in 1/10-Verdünnungen hergestellt wurde, sind in der Fig. 6 dargestellt. MUG wurde wahrend 1 h inkubiert; man beobachtet, daß die Nachweisgrenze weniger gut ist als im Protokoll des Beispiels 3 (zwischen 250 und 500 pg/ml). Auf der anderen Seite sind die Koeffizienten der Intra- und Inter-Bestimmungsvariation in diesem Fall viel höher. Der Nutzen dieses Protokolls ist, daß es erlaubt, die Bestimmung in einer kürzeren Zeit durchzuführen.
- Die Konzentrationen der Reagentien wurden so gewählt, daß das Mengenverhältnis der verwendeten Reagentien und die Qualität der Bestimmung günstiger ist. Es ist offensichtlich, daß die Konzentrationen verändert werden können und daß dabei die Bestimmung genau bleibt.
- Unter gleichen Bedingungen wie denen des Beispiels 4 kann eine Bestimmung des LH, bei der AP2 an eine Peroxidase gekoppelt ist, durchgeführt werden.
- Die Bestimmung, ausgehend von Blut, kann sowohl mit einem quantitativen als auch mit einem qualitativen Ziel verwendet werden; unter "qualitativer Bestimmung" versteht man einen Test, der es erlaubt, den präovulatorischen Gipfel des LH beim Weibchen im Terrain ohne Meßapparatur und einfach mit dem Auge interpretierbar zu detektieren. Dieser Test erlaubt ebenso die Detektion von LH-Pulsen beim Weibchen oder beim Männchen.
- Eine Bestimmung, die ausgehend vom Plasma durchgeführt wird, stellt eine beträchtliche Belastung in dem Sinne dar, daß ein Zentrifugationsschritt, das Pipettieren des Plasmas nach der Zentrifugation und sein Transfer in ein neues Gefäß und ein Verdünnungsschritt vor der Verwendung in der Bestimmung notwendig sind (d.h. Pipettieren, Homogenisieren im Verdünnungspuffer).
- Um dieses Problem zu beseitigen, verwendet man in diesem Test ein neues Verfähren zur Blutabnahme bei Tieren. Es besteht darin, daß man eine sehr feine Nadel in die Jugolarvene des Tieres sticht, einen Tropfen Blut herausperlen läßt, auf diesen das äußerste Ende einer heparinisierten, auf ein sehr genaues Volumen kalibrierten (10 oder 25 µl) Glaskapillare ansetzt. Die Kapillare muß horizontal gehalten werden, damit das Blut bis an das äußerste Ende der Kapillare wandern kann. Mit Hilfe eines kleinen Plastiksaugballes, der dem Durchmesser der Kapillare angepaßt ist, wird ihr Inhalt in ein Gefäß überführt, welches im Falle einer Kapillare mit 25 µl 225 µl heparinisiertes PBS-Tween-BSA enthält. Das Blut wird dann 10fach verdünnt und wird dann nur noch in 2 x 100 µl in die Vertiefungen einer dafür vorgesehenen Platte verteilt.
- Diesen letzten Schritt kann man dadurch vermeiden, daß man alle Vertiefungen der Platte mit 90 µl heparinisiertem PBS-BSA-Tween füllt. Dann genügt es, Kapillaren eines Volumens von 10 µl zu verwenden und diese jeweils direkt in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte zu leeren. Die zu bestimmende Probe wird so direkt verdünnt und auf die Platte gegeben.
- * Sensibilisierung der Platten:
- AP1 wird zu einer Konzentration von 7,5 µg/ml in 0,1 M Carbonatpuffer, pH 9,6, verdünnt und 1 h bei 37ºC und dann 18 h bei 4ºC inkubiert. Die Platten werden dann 5mal mit PBS-Tween gewaschen, dann mit 100 µl INC-Medium je Vertiefung angefüllt. Sie werden 30 min bei 37ºC inkubiert, geleert, getrocknet und dann mit Kunststoff versiegelt oder direkt verwendet.
- * Zugabe der Proben:
- - entweder werden die 10 µl Blut direkt in die der Probe entsprechende Vertiefung gegeben, nachdem zuvor alle Vertiefungen mit 90 µl heparinisierten PBS-BSA-Tween gefüllt wurden;
- - oder man gibt je Vertiefung 100 µl der 25 µl Blut, die in 225 µl heparinisiertem PBS-BSA-Tween verdünnt wurden, zu.
- Die Inkubation beträgt wenigstens 1 h bei 37ºC oder bei Raumtemperatur. Während der Inkubation bewegt man die Platte alle 15 min durch manuelles Schwenken, um die Erythrocyten in der flüssigen Phase wieder zu homogenisieren. Man führt dann funf Waschungen mit PBS-Tween durch, wenn man sich im Labor befindet, oder mit physiologischer Kochsalzlösung (NaCl 0,15 M) oder fließendem Leitungswasser, wenn man sich im Terrain befindet.
- * Zugabe des zweiten Antikörpers:
- 100 µl AP2, welcher in INC-Medium zu 5 µg/ml verdünnt wurde, wird in jede Vertiefung gegeben. Die Inkubation beträgt 45 min bei 37 ºC oder bei Raumtemperatur. Die Platte wird dann gemäß der vorangegangenen Hinweise gewaschen.
- * Zugabe des dritten Antikörpers:
- 100 µl AP3-Peroxidase werden in jede Vertiefung gegeben; AP3 wurde in INC-Medium 1/5000 gemäß den Hinweisen des Beispiels 3 verdünnt.
- Im Kit sind insbesondere AP2 und AP3 vollständig vorbereitet. Nach einer Inkubation von 45 min bei 37ºC oder bei Raumtemperatur wird wie oben die Platte gewaschen, und man geht zur enzymatischen Entwicklung über.
- Die ABTS-Lösung (gemäß den Hinweisen, die oben unter C gegeben wurden, hergestellt) und 2 % Wasserstoffperoxid werden erst unmittelbar gemischt, d.h. unmittelbar vor der Verwendung. 100 µl des Substrats werden in jede Vertiefung gegeben.
- Die enzymatische Reaktion läuft sofort ab und findet bei Raumtemperatur statt. Nach 2 min wird das Erscheinen einer grünen Farbe in den Vertiefungen sichtbar, die einem präovulatorischen LH-Gipfel entspricht. Nach 5 min sind Blutentnahmen von "Trägern" eines präovulatorischen LH- Gipfels im Vergleich zu anderen, bei denen das Substrat farblos bleibt, unterscheidbar.
- Dieser Test vom "Alles-oder-Nichts"-Typ ist aufgrund der Kombination AP1-AP2 im INC-Medium, welches jedes nichtspezifische Signal neutralisiert, möglich, d.h. daß die Proben mit einem schwachen Gehalt an LH, die gemäß diesem Protokoll hergestellt wurden, keinerlei Färbung des Substrats bewirken, im Gegensatz zu denen, welche einen starken Gehalt an LH haben, der zum unmittelbaren Erscheinen einer grünen Farbe führt.
- Das INC-Medium vermeidet daher die Notwendigkeit, ein mehr oder weniger helles Grün (z.B. der Fall eines erhöhten nichtspezifischen Signals) von einem Dunkelgrün (erhöhter LH-Spiegel) mit allen dadurch vorhandenen Risiken der Variabilität, unterscheiden zu müssen. Tatsächlich stellt dieser Alles-oder-Nichts-Charakter des vorgestellten Tests gegenüber den für das menschliche LH oder für andere tierische Hormone verkauften immenzymatischen Kits einen großen Vorteil dar.
- Die Bestimmung, die ausgehend von Blut durchgeführt wird, kann qualitativ, aber auch quantitativ sein. Es genügt, das optimierte experimentelle Protokoll der Bestimmung anzuwenden, welches oben im Beispiel 3 ausgeführt wurde, und die Vorsichtsmaßnahme, die Platte während der Inkubation des Bluts zu "bewegen", zu ergreifen.
- Die Berechnung des Korrelationskoeffizienten zwischen der Messung der LH-Konzentration im Blut und im Plasma, welche von der gleichen Blutentnahme stammen, wurde durch einen Vergleich der Ergebnisse, welche, ausgehend von zwei "biologischen Medien" (siehe Fig. 7) erhalten wurden, durchgeführt.
- Der Korrelationskoeffizient = 0,9788 (n = 40), die Gleichung der Regressionsgerade: y = 1,14 x + 0,889, wobei Y die LH-Konzentration (ng/ml), die im Blut gemessen wurde, ist und X die LH-Konzentration (ng/ml) ist, welche gemaß des Protokolls, welches im Beispiel 3 ausgeführt wurde, im Plasma gemessen wurde.
- Der für den Korrelationskoeffizienten erhaltene Wert zeigt, daß eine sehr genaue quantitative Bestimmung ausgehend von Blut mit dem oben angegebenen Protokoll auf jeden Fall möglich ist.
- Die gleichzeitige Inkubation von AP2- und AP3-Peroxidase (1 h) verringert die Gesamtdauer der Bestimmung.
- Die durchgeführten Versuche ergaben eine Dosiswirkungskurve mit geringerer Sensitivität als die, welche gemäß dem oben angegebenen Protokoll erhalten wurde, die jedoch für die Detektion von hohen Konzentrationen an LH (ab 15 ng/ml) ausreichend war. Wenn es für die Detektion von präovulatorischen Gipfeln notwendig ist, muß im Gegenzug die Substratinkubation 30 bis 45 min länger sein.
- Das hier dargestellte Beispiel wurde mit einer Herde von 20 für eine künstliche Insemination synchronisierten Ziegen durchgeführt.
- Das experimentelle Protokoll ist das gleiche, welches in Beispiel 3 dargestellt wurde, mit dem Unterschied, daß 100 µl Milch in jede Vertiefung gegeben wurden. In diesem Fall muß keinerlei Verdünnung vorgenommen werden; im Gegensatz zu Plasma oder Blut kann die Milch unbehandelt und nichtverdünnt verwendet werden.
- Nachdem die ersten Milchstrählen verworfen wurden, können 100 µl der Probe mit einer geeichten Kapillare auf die gleiche Art und Weise wie im Falle des Bluts gesammelt werden. Auf die gleiche Weise wird die Platte mit PBS-Tween oder mit Leitungswasser, je nach dem Ort, an dem die Durchführung des Tests erfolgt, gewaschen.
- Fig. 8 zeigt das Sekretionsprofil des LH-Gipfels bei einer Ziege im Blut (Kurve -*-) und in der Milch (.. ..). Man bemerkt, daß die in der Milch gefundenen LH-Konzentrationen im Vergleich zu den plasmatischen Konzentrationen niedriger sind. Aus diesem Grund ist es notwendig, ein Spektrophotometer für Mikrotiterplatten zu verwenden. Man bemerkt, daß das Erscheinen des LH-Gipfels in der Milch im Vergleich zum Blut um 4 h verschoben ist, wenn man als Vergleichspunkt den Beginn des Gipfels verwendet. Tabelle I unten zeigt die im Blut und in der Milch im Verlauf von 7 Blutentnahman, welche alle 4 h gleichzeitig in beiden Medien erfolgten gemessenen LH-Konzentrationen. Der Vergleich der Ergebnisse zeigt, daß das Erscheinen des LH-Gipfels in der Milch im Vergleich zum Blut um 4 bis 8 h verschoben ist, wenn man die Maximalwerte der Gipfel vergleicht. Im Gegensatz dazu ist der Beginn des Gipfels immer um 4 h in der Milch im Vergleich zum Blut verschoben und das auf konstante Art. Außerhalb des präovulatorischen Gipfels sind in der Milch LH-Konzentrationen nicht bestimmbar. Tabelle I: Detektion des LH-Gipfels bei der Ziege in Blut und in Milch
- ND: nicht detektierbar
- Die Konzentrationen sind in ng/ml angegeben
- Tabelle I zeigt deutlich die Bedeutung der erfindungsgemäßen Ausführungsform des Verfahrens beim Durchführen der Reproduktion bei Ziegenherden, aber ebenso und auf eine allgemeinere Weise bei allen Arten, bei denen es verwendbar ist (Rinder, Schafe, etc.) Es erlaubt es, die weiblichen Tiere, die keinen präovulatorischen Gipfel haben (die also keinen Eisprung hatten) zu entfernen und zu einem idealen Zeitpunkt die weiblichen Tiere, welche einen vorher stattgefundenen präovulatorischen Gipfel zeigten, zu befruchten. Dies ermöglicht das Aufstellen eines Inseminationsschemas, wie z.B. dem Schema III unten, welches sehr nützlich ist, insbesondere, um auf das höchste die Kampagnen der künstlichen Insemination, die bei den verschiedenen betroffenen Tierarten durchgeführt werden, rentabel zu machen. Schema III
- Das hier dargestellte Beispiel wurde mit einer Herde von 12 Lacaune-Milchschafen durchgeführt, die unter den "guten" Milchschafen ausgewählt wurden.
- Die weiblichen Tiere erhielten während 14 Tage eine Synchronisationsbehandlung (Fluorogestonacetat), nach der sie eine Injektion von 500 I.E. an eCG (ein Hormon, welches den Eierstock stimuliert) erhielten.
- Die Entnahmen von Blut und Milch wurden alle 4 h vorgenommen, mit Beginn des Brunftverhaltens. Daher wurde jedem weiblichen Tier während 32 h neunmal Blut entnommen.
- Die Messung der LH-Konzentration erfolgte in beiden Medien, Blut und Milch, gemaß dem experimentellen Protokoll, welches in Beispiel 3 oben dargestellt wurde.
- Die folgende Tabelle II drückt die Ergebnisse in ng/ml aus und zeigt eine perfekte Verzögerung von 4 h zwischen dem LH-Gipfel im Blut und dem, welcher in der Milch detektiert wurde, in der außerhalb des präovulatorischen Gipfels Konzentrationen an LH nicht detektierbar sind. Detektion des LH-Gipfels beim Schaf in Blut und in Milch (Tabelle II)
- LH: Werte in ng/ml
- Fett gedruckte Werte: Maximalwerte des LH-Gipfels in Blut und in Milch
- Der Nachweis des LH-Gipfels in der Milch zeigt mehrere Vorteile:
- . seine Dauer ist länger als im Blut (20 bis 24 h gegenüber 8 bis 12 h im Blut), so daß weniger Blutentnahmen vorgenommen werden müssen und die Zeiträume zwischen jeder Blutentnahme größer sein können (z.B. alle 8 h);
- . eine Milchentnahme ist mit weniger "Streß" verbunden als eine Blutentnahme und kann zum Zeitpunkt des Melkens der Tiere vorgenommen werden;
- . außerdem kann beim Schaf das Ablesen des Tests bei der Milch mit bloßem Auge durchgeführt werden.
- Fig. 16 zeigt das Sekretionsprofil des LH-Gipfels in ng/ml als Funktion der Zeit bei einem Schaf im Blut (Kurve -*-) und in der Milch (- -).
- Diese Beispiele werden durch Untersuchungsgruppen (Planches) dargestellt und durch eine Untersuchung der Korrelation zwischen den Konzentrationen, welche für die ELISA-Bestimmung erhalten wurden und denen, welche durch eine radioimmunologische Bestimmung, die im Plasma durchgeführt wurden, erhalten wurden, gestützt.
- a) Detektion des präovulatorischen LH-Gipfels bei superovulierenden Schafen (Fig. 9A und B):
- Die Fig. 9 sind Fotos von Platten, welche 12 Kolonnen, die mit 1 bis 12 bezeichnet sind, und 8 Reihen, die mit A bis H benannt sind, enthalten.
- Die Kolonnen 1 und 2 entsprechen einer Konzentrationseichreihe und die Kolonnen 3 bis 11 entsprechen Entnahmen, welche bei 8 Schafen durchgeführt wurden.
- Fig. 9A zeigt die Reihenfolge der Probenzugabe. Die Entnahmen von einem Weibchen werden in eine Kolonne gegeben (Kolonnen 3 bis 11); jede Fntnahme wird doppelt zugegeben. Die LH-Gipfel "erscheinen" in dunkelgrün, was in dieser Figur und in den folgenden Figuren als dunkelgrau erscheint, wie man im Detail in Fig. 9B sehen kann, bei der die Konzentrationsreihe in zwei Kolonnen (Kolonnen 1 und 2) links auf die Platte gegeben wurden.
- Die Entnahmen wurden alle 4 h mit Beginn der Brunft vorgenommen. Für das Schaf 1 (Kolonne 3) beobachtet man einen Gipfel über zwei ersten Entnahmen (Vertiefungen A&sub3;-B&sub3; und C&sub3;-D&sub3;).
- Diese Bestimmung wurde ausgehend von Plasma durchgeführt. Die Entwicklungszeit betrug 15 min bei Raumtemperatur.
- Fig. 10 stellt ein Sekretionsprofil des LH, welches bei einem Schaf (Beispiel 3) durch ELISA-Bestimmung (AP3-Peroxidase/ABTS) und durch RIA (Radioimmunoassay) ausgehend von Plasma enthalten wurde.
- b) Bestimmung des präovulatorischen Gipfels bei superovulierenden Ziegen (Fig. 11):
- Diese Fig. stellt ein Foto einer Platte dar, die vom gleichen Typ ist wie die vorangegangene (Kolonnen 1 bis 12, Reihen A bis H).
- Die Entnahmen wurde alle 4 h nach Beginn der Brunft vorgenommen. Die Bestimmungen wurden ausgehend von Blut durchgeführt. Die Entwicklung betrug 10 min bei Raumtemperatur.
- Die Entnahmen je Tier wurden in Kolonnen gegeben: die Kolonne 2 zeigt z.B. einen Gipfel in der Vertiefungen D&sub2;-E&sub2; und dann das Ende des Gipfel in F&sub2;. Der Höhepunkt des Gipfels findet sich in D&sub2;. Außerhalb der Gipfel bleibt das Substrat farblos. Jn der Kolonne 6 beobachtet man ebenso das Maximum des Gipfels in D&sub6;-E&sub6; und dann das Ende des Gipfels in F&sub6;.
- c) Detektion des präovulatorischen Gipfels bei Kühen (Fig. 12):
- Nach Injektion von GnRH werden den Tieren alle 30 min Proben entnommen. Die Entnahmen wurden doppelt bestimmt und in Kolonnen gegeben (Kuh 1: Kolonnen 2 und 3; Kuh 2: Kolonnen 4 und 5; Kuh 3: Kolonnen 6 und 7; Kuh 4: Kolonnen 8 und 9). Die Standardreihe wurde in die ersten beiden Linien A und B (Fig. 12A) gegeben.
- Die Bestimmung erfolgt ausgehend von Blut. Die Entwicklungszeit beträgt 5 min in Fig. 12A und 15 min in Fig. 12B bei Raumtemperatur. Man beobachtet die Abwesenheit des LH-Gipfels bei der Kuh 2, einen Beginn des LH-Gipfels bei der 4. und 5. Entnahme (F&sub2;-F&sub3;/G&sub2;-G&sub3;) für die Kuh Nr. 1. Bei zwei folgenden Tieren erscheint der Gipfel schneller: zur zweiten Entnahme (D&sub6;-D&sub7;) für Kuh Nr. 3 und zur ersten Entnahme (C&sub8;-C&sub9;) bei Kuh Nr. 4. Für diese letztere beobachtet man sehr schön den Wiederabfall des Gipfels.
- Fig. 13 zeigt ein vollständiges LH-Sekretionsprofil bei einer mit GnRH behandelten Kuh. Man kann ein Übereinanderliegen der durch ELISA und durch RIA gemessenen Konzentrationen festhalten.
- d) Untersuchung der Mikropulsierung bei Widdern (Fig. 14). Die Bestimmungen wurden in Plasma gemäß dem Protokoll des Beispiels 3 durchgeführt. Die Entnahmen wurden alle 20 min vorgenommen. Sie wurden in Reihen gegeben (Widder 1: Reihen C und D; Reihen E und F; Widder 3: Reihen G und H) und doppelt bestimmt (die Duplikate wurden vertikal angeordnet).
- Die Entwicklungszeit beträgt 30 min. Man beobachtet für Widder Nr. 1 einen Puls bei C&sub9;-D&sub9;, für Widder Nr. 2 bei E&sub4;-F&sub4; und E&sub1;&sub0;-F&sub1;&sub0; und sehr schwach für Widder Nr. 3 in G&sub4;-H&sub4;, ebenso wie für Tier Nr. 2 in E&sub9;-F&sub9;.
- Fig. 15 zeigt ein LH-Sekretionsprofil, welches für den Widder mit ELISA- und RIA-Bestimmungen erhalten wurde. Die im ELISA erhaltenen Konzentrationen haben niedrigere Absolutwerte als die, welche im RIA erhalten wurden; im Gegensatz dazu ist das Profil identisch. Dieser Unterschied ist auf die bessere Sensitivität der ELISA-Bestimmung zurückzuführen, die es ermöglicht, schwächere Werte als der RIA zu detektieren.
- e) Berechnung des Korrelationskoeffizienten, der für Bestimmungen erhalten wurde, die mit ELISA bzw. mit RIA erhalten wurden:
- Die verwendete RIA-Bestimmung ist die, welche von J. Pelletier et al., 1982, publiziert wurde.
- . Korrelationskoeffizient: r: 0,9705
- . Gleichung der Regressionsgeraden:
- y = 1,09x - 0,971.
- . Korrelationskoeffizient: r = 0,9759
- . Gleichung der Regressionsgeraden:
- y = 1,031x - 0,978.
- . Korrelationskoeffizient: r = 0,9808
- . Gleichung der Regressionsgeraden:
- y = 1,0745x - 2,45
- wobei Y die LH-Konzentration (ng/ml) ist, die mit ELISA bestimmt wurde,
- X die Konzentration von LH (ng/ml) ist, welche mit RIA gemessen wurde.
- Die Bestimmungen wurden ausgehend von Blutentnahmen durchgeführt, die alle 2 h während der Brunstperiode von Rusa de Nouvelle-Calédonie- Hirschkühen vorgenommen wurden. Die Entnahmen wurden bei sieben Hirschkühen vorgenommen, und die Bestimmungen wurden wie in Beispiel 3 beschrieben, vorgenommen. Die Tests wurden wie bei den anderen Arten mit bloßem Auge abgelesen. Fig. 17 zeigt das LH-Sekretionsprofil in ng/ml als Funktion der Zeit bei einer Hirschkuh (Hirschkuh Nr. 80). Die Ergebnisse, welche mit der Gesamtheit der weiblichen Tiere erhalten wurden, zeigen erneut, daß der Moment des LH-Gipfels während der Brunstperiode sehr variabel ist: im allgemeinen liegt er am Beginn der Brunst.
- Dieses zeigt in Anbetracht der Variabilität in Bezug auf das Erscheinen des LH-Gipfels deutlich die Wichtigkeit des erfindungsgemäßen Verfährens, um den genauen Zeitpunkt der Insemination zu bestimmen.
- Man kann insbesondere den Nutzen dieses Verfahrens bei der kunstlichen Insemination von weiblichen Embryonenspendern bei vom Aussterben bedrohten Rassen aus der Familie der Hirsche anmerken.
- Die Bestimmung wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben, ausgehend von täglichen Blutentnahmen, die bei zwei Hündinnen während der Läufigkeitsperiode durchgeführt wurden, vorgenommen. Bei der Hündin erstreckt sich der präovulatorische Gipfel des LHs über einen größeren Zeitraum als bei den anderen beschriebenen Arten: die Dauer beträgt im Mittel 24 h. Daher kann er dadurch detektiert werden, daß man nur eine tägliche Blutentnahme vornimmt, was für die Klientel eines Tierarztes einen Vorteil darstellt. Die Ergebnisse, welche mit der Hündin "Dixie" erhalten wurden und die in Fig. 18 dargestellt sind, zeigen dies deutlich. Die Tests werden, wie bei den anderen Arten, mit bloßem Auge abgelesen.
- Fig. 18 stellt das Sekretionsprofil des LH (- -) und des Progesterons (-*-) in ng/ml, die von der Hündin Dixie erhalten wurden, dar.
- Man beobachtet, daß über 48 h nach dem präovulatorischen Gipfel (3.9.90) hinaus der Gehalt an Progesteron beträchtlich zugenommen hat (> 50 ng/ml). Dies bezeugt das Vorhandensein eines Geibkörpers (der für die starke Progesteronsekretion verantwortlich ist), der das Ergebnis eines Eisprungs ist.
- In Anbetracht der Länge des Läufigkeitszeitraums bei der Hündin wird es der Kit erlauben, den Zeitpunkt der Ovulation bei der Hündin mit Genauigkeit zu erkennen und wird es erlauben, die Insemination zum optimalen Zeitpunkt durchzuführen (die Befruchtung findet bei der Hündin 48 h nach dem Eisprung statt). Auch hier kann mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ein genaues Inseminationsschema aufgestellt werden.
- Zwischen den LH-Konzentrationswerten, die mit Hilfe einer radioimmunologischen Bestimmung erhalten wurden und denen, welche mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, das gemäß dem Protokoll des Beispiels 3 durchgeführt wurde, wurde eine Korrelation erhalten. Die Bestimmungen wurden mit dem Plasma der Säue durchgeführt.
- . Korrelationskoeffizient n = 0,943
- . Gleichung der Regressionsgeraden:
- y = 0,1719x + 0,069 (n = 20), wobei:
- y die durch ELISA gemessene LH-Konzentration (ng/ml) ist und x die durch RIA gemessene LH-Konzentration (ng/ml) ist.
- Fig. 19 zeigt ein LH-Sekretionsprofil in ng/ml, welches mit der erfindungsgemaßen Bestimmung (-*-) und mit einer RIA-Bestimmung (- -) erhalten wurde.
- a- Für die Bestimmung verwendete Antikörper:
- - Der erste Antikörper (AC&sub1;) ist ein für die β-Untereinheit des FSH verschiedener Arten (Rind, Schaf, Pferd, Schwein, Mensch, Ratte, Kaninchen, Hund, Strauß) spezifischer monoclonaler Antikörper. Er wurde dankenswerterweise von Herrn Prof. Jacques Lussier für diese experimentellen Bestimmungen zur Verfügung gestellt. Dieser monoclonale Antikörper wurde von Dr. Lussier und seiner Arbeitsgruppe (Universität von Montreal - Tiennedizinische Fakultät - CRRA - CP 5000 - St. Hyacinthe J297C6 - Quebec) hergestellt. Es handelt sich um einen monoclonalen Antikörper vom IgG1-Typ.
- - Der zweite Antikörper (AC&sub2;) ist ein für das Schaf-FSH spezifischer polyclonaler Antikörper, welcher vom Kaninchen hergestellt wurde. Er wurde von der Station de Physiologie de la reproduction - INRA - 37380 Nouzilly, hergestellt und ist von dort verfügbar.
- - Der dritte Antikörper (AC&sub3;) ist ein von den Jackson Laboratories (USA) kommerzialisierter polydonaler Antikörper. Es handelt sich um einen Anti-IgG-Antikörper des Kaninchens, der an die Peroxidase gekoppelt ist und von der Ziege hergestellt wird - Referenz 111-035-003.
- b- Experimentelles Protokoll
- Das verwendete Protokoll ist das, welches in Beispiel 3 gezeigt wurde:
- (1) Der erste Antikörper wird in 0,1 M Carbonatpuffer, pH 9,6, zu einer Konzentration von 7,5 µg/ml eingestellt. 100 µl werden in jede Vertiefung gegeben. Die Inkubationszeiten für die Sensibilisierung der Platten sind die gleichen: 1 h bei 37ºC und 18 h bei 4ºC.
- (2) Das Waschen und die Sättigung der Vertiefung ("Surcoating") werden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 3 durchgeführt.
- (3) Die Inkubation der Proben und der Standardreihe: gleiches Verfahren wie in Beispiel 3; die Eichreihe des Schaf-FSH (NIH-Standard: oFSH-13-AFP-2846-C) wird in PBS-Tween-BSA, welches Serum eines durch Hypophysektemle behandelten Tieres, das 1/10 verdünnt wurde, hergestellt. Sie enthält folgende Konzentrationen: 125 pg/ml, 250 pg/ml, 500 pg/ml, 1 ng/ml, 2 ng/ml, 4 ng/ml, 8 ng/ml und 40 ng/ml. 100 µl je Vertiefung werden jeweils doppelt zugegeben. Das zu bestimmende Plasma wird in PBS- Tween-BSA 10fach verdünnt. Die Dauer der Inkubation beträgt 1 h hei 37ºC.
- (4) Waschungen, die denen des Beispiels 3 identisch sind
- (5) Vorbereitung und Inkubation des zweiten Anti-Schaf-FSH-Antikörpers (AC&sub2;). Er wird in INC-Medium zu einer Konzentration von 5 µg/ml verdünnt. Seine Herstellung wird auf die gleiche Weise durchgeführt wie in Beispiel 3. Die Inkubation beträgt 1 h bei 37ºC.
- (6) Waschschritte, die denen des Beispiels 3 identisch sind.
- (7) Vorbereitung und Inkubation des dritten Antikörpers (AC&sub3;), ein Anti-IgG des Kaninchens, der an die Peroxidase gekoppelt ist. Er wird gemäß dem Protokoll des Beispiels 3 durch eine 1/5000-Verdünnung (gemäß den Angaben des Herstellers) verdünnt. Inkubation 1 h bei 37ºC.
- (8) Waschschritte, die denen des Beispiels 3 identisch sind.
- (9) Zugabe des Substrats für die Peroxidase und Ablesen der optischen Dichte.
- c- Ergebnisse:
- * Fig. 20 zeigt die Ergebnisse einer derartigen Best irung, die gemäß dem INC-Protokoll (Kurve B) durchgeführt wurde. Die Nachweisgrenze liegt bei 0,25 ng/ml und die Sensitivität der Bestimmung ist im Vergleich zur Kurve A, die ohne Anwendung des INC-Verfährens erhalten wurde, beträchtlich erhöht. Tatsächlich war im Falle der Kurve A der Puffer, welcher für das Surcoating und die Inkubation von AC&sub2; und AC&sub3; verwendet wurde, einfaches PBS-BSA-Tween. Lediglich die Standardreihe des oFSH wurde unter den gleichen Bedingungen wie für Kurve B durchgeführt, d.h. in PBS-BSA-Tween, dem 1/10 verdünntes Serum aus einem durch Hypophysektomie behandelten Tier zugegeben wurde. Der Vergleich dieser beiden Kurven zeigt die Wichtigkeit des INC-Verfahrens, um eine sehr gute Sensitivität in der Bestimmung des oFSH zu erhalten. Diese Ergebnisse zeigen ebenso, daß die Effizienz des INC-Verfahrens nicht auf die Bestimmung des tierischen LH durch die oben definierten AP1 und AP2 beschränkt ist, sondern daß sie ebenso für die Bestimmung eines anderen Hypophysenhormons, dem FSH, bei welchem ein anderer Antikörper mitwirkt, anwendbar ist. Die Verwendung des INC-Mediums erlaubte, wie bei der Bestimmung der tierischen LHs und des hins jegliche nichtspezifische Serüminterferenzen zu neutralisieren und dadurch in beträchtlicher Weise die Nachweisgrenze und die Sensitivität der Bestimmung des oFSH zu verbessern.
- * 53 Plasmaproben von Schafen wurden gemaß dem INC-Verfähren in Bezug auf FSH bestimmt. Die Ergebnisse, die mit dieser Technik erhalten wurden, wurden in Bezug zu denen, welche mit Hilfe eines radioimmunologischen Bestimmungsverfährens erhalten wurden, gesetzt:
- . der Korrelationskoeffizient ist 0,9759
- . die Gleichung der Regressionsgeraden ist
- Y = 0,585X -0,845
- wobei Y die durch den ELISA gemessene oFSH-Konzentration (ng/ml) ist und X die durch RIA gemessene Konzentration an oFSH (ng/ml) ist.
- Es muß angemerkt werden, daß erhöhte plasmatische Konzentrationen (15 bis 20 ng/ml) an oFSH ohne weiteres mit dem Auge bestimmbar sind, ohne daß Auswertungsgeräte notwendig sind und daß sich niedrige (0,5 bis 2 ng/ml) plasmatische Spiegel deutlich unterscheiden. Dies kann es ermöglichen, den Gipfel des sekretierten FSH vor der Ovulation unter einfachen Bedingungen außerhalb des Laboratoriums zu detektieren und zu messen.
- Bedingt durch die Nachweisgrenze, die die Bestimmung ermöglicht, eröffnet das INC-Verfahren die Möglichkeit, sehr niedrige zirkulierende Spiegel (zwischen 0,25 und 5 ng/ml) zu detektieren, was einen offensichtlichen physiologischen Nutzen darstellt.
- a- Für die Bestimmung verwendete Antikörper:
- * Der erste Antikörper (AC&sub1;) ist ein monoclonaler Antikörper, der für das menschliche LH (hLH) spezifisch ist und der von der Société Pierce - Referenz: 37110, vertrieben wird. Es handelt sich um einen monoclonalen Antikörper vom IgG&sub1;-Typ, er stammt vom Clon ZMLHZ.
- * Der zweite Antikörper (AC&sub2;) ist ein polyclonaler Anti-hLH-Antikörper, welcher vom Kaninchen hergestellt wurde und von der Société UCB - Referenz: 1504/001, vertrieben wird.
- * Der dritte Antikörper (AC&sub3;) ist ein polyclonaler Antikörper, der von den Jackson Laboratories - Referenz 111-035-003, vertrieben wird. Es handelt sich um ein Anti-IgG des Kaninchens, der an die Peroxidase gekoppelt ist und der von der Ziege hergestellt wird.
- b- Experimentelles Protokoll:
- Das angewendete Protokoll ist das des Beispiels 3:
- (1) AC&sub1; wird in 0,1 M Carbonatpuffer, pH 9,6, zu einer Konzentration von 10 µg/ml (oder 7,5 µg/ml) zubereitet. Je Vertiefung werden 100 µl zugegeben. Die Inkubation beträgt 1 h bei 37ºC und 18 h bei 4ºC.
- (2) Waschen und Surcoating (Ref. Beispiel 3)
- (3) Inkubation der Proben und der Standardreihe: Ref. Beispiel 3.
- Die zu bestimmenden Proben werden 10fach (oder 5fach) in PBS-BSA-Tween verdünnt. Die hLH-Standardreihe wird in PBS-BSA-Tween, dem 10fach verdünntes Serum aus einem mit Hypophysektomie behandelten Tier zugegeben wurden, zubereitet. Sie enthält die folgenden Konzentrationen: 62,5 pg/ml, 125 pg/ml, 250 pg/ml, 500 pg/ml, 1 ng/ml, 2 ng/ml, 4 ng/ml, 8 ng/ml, 40 ng/ml.
- (4) Waschschritte - Ref. Beispiel 3
- (5) AC&sub2; wird zu einer Konzentration von 2,5 µg/ml verdünnt und in INC-Medium auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 3 präinkubiert.
- (6) Waschschritte
- (7) AC&sub3; wird 1/5000 in INC-Medium wie in Beispiel 3 verdünnt
- (8) Waschschritte
- (9) Zugabe des Substrats (ABTS) und Ablesen der Ergebnisse nach 1 h.
- c- Ergebnisse
- * Fig. 21 zeigt die Ergebnisse, welche mit einer hLH-Standardreihe unter Verwendung des INC-Verfährens gemaß dem oben angegebenen Protokoll (Kurve B) erhalten wurden und die, welche mit der gleichen Standardreihe ohne Anwendung des INC-Verfahrens (Kurve A) erhalten wurden. Im letzteren Fall war der Puffer, der für das Surcoating und die Inkubation von AC&sub2; und AC&sub3; verwendet wurde, lediglich PBS-BSA-Tween. Der Vergleich der beiden Kurven zeigt erneut den Nutzen und die Wirkung des INC-Verfährens, welches zu einer sehr deutlichen Verbesserung in Bezug auf die Sensitivität der Bestimmung und in Bezug auf die Nachweisgrenze führt, dadurch, daß alle nichtspezifischen Signale, die auf nichtspezifische Seruminterferenzen zurückzuführen sind, neutralisiert werden.
- * 20 Plasmaproben von Frauen wurden in Bezug auf hLH gemäß dem oben dargestellten Verfähren untersucht. Die mit dieser ELISA-Technik erhaltenen Ergebnisse wurden in Bezug mit denen gebracht, welche mit dem hLH- Bestimmungs-Kit erhalten wurden, der von Abbott (Immun-Enzym-Mikro-partikuläres System - IMX Abbott) erhalten wurden:
- . der Korrelationskoeffizient ist 0,8808
- . die Gleichung der Regressionsgerade ist
- Y = 0,0483X + 0,0986
- wobei Y die im ELISA gemessene hLH-Konzentration (ng/ml) ist und X die mit dem IMX-System von Abbott gemessene hLH-Konzentration (I.E./l) ist.
- * In Anbetracht der Abwesenheit jeglichen nichtspezifischen Signals und der großen Sensitivität der Bestimmung wird es möglich sein, hohe Werte (präovulatorischer LH-Gipfel), die eine grüne Farbe ergeben, von niedrigen Werten zu unterscheiden, die farblos bleiben. Diese Auswertung mit dem bloßen Auge wird es ermöglichen, dieses Verfähren für die Entwicklung eines Kits zu verwenden, der zuhause die Bestimmung des präovulatorischen LH-Gipfels bei der Frau ermöglicht. Ebenso wird er auch für eine verläßliche quantitative Bestimmung in Laboratorien verwendet werden können. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Effizienz des INC-Verfahrens nicht auf die Verwendung der polyclonalen Antikörper AP1 und AP2, die oben bei der Bestimmung tierischer LHs definiert wurden, beschränkt ist, sondern, daß sie ebenso zu einer Verbesserung der Bestimmung eines anderen LH (das menschliche LH) beiträgt, bei dem andere Antikörper beteiligt sind (AG monodonal Anti-hLH, Pierce; AC2 polydonal Anti-hLH in Kaninchen hergestellt-UCB).
Claims (19)
1. Verfahren zur Detektion und/oder quantitativen
immunologischen Bestimmung von Hormonen der Hypophyse von
Menschen oder Tieren in Kulturmedien oder in biologischen
Flüssigkeiten, bei dem mindestens zwei Antikörper
eingesetzt werden, die für das quantitativ zu bestimmende Hormon
spezifisch sind, dadurch gekennzeichnet
daß zur Erhöhung der Sensibilität und der Spezifität der
Detektion und/oder der quantitativen Bestimmung die
Antikörper vor ihrem Einsatz für die Detektion oder die
quantitative Bestimmung in einem Medium vorinkubiert
werden, welches Plasma oder Serum, das frei ist von dem zu
detektierenden und/oder quantitativ zu bestimmenden Hormon
und durch Hypophysektomie erhalten worden ist (INC-Medium),
enthält.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß das INC-Medium mit einem
pH-neutralen Puffer und einem grenzflächenaktiven Mittel assoziiert
wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch
gekennzeichnet, daß das INC-Medium ein von
Hypophysehormonen freies und durch Hypophysektomie eines
Tieres erhaltenes Serum oder Plasma und einen pH-neutralen
Puffer, assoziiert mit einem grenzflächenaktiven Mittel,
enthält.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch
gekennzeichnet, daß das INC-Medium ein Serum oder ein
Plasma eines hypophysektomisierten Widders und einen pH-
neutralen Puffer, assoziiert mit einem grenzflächenaktiven
Mittel, enthält.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch
gekennzeichnet, daß das Plasma oder Serum, das frei ist
von dem quantitativ zu bestimmenden Hormon, und der Puffer
in einem Verhältnis von 1:1 vorliegen.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch
gekennzeichnet, daß der erste Antikörper,
fixiert auf einem festen Träger, gesättigt in INC-Medium,
und der zweite Antikörper, gegebenenfalls gekuppelt an ein
geeignetes Enzym, vorinkubiert in einem INC-Medium, mit der
zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit in Kontakt
gebracht werden und darauf die an die feste Phase gebundene
und/oder freie enzymatische Aktivität mit jedem geeigneten
Mittel nachgewiesen wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch
gekennzeichnet, daß, wenn der zweite in dem INC-Medium
vorinkubierte Antikörper nicht an ein Enzym gekuppelt ist,
der Nachweis der Reaktion durch Einführung eines dritten
Antikörpers erfolgt, der an ein geeignetes Enzym gekuppelt
und in dem INC-Medium vorinkubiert ist und der sich
spezifisch an den zweiten Antikörper bindet.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, dadurch
gekennzeichnet, daß der erste und der
zweite Antikörper vorteilhafterweise aus der Gruppe
ausgewählt werden, die die monoclonalen Anti-FSH-, Anti-LH-,
Anti-TSH-, Anti-GH-, Anti-ACTH-, Anti-Prolactin-,
Anti-Ocytocin-, Anti-ADH-, Anti-MSH-Antikörper und die polyclonalen
Anti-FSH-, Anti-LH-, Anti-TSH-, Anti-GH-, Anti-ACTH-, Anti-
Prolactin-, Anti-Ocytocin-, Anti-ADH- und
Anti-MSH-Antikörper umfaßt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch
gekennzeichnet, daß die polyclonalen Anti-LH-Antikörper
vor allem erhalten werden durch Immunisierung eines
geeigneten Tieres mit Hilfe eines Antigens, das ein
äquimolares Gemisch verschiedener gereinigter Fraktionen von Schaf-
LH, registriert unter der Nr. 1051, 1055, 1072, 1063, 1085
und 1086, umfaßt und anschließend durch Reinigung des durch
Ionenaustauschchromatographie oder durch
Affinitätschromatographie erhaltenen Immunserums, wobei die polyclonalen
Antikörper einen Prozentsatz an Kreuzreaktionen mit den
anderen Glykoprotein-Hormonen, wie FSH, von weniger als 4%,
d.h. eine Spezifität gegenüber LH aufweisen, daß sie eine
Polyspezifität der Erkennung von LH von zahlreichen
Tierarten, insbesondere mindestens der Arten Schafe, Rinder,
Ziegen, Schweine, Hunde, Kamele, Mäuse sowie Hirsche
aufweisen und eine Affinität gegenüber Schaf-LH in der
Größenordnung von 10&sup9;M&supmin;¹ jeweils in zwei unterschiedlichen
Tierarten aufweisen.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch
gekennzeichnet, daß der erste und der
zweite Antikörper vorteilhafterweise aus der Gruppe
ausgewählt werden, die polyclonale
Kaninchen-Anti-LH-Schaf-Antikörper und polyclonale Pferd-Anti-LH-Schaf-Antikörper
umfaßt, und daß der dritte Antikörper vorteilhafterweise aus
der Gruppe ausgewählt wird, die die Pferd-Anti-IgG und die
Kaninchen-Anti-IgG, gekuppelt an ein geeignetes Enzym,
umfaßt.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10,
dadurch gekennzeichnet, daß der erste
Antikörper ein polyclonaler Kaninchen-Anti-LH-Schaf-Antikörper
ist, der zweite Antikörper ein polyclonaler Pferd-Anti-LH-
Schaf-Antikörper ist und der dritte Antikörper ein Pferd-
Anti-IgG, gekuppelt an ein geeignetes Enzym und
insbesondere an eine Peroxidase oder an eine β-Galactosidase, ist.
12. Reagens zur Durchführung des Verfahrens der
Detektion und/oder der quantitativen immunologischen Bestimmung
von Hormonen beim Tier einschließlich des Menschen nach
einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch
gekennzeichnet, daß es einen Anti-Hormon-Antikörper enthält, der
als zweiter und/oder dritter Antikörper in dem genannten
Verfahren verwendet werden kann, und daß der Antikörper in
einem INC-Medium vorinkubiert wird.
13. Reagens für die Durchführung des Verfahrens der
Detektion und/oder der quantitativen immunologischen
Bestimmung von Hormonen beim Tier einschließlich des Menschen
nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch
gekennzeichnet, daß es einen Anti-Hormon-Antikörper
enthält, der als erster Antikörper in dem Verfahren
verwendet werden kann, wobei der erste Antikörper auf einem
festen Träger, gesättigt in INC-Medium, fixiert ist.
14. Besteck für die Detektion und/oder Diagnose von
Hypophysehormonen (FSH, LH, TSH, GH, ACTH, Prolactin,
Ocytocin, ADH, MSH) bei Menschen oder beim Tier oder Kit für die
Durchführung des Tests gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11,
dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich
zu den nützlichen Mengen Puffer für die Ausführung der
Detektion umfaßt:
- einen ersten für das quantitativ zu bestimmende
Hormon spezifischen Antikörper, ausgewählt aus den
Antiquantitativ zu bestimmendes Hormon-Antikörpern, fixiert auf
einem festen Träger, gesättigt in INC-Medium, nach Anspruch
13;
- einen zweiten für das quantitativ zu bestimmende
Hormon spezifischen Antikörper, ausgewählt aus den
Antispezifisch zu bestimmendes Hormon-Antikörpern, gekuppelt an
ein geeignetes Enzym und vorinkubiert in dem INC-Medium
gemäß Anspruch 12;
- ein Substrat für den Nachweis des Enzyms und
- ein INC-Medium.
15. Besteck nach Anspruch 14, dadurch
gekennzeichnet, daß es, wenn für die quantitative
Bestimmung von LH eingesetzt, umfaßt:
- einen ersten polyclonalen Antikörper, fixiert auf
einem festen Träger, gesättigt in INC-Medium, ausgewählt
unter den polyclonalen Kaninchen-Anti-LH-Schaf-Antikörpern
und den polyclonalen Pferd-Anti-LH-Schaf-Antikörpern;
- ein Enzym-Antikörperkonjugat, in dem der
Antikörper ausgewählt ist aus der Gruppe, die die polyclonalen
Kaninchen-Anti-LH-Schaf-Antikörper und die polyclonalen
Pferd-Anti-LH-Schaf-Antikörper umfaßt, wobei die Konjugate
in einem INC-Medium vorinkubiert worden sind;
- ein Substrat für den Nachweis des Enzyms;
- eine Entnahmekapillare; und
- ein INC-Medium.
16. Besteck nach Anspruch 15, dadurch
gekennzeichnet, daß das Enzym aus der Gruppe, umfassend
die Peroxidasen und β-Galactosidase, ausgewählt ist.
17. Besteck nach Anspruch 14, dadurch
gekennzeichnet, daß es umfaßt:
- eine Reihe von geeigneten festen Trägern,
überzogen mit einem ersten Antikörper, ausgewählt unter den Anti-
quantitativ zu bestimmendes Hormon-Antikörpern, wobei die
festen Träger in INC-Medium gesättigt sind;
- einen zweiten Antikörper, ausgewählt aus der
Gruppe, die die Antikörper Anti-FSH, Anti-LH, Anti-TSH,
Anti-GH, Anti-ACTH, Anti-Prolactin, Anti-Ocytocin und Anti-
ADH, die von dem ersten Antikörper verschieden sind,
vorinkubiert in einem INC-Medium, enthält;
- ein Peroxidase-Anti-IgG-Konjugat, vorinkubiert in
einem INC-Medium;
- ein Substrat für den Nachweis der Peroxidase; und
- ein INC-Medium.
18. Besteck nach Anspruch 17, dadurch
gekennzeichnet, daß es umfaßt:
- eine Reihe von festen Trägern, überzogen mit
einem ersten Antikörper, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend
die polyclonalen Kaninchen-Anti-LH-Schaf-Antikörper, wobei
die festen Träger in INC-Medium gesättigt sind;
- einen zweiten Antikörper, ausgewählt aus der
Gruppe, umfassend die polyclonalen
Pferd-Anti-LH-Antikörper;
- ein Peroxidase-Pferd-Anti-IgG-Konjugat,
vorinkubiert in einein INC-Medium;
- ein Substrat für den Nachweis der Peroxidase;
- eine Entnahmekapillare; und
- ein INC-Medium.
19. Besteck nach Anspruch 17, dadurch
gekennzeichnet, daß es umfaßt:
- eine Reihe von festen Trägern, überzogen mit
einem ersten Antikörper, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend
die polyclonalen Antikörper von Kaninchen-Anti-LH-Schaf,
wobei die festen Träger in INC-Medium gesättigt sind;
- ein Konjugat β-Galactosidase-polyclonale Pferd-
Anti-LH-Schaf-Antikörper, vorinkubiert in einem INC-Medium;
- ein Substrat für den Nachweis der
β-Galactosidase;
- eine Entnahmekapillare; und
- ein INC-Medium.
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