DE2446099C3 - Methode zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure - Google Patents

Description

Es besteht seit langer Zeit das Bedürfnis für eine spezifische quantitative Methode ?ur Bestimmung von Harnsäure in biologischen Flüssigkeiten, wie z. B. Urin, Blut bzw. Serum oder Plasma, die spezifisch ist, nur eine kleine Menge an Untersuchungsmaterial benötigt, billig genug ist, um Massenuntersuchungen zu ermöglichen, keine besondere technische Ausbildung verlangt, und somit für die klinische Verwendung gut geeignet ist. Zusätzlich wird als besonders wünschenswert betrachtet, daß eine derartige Methode sich für ein automatisches System, das mit kontinuierlicher Probenstromung arbeitet, eignet, so daß eine große Anzahl Proben hesteht ein Bedürfnis für ein automatisches ; welches mit kontinuierlicher Probenstromung arbeitet und bei der diagnostischen Untersuchung von ene größen Anzahl Menschen auf die Anwesenheit ,,hnlnmschen Mengen an Harnsaure m ihrem Blut

SSS⁸SSn^ fietot- ^Di^e "^arnsir ^si¹¹

beim Menschen das Endprodukt des Punnabbaus dar und wird deshalb physiologischerweise im Blut aufgefunden Bei zahlreichen Erkrankungen kommt es zu 2er Erhöhung bzw. Erniedrigung der Harnsaure-Kon-Tentrat on, so daß das Feststellen einer Abweichung vom physiologischen Harnsäuresp.egel im Blut ein _IS äußerst wichtiger diagnostischer Hinweis fur den Arzt ^1StSo werden z.B. bei folgenden Erkrankungen Erhöhungen der Harnsäure-Konzentration gefunden: Gicht, sSere Pneumonien mit ausgedehnten Gewebszersto-

rungen, Leukämie, Perniciosa; eine Erniedrigung wird ζ B bei der toxischen Schädigung der Nierentubuh bei der Wilson-Erkrankung gefunden.

Die bekannten Methoden zur Bestimmung von Harnsäure können im weiteren Sinn in enzymatisch*

,« Methoden, Methoden, worin ein Alkalimetallsalz von Phosphorwolframsäure verwendet wird und verschiedene chemische kolorimetrische Methoden eingeteilt werden. Die enzymatischen Methoden worin das Enzvm Uricase verwendet wird, haben den Nachteil,

» daß die Messung im U.V.-Gebiet durchgeführt wird, wodurch mit teuren Quarzküvetten und mit einem Spektralphotometer gearbeitet werden muß. In der Methode, worin ein Alkalimetallsalz der Phosphorwolframsäure Verwendung findet wird zwar im sichtbaren

Bereich gemessen, jedoch hat diese Methode den Nachteil daß andere reduzierend wirkende Komponenten mite'rfeßt werden, vas zu hohe und damit falsche Meßwerte ergibt.
Vor kurzem wurde von G. F. Domagk und

H H Schlicke in Analytical Biochemistry 22, 219- 224 (1968), eine besonders interessante Methode zur enzymatischen Bestimmung von Harnsäure beschrieben welche den Vorteil der spezifischen enzymatischen Bestimmung mit dem Vorteil der Meßmöglich-

4< keil im sichtbaren Bereich kombiniert. Gemäß dieser Methode wird in einem ersten Schritt Harnsäure mit Uricase in Allantoin und Wasserstoffperoxid umgewandelt.

H-N

Uricase _t H₂N + 2H₂O f- O₂

\=O + CO₂ -f H₂O₂

Harnsäure

Anschließend wird eine Indikatorreaktion angekop- 6o Leucoform vorliegendes Chromogen /um Farbstoff pelt, wobei das entstandene Wasserstoffperoxid unter oxidiert. Als Chromogen wird o-Dianisidin erwähnt, katalytischer Einwirkung von Peroxidase ein in der

OCH₁

OCH, OCH,

H, O₂ + H₂N

2H,O

Einer der Nachteile dieser Methode ist jedoch der zeitraubende Enteiweißungsschritt vor der eigentlichen Durchführung der Bestimmung. Diese Methode ist für manuelles Vorgehen beschrieben und eignet sich gemäß den Ausführungen von D. S u s i c und P. Scheibe in Z. Anal. Chem.257, 130-132 (1971), nicht für eine Automatisierung.

In dieser Publikation von S u s i c et al, in welcher die Verwendung von ABTS [Ammoniumsalz von 2,2'Azino-di-(3-ät(iyl-benzthiazolinsulphonsäure-6)] als Chromogen in einer automatisierten Harnsäurebestimmung beschrieben ist, wird hervorgehoben, daß o-Dianisidin sich für den gleichen Zweck wie ABTS nicht eignet, da dessen Empfindlichkeit zu gering ist.

Es wurde nun gefunden, daß ein unsubstituiertes oder kernsubstituiertes Benzidin oder Diphenylin, wie beispielsweise o-Dianisidin, trotzdem mit Erfolg als Chromogen in einer automatisierten Methode zur Bestimmung der Harnsäure verwendet werden kann und diese Methode mit genügender Empfindlichkeit, sehr hoher Genauigkeit und großem Linearitätsbereich arbeitet.

Weiter wurde festgestellt, daß eine automatisierte Methode zur Harnsäurebestimmung, worin o-Dianisidin als Chromogen eingesetzt wird, im Gegensatz zu einer entsprechenden Methode, worin ABTS als Chromogen verwendet wird, eine geringe Störanfälligkeit aufweist und sich für Routineuntersuchungen eignet.

Demnach betrifft die vorliegende Erfindung eine Me'hode zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure in biologischen Flüssigkeiten, worin man in kontinuierlicher Strömung die folgenden Schritte nacheinander durchführt,

a) in kontinuierlicher Strömung wird eine bestimmte Menge an Probe mit einer Verdünnungslösung gemischt,

b) diese Mischung wird durch einen Dialysator geleitet, dabei wird eine klare wässerige Lösung von dieser Mischung abgetrennt,

c) diese klare wäßrige Lösung wird mit einer gepufferten Uricaselösung mit einem pH-Wert zwischen 8,5 und 10 gemischt,

d) die gemäß Schritt c) erhaltene wässerige Lösung wird inkubiert,

e) das Reaktionsgemisch wird bei einem pH-Wert zwischen 5,5 und 8,5 mit einem Chromogen und Peroxidase gemischt und dadurch eine gefärbte Lösung erzeugt,

f) diese gefärbte Lösung wird durch eine Durchflußküvette geleitet und der in der Probe vorhandene Harnsäuregehalt wird während des Fließens der gefärbten Lösung durch die Durchflußküvette, photometrisch bestimmt.

Erfindungsgemäß verwendet man nun als Chromogen in einer solchen Methode ein unsubstituiertes oder kernsubstituiertes Benzidin oder Diphenylin.

In Schritt a) der erfindungsgemäßen Methode kann als Verdünnungsmittel eine wässerige Lösung von Alkali- oder Erdalkalisalzen, wie /.. B. Natriumchlorid, Natriunitetraborat, Kaliumchlorid oder Calciumchlorid verwendet werden. Besonders bevorzugt wird Natriumchlorid. Die Konzentration an Alkali- odor Erdalkalisalzen hangt vom jeweiligen Salz ab. Im Falle von Natriumchlorid wird eine Konzentration /wischen ungefähr !.2 bis 2.0 Prozent bevorzugt, wobei eine Konzentra'ion von ungefähr 1,3 Prozent ganz besonders bevorzugt isi.

In Schritt b) der erfindungsgemäßen Methode wird die Mischung zum Zweck der Enteiweißung durch einen Dialysator geleitet, wobei eine klare wässerige Lösung von dieser Mischung abgetrennt wird. Die Art des Dialysators ist nicht kritisch. Es wird jedoch bevorzugt, einen Dialysator mit einem Dialysierweg von 30 bis 100 cm zu verwenden.

in Schritt c) wird in den Dialysator die entproteinisierte Lösung mit einer gepufferten Uricaselösung

ίο vereinigt. Als Uricase werden aus tierischen Organen isolierte Präparate verwendet, wie z. B. Schweinsleberuricase. Diese Uricase wird vor der Reaktion in einen wäßrigen Puffer von pH-Wert 8,5 bis 10 aufgelöst. In der Regel kann jede übliche Puffermischung, welche sich zur Aufrechterhaltung eines derartigen pH-Bereiches eignet, verwendet werden. Vorzugsweise wird jedoch ein Borat-Puffer, insbesondere ein Natriumtetraborat-Puffer, verwendet. Die Konzentration des Puffers in der Puffer-Uricase-Lösung hängt von dem jeweiligen Puffer ab. Im Falle von Natriumtetraborat liegt diese Konzentration zweckmäßig zwischen 5 und 15mMol/ Liter. Besonders bevorzugt wird eine Konzentration von lOmMol/Liter. Die erforderliche Aktivität an Uricase hängt von dem jeweiligen Puffer ab. Im Falle

*5 von Natriumtetraborat liegt diese Aktivität vorzugsweise bei mindestens 2 Einheiten, wobei 10 Einheiten pro Liter besonders bevorzugt sind.

Zur Vervollständigung der in Schritt c) erfolgten Umwandlung von Harnsäure in Allantoin und Wasserstoffperoxid wird in Schritt d) das Reaktionsgemisch inkubiert. Die Temperatur der Inkubation ist nicht kritisch, liegt jedoch mit Vorteil bei ungefähr 37⁰C. Die Dauer der Inkubation hängt von mehreren Parametern ab, wie z. B. von der Temperatur, dem Dialysierweg, und der Uricaseaktivität. Als Inkubationszeit wird bevorzugt 4 Minuten gewählt.

Nach der Inkubation wird in Schritt e) das entstandene Wasserstoffperoxid unter katalytischer Einwirkung von Peroxidase mit einem kernsubstituierten oder unsubstituierten Benzidin (4,4'-Diaminobiphenyl) oder Diphenylin (2,4'-Diaminobiphenyl) zur Reaktion gebracht. Als substituiertes Benzidin eignen sich z. B. o-Dianisidin und o-Tolidin. Diese Leucofarbstoffe werden in wässeriger Lösung zugegeben. Die Konzentration dieser Leucofarbstoffe ist nicht kritisch und beträgt im Falle von o-Dianisidin mit Vorteil 1,3 mg/ml.

Die Peroxidase wird in Form einer wässerigen, . vorzugsweise gepufferten Lösung zugegeben. Als Peroxidase wird eine solche, welche aus Merrettich isoliert wurde, bevorzugt.

Die Aktivität der Peroxidase in der Lösung hängt von dem jeweiligen Puffer ab, beträgt jedoch mit Vorteil mindestens 0,04 Einheiten/ml, wobei 0,4 Einheiten/ml besonders bevorzugt werden. Die Peroxidase-Lösung wird zweckmäßigerweise auf einen pH-Wert zwischen 5,5 und 8,5 gepuffert. Hs kann jede übliche Puffermischung, welche sich zur Aufrechterhaltung eines derartigen pH-Bereiches eignet, verwendet werden. Vorzugsweise wird ein Phosphaipuft'er vom pH-Wert 7,5 eingesetzt. Die Reihenfolge der Zusetzung des i.eucofarbstoffes, des Puffers und der Peroxidase spielt keine Rolle, es wird jedoch vorzugsweise· zuerst die l.eucofarbstofflösung and anschließend die: gepufferte Peroxidase-Lösung zugesetzt.

Schließlich wird in Schritt f) die Extinktion der erhaltenen gefärbten Lösung in einem Photometer gemesser.. Im Falle von o-Dianisidin erfolgt diese Messung /wischen 420 und 4bO nni. Die Ergebnisse der

20

photometrischen Messung werden mit einem geeigneten Registriergerät festgehalten.

Ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen

automatisierten Methode wird anhand der Figur näher erläutert.

Die Figur illustriert ein automatisches System mit

kontinuierlicher Strömung, worin die zu analysierenden Proben der Reihe nach aus getrennten Probebehältern vom Probenschlauch 2 gesaugt wird (Durchfluß 0,42cc/min). Der Probeteller 1 dreht mit einer konstanten Geschwindigkeit und Hefen dem System 60 Proben pro Stunde mit einem Waschverhältnis von

5:1. Eine auf diese Weise angesaugte Probe wird in Strömung mit einer l,3°/oigen Kochsalzlösung (Durchfluß 2,00cc/Min.) gemischt und durch eine übliche

Mischspule 3 mit 5 Windungen aus Glas geleitet.

Nachdem die Mischung die Mischspule durchflossen hat, wird sie durch einen Dialysator 4 (Dialysierweg 60 cm), welcher mit einer Cellophanmembran od. dgl. versehen ist, gepumpt, wobei die Harnsäure durch Dialyse in die

in den unteren Teil des Dialysators zugeführte (Durchfluß 2,00cc/Min.) gepufferte Uricase-Lösung

(pH = 9,5), übergeht. Nach Durchgang des Dialysators

wird das Reaktionsgemisch bei einer Temperatur von 37⁰C während 4 Minuten in einem Heizbad 5 inkubiert, wobei die Harnsäure quantitativ zu Allantoin und Wasserstoffperoxid umgesetzt wird. Dem erhaltenen

Reaktionsgemisch wird dann in kontinuierlicher Weise

eine wäßrige Lösung von o-Dianisidin zugesetzt (Durchfluß 0,10cc/Min.). Anschließend wird diese

Mischung durch eine Mischspule 6 mit 20 Windungen aus Glas geleitet. Nach Durchfließen dieser Mischspule

6 wird eine gepufferte wässerige Peroxidase-Lösung Tabelle I

von pH-Wert 7,0 zugesetzt (Durchfluß 0,42 cc/Min.), wodurch die entstandene Mischung einen pH-Wert von 7,5 aufweist. Diese Mischung wird dann durch eine zweite Mischspule 7 mit 20 Windungen geleitet. Bei Durchströmung dieser Mischspule 7 reagiert das Wasserstoffperoxid unter katalytischem Einfluß der Peroxidase mit dem o-Dianisidin unter Bildung einer gelborangen Färbung. Anschließend werden in einem

Photometer 8 in einer 15-mm-Durchflußküvette bei 460 nm photometrische Messungen durchgeführt, d. h.

die Extinktion der zu prüfenden Lösung wird bei 460 nm in einem Photometer mit einer Durchflußküvette gemessen. Die Ergebnisse der photometrischen Messung werden mit einem geeigneten Registriergerät 9 festgehalten.

Das System mit kontinuierlicher Strömung, welches durch die Figur illustriert ist, saugt 60 Proben/Stunde an. Die Materialien, welche in das System einströmen, werden mittels einem geeigneten Pumporgan 10, welches eingestellt wurde, um die gewünschte Strömungsgeschwindigkeiten aufrechtzuerhalten, in dieses System gepumpt. Zur Vermeidung von Kontaminationseinflössen werden die Verdünnungslösung und die gepufferte Uricase-Lösung durch Luftblasen segmentiert (Durchfluß 0,23CcZMIn.). Zur Erzielung eines regelmäßigen Blasenmusters wird diesen beiden Lösungen sowie der gepufferten Peroxidase-Lösung ein Detergenz zugesetzt Als Detergenz eignet sich z. B. Polyoxyäthylcnsorbitanmonolaurylat. Die Konzentration des zugefügten Detergenz beträgt für die Verdünnungslösung vorzugsweise 0,25 Prozent, für die beiden anderen Lösungen vorzugsweise 1 Prozent.

Die Menge an Reagenzien, welche in einem bestimmten Reagenzsystem gebraucht wird, kann ohne Mühe, in Relation zu der zu untersuchenden Probe, mit Bestimmungen.

Hilfe der vorstehend angegebenen molaren Mengen respektive Enzymaktivität berechnet werden. Diese Berechnungen sind dem Fachmann geläufig. Beispielsweise kann ein Reagenzsystem die folgenden spezifischen Verbindungen enthalten:
Reagenz A

10 Einheiten Uricase (Suspension) (oder Lyophilisat)
Reagenz B

60 mmol Phosphat-Puffer (Granulat) 100 Einheiten Peroxidase (Lyophilisat) Reagenz C

66 mg o-Dianisidin (Lyophilisat) Reagenz D

18 ml Tween 20 (viskose Flüssigkeit) Reagenz E

10 mmol Natriumtetraborat (kristallines Pulver)

Die Haltbarkeit dieser Reagenzien beträgt mindestens 1 Jahr bei 2-8° C.

Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele noch weiter erläutert. Alle Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben.

B e i s ρ i e 1 1

Es wurde eine Verdünnungsreihe wäßriger Harnsäurestandards hergestellt mit den Konzentrationen 2 mg/100 ml, 5 mg/100 ml, 10 mg/100 ml, 20 mg/100 ml, 30 mg/100 ml und 40 mg/100 ml. Diese Standards werden wie Proben eingesetzt und wie in dem durch die Figur veranschaulichten Ausführungsbeispiel bestimmt.

Harnsäurekonzentration	Ergebnis in
mg/ml	Skalenteilen
2	4,4
5	11,1
10	22,3
20	44,4
30	65,0
40	87,3

Die Tabelle 1 beweist, daß mit der erfindungsgemäßen Methode ein gesicherter Linearitätsbereich bis 40 mg/ml gewährleistet ist.

Beispiel 2

Es wurde der Harnsäuregehalt von 5 verschiedener KontroHseren gemäß dem Ausführungsbeispiel nach der Figur bestimmt. Das Ergebnis wird in dei nachstehenden Tabelle II wiedergegeben.

Tabelle	H	X	S	VK	N
Serum	4,50	0,054	1,20	15
a	4,17	0,049	1,18	15
b	9,11	0,012	0,13	10
C	439	0,032	0,73	10
d	4,88	0,07	1,43	10
e	Mittelwert mg		Harnsäure/100 ml.
X =		Standardabweichung.
s =	Variationskocffizient (%). Anzahl der in der Serie dnr<
VK = N =
■■hprfiihricn

Die Tabelle II zeigt einen durchschnittlichen Variationskoeffizienten von weniger als 1 Prozent und beweist somit die Präzision der Methode.

Beispiel 3

Es wurden respektiv 0,93 mg/100 ml, 1,86 mg/100 ml und 2,79 mg/100 ml an Harnsäure 2 verschiedenen

Kontrollsera zugesetzt und der Harnsäuregehalt gemäß dem Ausführungsbeispiel nach der Figur bestimmt.

Das Ergebnis wird in der nachstehenden Tabelle 111 wiedergegeben.

Tabelle Hl veranschaulicht die Rückgewinnung (»Rccovery-Mcihode«) von Harnsäure.

Tabelle III	Zugefügte Harnsäure	Gesamtmenge an	Zurückgewonnene	Durchschnitt	Rück
Harnsäure in der		Harnsäure	Harnsäure		gewinnung
Probe	mg/100 ml	mg/100 ml	mg/100 ml	%
mg/100 ml	0,93	5,43	5,39	99,3
4,50	1,86	6,36	6,35	99,8
4,50	2,79	7,29	7,30	100,2
4,50	0,93	9,89	10,08	102
8,96	1,86	10,82	10,99	101,5
8,96	2,79	11,75	11,68	99,4
8,96			100.36

Beispiel 4

Es wurden respektive 10 mg/100 ml Glutathion, 10 mg/100 n.l Allantoin und 5 mg/100 ml Kreatinin einem Kontrollserum mit einem ursprünglichen HarnsLure-Gehalt von 4,6 mg/100 ml zugegeben und danach der Harnsäuregehalt erneut gemäß dem Ausführungsbeispiel nach der Figur bestimmt.

Das Ergebnis wird in der nachstehenden Tabelle IV wiedergegeben.

Tabelle	IV	Sollwert	Gefundener
Probe	Zugefügte Fremd		Wert
	substanz	mg/100 ml	mg/100 mi
		4,6	4,6
1		4,6	4,6
2	Glutathion,
	10 mg/100 ml	4,6	4,7
3	Allantoin,
	10 mg/100 ml	4,6	4,7
4	Kreatinin,
	5 mg/100 ml

Tabelle IV veranschaulicht die geringe Störanfälligkeit der erfindungsgemäßen Methode in bezug auf Glutathion, Allantoin und Kreatinin.

B e i s ρ i e 1 5

Es wurde ein Standard hergestellt mit der Konzentration 30 mg Harnsäure pro 100 ml. Ein aliquoter Teil dieses Standards wurde mit Ascorbinsäure so versetzt, daß die Gesamtkonzentration an Ascorbinsäure 5 mg/ 100 ml betrug. Anschließend wurden die beiden Standards wie Proben in das System eingesetzt und der Gehalt der Harnsäure gemäß dem Ausführungsbeispiel nach der Figur gemessen.

Ergebnis:

Probe ohne Ascorbinsäure: 30,0 mg Harnsäure/100 ml

Probe mit Ascorbinsäure: 30,2 mg Harnsäure/100 ml

Das vorstehende Ergebnis zeigt die geringe Störanfälligkeit der erfindungsgemäßen Methode in bezug aul Ascorbinsäure.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

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Claims (2)

schnell und mit großer Genauigkeit analysiert werden Patentansprüche:

1. Methode zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure in biologischen Flüssigkeiten, worin man in kontinuierlicher Strömung die folgenden Schritte nacheinander durchführt,

a) in kontinuierlicher Strömung wird eine bestimmte Menge an Probe mit einer Verdünnungslösung gemischt,

b) diese Mischung wird durch einen Dialysator geleitet, dabei wird eine klare wässerige Lösung von dieser Mischung abgetrennt,

c) diese klare wässerige Lösung wird mit einer gepufferten Uricaselösung mit einem pH-Wert zwischen 8.5 und 10 gemischt

d) die gemäß Schritte) erhaltene wässerige Lösung wird inkubiert,

e) das Reaktionsgemisch wird bei einem pH-Wert zwischen 5,5 und 8,5 mit einem Chromogen und Peroxidase gemischt und dadurch eine gefärbte Lösung erzeugt

f) diese gefärbte Lösung wird durch eine Durchflußküvette geleitet und der in der Probe vorhandene Harnsäuregehalt wird während des Fließens der gefärbten Lösung durch die Durchflußküvette photometrisch bestimmt, dadurch gekennzeichnet, daß man als Chromogen ein unsubstituiertes oder kernsubstituiertes Benzidin oder Diphenylin verwendet.

2. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als kernsubstituiertes Benzidin o-Dianisidin verwendet.

IO