JPS582675B2 - シンキコウセイブツシツノセイホウ - Google Patents
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D477/00—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring
- C07D477/10—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 4, and with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2
- C07D477/12—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 4, and with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2 with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, attached in position 6
- C07D477/16—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 4, and with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2 with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, attached in position 6 with hetero atoms or carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 3
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Description
【発明の詳細な説明】
この発明はMM13902と名付けた新規な抗生物質及
びその塩類の製法に関する。
びその塩類の製法に関する。
ス1・レプトマイセス オリバセウス
(Streptomyces olivaceus)の
ある菌種の培養により、新規な抗生物質が得られること
を見出した。
ある菌種の培養により、新規な抗生物質が得られること
を見出した。
我々がMM13902と命名した新規物質は、強力な抗
生物質であることに加えてペニシリン類やセファロスポ
リン類と相乗的に作用をするものである。
生物質であることに加えてペニシリン類やセファロスポ
リン類と相乗的に作用をするものである。
英国特許第1,3 6 3,0 7 5号明細書で、ス
トレプトマイセス オリバセウスのある菌種の培養によ
り有用なβ−ラクタマーゼ阻害剤が得られると開示した
。
トレプトマイセス オリバセウスのある菌種の培養によ
り有用なβ−ラクタマーゼ阻害剤が得られると開示した
。
かくして、この発明に至る迄、上記英国特許で開示され
た物質は実質的に純品であると信じられていたが、これ
は純品ではなく、この物質の少部分の成分が単離できそ
のものは強い抗菌作用を有することを発見した。
た物質は実質的に純品であると信じられていたが、これ
は純品ではなく、この物質の少部分の成分が単離できそ
のものは強い抗菌作用を有することを発見した。
この新規物質をMM1.3902と名付け且つこのもの
は、現在のところ英国特許第1,363,075号明細
書の物質の有するβ−ラクタマーゼ阻害活性のごく一部
に寄与するが、該物質の有する抗菌活性の一部を負って
いるものと信ずるものである。
は、現在のところ英国特許第1,363,075号明細
書の物質の有するβ−ラクタマーゼ阻害活性のごく一部
に寄与するが、該物質の有する抗菌活性の一部を負って
いるものと信ずるものである。
もともとこの発明の明細書では、該英国特許第1,36
3,075号で開示された物質をクレームするものと解
釈されるべきではない。
3,075号で開示された物質をクレームするものと解
釈されるべきではない。
他のβ−ラククマーゼ阻害剤が、ストレプトマイセスの
菌、例えばドイツ公告特許出願第2. 3 4. 0.
0 0 5号で開示された菌で生産されることが公知
であるが、かような公知物質は、MM13902の有す
るごとき種類の強い抗菌活性を示していない。
菌、例えばドイツ公告特許出願第2. 3 4. 0.
0 0 5号で開示された菌で生産されることが公知
であるが、かような公知物質は、MM13902の有す
るごとき種類の強い抗菌活性を示していない。
この発明のMM13902は、固体のカルボン酸であり
、実質的に純粋なナトリウム塩の形で次の特性を有する
。
、実質的に純粋なナトリウム塩の形で次の特性を有する
。
1)水に易溶、メタノールに溶け、クロロホルム、ジエ
チルエーテルと炭化水素類に実質的に不溶である。
チルエーテルと炭化水素類に実質的に不溶である。
11)水溶液で、吸収極太を持った特有の紫外線吸収ス
ペク1・ルを有し、その吸収極大の一つは約3 0 5
’nmである。
ペク1・ルを有し、その吸収極大の一つは約3 0 5
’nmである。
I11)新しく作ったKBrディスク中04%(重量/
重量)含ませた際、吸収極大が殊に約3450.295
0,1750 ,1620 ,15].0 ,1400
と1260cIrL ’ に有する特有の赤外線吸収ス
ペクトルを示す。
重量)含ませた際、吸収極大が殊に約3450.295
0,1750 ,1620 ,15].0 ,1400
と1260cIrL ’ に有する特有の赤外線吸収ス
ペクトルを示す。
1■)D20中で測定した核磁気共鳴スペクトルは殊に
(a)ほぼ1 4 H zの結合定数を持ったほぼ2.
85τと4.00τに中心がある一対の低磁場二重線、
(b)ほぼ855τに中心がある二重線、及びほぼ8,
00τに鋭い一重線を有する。
(a)ほぼ1 4 H zの結合定数を持ったほぼ2.
85τと4.00τに中心がある一対の低磁場二重線、
(b)ほぼ855τに中心がある二重線、及びほぼ8,
00τに鋭い一重線を有する。
V) スタフイロコツ力ス アウレウス、バチルスズ
ブチリス、エシエリシア コリ、クレブシラエロゲネス
、プロテウス ミラビリス、サルモネラ テイフイ及び
シュードモナス エルギノーサの菌を含む各種の菌種に
対し抗菌活性を有する。
ブチリス、エシエリシア コリ、クレブシラエロゲネス
、プロテウス ミラビリス、サルモネラ テイフイ及び
シュードモナス エルギノーサの菌を含む各種の菌種に
対し抗菌活性を有する。
vO アンピシリンと混合して用いると、エシエリシ
ア コリ、クレブシラ エロゲネス、プロテウス ミラ
ビリス、プロテウス モルガニイ及びスタフイ口コツ力
ス オウレウス ラッセルを含む微生物に対する活性を
相乗する。
ア コリ、クレブシラ エロゲネス、プロテウス ミラ
ビリス、プロテウス モルガニイ及びスタフイ口コツ力
ス オウレウス ラッセルを含む微生物に対する活性を
相乗する。
MM13902の純ジナトリウム塩はβ−ラクタマーゼ
阻害剤で、エシエリシア コリBllのβ−ラクタマー
ゼに対し0. 0 0 1 d//fnl と0.0
0 0 1 ltg/mlの間のI50(後述)を示
す。
阻害剤で、エシエリシア コリBllのβ−ラクタマー
ゼに対し0. 0 0 1 d//fnl と0.0
0 0 1 ltg/mlの間のI50(後述)を示
す。
**セルロース上薄層クロマトグラフイーに付すと、M
M13902の純ジナ1ヘリウム塩は、次のようなおお
よそのRf値を有する。
M13902の純ジナ1ヘリウム塩は、次のようなおお
よそのRf値を有する。
a. n−ブタノール/イソプロパノール/水−7:
7:6(容量);Rf=o.72 b. イソプロパノール/水−7 : 3 : Rf
=0.85c. n−ブタノール/エタノール/水
−7:7:6:Rf=0.81 d. n−プロパノール/水−4 : 1 : Rf
=0.75oMM 1 3 9 0 2は硫黄含有抗
菌性剤として特徴付けることができ、その塩はストレプ
1・マイセスオリバセウスATCC31126の培養に
よって生産され、そのジナトリウム塩の水溶液では図1
に示したと同様に約305nmと約22 5 i1 m
に紫外部吸収極大を有する。
7:6(容量);Rf=o.72 b. イソプロパノール/水−7 : 3 : Rf
=0.85c. n−ブタノール/エタノール/水
−7:7:6:Rf=0.81 d. n−プロパノール/水−4 : 1 : Rf
=0.75oMM 1 3 9 0 2は硫黄含有抗
菌性剤として特徴付けることができ、その塩はストレプ
1・マイセスオリバセウスATCC31126の培養に
よって生産され、そのジナトリウム塩の水溶液では図1
に示したと同様に約305nmと約22 5 i1 m
に紫外部吸収極大を有する。
あるいはMM13902は、その実質的に純粋なジナt
− IJウム塩の形で新しく作った0.4%(重量/重
量) K B rディスクでの赤外吸収スペクトルは、
図2で示したごときであり且つ実質的に純粋なジナトリ
ウム塩の形で新しく作ったD20の溶液で測定した核磁
気共鳴スペクトルは、図3で示したごときである抗菌性
剤として特徴付け得るものである。
− IJウム塩の形で新しく作った0.4%(重量/重
量) K B rディスクでの赤外吸収スペクトルは、
図2で示したごときであり且つ実質的に純粋なジナトリ
ウム塩の形で新しく作ったD20の溶液で測定した核磁
気共鳴スペクトルは、図3で示したごときである抗菌性
剤として特徴付け得るものである。
かくしてMM13902は式(I):
で表すことができる。
物質MM13902は、塩にしない酸の形では不安定で
ある傾向にある。
ある傾向にある。
従ってこの発明でMM13902の塩類を提供するのが
好ましい。
好ましい。
又MMi3902の塩は2塩基塩であることが好ましい
。
。
最も適切な塩類としては、ナトリウム、カリウム、カル
シウム、マグネシウム、アルミニウム、通常の置換アン
モニウムイオン類などの医薬的に受容なイオン類とで形
成された塩である。
シウム、マグネシウム、アルミニウム、通常の置換アン
モニウムイオン類などの医薬的に受容なイオン類とで形
成された塩である。
特に適切な塩類としては、ナトリウム又はカリウム塩、
例えばジナトリウム又はジカリウム塩のようなアルカリ
金属塩類である。
例えばジナトリウム又はジカリウム塩のようなアルカリ
金属塩類である。
この発明によって提供されるMM13902及びその塩
類としては、少なくとも50%の純品であるのが適切で
あり、少なくとも70%の純品であるのがより適切で、
好ましくは80%純品例えば90〜100%の純品であ
ることである。
類としては、少なくとも50%の純品であるのが適切で
あり、少なくとも70%の純品であるのがより適切で、
好ましくは80%純品例えば90〜100%の純品であ
ることである。
この発明によるMM13902及びその塩は、医薬的に
受容な賦形剤と共に医薬組成物として用いることができ
る。
受容な賦形剤と共に医薬組成物として用いることができ
る。
最も適切な絹成物としては、MM13902のナトリウ
ム塩又はカリウム塩例えばジナトリウム塩又はジカリウ
ム塩を含むものである。
ム塩又はカリウム塩例えばジナトリウム塩又はジカリウ
ム塩を含むものである。
かような組成物は、経口、局所又は非経口用に適する剤
型であってもよい。
型であってもよい。
例えば、錠剤、カプセル、クリーム、シロップ、調剤用
散剤や、注射もしくは注入に適する滅菌形態で使用しう
る。
散剤や、注射もしくは注入に適する滅菌形態で使用しう
る。
このような製剤には、希釈剤、結合剤、着色剤、矯味剤
、保存剤、崩解剤のような通常の医薬的に受容な物をペ
ニシリン類及びセファロスポリン類jのような抗生物質
の製剤化によく知られた通常の製剤プラクテイスに従っ
て含め得る。
、保存剤、崩解剤のような通常の医薬的に受容な物をペ
ニシリン類及びセファロスポリン類jのような抗生物質
の製剤化によく知られた通常の製剤プラクテイスに従っ
て含め得る。
MM13902又はその塩類は、それだけを含めた組成
物としてもよいが、β−ラクタム系抗生物質と一緒に製
剤化してもよい。
物としてもよいが、β−ラクタム系抗生物質と一緒に製
剤化してもよい。
適切なβ−ラク1タム系抗生物質にはβ−ラクタマーゼ
に感受性があることが知られたものやβ−ラクタマーゼ
に対しかなり強い固有の耐性を有するものを含む。
に感受性があることが知られたものやβ−ラクタマーゼ
に対しかなり強い固有の耐性を有するものを含む。
このようなβ−ラクタム系抗生物質としては、アンピシ
リン、アモキシシリン、ベンジルペニシリン、,フエノ
キシメチルペニシリン、プロピシリン、セファロリシン
、セホキシチン、セファロチン、セファレキシン、カル
ペニシリン、チカルシリン、及ヒカルペニシリン又はチ
カルシリンのフエニル、トリルもしくはインダニルエス
テル又はアンピシシリン、ベンジルペニシリン、アモキ
シシリン、セファロリジン、セファログリシンなどのア
セトキンメチル、ピバロイルオキシメチルもしくはフタ
リジルエステルのような生体内で加水分解しうるエステ
ル類を含む。
リン、アモキシシリン、ベンジルペニシリン、,フエノ
キシメチルペニシリン、プロピシリン、セファロリシン
、セホキシチン、セファロチン、セファレキシン、カル
ペニシリン、チカルシリン、及ヒカルペニシリン又はチ
カルシリンのフエニル、トリルもしくはインダニルエス
テル又はアンピシシリン、ベンジルペニシリン、アモキ
シシリン、セファロリジン、セファログリシンなどのア
セトキンメチル、ピバロイルオキシメチルもしくはフタ
リジルエステルのような生体内で加水分解しうるエステ
ル類を含む。
MM13902又はその塩とβ−ラクタム系抗生物質と
の割合は通常10:1〜1:10、例えば3:1〜1:
3である。
の割合は通常10:1〜1:10、例えば3:1〜1:
3である。
単一の服用型に存在さす抗菌剤の全量は通常50〜15
00Tn9で、100〜1000m9が普通,であろう
。
00Tn9で、100〜1000m9が普通,であろう
。
好ましい単一服用組成物としては、泌尿管系、呼吸器系
、軟組織系などの疾患の治療に1日当り1以上例えば1
日当り2〜4回投与しうるものである。
、軟組織系などの疾患の治療に1日当り1以上例えば1
日当り2〜4回投与しうるものである。
かくして組成物は気管支炎、淋疾、中耳炎、乳線炎など
の治療に用いうる。
の治療に用いうる。
この発明の一つの観点によれば、後述するごときMM4
550(複合物, Complex)の溶液を、実質的
にMM13902又はその塩の溶液よりなるフラクショ
ンと他のフラクションにクロマトグラフイー的に分け、
その溶液からMM13902又はその塩を分離すること
よりなるMM13902又はその塩の製法が提供される
。
550(複合物, Complex)の溶液を、実質的
にMM13902又はその塩の溶液よりなるフラクショ
ンと他のフラクションにクロマトグラフイー的に分け、
その溶液からMM13902又はその塩を分離すること
よりなるMM13902又はその塩の製法が提供される
。
ここでゝ実質的にMM13902又はその塩の溶液より
なる“フラクションとは、その溶液中に存在する抗生物
質がMM1.3902又はその塩のみか又は他の抗生物
質が存在した際はMM13902又はその塩より少なく
存在することを意味する。
なる“フラクションとは、その溶液中に存在する抗生物
質がMM1.3902又はその塩のみか又は他の抗生物
質が存在した際はMM13902又はその塩より少なく
存在することを意味する。
MM13902又はその塩は、フラクション中の抗生物
質の70%であるのが適切で、より適切には80%好ま
しくは90〜100%存在することである。
質の70%であるのが適切で、より適切には80%好ま
しくは90〜100%存在することである。
どのフラクションが実質的にMM13902又はその塩
のみからなるかを決める適当な方法としては、各サンプ
ルの紫外線吸収スペクトルを測定することであることを
見出した。
のみからなるかを決める適当な方法としては、各サンプ
ルの紫外線吸収スペクトルを測定することであることを
見出した。
図1と類似の紫外部吸収スペクトルを示すフラクション
には、後述のMM4.550のような他の抗生物質を実
質的に含まず通常MM13902又はその塩を含む。
には、後述のMM4.550のような他の抗生物質を実
質的に含まず通常MM13902又はその塩を含む。
一般的に約305nmに明白な紫外部吸収極大を示すフ
ラクションは所望純度のものである。
ラクションは所望純度のものである。
上の方法は、通常MM13902をジ塩基性塩として単
離するのに使用される。
離するのに使用される。
MM13902のモノ塩基性塩又は遊離酸のMM139
02自体を必要とする場合には、一般にMM13902
のモノ塩基性塩及び遊離酸のMM13902はMM4.
5 5 0 (複合物)のような混合物から分離する
に充分な安定性を持たないので、MM13902のジ塩
基性塩を酸性化して作ることができる。
02自体を必要とする場合には、一般にMM13902
のモノ塩基性塩及び遊離酸のMM13902はMM4.
5 5 0 (複合物)のような混合物から分離する
に充分な安定性を持たないので、MM13902のジ塩
基性塩を酸性化して作ることができる。
モノ塩基性塩及び遊離酸は安定性が悪いため容易に得る
ことはできない。
ことはできない。
前述したようにMM13902のクロマトグラフ的分離
はジナトリウム塩のようなMM13902の塩を用いて
行うのが最良と思う。
はジナトリウム塩のようなMM13902の塩を用いて
行うのが最良と思う。
MM13902の塩類は高親油性溶媒より水性溶媒によ
り溶解するのでこの発明に用いるクロマトグラフによる
精製には水性溶媒系を使用するのが好ましい。
り溶解するのでこの発明に用いるクロマトグラフによる
精製には水性溶媒系を使用するのが好ましい。
ほぼ中性に緩衝された電解質の水性液を塩基性イオン交
換樹脂のような極性支持体と共に使用するのが適当であ
ることを見出した。
換樹脂のような極性支持体と共に使用するのが適当であ
ることを見出した。
かくしてリン酸緩衝液のような通常の緩衝液で約pH
7にした塩化ナトリウムの水性溶液を第3級アミン基又
は第4級アンモニウム基を含み得る支持体と共に使・用
することができる。
7にした塩化ナトリウムの水性溶液を第3級アミン基又
は第4級アンモニウム基を含み得る支持体と共に使・用
することができる。
塩基性イオン交換セルロース類及び塩基性イオン交換架
橋されたデキストラン類が適当な支持体であり、QAE
セファデツクス(登録商標名)A25が、0.7モルの
塩化ナトリウムのpH71Jン酸緩衝液よりなる溶媒系
の際に特に好適な支持体であることが見出された。
橋されたデキストラン類が適当な支持体であり、QAE
セファデツクス(登録商標名)A25が、0.7モルの
塩化ナトリウムのpH71Jン酸緩衝液よりなる溶媒系
の際に特に好適な支持体であることが見出された。
あるいは、水及び低級アルカノールのような水と混和し
うる有機溶剤からなる溶媒系をシリカゲル又はセルロー
スのような不活性支持体と共に使用に適することが判明
した。
うる有機溶剤からなる溶媒系をシリカゲル又はセルロー
スのような不活性支持体と共に使用に適することが判明
した。
セルロースと共に使用する特に適当な溶媒系とは水とイ
ソプロパノールの混合物特にインプロパノール7:水3
の混合物である。
ソプロパノールの混合物特にインプロパノール7:水3
の混合物である。
しかしながら、イオン交換樹脂を用いる上記の操作によ
る製品は、食塩を多く含むことが多いので、集めた溶液
を脱塩するのがよい。
る製品は、食塩を多く含むことが多いので、集めた溶液
を脱塩するのがよい。
脱塩は、溶液を親油性物質を含むカラムに通すことによ
って行うことができ、そこでMM13902は吸着され
食塩は吸着されない。
って行うことができ、そこでMM13902は吸着され
食塩は吸着されない。
カラム用の適当な資材としては、アンバーライトXAD
4のようなポリスチレン類が含まれる。
4のようなポリスチレン類が含まれる。
あるいはセファデツクスG25のような架橋デキストラ
ン類やバイオゲル(登録商標名)P2のようなポリアク
リルアミドゲル類のごとき沖過剤を使用してのゲル沖過
法も利用できる。
ン類やバイオゲル(登録商標名)P2のようなポリアク
リルアミドゲル類のごとき沖過剤を使用してのゲル沖過
法も利用できる。
抗生物質は、水、水性メタノールなどを用いてカラムよ
り溶離させることができる。
り溶離させることができる。
上記の工程で所望の溶液が得られた際、緩和な条件下で
溶媒を除去することによりMM13902のジ塩基性塩
を固体で得ることができる。
溶媒を除去することによりMM13902のジ塩基性塩
を固体で得ることができる。
かような固体物を得るのに用い得る方法としてMM13
902含有の集めたフラクションを減圧濃縮し、凍結乾
燥することがあることを見出した。
902含有の集めたフラクションを減圧濃縮し、凍結乾
燥することがあることを見出した。
所望により上記の工程は2以上の段階に分けて行うこと
ができる。
ができる。
例えば、MM4550(複合物)の溶液を他の抗菌剤の
それ自体の重量までまざったMM13902又はその塩
よりなるフラクションに分けることができ、フラクショ
ンは例えばMM13902又はその塩を約50〜60%
含む物を得るべく凍結乾燥でき、次いでこの物は例えば
MM13902又はその塩を90〜100%含む物を得
るべく再びクロマトグラフイーに付すことができる。
それ自体の重量までまざったMM13902又はその塩
よりなるフラクションに分けることができ、フラクショ
ンは例えばMM13902又はその塩を約50〜60%
含む物を得るべく凍結乾燥でき、次いでこの物は例えば
MM13902又はその塩を90〜100%含む物を得
るべく再びクロマトグラフイーに付すことができる。
この明細書で用語ゝMM4550(複合物)“とけもと
もと英国特許第1,3 6 3,0 7 5号でMM4
550として表示した物を表すために用いられる。
もと英国特許第1,3 6 3,0 7 5号でMM4
550として表示した物を表すために用いられる。
同特許の実症例を繰り返して行い生産されたMM4.5
50(複合物)は、MM4550の塩類、MM1390
2の塩類及びかなりの量の他の物質を各種割合で含む不
純物である。
50(複合物)は、MM4550の塩類、MM1390
2の塩類及びかなりの量の他の物質を各種割合で含む不
純物である。
MM4550(複合物)は、MM13902の紫外部の
特異吸収を持たない。
特異吸収を持たない。
英国特許第1,3 6 3,0 7 5号の実施例の追
試で得たMM4550(複合物)のI50(後述)は通
常0. 0 0 0 4 lt & /ml以下ではな
い。
試で得たMM4550(複合物)のI50(後述)は通
常0. 0 0 0 4 lt & /ml以下ではな
い。
MM4.550(複合物)中に存在するMM4550の
塩類とMM13902の塩類との割合は、非常に変動し
ていると思われ、使用した微生物の菌及び/又は使用し
た正確な分離技術のような因子によるものと考えられる
が、この複合物はMM13902よりMM4550をよ
り多く含むことが一般的に見出された。
塩類とMM13902の塩類との割合は、非常に変動し
ていると思われ、使用した微生物の菌及び/又は使用し
た正確な分離技術のような因子によるものと考えられる
が、この複合物はMM13902よりMM4550をよ
り多く含むことが一般的に見出された。
MM4550(複合物)の製法は後の2解説“の項で述
べる。
べる。
この明細書で、用語ゝMM4550“は強力なβ−ラク
タマーゼ阻害剤であり又ある程度の抗菌活性を有する実
質的に純粋な化合物を述べるのに用いられる。
タマーゼ阻害剤であり又ある程度の抗菌活性を有する実
質的に純粋な化合物を述べるのに用いられる。
MM4550の性状はゝ解説“の項で後述する。
他の観点によれば、この発明はMM13902及びその
塩類の製法を提供するもので、その製法はストレプトマ
イセス属のMM13902生産菌を培養し、その培養物
からMM13902又はその塩を採取することよりなる
。
塩類の製法を提供するもので、その製法はストレプトマ
イセス属のMM13902生産菌を培養し、その培養物
からMM13902又はその塩を採取することよりなる
。
この方法においてMM13902生産菌とは後述するご
ときストレプトマイセス オリバセウス及びその関連微
生物の菌である。
ときストレプトマイセス オリバセウス及びその関連微
生物の菌である。
ストレプトマイセス オリバセウスのATCC2137
9:微工研寄託番号2960、ATCC21380:微
工研寄託番号2956、ATCC21 381 :微工
研寄託番号2957、A. T C C21382:微
工研寄託番号2958、ATCC31126(一ATC
C21379/M3):微工研寄託番号2955又はそ
れらの変異菌が最も適当な微生物として使用される。
9:微工研寄託番号2960、ATCC21380:微
工研寄託番号2956、ATCC21 381 :微工
研寄託番号2957、A. T C C21382:微
工研寄託番号2958、ATCC31126(一ATC
C21379/M3):微工研寄託番号2955又はそ
れらの変異菌が最も適当な微生物として使用される。
更にこの方法で使用するのに特に好ましい微生物は、ス
トレプトマイセス オリバセウス ATCC31126
である。
トレプトマイセス オリバセウス ATCC31126
である。
ここで使用した用語ゝ培養“とは、炭素、窒素、硫黄及
び鉱物塩類の同化性源の存在下に故意の好気性発育をさ
せることを意味する。
び鉱物塩類の同化性源の存在下に故意の好気性発育をさ
せることを意味する。
このような好気性発育は、固体又は半固体の栄養培地中
又は栄養源が溶解又は懸濁している液体培地中で行うこ
とができる。
又は栄養源が溶解又は懸濁している液体培地中で行うこ
とができる。
好気的表面培養又は液内培養によって行うことができる
。
。
栄養培地を複合栄養物で作ってもよく又化学的に限定す
ることもできる。
ることもできる。
酵母抽出物、大豆粉末などのような複合栄養源を含む培
地が特に好ましいことを見出した。
地が特に好ましいことを見出した。
又コバルトイオン、硫酸イオン及び炭酸カルシウムの添
加がよいことも見出した。
加がよいことも見出した。
28±2℃の温度での培養が抗生物質の許容できる収率
を与え且つ発酵開始後2〜3日でブロスを採取するのが
良い時期であることを見出した。
を与え且つ発酵開始後2〜3日でブロスを採取するのが
良い時期であることを見出した。
ここで使用した用語ゝ変異株“とは、自然に生ずるか又
は外部剤を故意に用いるか否かにかかわりなくその外部
剤によって生ずる変異菌を含む。
は外部剤を故意に用いるか否かにかかわりなくその外部
剤によって生ずる変異菌を含む。
変異菌を作る適当な方法としては、H.I.アドラー氏
、国際原子力エネルギー局、ウインでのシンポジウムの
議事録、1973年、第241頁の1工業用微生物に対
する照射と放射性同位元素“の中での「微生物の発展技
術」に述べられた方法を含むものである。
、国際原子力エネルギー局、ウインでのシンポジウムの
議事録、1973年、第241頁の1工業用微生物に対
する照射と放射性同位元素“の中での「微生物の発展技
術」に述べられた方法を含むものである。
これには次のことが含まれる。1)イオン化照射(例え
ばX線やγ線照射)、紫外線光、紫外線光と感光剤(例
えば8−メトキシプソラレン)、亜硝酸、ヒドロキシル
アミン、ピリミジン塩基同族体(例えば5−プロムウラ
シル)、アクリジン類、アルキル化剤(例えばマスター
ドガス、エチルメタンスルホン酸塩)、過酸化水素、フ
ェノール類、ホルムアルデヒド、熱など。
ばX線やγ線照射)、紫外線光、紫外線光と感光剤(例
えば8−メトキシプソラレン)、亜硝酸、ヒドロキシル
アミン、ピリミジン塩基同族体(例えば5−プロムウラ
シル)、アクリジン類、アルキル化剤(例えばマスター
ドガス、エチルメタンスルホン酸塩)、過酸化水素、フ
ェノール類、ホルムアルデヒド、熱など。
11)くみかえ、形質変換、形質導入、溶原化、溶原的
変換や突然変異用の選択的手法のような遺伝学的手法。
変換や突然変異用の選択的手法のような遺伝学的手法。
変異促進剤を用いると所望抗生物質の生産量を増す能力
のある微生物が作り得ることを見出した。
のある微生物が作り得ることを見出した。
例えば、ストレプトマイセス オリバセウスATCC2
1 37 9(微丁研寄託番号2960)の培養物に照
射し、次いで得られる菌種を分離すると後述するような
KAG検定で最犬の活性ゾーンを生産するとみられるも
ので、ストレプトマイセス オリバセウスATCC 3
1 1 2 6の分離につながった。
1 37 9(微丁研寄託番号2960)の培養物に照
射し、次いで得られる菌種を分離すると後述するような
KAG検定で最犬の活性ゾーンを生産するとみられるも
ので、ストレプトマイセス オリバセウスATCC 3
1 1 2 6の分離につながった。
この菌はこの発明に使用するのに好ましい菌である。
なおATCC31126はオランダでCB8155.7
5として寄託されている。
5として寄託されている。
ストレプトマイセス オリバセウスとその関連微生物は
次の特性を有する。
次の特性を有する。
(a) 灰色又は黄色の胞子形成気生菌糸を有する。
(b) 波形又は螺旋形の担胞子体形態を有する。
(c) 平滑な表面の胞子を有する。
(d) メラミンを生産しない。
上記の特性を有する菌種には、表5〜9に記載したもの
を含む。
を含む。
一般に所望の抗生物質を得るのに用いる全ての分離及び
精製法に例えば20℃以下より好ましくは12℃以下の
高めた温度ではなくて行う必要がある。
精製法に例えば20℃以下より好ましくは12℃以下の
高めた温度ではなくて行う必要がある。
所望の製品は、通常培養沖液より多く得られるので、分
離工程の最初に発酵物より例えば沖過により固形物の除
去を行う。
離工程の最初に発酵物より例えば沖過により固形物の除
去を行う。
MM13902父はそ;の塩の不純製品は、清澄培養沖
液からMM13902又はその塩を活性炭のような活性
物質に吸着させ次いでそれから水性アセトンのような溶
媒を用いて溶離させることにより得ることができる。
液からMM13902又はその塩を活性炭のような活性
物質に吸着させ次いでそれから水性アセトンのような溶
媒を用いて溶離させることにより得ることができる。
この工程は通常MM13902のジ塩基性塩について・
行われる。
行われる。
又は、MM 1 3 9 0 2又はその塩の不純製品
を培養沢液より、親油性アンモニウム塩と水非混和性溶
媒とを用い抽出することにより得ることができる。
を培養沢液より、親油性アンモニウム塩と水非混和性溶
媒とを用い抽出することにより得ることができる。
これは上記の方法より有利であることが多い。
(MM13902は減圧下で有機溶冫媒を留去すると置
換アンモニウム塩として得ることができる。
換アンモニウム塩として得ることができる。
)MM13902の置換アンモニウム塩の当初溶液を沃
化ナI− IJウムのような沃化アルカリ金属の溶液を
用いて水層に逆抽出するのが好ましい。
化ナI− IJウムのような沃化アルカリ金属の溶液を
用いて水層に逆抽出するのが好ましい。
この最後の工程を変え一般に不純なMM13902のジ
塩基性塩の水性溶液を作るのに用いられる。
塩基性塩の水性溶液を作るのに用いられる。
上記したようなMM13902又はその塩類の不純なも
のから、許容しうる純度の物を得るため前述のクロマト
グラフィーに付される。
のから、許容しうる純度の物を得るため前述のクロマト
グラフィーに付される。
冫 次の解説は抗菌性化合物の分離に有用な一般的情報
を明らかにするものである。
を明らかにするものである。
又次の実捲例はこの発明を例証するためのものである。
解説1:
I50の決定
;1,o値は、エシエリシア コリ ]”311のβ−
ラクタマーゼ酵素(この微生物はR因子で制御されたβ
−ラクタマーゼを含む)によりアンピシリンの加水分解
を50%阻止するに必要な物質の量である。
ラクタマーゼ酵素(この微生物はR因子で制御されたβ
−ラクタマーゼを含む)によりアンピシリンの加水分解
を50%阻止するに必要な物質の量である。
β−ラククマーゼは、リッチモンドとスキ)一ズ( A
.dy. in Microbiol . Phys
iol.9.31( 1973))の分類によれば、タ
イプIllaの酵素に入る。
.dy. in Microbiol . Phys
iol.9.31( 1973))の分類によれば、タ
イプIllaの酵素に入る。
アンピシリンからそのペニシロ酸へのβ−ラクタマーゼ
加水分解の割合は、澱粉・ヨード滴定検定により分かり
、その一つの方法でペニシロ酸の生成割合が澱粉・ヨー
ド複合物の脱色で分かる。
加水分解の割合は、澱粉・ヨード滴定検定により分かり
、その一つの方法でペニシロ酸の生成割合が澱粉・ヨー
ド複合物の脱色で分かる。
この方法及びβ−ラクタマーゼの製法は、M.コールH
S−エルソンとP. D.フルブロックの報告(Bi
ochemical Journal 1 9 7 2
, 1 2 7 ,295〜308)に記載されてい
る。
S−エルソンとP. D.フルブロックの報告(Bi
ochemical Journal 1 9 7 2
, 1 2 7 ,295〜308)に記載されてい
る。
上記の方法の少し改良として、阻害剤のサンプルは基質
のアンピシリンを添加する前37°Cで15分間酵素と
予め培養した。
のアンピシリンを添加する前37°Cで15分間酵素と
予め培養した。
その操作は次の通りであった。試薬
緩衝液:
0.05モル,pH 7 リン酸カリウム緩衝液澱粉
/ヨード液: ノビツク(Biochem.,T.( 1 9 6 2
) 8 3 ,236〕記載の方法で調整 基質: 緩衝液中アンピシリン4 0 ltji /mlβ−ラ
ククマーゼ酵素: コールら(Biochem.J.(1 972)1 2
7,295〕記載の方法に従いE.コIJ B1,よ
り調4整。
/ヨード液: ノビツク(Biochem.,T.( 1 9 6 2
) 8 3 ,236〕記載の方法で調整 基質: 緩衝液中アンピシリン4 0 ltji /mlβ−ラ
ククマーゼ酵素: コールら(Biochem.J.(1 972)1 2
7,295〕記載の方法に従いE.コIJ B1,よ
り調4整。
緩衝液中の酵素製品の希釈は、未阻止反応で100秒当
り約03の光学濃度単位の低下を来たすようにした。
り約03の光学濃度単位の低下を来たすようにした。
他のEコリのβ−ラクタマーゼ生産菌を用いることがで
き、特にこれらの菌はR因子例えばRTEMを伝達する
。
き、特にこれらの菌はR因子例えばRTEMを伝達する
。
条件
反応は37℃で1cIrLのキュベット中でS pso
oパイ ユニカム分光光度計を用い行った。
oパイ ユニカム分光光度計を用い行った。
これは、4つのサンプルのキュベットと対応するブラン
クで行うことができる。
クで行うことができる。
最初のキュベットを対照の,反応に使用し、阻害剤を含
めなかった。
めなかった。
第2〜4のキュベットは各種希釈の阻害剤に用いた。
反応は、5900mにおける光学濃度を記録しながら、
3〜6分間隔で100秒当りの光学濃度の変化をみて反
応速度を測定しつつ行われた。
3〜6分間隔で100秒当りの光学濃度の変化をみて反
応速度を測定しつつ行われた。
阻害剤サンプルは、阻害剤を加えない対照での反応割合
の50%に達する迄希釈した。
の50%に達する迄希釈した。
解説2:
KAG検定
KAG検定は、醗酵ブロス中又は分離工程中でのβ−ラ
クタマーゼ阻害剤の存在を決める方法である。
クタマーゼ阻害剤の存在を決める方法である。
45°Cのモルトン栄養培地にクレブシラエロゲネスの
適当なβ−ラクタマーゼ生産菌を接種し、次いで寒天中
ペニシリンGが6μ97mlの濃度になるのに充分な量
のペニシリンG滅菌液を;混合する。
適当なβ−ラクタマーゼ生産菌を接種し、次いで寒天中
ペニシリンGが6μ97mlの濃度になるのに充分な量
のペニシリンG滅菌液を;混合する。
次いで寒天をペトリ皿に注ぎ、固化後減菌金属カッター
を用い寒天層に等しい空間をもった円筒ウエルを入れる
。
を用い寒天層に等しい空間をもった円筒ウエルを入れる
。
テスト溶液をウエルに導入する。
次いでこの皿を27°C〜37°Cの一定温度で培養す
る。
る。
培養期間中、テスト溶液中の阻1害剤をウエルから寒天
中へ拡散させ、そこでクレブシラのセルから生産された
β−ラクタマーゼの作用が阻止される。
中へ拡散させ、そこでクレブシラのセルから生産された
β−ラクタマーゼの作用が阻止される。
かくして、ペニシリンGはβ一ラククマーゼによる分解
から保護され、クレブシラの発育を防ぐに充分な濃度で
存在する。
から保護され、クレブシラの発育を防ぐに充分な濃度で
存在する。
寒天冫のこの部分に阻害剤が充分な濃度に拡散しないと
クレブシラの高密度の発育を許し、β−ラクタマーゼに
よりペニシリンGが分解される。
クレブシラの高密度の発育を許し、β−ラクタマーゼに
よりペニシリンGが分解される。
クレブシラ発育の明白な円形の阻止帯が阻害剤を含むウ
エルの周囲に形成される。
エルの周囲に形成される。
各阻止帯の大きさは、テ1スト溶液中の阻害剤の濃度に
従属する。
従属する。
テスト溶液の力価(任意単位/ml)は帯の直径に対す
る阻害剤の対数濃度の標準線を参照して得られる。
る阻害剤の対数濃度の標準線を参照して得られる。
この検定系はバイオートグラフイーに用いることもでき
る。
る。
冫解説3:
英国特許第1,3 6 3,0 7 5号に開示された
物と比較できるMM4550(複合物)の製法ストレプ
トマイセス オリバセウスATCC21379をローク
ス瓶中の固形寒天斜面−ヒでi28゜Cで7日間生育さ
せた。
物と比較できるMM4550(複合物)の製法ストレプ
トマイセス オリバセウスATCC21379をローク
ス瓶中の固形寒天斜面−ヒでi28゜Cで7日間生育さ
せた。
寒天培地の組成は次の通り。
糾 成 量g/1
酵母抽出物 10.0グルコース1
水和物 100 ノ 寒 天 15.0
飲料水を加えて 1l 酵母抽出物は、英国・バーl・ンオントレント・ウエリ
ングトンロードのボブリル・フツド・イングレジエンツ
社より供給のゝイーテツクス“を用い、寒天は英国・S
. E. 1 ロンドン・ザウスワークブリッジロー
ドのオキソイド社より供給のものを用いた。
水和物 100 ノ 寒 天 15.0
飲料水を加えて 1l 酵母抽出物は、英国・バーl・ンオントレント・ウエリ
ングトンロードのボブリル・フツド・イングレジエンツ
社より供給のゝイーテツクス“を用い、寒天は英国・S
. E. 1 ロンドン・ザウスワークブリッジロー
ドのオキソイド社より供給のものを用いた。
培地は滅菌前にpH6.8に調整した。
0.02%のツウイン80(ポリオキシエチレン・ソル
ビタン・モノオレエート)含有の50ml滅菌脱イオン
水をロークスびん培養物に加え、胞子を振盪して懸濁液
とした。
ビタン・モノオレエート)含有の50ml滅菌脱イオン
水をロークスびん培養物に加え、胞子を振盪して懸濁液
とした。
この胞子懸濁液を接種材料として10Mのステンレス鋼
製の醗酵釜に入れた75lの滅菌種段階用培地に加えた
。
製の醗酵釜に入れた75lの滅菌種段階用培地に加えた
。
種段階用培地の組成は次の通りである。
組 成 量g71
大豆粉末 100
グルコース1水和物 200
飲料水を加えて 1l
(大豆粉末は英国・マンチェスター・オールドトラフオ
ードのプリテイシュ・アルカデー社製のアルカソイ50
を用いた。
ードのプリテイシュ・アルカデー社製のアルカソイ50
を用いた。
)発泡をおさえるために滅菌前の醗酵培地に大豆油中1
0%(容量)のプルロニツクLa+ (登録商標名)の
50mlを加えた。
0%(容量)のプルロニツクLa+ (登録商標名)の
50mlを加えた。
〔プルロニツクL8、は英国・W.3ロンドン・ザバー
レ231のヤコブセン・ファン・デン・ベルク・ユー・
ケー社より供給されたもので、エチレンオキシドとプロ
ピレンオキンドのブロック重合体である。
レ231のヤコブセン・ファン・デン・ベルク・ユー・
ケー社より供給されたもので、エチレンオキシドとプロ
ピレンオキンドのブロック重合体である。
〕培地を醗酵槽中で120℃で20分間蒸気滅菌した。
種段階培養液を8.5インチ直径の翼付皿攪拌機を用い
340r.p−mで攪拌し、開放式スパージャーを通し
て150l/mmの滅菌空気を導入した。
340r.p−mで攪拌し、開放式スパージャーを通し
て150l/mmの滅菌空気を導入した。
培養器にはバツフルプレートを装備した。28℃に調整
し、この条件下で45時間培養後にコCD 種培養ti
の7.5lを、300lのステンレス鋼製の醗酵釜に入
れた150lの滅菌発酵培地に接種液として入れた。
し、この条件下で45時間培養後にコCD 種培養ti
の7.5lを、300lのステンレス鋼製の醗酵釜に入
れた150lの滅菌発酵培地に接種液として入れた。
醗酵培地の組成は次の通り。
組 成 分 量g71大豆粉末(ア
ルカソイ50) 10.0グルコース1水和物
2 0. 0白 あ(炭酸カルンウム
より沈澱)0.2塩化コバルト(CoCl26H20
) 0.0 0 1飲料水を加えて
1l発泡防止用に大豆油中10%のプルロ
ニツクI’stを300ml加えた。
ルカソイ50) 10.0グルコース1水和物
2 0. 0白 あ(炭酸カルンウム
より沈澱)0.2塩化コバルト(CoCl26H20
) 0.0 0 1飲料水を加えて
1l発泡防止用に大豆油中10%のプルロ
ニツクI’stを300ml加えた。
48時間後に醗酵物を取り遠心分離で澄明にした。
この澄明にしたものは、100,000の1の希釈度で
の酵素検定で50%の阻止をした。
の酵素検定で50%の阻止をした。
これの1−00lを1 2kg( 湿重t)ワットマン
DE32イオン交換セルローズのアセテート型(英国・
E. C. 4ロンドン・ニューブリッジストリート、
比リーブ・アンゼル社製,ジエチルアミノエチル基で置
換された微細結晶性セルローズ)と攪拌した。
DE32イオン交換セルローズのアセテート型(英国・
E. C. 4ロンドン・ニューブリッジストリート、
比リーブ・アンゼル社製,ジエチルアミノエチル基で置
換された微細結晶性セルローズ)と攪拌した。
スラリーを濾過し、0.5モル硫酸カリウム127でM
M4550(複合物)をセルロースから溶離させた。
M4550(複合物)をセルロースから溶離させた。
溶離液を減圧下30℃以下でクライミング・フイルム蒸
発器中で6lに濃縮、12lのアセトン添加で多量の硫
酸カリウムを沈澱させ、P液を30℃以下減圧下で20
0mlに濃縮した。
発器中で6lに濃縮、12lのアセトン添加で多量の硫
酸カリウムを沈澱させ、P液を30℃以下減圧下で20
0mlに濃縮した。
濃縮液をアンバーライt−XAD−4樹脂(ロームアン
ドハース社製、非イオン系ポリスチレン樹脂)の76m
mX2m塔に通し、脱イオン水で溶離させ、溶離液を1
.40mlのフラクションに集めた。
ドハース社製、非イオン系ポリスチレン樹脂)の76m
mX2m塔に通し、脱イオン水で溶離させ、溶離液を1
.40mlのフラクションに集めた。
KA(42により検出された活性フラクションを集め(
22l)、アミコンUM−05膜(直径].5C)mm
,英国・ハイワイコブ・クイーンロード57、アミコン
社製)を用いるウルトラ濾過で60P.S.i. 窒
素気流中275mlに濃縮した。
22l)、アミコンUM−05膜(直径].5C)mm
,英国・ハイワイコブ・クイーンロード57、アミコン
社製)を用いるウルトラ濾過で60P.S.i. 窒
素気流中275mlに濃縮した。
濃縮物を凍結乾燥し、褐色粉末( I500.0 0
4 pg/rnl) 2.2gを得た。
4 pg/rnl) 2.2gを得た。
この粉末1gを02モル硫酸ナトリウム1lに溶解し、
ジクロルメタン中2%(重量/容量)のテトラーn−ブ
チルアンモニウム・ハイドロゲン・サルフエート(スエ
ーデンのAB.アストラ社製)の1lと混合した。
ジクロルメタン中2%(重量/容量)のテトラーn−ブ
チルアンモニウム・ハイドロゲン・サルフエート(スエ
ーデンのAB.アストラ社製)の1lと混合した。
ジクロルメタン層を分け、一70℃に冷却し、濾過して
氷を除去し蒸発で20mlに濃縮した。
氷を除去し蒸発で20mlに濃縮した。
40〜60℃の石油エーテル400mlを加え、遠心分
離で沈澱物を集めた。
離で沈澱物を集めた。
沈澱物を10rulのジクロルメタンに再溶解し、沃化
バリウム80m9と炭酸バリウム70m9含有の1,o
ml!の水で抽出した。
バリウム80m9と炭酸バリウム70m9含有の1,o
ml!の水で抽出した。
層を分離し、水層を濾過しp[{6.5に調整した。
溶液を凍結乾燥し黄色粉末を得た。固体をアセトンで洗
浄し、過剰沃化バリウムを溶出させ淡黄色の固形物を遠
心分離で採取し減圧乾燥した。
浄し、過剰沃化バリウムを溶出させ淡黄色の固形物を遠
心分離で採取し減圧乾燥した。
収率1 31nI?( I5oo.o o 0 4 p
g/ml)解説4: 英国特許第1,3 6 1,0 7 5号記載の物を得
るに有用な培養濾液の炭素吸着の例示 解説3で得られた培養濾液は、穴あき板状寒天拡散抗菌
検定でクレブシラ エロゲネスに対シソーンの直径17
mmを与えた。
g/ml)解説4: 英国特許第1,3 6 1,0 7 5号記載の物を得
るに有用な培養濾液の炭素吸着の例示 解説3で得られた培養濾液は、穴あき板状寒天拡散抗菌
検定でクレブシラ エロゲネスに対シソーンの直径17
mmを与えた。
KAG検定でゾーンの直径38朋でI50は100,0
00の1希釈。
00の1希釈。
5°Cの清澄培養濾117([を9インチ直径のカラム
で活性炭(英国のデアーボーン・ケミカル社製のファー
ネルBO、60〜80メッシュで1規定塩酸で予め洗浄
、リン酸塩でpH 6に緩衝)を16インチの高さにつ
めたものに通し毎分800〜1000mlの上昇流動で
浸出させた。
で活性炭(英国のデアーボーン・ケミカル社製のファー
ネルBO、60〜80メッシュで1規定塩酸で予め洗浄
、リン酸塩でpH 6に緩衝)を16インチの高さにつ
めたものに通し毎分800〜1000mlの上昇流動で
浸出させた。
ブリューを税イオン水10lで洗浄し、カラムは20℃
で20%アセトンで溶離させた。
で20%アセトンで溶離させた。
10lに至る活性フラクションを30°C以下で減圧濃
縮し6lにし、凍結乾燥してI,o0.0 5μg7m
l!を示す粗製MM4550(複合体)282.pを得
た。
縮し6lにし、凍結乾燥してI,o0.0 5μg7m
l!を示す粗製MM4550(複合体)282.pを得
た。
酵素阻害活性の回収率は22%であった。
ダルコグラニュラー炭素(英国のハネーウイル・アタラ
ス社製)を用いて活性炭処理を行っても同様な結果が得
られたく解説5: 英国特許第1,3 6 3,0 7 5号記載の物を得
るに有用な培養濾液のイオン交換樹脂クロマトグラフイ
ーの例示 内径ICrILのカラムに6crrL(床容量4.7m
l)の高さにダウエックス21Kイオン交換樹脂(英国
・ドルセット・ポールのB.D.Hケミカル社製、塩基
性基含有ポリスチレンージビニルベンゼン樹脂、20〜
50米国メッンユでクロリド型)をつめた。
ス社製)を用いて活性炭処理を行っても同様な結果が得
られたく解説5: 英国特許第1,3 6 3,0 7 5号記載の物を得
るに有用な培養濾液のイオン交換樹脂クロマトグラフイ
ーの例示 内径ICrILのカラムに6crrL(床容量4.7m
l)の高さにダウエックス21Kイオン交換樹脂(英国
・ドルセット・ポールのB.D.Hケミカル社製、塩基
性基含有ポリスチレンージビニルベンゼン樹脂、20〜
50米国メッンユでクロリド型)をつめた。
次いでこれを5%水性メタノールでほぼ4,7rdで4
回及び蒸留水4. 7 mlで1回洗浄した。
回及び蒸留水4. 7 mlで1回洗浄した。
解説3で記載したごとき方法で得られた2lの培養濾液
をカラムに通した。
をカラムに通した。
次いで50%水性メタノールで洗浄し不純物を除去した
。
。
50%水性メタノール中5%の食塩でMM4550(複
合物)を溶離させた。
合物)を溶離させた。
下記の表1は活性単位の用語で得られた結果を示すもの
である。
である。
・培養濾液中のMM4550(複合物)の含量は、任意
に8単位/mlにされた。
に8単位/mlにされた。
カラムからの溶出フラクションは、クレブシラ エロゲ
ネスに対する抗菌拡散法を用い検定し、その活性単位は
培養沖液の各種希釈液の単位/mlに対してゾーン直径
をプロットして作った標準線(培養濾液を標準として用
いた)を参照して算出した。
ネスに対する抗菌拡散法を用い検定し、その活性単位は
培養沖液の各種希釈液の単位/mlに対してゾーン直径
をプロットして作った標準線(培養濾液を標準として用
いた)を参照して算出した。
カラム法がMM4550(複合物)の濃縮に効果的な方
法であったことが判るであろう。
法であったことが判るであろう。
フラクンヨン2〜5が全量わずか37mlで活性の60
%・を含んでいた。
%・を含んでいた。
このフラクションの全乾燥重量は約210mI?であり
、従って35gの固形物がカラムに添加されたことにな
る。
、従って35gの固形物がカラムに添加されたことにな
る。
解説6:
英国特許第1,3 6 3,0 7 5号記載の物を得
るに有用な培養濾液のイオン対抽出の例示 硫酸ナトIJウム248gを解説3で記載された方法で
作った清澄培養濾液10lに加え、その溶液をジクロル
メタン中2%テトラn−プチルアンモニウム ハイドロ
ゲン スルファート10lで30分攪拌しつつ抽出した
。
るに有用な培養濾液のイオン対抽出の例示 硫酸ナトIJウム248gを解説3で記載された方法で
作った清澄培養濾液10lに加え、その溶液をジクロル
メタン中2%テトラn−プチルアンモニウム ハイドロ
ゲン スルファート10lで30分攪拌しつつ抽出した
。
層を分離し、ジクロルメタン層を2゜Cに冷却した。
ワットマンNolPS紙を通し少量の懸濁水を除去した
。
。
ジクロルメタン溶液を30℃以下で減圧濃縮し20ml
とした。
とした。
400mlの石油エーテル(40〜60℃)を加えると
MM4 5 5 0 (複合物)含有のゴム状物が沈澱
した。
MM4 5 5 0 (複合物)含有のゴム状物が沈澱
した。
これを遠心分離で集め、50mlのジクロルメタンに再
溶解し、1gの沃化バリウムと1gの炭酸バリウム含有
の水50mlで2分間振とうし抽出した。
溶解し、1gの沃化バリウムと1gの炭酸バリウム含有
の水50mlで2分間振とうし抽出した。
固形分を濾別し、二つの層を分離し、バリウム塩として
MM4550(複合物)を含有する水性層をpH6.5
に調整、凍結乾燥した。
MM4550(複合物)を含有する水性層をpH6.5
に調整、凍結乾燥した。
それにより、I50が0.0 0 1 1di/mlの
粗製朋4550(複合物)を317m9得た。
粗製朋4550(複合物)を317m9得た。
?説7:
テトラn−プチルアンモニウム ハイドロゲンスルファ
ートを使用してMM4550とMM13902含有の部
分精製された抗生物質複合物の製法 解説4に従って作られたMM4550(複合物)の粗製
品12.5gを水125mlに再溶解し、10%(重量
/容量)テトラn−プチルアンモニウムハイドロゲン
スルファートのジクロルメタン溶i125mlで抽出し
た。
ートを使用してMM4550とMM13902含有の部
分精製された抗生物質複合物の製法 解説4に従って作られたMM4550(複合物)の粗製
品12.5gを水125mlに再溶解し、10%(重量
/容量)テトラn−プチルアンモニウムハイドロゲン
スルファートのジクロルメタン溶i125mlで抽出し
た。
分離したジクロルメタン層を190■の沃化ナl− I
Jウム含有の2℃の水100mlを用いゆっくり攪拌し
つつ且つ水層を2%炭酸水素ナl− IJウムでpH6
.4に調整しつつ逆抽出した。
Jウム含有の2℃の水100mlを用いゆっくり攪拌し
つつ且つ水層を2%炭酸水素ナl− IJウムでpH6
.4に調整しつつ逆抽出した。
溶液を凍結乾燥し、乾燥固体をアセトン洗浄して F.
コリβ−ラクタマーゼに対しI,oO.0 0 0
2 1t9を持つMM4 5 5 0とMM1390
2のナトリウム塩が混った製品88mgを得た。
コリβ−ラクタマーゼに対しI,oO.0 0 0
2 1t9を持つMM4 5 5 0とMM1390
2のナトリウム塩が混った製品88mgを得た。
抗生物質の回収率は70%。アンピシリンと解説7で得
た物との混合物の抗菌力を栄養寒天中希釈法で測定した
。
た物との混合物の抗菌力を栄養寒天中希釈法で測定した
。
得られた最低発育曲ト濃度は表2の通りである。
アモキシリンとMM4550(複合物)の混合物でも上
記と同様な相乗効果が認められた。
記と同様な相乗効果が認められた。
解説8:
セチルジメチルベンジルアンモニウムクロリドを使用し
てのMM4550とMM13902含!有部分精製抗生
物質複合物の製法。
てのMM4550とMM13902含!有部分精製抗生
物質複合物の製法。
解説4で記載されたごときファーネル炭素カラムからア
セトン・水で溶離させたもの、凍結乾燥品( I50=
0.02μg/rnl)を蒸留水に溶解し、13711
97mlの濃度とし、pH6.5に調製した。
セトン・水で溶離させたもの、凍結乾燥品( I50=
0.02μg/rnl)を蒸留水に溶解し、13711
97mlの濃度とし、pH6.5に調製した。
1この溶液100mlを0.1%セチルジメチルベ
ンジル アンモニウムクロリドのジクロルメタン溶液の
等量で抽出した。
ンジル アンモニウムクロリドのジクロルメタン溶液の
等量で抽出した。
遠心分離で層を分け、有機層を再び0.05%沃化ナト
リウム溶液100mlで逆抽出した。
リウム溶液100mlで逆抽出した。
層を分離し、水層に残存するジクロjルメタンを減圧下
10分間で除去した。
10分間で除去した。
水層を凍結乾燥し、乾燥品を5077Ilのアセトンで
3回洗浄した。
3回洗浄した。
アセトン洗浄の製品を真空乾燥器中で乾燥し、淡褐色粉
末( 43m9, ■,o= o.o 0 2μg/r
rll)を得た。
末( 43m9, ■,o= o.o 0 2μg/r
rll)を得た。
解説9:
ゲル濾過を使用してMM 4 5 5 0とMM139
02含有部分精製抗生物質複合物の製法解説4の方法で
作った粗製MM4550(複合物)I50=0.2 l
t 9 7ml!の1gを溶離剤としてアエセトン/水
−4二6を用いセファデツクスG25(上級品)でクロ
マトグラフイーに付した。
02含有部分精製抗生物質複合物の製法解説4の方法で
作った粗製MM4550(複合物)I50=0.2 l
t 9 7ml!の1gを溶離剤としてアエセトン/水
−4二6を用いセファデツクスG25(上級品)でクロ
マトグラフイーに付した。
カラムの大きさは2.5Cr/′L×32crrLで溶
離は毎分1.5mlで行った。
離は毎分1.5mlで行った。
活性フラクションを集め、30°C以下で減圧濃縮し、
凍結乾燥して無晶形の淡黄色固体.[( I 50−0
. 0 0 5 ,a j! /ml) 2 2 m9
を得た。
凍結乾燥して無晶形の淡黄色固体.[( I 50−0
. 0 0 5 ,a j! /ml) 2 2 m9
を得た。
回収率88%で40倍に精製された。
解説10:
セルロース・クロマトグラフイーを使用してMM455
0とMM13902含有精製抗生物J質複合物の製法 解説7で作られたMM4550(複合物)610■を溶
離剤としてイソプロパノール/水=7:3(容量)を用
い、セルロース(ワットマンCC31)をつめた2.5
cTL×32Crt′Lのカラムでクロマトグラ7フイ
ーに付した。
0とMM13902含有精製抗生物J質複合物の製法 解説7で作られたMM4550(複合物)610■を溶
離剤としてイソプロパノール/水=7:3(容量)を用
い、セルロース(ワットマンCC31)をつめた2.5
cTL×32Crt′Lのカラムでクロマトグラ7フイ
ーに付した。
溶離速度は毎分1.5ml0抗菌活性を示すフラクショ
ンを合せ、30’C以下で減圧濃縮、凍結乾燥して抗生
物質複合物( I,o=0.0 0 0 0 7 lt
g/ml)の褐色無晶形固体40m9を得た。
ンを合せ、30’C以下で減圧濃縮、凍結乾燥して抗生
物質複合物( I,o=0.0 0 0 0 7 lt
g/ml)の褐色無晶形固体40m9を得た。
■,。が非常に小さい値であることは活性物質の純度が
改善されたことを示す。
改善されたことを示す。
別の機会に、上記の操作を行い1,。
−0.001μj;l/mlの物を得た。
これの抗菌活性を表3に示す。
抗菌活性は光接種を用いるオキソイド感性ブロス(1%
の一夜ブロス)で標準微量滴定法で測定した。
の一夜ブロス)で標準微量滴定法で測定した。
解説11:
MM4550
MM4550は次のような性質を認めることができる。
MM4550は酸性の固体でそのナトリウム塩は次の特
性を有する。
性を有する。
1)水に易溶、メタノールに溶け、ク[Jロホルム、ジ
エチルエーテルと炭化水素類に実質的に不溶である。
エチルエーテルと炭化水素類に実質的に不溶である。
11)水溶液で、吸収極大を持った特有の紫外線吸収ス
ペクトルを有し、その吸収極大は約238nmと約28
7nmである。
ペクトルを有し、その吸収極大は約238nmと約28
7nmである。
111)新しく作ったKBrディスク中0.4%(重量
/重量)存在する際、殊に約3450,2950,17
65,1695,1510,1390と1260crr
L ’ に吸収極大を有する特有の赤外線吸収スペクト
ルを示す。
/重量)存在する際、殊に約3450,2950,17
65,1695,1510,1390と1260crr
L ’ に吸収極大を有する特有の赤外線吸収スペクト
ルを示す。
KBrディスクを調整約一週間後に再びスペクトルを測
定するとかなり変化があり、約1765cx’ の大き
なピークはかなり減少するか消失している。
定するとかなり変化があり、約1765cx’ の大き
なピークはかなり減少するか消失している。
iv)D20中で測定した核磁気共鳴スペクトルは殊に
(a)ほぼ1 5 H zの結合定数を持ったほぼ2。
(a)ほぼ1 5 H zの結合定数を持ったほぼ2。
45τと3。65τに中心がある一対の低磁場二重線、
(b)ほぼ8.55τに中心がある二重線、(c)ほぼ
7.95τに鋭敏な一重線を有する。
(b)ほぼ8.55τに中心がある二重線、(c)ほぼ
7.95τに鋭敏な一重線を有する。
V)セルロースーヒ薄層クロマトグラフイーに付すと、
MM4550のジナトリウム塩は、次のようなおおよそ
のRf値を有する。
MM4550のジナトリウム塩は、次のようなおおよそ
のRf値を有する。
(a) ブタノール/イソプロパノール/水−7:7
: 6 : Rf=0.6 (b) イソプロパノール/水−7 : 3 : R
f=07(c)n−ブタノール/エタノール/水−7:
7:6;Rf=0.7 (d) n−プロパノール/水= 4 : 1 ;
Rf=0.6■1)スタフイロコツカス アウレウス、
バチルスズブチリス、エシエリシア コリ、クレブシラ
エロゲネス、プロテウス ミラビリス、アシネトバクタ
ー アニトラタス、セラチア マルセ]ツセンス及びシ
ゲラ ゾネイの菌を含む各種の菌種に対し抗菌活性を有
する。
: 6 : Rf=0.6 (b) イソプロパノール/水−7 : 3 : R
f=07(c)n−ブタノール/エタノール/水−7:
7:6;Rf=0.7 (d) n−プロパノール/水= 4 : 1 ;
Rf=0.6■1)スタフイロコツカス アウレウス、
バチルスズブチリス、エシエリシア コリ、クレブシラ
エロゲネス、プロテウス ミラビリス、アシネトバクタ
ー アニトラタス、セラチア マルセ]ツセンス及びシ
ゲラ ゾネイの菌を含む各種の菌種に対し抗菌活性を有
する。
vii)各種殊にエシエリシア コリ、クレブシラエロ
ゲネス及びスタフイロコツカス アウレウスを含む菌に
よって生産されたβ−ラクタマーゼ類に対し酵素阻害作
用を有する。
ゲネス及びスタフイロコツカス アウレウスを含む菌に
よって生産されたβ−ラクタマーゼ類に対し酵素阻害作
用を有する。
E.コリBllのβ−ラクタマーゼに対するI50は0
.0 0 0 1 ltg /ml以下である。
.0 0 0 1 ltg /ml以下である。
viii)アンピシリンと混合して用いると、エシエリ
シア コリ、クレブシラ エロゲネス、プロテウス ミ
ラビリス、プロテウス モルガニイ及びスタフイ口コツ
力ス オウレウス ラッセルを含む微生物に対する活性
を相乗する。
シア コリ、クレブシラ エロゲネス、プロテウス ミ
ラビリス、プロテウス モルガニイ及びスタフイ口コツ
力ス オウレウス ラッセルを含む微生物に対する活性
を相乗する。
IX)アミノ酸分析でこの物はポリペプチドや蛋白質で
はないことが示される。
はないことが示される。
酸性加水分解後α一アミノアジピン酸は見出されない。
×)エールリツヒ試薬(300rnI?の4−ジメチル
アミノベンズアルデヒドを54mlのn−ブタノール、
9rrLlのエタノールと9mlの濃塩酸の混合液に溶
解)に陽性で、ペーパークロマトグラムと薄層クロマト
板上で青色を示す。
アミノベンズアルデヒドを54mlのn−ブタノール、
9rrLlのエタノールと9mlの濃塩酸の混合液に溶
解)に陽性で、ペーパークロマトグラムと薄層クロマト
板上で青色を示す。
×1)一般の酵素毒ではなく、E.コリのβ−ラクタマ
ーゼを阻害するに必要な量より過剰濃度で、モノアミン
オキシダーゼ カルボニツクアンヒドラーゼ、ドーパデ
力ルポキシラーゼ、トリプシン、キモトリプシン又はウ
レアーゼの各酵素を阻害しない。
ーゼを阻害するに必要な量より過剰濃度で、モノアミン
オキシダーゼ カルボニツクアンヒドラーゼ、ドーパデ
力ルポキシラーゼ、トリプシン、キモトリプシン又はウ
レアーゼの各酵素を阻害しない。
かくしてMM4550は式(■):
で表わすことができる。
解説12:
微生物
最初ATCC21379 ,ATCC21380,AT
CC21381とATCC2 1.3 82 (これら
はスペイン、ニュージーランド、南阿及びイスラエルで
それぞれ得られた土壌サンプルから分離)の培養物にM
M4 5 5 0 (複合物)が生産されていることを
見出した。
CC21381とATCC2 1.3 82 (これら
はスペイン、ニュージーランド、南阿及びイスラエルで
それぞれ得られた土壌サンプルから分離)の培養物にM
M4 5 5 0 (複合物)が生産されていることを
見出した。
我々の研究所では、これらの培養物は同じであると思わ
れ、かつボウスフイルド博士、スコットランド・アベル
デーン・トーリーリサーチステーションのザ・ナショナ
ル・コレクション・オブ・インダストリアル・バクテリ
ヤ(NCIB)の放線菌の専問家により、フユーター氏
の広く知られた1967年の分類〔S1カルジャー、バ
ーゼルのシステマテツク・デル・ストレプトマイセテン
、382頁〕を用い全てストレプトマイセスオリバセウ
スと同定された。
れ、かつボウスフイルド博士、スコットランド・アベル
デーン・トーリーリサーチステーションのザ・ナショナ
ル・コレクション・オブ・インダストリアル・バクテリ
ヤ(NCIB)の放線菌の専問家により、フユーター氏
の広く知られた1967年の分類〔S1カルジャー、バ
ーゼルのシステマテツク・デル・ストレプトマイセテン
、382頁〕を用い全てストレプトマイセスオリバセウ
スと同定された。
以後にMM4550生産が表5にみられるような他のス
トレプトマイセス属の菌種にも見出された。
トレプトマイセス属の菌種にも見出された。
S.オリバセウスはワックスマン氏により1919年に
記載された〔カルチュアル・スタデーズ・オブ・スピー
シズ・オブ・アクチノマイセス,フィル,サイエンス,
8,71〜215〕。
記載された〔カルチュアル・スタデーズ・オブ・スピー
シズ・オブ・アクチノマイセス,フィル,サイエンス,
8,71〜215〕。
続いて1960年にソ聯の研究グループが非常によく似
た特長を持った菌種を報告し、それをアクチノマイセス
(ストレプトマイセス)フルボビリデスと命名した〔ク
ユーシエバら、Trud.Inst.Mikrobio
l ,Akad Nauk. SSSR. , 8,
226〜253(1960))。
た特長を持った菌種を報告し、それをアクチノマイセス
(ストレプトマイセス)フルボビリデスと命名した〔ク
ユーシエバら、Trud.Inst.Mikrobio
l ,Akad Nauk. SSSR. , 8,
226〜253(1960))。
ストレプトマイセス属の微生物は、その生育条件により
形態学的及び生理学的特性が非常に異にするものである
。
形態学的及び生理学的特性が非常に異にするものである
。
多くの菌種についての記述は、その大きな相異があるこ
とを認識する以前になされており、結果的に重複や同義
語がある。
とを認識する以前になされており、結果的に重複や同義
語がある。
フユター氏(1967年)は25種をS.フルボビリデ
スを含むS1オリバセウスと同義語であるとしている。
スを含むS1オリバセウスと同義語であるとしている。
命名と分類の混同を解消すべ<、1.962年にシャー
リングらによるザ・インターナショナル・ストレプトマ
イセス・プロジェクト(ISP)が始った( Int.
J. Syst. Bacteriol.,18,
69〜189( 1968))。
リングらによるザ・インターナショナル・ストレプトマ
イセス・プロジェクト(ISP)が始った( Int.
J. Syst. Bacteriol.,18,
69〜189( 1968))。
このプロジェクトで協力者らが標準条件下でのストレプ
トマイセスの菌種の正確な記述をする一連の研究を行っ
た。
トマイセスの菌種の正確な記述をする一連の研究を行っ
た。
このテーマにより、S.オリバセウスやS.フルボビリ
デスを含む約400の命名された菌種の代表的菌に標準
的な記載が作られた。
デスを含む約400の命名された菌種の代表的菌に標準
的な記載が作られた。
S.オリバセウスとS.フルボビリデスについてのこの
プロジェクトによる記載は、二つの特性のみが異なって
いる。
プロジェクトによる記載は、二つの特性のみが異なって
いる。
即ちi)担胞子体の形態と11)唯一の炭素源としてイ
ノシトールの利用能。
ノシトールの利用能。
S.オリバセウスは次のように記載されている。
胞子鎖形態:
波形(Rect iflexibile)部分を暗示す
る屈曲性の胞子鎖から漸次うつり変る開放螺旋形を持つ
螺旋形部分。
る屈曲性の胞子鎖から漸次うつり変る開放螺旋形を持つ
螺旋形部分。
成熟胞子鎖は一般に長く、1つの鎖当り50以上の胞子
を持つことが多い。
を持つことが多い。
炭素利用性:
D − クルコース、L−アラビノース、D−キシロー
ス、i−イノシトール、D−マニトール、Dーフルク1
〜−スとラムノースを生育に利用する。
ス、i−イノシトール、D−マニトール、Dーフルク1
〜−スとラムノースを生育に利用する。
シュクロースとラフイノースには全くの生育を認めない
かこん跡の生育しか認めない。
かこん跡の生育しか認めない。
S.フルボビリデスについて次のように記載されている
。
。
胞子鎖形態:
波形部分、成熟胞子鎖はやや短かく1つの鎖当り10〜
50の胞子をもつ。
50の胞子をもつ。
炭素利用性:
D−グルコース、L−アラビノース、D−キシロース、
D−マニトール、D−フルクトースとラムノースを利用
。
D−マニトール、D−フルクトースとラムノースを利用
。
シュークロースの利用は疑問。i−イノシトール又はラ
フイノースは全く生育を認めないかこん跡の生育しか認
めない。
フイノースは全く生育を認めないかこん跡の生育しか認
めない。
S#’)バセウス又はS.フルボビリデス及び他の関聯
菌種と同義語と命名された一連のカルチャーを標準的方
法及び培地を用いて測定した〔前掲IS’Pで推奨され
たシャーリングらInt.J.Syst. Bacte
riol.,1 6 , 3 1 3 〜3 4 0(
1966)参照〕。
菌種と同義語と命名された一連のカルチャーを標準的方
法及び培地を用いて測定した〔前掲IS’Pで推奨され
たシャーリングらInt.J.Syst. Bacte
riol.,1 6 , 3 1 3 〜3 4 0(
1966)参照〕。
カルチャーが異なるソースより得られた。
A.TCC21 379 ,21 380 ,21 3
8 1 ,21382をMM4550(複合物)の生産
をもとにして土壌より分離した。
8 1 ,21382をMM4550(複合物)の生産
をもとにして土壌より分離した。
比較目的に他の菌種を各種のカルチャーから得た。
MM4550(複合物)の生産、気生菌糸の色、担胞子
体の形、挙質菌糸の色、溶解色素産生、メラミン産生及
び炭素利用の試験結果を表5〜9に示す。
体の形、挙質菌糸の色、溶解色素産生、メラミン産生及
び炭素利用の試験結果を表5〜9に示す。
全ての菌種について電子顕微鏡下で胞子表面はなめらか
である。
である。
ISP記述よりS.オリバセウスの担胞子体の螺旋状生
育は変りやすい特性であることが明らかである。
育は変りやすい特性であることが明らかである。
真正の螺旋をS.オリバセウス即ちATCC3335の
タイプに観察された。
タイプに観察された。
川胞子体の大部分は長い。
ATCC21379,21380,21 38]又は2
1382の培養物に和胞子体は}長く波形の背景の中で
螺旋状の傾向を示したが、真正の螺旋が観察されなかっ
た。
1382の培養物に和胞子体は}長く波形の背景の中で
螺旋状の傾向を示したが、真正の螺旋が観察されなかっ
た。
しかし、二つの81オリバセウス菌即ちNCIB823
8とNCIB8509では大部分の和胞子体は波形であ
った。
8とNCIB8509では大部分の和胞子体は波形であ
った。
NCIB8238では中間の長さで、NCIB8509
は長かった。
は長かった。
S.フルボビリデスの典形的菌のATCC15863か
ら観察された担胞子体はATCC21379,21 3
80,21381,21382,31126のものより
短かく唯一の波形であった。
ら観察された担胞子体はATCC21379,21 3
80,21381,21382,31126のものより
短かく唯一の波形であった。
これらの特性からみてATCC2 1 379 ,21
380,21381,21382,311.26はよく
一致するが正確にはS.オリバセウスの記述に一致しな
い。
380,21381,21382,311.26はよく
一致するが正確にはS.オリバセウスの記述に一致しな
い。
ATCC21379,21380,21,381.21
382,31.126はイノシトール利用性でいくらか
変化を示しこれはS.オリバセウスとS.フルボビリデ
スとのISPの典形的菌種の記述によると異にする特件
である(表8参照)。
382,31.126はイノシトール利用性でいくらか
変化を示しこれはS.オリバセウスとS.フルボビリデ
スとのISPの典形的菌種の記述によると異にする特件
である(表8参照)。
ATCC31125とATCC21380はイノシトー
ルを利用し、これは、S.オリバセウスの特性であり、
一方他の菌種は利用性が疑しいか陰性である。
ルを利用し、これは、S.オリバセウスの特性であり、
一方他の菌種は利用性が疑しいか陰性である。
しかし、一つの炭化水素の利用能をみて種を分けること
は一般に満足し得るものではない。
は一般に満足し得るものではない。
このような差異は、一つの遺伝子の突然変異で生ずるか
も知れないし、菌株の意味であると考えられることがよ
くある。
も知れないし、菌株の意味であると考えられることがよ
くある。
S.オリバセウスのNCIB8138,NCIB’85
09,ATCC21 549,ATCC12019及び
ATCC3335の糖利用性の差異を多くの権威者は、
それらは種を異にすると考えないと示唆している。
09,ATCC21 549,ATCC12019及び
ATCC3335の糖利用性の差異を多くの権威者は、
それらは種を異にすると考えないと示唆している。
かくして、ATCC21379,21380,2138
1,21382,31126はS.オリバセウスとして
表わすのが適当とみえる。
1,21382,31126はS.オリバセウスとして
表わすのが適当とみえる。
現在S.オリバセウスとS.フルボビリデスと命名され
たものにより重要な差異が見出されない限り、これらは
国際的に一つの種と認められる可能性があろう。
たものにより重要な差異が見出されない限り、これらは
国際的に一つの種と認められる可能性があろう。
この場合、正しい名前は先行規定によってS.オリバセ
ウスであろう。
ウスであろう。
これは又フユター氏がS.オリバセウスと同義語として
挙げたものも含まれるであろう。
挙げたものも含まれるであろう。
MM4550(複合物)生産用のS.オリバセノウス及
びその関聯菌の培養濾液の試験は次のように行うことが
できる。
びその関聯菌の培養濾液の試験は次のように行うことが
できる。
即ち、リストした菌の培養濾液をワットマン扁1紙の原
点に20ltlスポットし、冷時一夜をかけてn−ブタ
ノール:イソプ口パノール:水−7:17:6でクロマ
トグラフイーをした。
点に20ltlスポットし、冷時一夜をかけてn−ブタ
ノール:イソプ口パノール:水−7:17:6でクロマ
トグラフイーをした。
別の組でn一ブタノール:氷酢酸:水−12: 3:5
を用い同じく冷時一夜をかけて行った。
を用い同じく冷時一夜をかけて行った。
部分精製したMM4550(複合物)のサンプルを同時
に二つの系で展開した。
に二つの系で展開した。
フ 又は25mlの清澄培養ブリューをジクロルメタン
中02%のセチルジメチルベンジルアンモニウム クロ
リド液12.5mlで抽出し、層を分け、有機層を残し
、0,5%の沃化ナl− 1)ウム溶液2.5mlを加
え、振盪、分離、水層を残し、これをクロマ丁トグラフ
イーに付す。
中02%のセチルジメチルベンジルアンモニウム クロ
リド液12.5mlで抽出し、層を分け、有機層を残し
、0,5%の沃化ナl− 1)ウム溶液2.5mlを加
え、振盪、分離、水層を残し、これをクロマ丁トグラフ
イーに付す。
例えば薄層クロマト片に5μスポットし、n−ブタノー
ル:イソプロパノール:水−7:7:6で展開する。
ル:イソプロパノール:水−7:7:6で展開する。
実椎例 I
MM4550(複合物)の製法とMM4550とMM1
3902への分離 解説の項で説明した分離操作を各種の頃序で利用できる
。
3902への分離 解説の項で説明した分離操作を各種の頃序で利用できる
。
特に適切な順序とは下記のような活性炭吸着、イオン対
抽出とセルロースクロマトグラフイーである。
抽出とセルロースクロマトグラフイーである。
解説3で得たような培養濾液340lをファーネルBO
炭素をつめた塔(直径9インチ×高さ21インチ)に毎
分800〜1200mlの上昇流で通した。
炭素をつめた塔(直径9インチ×高さ21インチ)に毎
分800〜1200mlの上昇流で通した。
炭素はMM4 5 5 0 (複合物)の吸着前に使用
されたもので、次の試薬で洗浄し再生した。
されたもので、次の試薬で洗浄し再生した。
0.5規定水酸化ナトリウム、0.2規定水酸化ナトリ
ウム:アセトン−3:2、水、1規定塩酸、水、pI{
6のリン酸緩衝液、水。
ウム:アセトン−3:2、水、1規定塩酸、水、pI{
6のリン酸緩衝液、水。
カラムを水201で洗浄し、培養濾液を除き、アセトン
:水−2:8(容量)を毎分200〜2 5 0 ml
流下させて溶離させた。
:水−2:8(容量)を毎分200〜2 5 0 ml
流下させて溶離させた。
1lのフラクションを集めた。
MM4550(複合物)含有のフラクションをクレブシ
ラエ口ゲ゛ネスを用いての抗菌拡散検定で検出し、これ
を集め(11l)、30℃以下で減圧濃縮して5.5l
とした。
ラエ口ゲ゛ネスを用いての抗菌拡散検定で検出し、これ
を集め(11l)、30℃以下で減圧濃縮して5.5l
とした。
この段階のMM4550(複合物)の回収率は20%で
あった。
あった。
濃縮物を2℃に冷却し、−5゜Cのジクロルメタン中2
%(重量/容量)のテトラn−プチルアンモニウム ハ
イドロゲン スルファート5.51を加え、2つの層を
2分間混合した。
%(重量/容量)のテトラn−プチルアンモニウム ハ
イドロゲン スルファート5.51を加え、2つの層を
2分間混合した。
ジクロルメタン層を分離し、0℃の0.6%沃化ナ}
IJウム容液の1lを加えた。
IJウム容液の1lを加えた。
2層をゆっくり攪拌した。水層を2%炭酸水素ナl−
IJウム水溶液で除々にpH6.5〜7.0に調整した
。
IJウム水溶液で除々にpH6.5〜7.0に調整した
。
水層を分離、凍結乾燥した。
乾燥固体を乾燥アセトンで抽出して過剰の沃化ナトリウ
ムを除去し、次いで不溶性の残渣から減圧下でアセトン
を除去し淡黄色粉末1.1gを得た。
ムを除去し、次いで不溶性の残渣から減圧下でアセトン
を除去し淡黄色粉末1.1gを得た。
この段階でのMM4550(複合物)の一貫回収率は1
0%であった。
0%であった。
培養濾液中に溶解していた全固形物にもとづいての精製
度合は、125倍であった。
度合は、125倍であった。
2.5cr/L直径のカラムに、インプロパノール:水
= 7 : 3 容量比中セルロース粉末(ワットマン
CC31)を32crrLの高さに詰めた。
= 7 : 3 容量比中セルロース粉末(ワットマン
CC31)を32crrLの高さに詰めた。
5 0 0 ynI?cD淡黄色粉末をインプロパノー
ル: 水−7 : 3 容量比の21nlに溶解し、同
じ溶媒を用い1分間1.5mlの流速でクロマトグラフ
イーをした。
ル: 水−7 : 3 容量比の21nlに溶解し、同
じ溶媒を用い1分間1.5mlの流速でクロマトグラフ
イーをした。
3 m.lのフラクションを集め、約285nmに紫外
部吸収極大を示すものを合し、濃縮・凍結乾燥してMM
4550(複合物)を得た。
部吸収極大を示すものを合し、濃縮・凍結乾燥してMM
4550(複合物)を得た。
上の実験で、約285nmに吸収を示すフラクションに
は酵素阻害・抗菌活性を示す物質が含まれていることを
認めた。
は酵素阻害・抗菌活性を示す物質が含まれていることを
認めた。
凍結乾燥したMM4550(複合物)の収率は35m9
であった。
であった。
本品は、褐色無晶形でI50一0.0001μji/m
lを有した。
lを有した。
この段階での活性物質の一貫回収率は3%で、通算60
0倍に精製された。
0倍に精製された。
この製品の抗菌活性を光接種物を用いるオキソイド感光
テストの標準微量滴定法で決めた。
テストの標準微量滴定法で決めた。
得られた最小発育阻止濃度は前述の表3に示したものと
類似であった。
類似であった。
この製品を展開剤としてn−ブタノール:イソプロパノ
ール:水(7:7:6)を用いセルロース(イーストマ
ンコダック社ゝクロマグラム“シート)上での薄層クロ
マ1〜グラフ分析で2つの活性物質に分離され、その1
つはほぼRf=0.58でMM4550と同定し、ほぼ
Rf=0.72のものはMM13902と同定した。
ール:水(7:7:6)を用いセルロース(イーストマ
ンコダック社ゝクロマグラム“シート)上での薄層クロ
マ1〜グラフ分析で2つの活性物質に分離され、その1
つはほぼRf=0.58でMM4550と同定し、ほぼ
Rf=0.72のものはMM13902と同定した。
この両物質は、B.ズブチリス,S.アウレウス(オク
スホード)、S.アウレウス(ペニシリン耐性菌)、E
. コリ(ペニシリン感受性及び耐性菌)、サルモネ
ラテイフイムリウム、プロテウス ミラビリス、プロテ
ウム モルガニとクレブシラ エロゲネスを含む各種微
生物でバイオートグラフイーで検出できる。
スホード)、S.アウレウス(ペニシリン耐性菌)、E
. コリ(ペニシリン感受性及び耐性菌)、サルモネ
ラテイフイムリウム、プロテウス ミラビリス、プロテ
ウム モルガニとクレブシラ エロゲネスを含む各種微
生物でバイオートグラフイーで検出できる。
得た結果を表4に示す。更に実験を行ない、2つの物質
をセルロース薄層クロマト上でイソプロパノール:水(
8:2)で展開し分離、リン酸緩衝液で溶出した。
をセルロース薄層クロマト上でイソプロパノール:水(
8:2)で展開し分離、リン酸緩衝液で溶出した。
各抽出液のβ−ラクタマーゼ阻害を検定し、両物質共E
.コリのβ−ラクタマーゼ阻害剤であることが判明した
。
.コリのβ−ラクタマーゼ阻害剤であることが判明した
。
又両物質共K.エロゲネスに対しベンジルペニシリンと
相乗作用することが判明した。
相乗作用することが判明した。
実施例 2
MM4550(複合物)の製法とMM4550:とMM
13902の分離 S.オリバセウスATCC31 1 26を5℃、p}
{6.5での醗酵から得られた培養濾液1.100lを
ゝダルコ“顆粒炭素を詰めたカラム(0.3m×1m)
に毎分3.2lで通した。
13902の分離 S.オリバセウスATCC31 1 26を5℃、p}
{6.5での醗酵から得られた培養濾液1.100lを
ゝダルコ“顆粒炭素を詰めたカラム(0.3m×1m)
に毎分3.2lで通した。
〔炭素はMM4550(複合物)の吸着に前に使用され
たもので、0,5規定水酸化ナトリウム0.2規定水酸
化ナトリウム:アセトン(3:2)、水、1規定塩酸、
水、リン酸緩衝液( pH 6 )、水の順序で洗浄再
生してから用いた。
たもので、0,5規定水酸化ナトリウム0.2規定水酸
化ナトリウム:アセトン(3:2)、水、1規定塩酸、
水、リン酸緩衝液( pH 6 )、水の順序で洗浄再
生してから用いた。
〕カラムを60lの水で洗浄し、培養濾液を除去、次い
でアセトン:水(2:8容量比)を用い30℃で毎分1
.1lで溶離させた。
でアセトン:水(2:8容量比)を用い30℃で毎分1
.1lで溶離させた。
601を集め続いて5×10lのフラクションを得た。
K.エロゲネスを用いる抗菌城散検定で検出したMM4
5 5 0(複合物)含有フラクションを集め(40
l)、30℃以下減圧下で32lに濃縮した。
5 5 0(複合物)含有フラクションを集め(40
l)、30℃以下減圧下で32lに濃縮した。
この段階でのMM4550(複合物)の回収率は15%
。
。
濃縮物を5℃に冷却し、16lの0.2%セチルジメチ
ルベンジルアンモニウムクロリドのジクロルメタン溶液
(5゜C)を加え、2つの層を5分間混合した。
ルベンジルアンモニウムクロリドのジクロルメタン溶液
(5゜C)を加え、2つの層を5分間混合した。
ジクロルメタン層を分離し、0.4%沃化ナトリウム溶
液(5℃)3.75lを加えた。
液(5℃)3.75lを加えた。
2つの層を5分間混合、水層を分離、凍結乾燥した。
乾燥固体を乾燥アセトンで抽出し、過剰の沃化ナトリウ
ムを除去し、残存固体を減圧乾燥し淡黄色粉末2.87
gを得た。
ムを除去し、残存固体を減圧乾燥し淡黄色粉末2.87
gを得た。
この時点でのMM4550(複合物)の一貫回収率は6
%であった。
%であった。
培養濾液中の全溶解固体より算出した精製度合は160
倍であった。
倍であった。
63mm直径のカラムにイソプロパンール:水( 7
: 3容量比)中のセルロース粉末(ワットマンCC3
1)を300mmの高さに詰めた。
: 3容量比)中のセルロース粉末(ワットマンCC3
1)を300mmの高さに詰めた。
2.0gの淡黄色粉末をインプロパノール:水(7:3
)5mlに溶解し、同じ溶媒で1分間3mlでクロマト
1グラフイーを行った。
)5mlに溶解し、同じ溶媒で1分間3mlでクロマト
1グラフイーを行った。
K.エロゲネスに対する検定で、MM455Q(複合物
)含有フラクションを取り、30゜C以下で減圧濃縮し
、凍結乾燥して207■の褐色固形物を得た。
)含有フラクションを取り、30゜C以下で減圧濃縮し
、凍結乾燥して207■の褐色固形物を得た。
この際のMM4550(複合物)の回収率は51%であ
り、精製は5倍であった。
り、精製は5倍であった。
16mm直径のカラムにn−プロパノール:水(4:l
容fi比)中のセルロース粉末(ワットマンCC31)
を30CHutの高さに詰めた。
容fi比)中のセルロース粉末(ワットマンCC31)
を30CHutの高さに詰めた。
198〜の褐色固形物を水:n−プ口パノール( 1
: 1)に溶解し、n−プロパノール:水(4:1)で
1分間0. 5 mlの流速でクロマトグラフイーを行
った。
: 1)に溶解し、n−プロパノール:水(4:1)で
1分間0. 5 mlの流速でクロマトグラフイーを行
った。
6mlのフラクションを集め、K.エロゲネスに対し微
生物検定した。
生物検定した。
各フラクションの紫外部スペクトルを測定した。
フラクション23〜28は約305nrnの紫外部吸収
極大を有し、MM 13902のジナトリウム塩を含有
した。
極大を有し、MM 13902のジナトリウム塩を含有
した。
このフラクションを集め、減圧濃縮、凍結乾燥し30T
n9の固形物を得た。
n9の固形物を得た。
本品はイーストマン・コダック社セルロース板を用い、
n−プロパノール:水(4:1容量比)での薄層クロマ
トでRfO.77に唯一の抗生物質活性を有するゾーン
を示した。
n−プロパノール:水(4:1容量比)での薄層クロマ
トでRfO.77に唯一の抗生物質活性を有するゾーン
を示した。
このゾーンはバシルス ズブチリスでバイオートグラフ
イーにより検出した。
イーにより検出した。
フラクション29〜40は、約285nmに紫外部吸収
極大を示しMM455Qを含有した。
極大を示しMM455Qを含有した。
これらを集め、減圧濃縮、凍結乾燥し53■の固形物を
得た。
得た。
このものは少量のMM 13902の塩が混入したMM
4.550の塩を含有した。
4.550の塩を含有した。
実施例 3
MM13902製造の好ましい分離法
S.オリバセウスATCC31126の胞子を乾燥剤付
密封容器内の乾燥土壌チューブ中に20℃において保存
した。
密封容器内の乾燥土壌チューブ中に20℃において保存
した。
少量の土壌貯蔵物(ほぼ2oTII?)を次の培地10
0ml含有の500mlエルレンマイヤーフラスコに無
菌的に移した。
0ml含有の500mlエルレンマイヤーフラスコに無
菌的に移した。
組 成 量g/1
グルコース1水和物 20.0大豆粉末
10.0脱イオン水を加えて
1l滅菌前にpHを6.5に調製した。
10.0脱イオン水を加えて
1l滅菌前にpHを6.5に調製した。
大豆粉末は、英国・マンチェスター・オールドストラド
フオードのプリテイシュ・アルカデー社の1アルカソイ
50“を用いた。
フオードのプリテイシュ・アルカデー社の1アルカソイ
50“を用いた。
フラスコは回転式振盪機上( 240 r. p. m
)28℃で約30時間培養した。
)28℃で約30時間培養した。
2m/の得られる発育生成物を1ロータス“ビンの傾面
固形寒天に接種した。
固形寒天に接種した。
寒天培地の組成は次の通り。組 成
量 V−S野菜ジュ−,2. 20.0ml
寒 天 200g脱イオ
ン水を加え 1l滅菌前にpHを6.
0に調整した。
量 V−S野菜ジュ−,2. 20.0ml
寒 天 200g脱イオ
ン水を加え 1l滅菌前にpHを6.
0に調整した。
V−8ジュースは英国・ノルフォーク・キングスレイン
のキアンベルス・スープ社より得たものである。
のキアンベルス・スープ社より得たものである。
接種物はビンを振動させることにより寒天表面に拡げら
れ、次いでまっすぐの状態で30°Cで培養した。
れ、次いでまっすぐの状態で30°Cで培養した。
2日間培養後、過剰の液体をピペットで除去し更に4日
間培養を行った。
間培養を行った。
ゝロータス“ビン培養物のこの製法を採用すれば、傾面
培養物にアクチノファージが起るのが抑制されることは
見い出されている。
培養物にアクチノファージが起るのが抑制されることは
見い出されている。
0.02%ツウイーン80含有の滅菌脱イオン水50m
lを1ロークス“ビン培養物に入れ、振とうして胞子を
懸濁させた。
lを1ロークス“ビン培養物に入れ、振とうして胞子を
懸濁させた。
この胞子懸濁液を1004ステンレス鋼製醗酵釜に入れ
た75lの滅菌種つけ培地に接種した。
た75lの滅菌種つけ培地に接種した。
種つけ培地糾成は次の通り。組 成
量g71大豆粉末(アルカソイ50)
10.0グルコース1水和物 2
0.0飲料水を加え 1l発
泡抑制のため、10%(容量戸プルロニツクL81“大
豆油溶液50mlを滅菌前の醗酵培地に添加した。
量g71大豆粉末(アルカソイ50)
10.0グルコース1水和物 2
0.0飲料水を加え 1l発
泡抑制のため、10%(容量戸プルロニツクL81“大
豆油溶液50mlを滅菌前の醗酵培地に添加した。
培地を120℃で20分間醗酵釜中で蒸気滅菌した。
種つけ培養物を、75インチ直径の羽根刑攪拌機を用い
1 4.O r. p. m. で攪拌し、開放末端
スパージャーを通して滅菌空気を毎分751供給した。
1 4.O r. p. m. で攪拌し、開放末端
スパージャーを通して滅菌空気を毎分751供給した。
温度は28℃に調節し、この条件下で48時間培養させ
た後、2000lステンレス鋼製じゃま板付醗酵釜に入
れた1500lの滅菌醗酵培地に容器の内容物を接種し
た。
た後、2000lステンレス鋼製じゃま板付醗酵釜に入
れた1500lの滅菌醗酵培地に容器の内容物を接種し
た。
醗酵培地の組成は次の通り。
組 成 量( g/l )大豆粉末(
アルカソイ50) 10.0グルコース1水
利物 20,0白あ(沈降炭酸りルシ
ウム)0.2 塩化コバルト(CoCJl?,, −6H20)
0. 0 0 1硫酸ナトリウム(無水)
t.0飲料水を加えて
1500l滅菌前に水酸化ナ} IJウムでpF{を
6.0に調整シタ。
アルカソイ50) 10.0グルコース1水
利物 20,0白あ(沈降炭酸りルシ
ウム)0.2 塩化コバルト(CoCJl?,, −6H20)
0. 0 0 1硫酸ナトリウム(無水)
t.0飲料水を加えて
1500l滅菌前に水酸化ナ} IJウムでpF{を
6.0に調整シタ。
10%ゝゝプルロニツクL81 “犬豆油液3lを滅菌
前に発泡防止に加えた。
前に発泡防止に加えた。
滅菌後、滅菌水酸化ナトリウム溶液で再びpH7.0に
調整した。
調整した。
二つの19インチ直径の羽根皿付攪拌機を106r.
p. mに攪拌した。
p. mに攪拌した。
温度を30゜Cに調節し、空気流量毎分120(lで醗
酵を行った。
酵を行った。
60時間後に醗酵物を取り出し、遠心分離で澄明化した
。
。
上記の生産物は、任意に340単位/mlに定められた
。
。
検定は解説2記載の方法を用いた。1 0゜C1 pH
8の培養濾液1050l(340単位/l)セチルジ
メチルベンジルアンモニウムクロリド1, 2 0 0
.!17含有のジクロルメタン310lを用い10℃
で、予め決めた流速でインラインミキサーを通し二つの
液体をポンプで送り抽出した。
8の培養濾液1050l(340単位/l)セチルジ
メチルベンジルアンモニウムクロリド1, 2 0 0
.!17含有のジクロルメタン310lを用い10℃
で、予め決めた流速でインラインミキサーを通し二つの
液体をポンプで送り抽出した。
層をシャープレス連続遠心分離で約2分間混合して分離
した。
した。
ジクロルメタン層300lを水性沃化ナトリウムで抽出
した。
した。
この逆抽出は、210gの沃化ナl− IJウム含有の
全量701の水を用い4つのバッチで行った。
全量701の水を用い4つのバッチで行った。
層は比重で分けた。水層を希塩酸でpH 7. 7〜7
.0に調整し、濾過した。
.0に調整し、濾過した。
沃化ナ} l)ウム抽出’lll71には21,900
単位/mlを含有した。
単位/mlを含有した。
10(J直径のガラス製カラムに食塩(0.3モル)含
有のpH 7 1Jン酸緩衝71(o.osモル)中の
QAEセファデツクスA25(ファーマシア社製)を4
0c1rLの高さに詰めイオン交換樹脂塔を作った。
有のpH 7 1Jン酸緩衝71(o.osモル)中の
QAEセファデツクスA25(ファーマシア社製)を4
0c1rLの高さに詰めイオン交換樹脂塔を作った。
5℃の沃什ナl− IJウム抽出液(7l)を毎分50
mlの速さでこの塔に入れた。
mlの速さでこの塔に入れた。
pH 7の0.05モルリン酸緩衝液中0.7モル塩化
ナトリウム溶液で毎分25mlの流速で5゜Cにおいて
溶離させた。
ナトリウム溶液で毎分25mlの流速で5゜Cにおいて
溶離させた。
2l(7)溶出液を捨て、90のフラクション( 1.
0 0ml〕を集めた。
0 0ml〕を集めた。
このフラクションを紫外分元々度計で検出し、約3 0
5 nmに吸収極大を示すこれらのフラクソヨンを取
り、pH 7に言周整した。
5 nmに吸収極大を示すこれらのフラクソヨンを取
り、pH 7に言周整した。
(フラクンヨン50〜62は1,440mlで、71,
000単位/mlであった。
000単位/mlであった。
)この領域に吸収極太を有するフラクションはMM13
902を含有したことを前に示した。
902を含有したことを前に示した。
この集めたフラクションに塩化ナトリウム(5g/10
0ml)を加え、5℃において6.3crrL直径のカ
ラムにアンバーライトXAD4樹脂(ローム・アンド・
ハース社製)を30c1nの高さに詰めたもの毎分20
mlの流速で通した。
0ml)を加え、5℃において6.3crrL直径のカ
ラムにアンバーライトXAD4樹脂(ローム・アンド・
ハース社製)を30c1nの高さに詰めたもの毎分20
mlの流速で通した。
MM13902は無機の不純物がなくこれらの条件下で
樹脂に吸着される。
樹脂に吸着される。
MM13902を室温で蒸留水200ml次いで50%
水性メタノールを用し溶離さぜた。
水性メタノールを用し溶離さぜた。
溶出11lを30℃以下で減圧濃縮し、70mlとし、
pH 7に調整、凍結乾燥すると1.62gの褐色固形
物が得られた。
pH 7に調整、凍結乾燥すると1.62gの褐色固形
物が得られた。
このものは37,000単位/m9活性を有する部分精
製されたMM13902の塩であった。
製されたMM13902の塩であった。
部分M製のMM13902ジナトリウム塩l.0,91
37.000単位/m9をセルロースカラム( 3.
8 cIrLX 3 0 cm.,ワツ1・マンCC
31セルロース)でn−プロパノール/水(4:]容量
比)を用い毎分2. 5 m.lの流速でクロマトグラ
フイを行った。
37.000単位/m9をセルロースカラム( 3.
8 cIrLX 3 0 cm.,ワツ1・マンCC
31セルロース)でn−プロパノール/水(4:]容量
比)を用い毎分2. 5 m.lの流速でクロマトグラ
フイを行った。
流出液の最初の170rIllを捨て、100X15m
l.のフラクションを集めた。
l.のフラクションを集めた。
MM13902ジナトリウム塩含有フラクションA63
7〜43(紫外線吸収で測定)は89mlになった。
7〜43(紫外線吸収で測定)は89mlになった。
これを30°C以下で減圧濃縮してn−プロパノールを
除去し、次いで凍結乾燥して219Tn9の黄色粉末(
活性73,000単位/■)を得た。
除去し、次いで凍結乾燥して219Tn9の黄色粉末(
活性73,000単位/■)を得た。
このものはE1%一約343を持ち、約3081c1r
L nmに紫外線吸収極大を示した。
L nmに紫外線吸収極大を示した。
又このものは図2及び図3のような赤外線及び核磁気共
鳴スペクトルを有した。
鳴スペクトルを有した。
抗菌活性は表10に示す通りである。
元素分析により、ことに窒素、硫黄、ナトリウムを含み
、その割合即ちN:S:Naはおおよそ2:2:2であ
った。
、その割合即ちN:S:Naはおおよそ2:2:2であ
った。
MM13902のジナトリウム塩についての円偏光2色
性曲線の正及び負極大を、通路長さICTL、濃度0.
3 7 m9 7m.lで記録計付きカリー・61分
光偏光光度計で測定した。
性曲線の正及び負極大を、通路長さICTL、濃度0.
3 7 m9 7m.lで記録計付きカリー・61分
光偏光光度計で測定した。
その結果は次の通りであった。
この本発明は特許請求の範囲に記載の方法であるが、次
の態様を含む。
の態様を含む。
1.MM13902物質は固形のカルボン酸でその実質
的に純ナトIJウム塩は次の特性:i)水に易溶、メタ
ノールに溶解、クロロホルム、ジエチルエーテルと炭化
水素類に実質的に不溶である。
的に純ナトIJウム塩は次の特性:i)水に易溶、メタ
ノールに溶解、クロロホルム、ジエチルエーテルと炭化
水素類に実質的に不溶である。
II)水溶液で、吸収極太を持った特有の紫外線吸収ス
ペクトルを有し、その吸収極大の一つは約305nmで
ある。
ペクトルを有し、その吸収極大の一つは約305nmで
ある。
111)新しく作ったKBrディスク中0.4%(重量
/重量)含ませた際、殊に約3450 ,2950,1
750,1,620,1510.1400と1260c
rfL−1に吸収極太を有する特有の赤外線吸収スペク
トルを示す、 iv) D20中で測定した核磁気共鳴スペクトルは、
殊に(a)ほぼ14Hzの結合定数を持ったほぼ2.8
5τと4.00τに中心がある一対の低磁場二重線、(
b)ほぼ8.55τに中心がある二重線、及びほぼ8,
00τに鋭い一重線を有する、 V)スクフイロコツカス アウレウス、バチルスズブチ
リス、エシエリシア コリ、クレブシラ エロゲネス、
プロテウス ミラビリス、サルモネラ テイフイ及びシ
ュードモナスエルギノーサ、の菌を含む各種の菌種に対
し抗菌活性を有する、 ■1)アンピシリンと混合して用いると、エシエリシア
コリ、クレブシラ エロゲネス、プロテウス ミラビ
リス、プロテウス モルガニイ及びスタフイロコツカス
オウレウスラッセルを含む微生物に対する活性を相乗
する、 を有する特許請求の範囲の方法によるMM13902又
はその塩の製法。
/重量)含ませた際、殊に約3450 ,2950,1
750,1,620,1510.1400と1260c
rfL−1に吸収極太を有する特有の赤外線吸収スペク
トルを示す、 iv) D20中で測定した核磁気共鳴スペクトルは、
殊に(a)ほぼ14Hzの結合定数を持ったほぼ2.8
5τと4.00τに中心がある一対の低磁場二重線、(
b)ほぼ8.55τに中心がある二重線、及びほぼ8,
00τに鋭い一重線を有する、 V)スクフイロコツカス アウレウス、バチルスズブチ
リス、エシエリシア コリ、クレブシラ エロゲネス、
プロテウス ミラビリス、サルモネラ テイフイ及びシ
ュードモナスエルギノーサ、の菌を含む各種の菌種に対
し抗菌活性を有する、 ■1)アンピシリンと混合して用いると、エシエリシア
コリ、クレブシラ エロゲネス、プロテウス ミラビ
リス、プロテウス モルガニイ及びスタフイロコツカス
オウレウスラッセルを含む微生物に対する活性を相乗
する、 を有する特許請求の範囲の方法によるMM13902又
はその塩の製法。
2.MM13902の実質的純ジナ} IJウム塩がセ
ルロース薄層クロマトグラフィに付してほぼ次のRf値
: a) n−ブタノール/イソプロパノール/水一7:
7:6(容量):Rf=o.72 b)インプロパノール/水−7:3:Rf一〇.85 c) n−ブタノール/エタノール/水−7=7:6
:Rf=0.81 a) n−プロパノール/水−4:1;Rf一〇.7
5、 を与えること及び純ジナトリウム塩がエシエリシア コ
IJ B 1 1のβ−ラクタマーゼに対し0、O O
1〜0.0 0 0 1 μg/mlのI50を有す
ることにより更に特徴づけられる上記1に従う方法。
ルロース薄層クロマトグラフィに付してほぼ次のRf値
: a) n−ブタノール/イソプロパノール/水一7:
7:6(容量):Rf=o.72 b)インプロパノール/水−7:3:Rf一〇.85 c) n−ブタノール/エタノール/水−7=7:6
:Rf=0.81 a) n−プロパノール/水−4:1;Rf一〇.7
5、 を与えること及び純ジナトリウム塩がエシエリシア コ
IJ B 1 1のβ−ラクタマーゼに対し0、O O
1〜0.0 0 0 1 μg/mlのI50を有す
ることにより更に特徴づけられる上記1に従う方法。
3.MM13902は硫黄含有抗菌剤で、その塩類はス
トレプトマイセス オリバセウスATCC31126の
培養によって生産され、且つそのジナ1・リウム塩の水
溶液では図1で示されるように約305nmと約22
5nmに実質的に紫外部吸収極大を有することで特徴づ
けられる特,許請求の範囲に従う方法。
トレプトマイセス オリバセウスATCC31126の
培養によって生産され、且つそのジナ1・リウム塩の水
溶液では図1で示されるように約305nmと約22
5nmに実質的に紫外部吸収極大を有することで特徴づ
けられる特,許請求の範囲に従う方法。
4.MM1.3902がMM13902及びその塩類で
、MM1’3902化合物は抗菌剤であって、その実質
的に純ジナトリウム塩を新しく調整した0.4%(重量
)KBrディスクで赤外線吸収.スペクトルを測定した
際は実質的に図2に示す通りであり且つ同じくジナトリ
ウム塩を新しく調整したD20溶液で核磁気共鳴スペク
トルを測定した際は実質的に図3に示す通りであること
により特徴づけられる特許請求の範囲に従う方法。
、MM1’3902化合物は抗菌剤であって、その実質
的に純ジナトリウム塩を新しく調整した0.4%(重量
)KBrディスクで赤外線吸収.スペクトルを測定した
際は実質的に図2に示す通りであり且つ同じくジナトリ
ウム塩を新しく調整したD20溶液で核磁気共鳴スペク
トルを測定した際は実質的に図3に示す通りであること
により特徴づけられる特許請求の範囲に従う方法。
5.ストレプトマイセス属の菌が前述したようなストレ
プ1・マイセス オリバセウスの菌種又はその関連菌で
ある上記の何れかに従う方法。
プ1・マイセス オリバセウスの菌種又はその関連菌で
ある上記の何れかに従う方法。
6.ストレプトマイセスATCC31226又はその変
異株による上記5に従う方法。
異株による上記5に従う方法。
7.前述したようなMM4550(複合物)の溶液をク
ロマトグラフイー的にMM13902又はその塩の溶液
から実質的になる区分と他の区分に分別し、MM1.3
9’0 2又はその塩を単離することによりなる上記の
倒れかによるMM1 3902又はその塩の製法。
ロマトグラフイー的にMM13902又はその塩の溶液
から実質的になる区分と他の区分に分別し、MM1.3
9’0 2又はその塩を単離することによりなる上記の
倒れかによるMM1 3902又はその塩の製法。
8.MM13902のジ塩基性塩の製造に用いる上記7
に従う方法。
に従う方法。
9.前述したようなMM4.550(複合物)の溶液を
クロマトグラフイー的にMM13902又はその塩溶液
から実質的になる区分と他の区分に分け、MM1390
2又はその塩を分離することからなる前述したような実
質的に純MM13902又はその塩の製法。
クロマトグラフイー的にMM13902又はその塩溶液
から実質的になる区分と他の区分に分け、MM1390
2又はその塩を分離することからなる前述したような実
質的に純MM13902又はその塩の製法。
図1、図2及び図3は、MM1.3902の実質的純ジ
ナトリウム塩についての紫外線吸収スペクトル、赤外線
吸収スペクトル及び核磁気共鳴スペクl・ルをそれぞれ
示すものである。
ナトリウム塩についての紫外線吸収スペクトル、赤外線
吸収スペクトル及び核磁気共鳴スペクl・ルをそれぞれ
示すものである。
Claims (1)
- 1 ストレプトマイセス属のMM13902生産菌を培
養し、培養物からMM13902又はその塩を採取する
ことを特徴とする新規抗生物質の製法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB13856/74A GB1489235A (en) | 1974-03-28 | 1974-03-28 | Antibiotics |
AU45499/79A AU530414B2 (en) | 1974-03-28 | 1979-03-29 | Antibiotic mm13902 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS50140692A JPS50140692A (ja) | 1975-11-11 |
JPS582675B2 true JPS582675B2 (ja) | 1983-01-18 |
Family
ID=25627229
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP50038464A Expired JPS582675B2 (ja) | 1974-03-28 | 1975-03-28 | シンキコウセイブツシツノセイホウ |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS582675B2 (ja) |
AT (1) | AT345454B (ja) |
AU (2) | AU499459B2 (ja) |
BE (1) | BE827332A (ja) |
CA (1) | CA1050460A (ja) |
CH (1) | CH626628A5 (ja) |
DE (1) | DE2513854C2 (ja) |
FR (1) | FR2265399B1 (ja) |
GB (1) | GB1489235A (ja) |
LU (1) | LU72155A1 (ja) |
NL (1) | NL7503672A (ja) |
OA (1) | OA05204A (ja) |
SE (1) | SE7503536L (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6029668A (ja) * | 1983-07-28 | 1985-02-15 | Hino Motors Ltd | 経済運転ガイド装置 |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK145504C (da) * | 1976-04-28 | 1983-04-25 | Merck & Co Inc | Fremgangsmaade til fremstilling af det antibiotiske stof 890a2og/eller det antibiotiske stof 890a5 og farmaceutisk acceptable salte deraf |
NL7712091A (nl) * | 1976-11-17 | 1978-05-19 | Merck & Co Inc | Werkwijze ter bereiding van een nieuw antibiotisch middel. |
US4446146A (en) * | 1978-07-26 | 1984-05-01 | Beecham Group Limited | β-Lactam containing compounds, their preparation and use |
EP0008885B1 (en) * | 1978-09-09 | 1983-11-30 | Beecham Group Plc | Beta-lactam compounds, their preparation and use |
US4530791A (en) * | 1979-04-16 | 1985-07-23 | Kowa Co., Ltd. | β-Lactam antibiotics |
CN1976747A (zh) * | 2004-06-30 | 2007-06-06 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 包含beta-内酰胺抗生素的产品 |
-
1974
- 1974-03-28 GB GB13856/74A patent/GB1489235A/en not_active Expired
-
1975
- 1975-03-25 AT AT228475A patent/AT345454B/de not_active IP Right Cessation
- 1975-03-26 SE SE7503536*1A patent/SE7503536L/xx unknown
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