DE2555704A1

DE2555704A1 - Indikator zur quantitativen feststellung von in biologischen fluessigkeiten geloesten stoffen

Info

Publication number: DE2555704A1
Application number: DE19752555704
Authority: DE
Inventors: Harry Hochstrasser
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1974-12-18
Filing date: 1975-12-11
Publication date: 1976-06-24
Also published as: CA1054035A; FR2295424A1; BR7506899A; FR2295424B3; BE836833A; SE7512219L; GB1521767A; US3964871A; JPS5175596A; SE7901476L

Description

Becton, Dickinson and Company, East Rutherford, New Jersey, USA

Indikator zur quantitativen Peststellung von in biologischen Flüssigkeiten gelösten Stoffen

Die Erfindung bezieht sich auf einen Indikator zur quantitativen Peststellung von in biologischen Flüssigkeiten gelösten Stoffen und insbesondere auf einen zur einmaligen Benutzung vorgesehenen Indikator zur Feststellung des Glukosegehalts von biologischen Stoffen. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung und zur Verwendung der erfindungsgemäßen Indikatoren.

Zum einmaligen Gebrauch bestimmte Teststreifen zur Feststellung der Konzentration von Glukose oder anderen Substanzen in Flüssigkeiten sind bekannt und in Gebrauch. Diese Teststreifen, die aufgrund ihrer Einfachheit und Billigkeit weite Anwendung gefunden haben,weisen einen Abschnitt aus saugfähigem Material auf, der ein Reagenz trägt, das bei Berührung mit Glukose eine Farbänderung erfährt. Solche Indikatoren sind beispielsweise in den US-PS 2 865 718, 2 848 308, 2 893 844, 2 981 606, 3 164 534, 3 211 855 und 3 791 988 beschrieben.

Alle in diesen Patenten beschriebenen Indikatoren werden für eine kurze Zeit z.B. in eine Glukose enthaltende Lösung eingetaucht..

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Beim Kontakt mit der Glukose erfährt das Reagenz eine chemische Veränderung, die dem Benutzer visuell durch eine Farbänderung sichtbar wird. Im allgemeinen ist der Grad der Farbänderung ein sehr grobes Maß für die Konzentration der Glukose in der untersuchten Flüssigkeit. Der Indikator gemäß US-PS 2 981 6O6 beispielsweise verwendet eine Reagenzzusammensetzung, welche abhängig von der Konzentration der Glukose in der untersuchten Flüssigkeit eine Farbanzeige gibt, die von einem zarten Gelb über Grün zu Blau wechselt. Eine Schätzung des Glukosegehalts in Prozenten wird dann dadurch erreicht, daß die Farbanzeige mit einer Standard-Farbskala verglichen wird, die durch Eintauchen des Teststreifens in Lösungen mit bekannte* Glukosegehalt erhalten wurde.

Andere bekannte Indikatoren verwenden eine einzige Reagenzie, die erst oberhalb einer bestimmten Konzentration auf die Anwesenheit von Glukose anspricht. Diese Indikatoren, die beispielsweise in der US-PS 2 893 844 beschrieben sind, geben ebenfalls dem Benutzer eine sichtbare Anzeige durch eine Farbe, die bei der Reaktion des Reagenz mit der Glukose erzeugt wurde. Diese Indikatoren zeigen keinen Konzentrationsbereich an, sondern geben lediglich an, ob ein vorbestimmter Glukosegehalt in der untersuchten Flüssigkeit vorhanden oder überschritten ist.

Die bekannten, einmal verwendbaren Indikatoren geben keine direkte numerische Anzeige des Gehalts an Glukose oder einer anderen Substanz in der untersuchten Lösung. Für diese Bestimmung muß also entweder ein Vergleich mit einer Standard-Farbskala gemacht werden, um die Anzeige des Indikators in einen numerischen Wert umzuwandeln, oder es müßten mehrere Untersuchungen durchgeführt werden unter Verwendung einer eigenen Indikatorvorrichtung für eine Anzahl von Feststellungen von verschiedenen Minimumglukosepegeln. Beide Arten geben nur in grober Annäherung die Glukosekonzentrationen an und hängen von der Fähigkeit des Benutzers ab, Farbschattierungen genau zu erkennen.

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Ein weiterer Nachteil der im Handel befindlichen Indikatoren dieser Art liegt darin, daß bei ihrer Benutzung bestimmte Gebrauchsanweisungen sehr eng befolgt werden müssen. Die verwendeten Reagenzien reagieren nämlich nach der ersten Berührung mit der festzustellenden Substanz, beispielsweise Glukose, noch weiter. Die von den Reagenzien erzeugten Farben fahren fort, sich bis zur dunkelst Möglichen Schattierung zu entwickeln und daher miß der Indikator innerhalb einer eng begrenzten, genau bestimmten Zeit nach dem Eintauchen ausgewertet werden, wenn man eine auch nur einigermaßen genaue Bestimmung durchführen will. Wenn der Benutzer nicht im Stande ist, die Wichtigkeit der Anweisung zu verstehen, daß die Anzeige des Indikators innerhalb der vorbestimmten Zeit ausgewertet werden muß oder dies nicht genau befolgt, ergibt sich eine ungenaue Auswertung.

Die erfindungsgemäßen Indikatoren sind ebenfalls für eimaligen Gebrauch bestimmt und ergeben eine Anzeige der Konzentration von gelöster Substanz, die direkt in numerischen Symbolen lesbar ist, wobei die Anzeige über jeden gewünschten Bereich von möglichen Konzentrationen verläuft. Zusätzlich ergeben die erfindungsgemäßen Indikatoren eine Anzeige kurz nach dem Eintauchen in die zu untersuchende Lösung und sie brauchen nicht innerhalb einer kritischen Zeit nach dem Eintauchen ausgewertet werden. Die Anzeigen sind eine verhältnismäßig lange Zeit nach dem Eintauchen stabil, so daß der Benutzer einen vernünftigen zeitlichen Spielraum hat, in welchem die Anzeige zwecks Erzielung richtiger Ergebnisse ausgewertet werden muß.

Die erfindungsgemäßen Indikatoren sprechen verhältnismäßig wenig auf die Wirkung von Fremdsubstanzen an, die in den zu untersuchenden Flüssigkeiten enthalten sind. Bei der bisher üblichen Art der Zuckerbestimmung in Urin beispielsweise verfälschte die Anwesenheit von bestimmten reduzierenden Substanzen, wie 2,5-Dihvdroxy-Benzoesäure oder Askorbinsäure im Urin die Anwesenheit von Zucker, siehe beispielsweise Feldman "Diabetes" Band 19, Kr. 5, Seiten 337 bis 3*3.

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Dies führt zu beträchtlichen Diagnosefehlern und zu einer fehlerhaften Verordnung oder NichtVerordnung von bestimmten Therapeutika. Bei Verwendung der erfindungsgemäßen Indikatoren werden die Auswirkungen von solchen Interferenzen praktisch vermieden, d.h. in der Praxis auf etwa 3$ der Wirkung verringert, die bei den bekannten Indikatoren·eintritt.

Auf Enzymen basierende Reagenzkompositionen für die Bestimmung von Glukose in Glukose enthaltenden Lösungen sind beispielsweise in den US-PS 2 848 308, 2 981 606, 3 164 534, 3 721 607 und 3 791 988 sowie in dem Artikel "Morin u.a., Clinical Chemistry, IO/9, 959-952 (1973)"» beschrieben, um nur einige wenige zu nennen. Obgleich viele dieser Zusammensetzungen dazu verwendet werden können, die erfindungsgemäßen Indikatoren herzustellen, werden vorzugsweise Glukose-empfindliche Reagenzien verwendet, die aus erfindungsgemäßen Zusammensetzungen bestehen. Die neuen erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind besonders vorteilhafte Reagenzien für die quantitative Bestimmung von Glukose, wirken sehr schnell, haben eine vorhersehbare, verbesserte Lagerungsstabilität und verringern die Größe des Einflusses von Fremdsubstanzen auf etwa J>% des Wertes, der bei den bekannten Indikatoren und Zusammensetzungen auftritt. Obgleich das Verhältnis von äquivalenten Proportionen von reduzierender oder entgegenwirkender Verbindung zu äquivalenten Proportionen der festzustellenden Glukose im Bereich von etwa 1:1 bis 5*·! variieren kann, sollte dieses Verhältnis vorzugsweise im wesentlichen stoichiometrisch sein. Unter stoichiometrisch werden die Mengen verstanden, die im wesentlichen in der gleichen Proportion sind wie das chemisch äquivalente Gewicht für die reagierenden Spezies. Wenn die erfindungsgemäßen Kompositionen verwendet werden, ist dieses Verhältnis im wesentlichen stoiehiometrisen, d.h. und daher vorhersagbar und bei der Herstellung leicht au überwachen. Außerdem kann nur bei Verwendung der erfindungsgemäßen bevorzugten Kompositionen die verhältnismäßige Abwesenheit einer Interferenz von reduzierenden Substanzen, die im.

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Urin vorhanden sein können und große Mengen von Glukose nicht erkennbar machen, festgestellt werden.

Der erfindungsgemäße Indikator zur quantitativen Peststellung von in biologischen Flüssigkeiten gelösten Stoffen besteht aus einem Träger und einer Mehrzahl von Indikatorreagenzien für diese Stoffe, von denen jede in einer eigenen Zone des Trägers angeordnet ist und von denen zumindest zwei die Anwesenheit einer unterschiedlichen Konzentration des Stoffes in der Lösung, beispielsweise durch Sichtbarmachung von geeigneten Symbolen einschließlich Ziffern, anzeigen.

Die Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Indikatoren.

Die Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Peststellung der Konzentration einer chemischen Verbindung in einer Lösung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein erfindungsgemäßer Indikator in die die Verbindung enthaltende Lösung eingetaucht, dann aus der Lösung herausgenommen und schließlich die angezeigte Konzentration der chemischen Substanz direkt von dem Indikator abgelesen wird. Dieses Verfahren ist besonders vorteilhaft für die Peststellung der Konzentration von Glukose in einer Lösung.

Die Erfindung umfaßt auch neue Glukose-anzeigende Zusammensetzungen, welche umfassen: Glukose-Oxidase; Meerettich-Peroxidase; eine Verbindung, die bei Oxydation durch Wasserstoffsuperoxyd in der Gegenwart von Meerettich-Peroxidase eine Farbe erzeugt; eine Gegenwirkverbindung aus der Gruppe bestehend aus Indoxylsulfat, Harnsäure, 3,4-Dihydroxy_jjiandelsäure, 3-Methoxy-4-Hydroxymandelsäure; 3,4-Dihydroxyphenylessigsäure; 3-Methoxy-4-Hydroxyphenylessigsäure; 3,4-Dihydroxyphenylalanin; 3-Methoxy-4-Hydroxyphenylalanin; 5-Hydroxyindol-3-Essigsäure; 5-Hydroxyindol-2-Carboxylsäure; 5-Hydroxytryptophan; Kreatinin; 2,5-Dihydroxypheny!essigsäure; o-Hydroxytyramin; 5-Hydroxytryptamin; und 2,5-Dihydroxybenzoftsäure; und eine Puffer-Verbindung,

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die den pH-Wert der Glukose-anzeigenden Zusammensetzung im Bereich von etwa 4 bis etwa 6 in der Gegenwart von biologischen Flüssigkeiten» wie Blut, urin» Tränen, Speichel und dergleichen,

Der Ausdruck ^trGegenwirkverbindung^K wie er in der Beschreibung und in den Ansprüchen verwendet wird, bedeutet eine Verbindung, die in gewisser Meise die Ansammlung von oxydiertem Indikator bis zu einem Zeitpunkt verhindert» zu welchem die Verbindung in der Reaktion vollständig verbraucht ist. Eine bevorzugte Gegenwirkverbindung ist 2_s5-0ihydroxybenzoesäure_ai die der Einfachheit halber im folgenden mit ^w2,5-DHBS" bezeichnet wird.

Weitere Einzelheiten und Merkmale 5er Erfindung ergeben sieb. aus den Ansprüchen sowie s.«e -Ιέ" fzLr-=ni~n Besztrzzhimg, in. Verbindung mit den Zeichnungen.

Fig. 1 ist eine perspektivische Darstellung eines erfindungsgemäßen Indikators nach dem Eintauchen in eine Glukose enthaltende Lösung;

Fig. 2 ist eine perspektivische Darstellung eines anderen erfindungsgemäßen Indikators nach Gebrauch;

Fig. 3 ist eine perspektivische Darstellung eines dritten erfindungsgemäßen Indikators nach Gebrauch;

Fig, Ha_; %'a 4s ν&Λ %£ sind perspektivische Darstellungen eines vierten, srfindungsgemäßen Indikators mit verschiedenen Anzeigen nach Eintauchen in verschiedenen ßlukose-enthaltenden Lösungen;

Fig. 5 ist eine perspektivische Darstellung eines fünften bevorzugten Indikators gemäß der Erfindung nach dem Eintauchen in Glukose enthaltenden Urin;

Fig. S ist ein Querschnitt entlang Linie 6-6 in Fig. 5₉ und

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Pig. 7 ist eine perspektivische Ansicht eines sechsten Ausführungsbeispiels der Erfindung.

Die erfindungsgemäßen Indikatoren sind verhältnismäßig einfache Vorrichtungen, die einmal benutzt und dann weggeworfen werden. Man könnte sie daher als "Einweg"-Indikatoren bezeichnen. Obgleich ihr wichtigster Gebrauch die Bestimmung des Glukosegehalts im Urin und im Blut von Säugetieren ist, sind sie nicht auf diese Anwendung beschränkt, sondern sie können grundsätzlich dazu verwendet werden, die Anwesenheit und Konzentration von jeder Substanz in jeder biologischen Flüssigkeit festzustellen. Durch die Auswahl geeigneter Reagenzien können die erfindungsgemäßen Indikatoren zur Peststellung der Konzentration von Ketonen, Albumin, Stickstoff usw. in Urin oder Harnstoff, Kalzium, Protein, Albumin, Cholesterin, Triglyzeride, Alkaliphosphatase, Bilirubin, Harnsäure usw. in Blutplasma oder Blutserum verwendet werden.

Die erfindungsgemäßen Indikatoren weisen einen Träger auf, der eine Mehrzahl von spezifischen Reagenzien enthält. Der Träger ist nicht kritisch in dem Sinn, daß er aus einem bestimmten Werkstoff bestehen muß, obgleich im folgenden einige bevorzugte Stoffe beschrieben werden. Allgemein kann gesagt werden, daß der Träger aus jedem Material bestehen kann, das in der Lage ist, das Reagenz so zu halten, daß es mit der zu untersuchenden Lösung in Berührung kommt. Spezielle Beispiele von Trägern sind Gewebe, Stäbe, Streifen, Späne, Blätter, Stangen und dergleichen Formen aus Glas, Metall, Holz, Papier, Polymerisaten wie Polyäthylen, Polypropylen, Polyalkyl-Azetat, Polykarbonat und dergleichen, Textilien und dergleichen. Bevorzugte Stoffe sind die saugfähigen Stoffe, die mit Lösungen der Reagenzkompositionen getränkt werden können, wie Filterpapier, Löschpapier und dergleichen.

Die Reagenzkomponenten der erfindungsgemäßen Indikatoren werden vorzugsweise in flüssiger Form hergestellt zwecks Ablagerung auf dem Träger. Nach dem Aufbringen auf den Träger werden die

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in Lösung befindlichen Reagenzkompositionen getrocknet, um ein Anhaften der Kompositionen am träger zu erreichen. Wenn der Träger aus einem saugfähigen Material besteht, wird die Lösung aufgesaugt und die Reagenzkompositionen verbleiben nach dem Trocknen im Inneren des Materials sowie an dessen Außenfläche, üblicherweise angewandte inerte Füllstoffe, Bindestoffe, die Oberflächenspannung vermindernde Mittel und dergleichen können, wenn nötig, in die Reagenskompositionen eingefügt werden. BestiBfflte Bindemittel wie Harzklefestöffe werden vorteilhaft in die Reagenzkoiapositionen eingeführt, um ihre Haftung an nicht porösen Trägern aus Metall, Glas oder nicht porösen polymeren Materialien zu verbessern,

Es ist wünschenswert, daß die Farbänderung in jeder Anzeigezone des Indikators klar, scharf, eindeutig und stark positiv sein soll. Es wurde festgestellt, daß der Genauigkeitsgrad, mit welchem die erfindungsgemäßen Indikatoren entsprechend diesem Wunsch funktionieren, in Beziehung steht mit dem Verhältnis des Volumens der auf den Träger aufgebrachten Reagenzlösung zum Volumen der Testlösung, die während des Eintauchens des Indikators in die Testlösung von dem Reagenz aufgenommen wird. Die besten Ergebnisse wurden in Bezug auf Genauigkeit dann erzielt, wenn dieses Verhältnis etwa ί:ί war. Je weiter man von diesem optimalen Verhältnis abweicht, desto größer wird der Verlust an Genauigkeit in Bezug auf die Indikatoranzeige.

Um dieses oben beschriebene bevorzugte Verhältnis zu erreichen, ist es notwendig, daß eine bestimmte Zone des bevorzugten saugfähigen Trägers mit dem in einem Lösungsmittel gelösten Reagenz voll gesättigt wird. Das Lösungsmittel wird dann verdampft. Nach Eintauchen in die zu untersuchende biologische Lösung nimmt das saugfähige Material an der Stelle, an der sich das Reagenz befindet, im allgemeinen ein Volumen der Testflüssigkeit auf, welches äquivalent dem Volumen des verdampften Lösungsmittels ist, wodurch das gewünschte 1:1 Verhältnis erreicht wird. Wenn jedoch der Bereich der Reagenz-Imprägnierung nicht so iso-

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liert ist, daß ein Platz von präzisem und bestimmbarem Volumen geschaffen ist, kann das Reagenz beim Eintauchen in die Testlösung über die Stelle der ursprünglichen Ablagerung hinausgetragen werden. Dies hat eine Verdünnung des Reagenz und damit eine Veränderung ihres Verhältnisses zu der absorbierten Testlösung während des Testes und schließlich eine Abweichung von den gewünschten, vorstehend erwähnten 1:1 Verhältnis zur Folge. Demzufolge haben bevorzugte Ausführungen des erfindungsgemäßen Indikators mit einem saugfähigen Träger eine Mehrzahl von Indikatorreagenzplätzen, die voneinander durch nichtabsorbierende oder hydrophobe Stoffe getrennt sind, so daß jeder Platz vorzugsweise annähernd gleiche Volumina des zur Ablagerung des Reagenz verwendeten Lösungsmittels sowie der zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit absorbiert. Die bevorzugte Ausführung kann beispielsweise dadurch hergestellt werden, daß eine Mehrzahl von saugfähigen Körpern, von denen jeder mit einem Reagenz von unterschiedlicher Empfindlichkeit gegenüber dem zu untersuchenden Stoff imprägniert wurde, an einer anderen Stelle eines hydrophoben Trägers, beispielsweise eines kompakten Streifens aus einem Polymerharz wie Polyäthylen, Polypropylen usw. befestigt wird. Nach Eintauchen eines solchen Indikators in die Testlösung wird ein präzises Volumen der Testflüssigkeit an der Stelle, an der sich das Indikatorreagenz befindet, absorbiert, welches dann im wesentlichen auf die gleiche Konzentration verdünnt wird, in welcher sie sich befand, als sie mit dem Lösungsmittel auf dem Körper abgeschieden wurde. Kennzeichnend für derartige bevorzugte Indikatoren sind insbesondere diejenigen gemäß Fig. 2 und 3·

Die Reagenzkomponenten der Indikatoren können bekannte Reagenzien für die quantitative Bestimmung der zu analysierenden Substanzen sein, welche eine sichtbare Anzeige geben, wenn sie spezifischen Konzentrationen einer solchen Substanz in einer Lösung ausgesetzt sind. Eine Mehrzahl von derartigen Reagenzien wird auf den Träger aufgebracht, und zwar jeder an einer anderen Stelle des Trägers, wobei zumindest zwei der Reagenzien eine Anzeige

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von verschiedenen Konzentrationen der Substanz in der Lösung geben. Solche Reagenzien und die Mittel zu ihrer Herstellung sind in Bezug auf den Glukosetest allgemein bekannt. Beispiele für Reagenzien, die dazu verwendet werden können, um Glukosekonzentrationen zu bestimmen, sowie Verfahren zu ihrer Herstellung sind in der US-PS 2 893 844 beschrieben. Im allgemeinen enthalten derartige Reagenzien ein Enzym, welches Glukoseoxidaseaktivität hat; Peroxidase; einen Indikator, der in der Gegenwart von Wasserstoffsuperoxyd und Peroxidase eine Farbänderung durchführt; und eine Verbindung, welche in gewisser Weise die Ansammlung von oxydiertem Indikator bis zu einem Zeitpunkt verhindert, zu welchem diese Verbindung in der Reaktion vollständig verbraucht ist. Diese Verbindung kann ein Reduktionsmittel sein, das ausreichend reaktiv ist, um den oxydierten Indikator, der bei der enzymen Konversion gebildet wurde, zu reduzieren. Eine solche Verbindung ist zum Beispiel Askorbinsäure. Andere derartige Verbindungen sind in der US-PS 2 893 844 beschrieben.

Eine alternative Methode zum Erreichen des gleichen Effektes ist in der Veröffentlichung "Screening Method for Glucose of Blood Serum Utilizing Glucose Oxidase and an Indophenol Indicator" von Leonard Dobrick, J. Biol. Chem. 1958, Seiten 403 bis 409, beschrieben.

Bevorzugte Reagenzien zur Verwendung in der Herstellung der erfindungsgemäßen Indikatoren zur Peststellung von Glukosekonzentrationen sind diejenigen, welche die vorher beschriebenen erfindungsgemäßen Kompositionen bilden. Die erfindungsgem_äßen Kompositionen werden dadurch hergestellt, daß Glukoseoxidase; Peroxidase; eine Gegenwirkverbindung; eine Verbindung, welche bei Oxydierung durch Kontakt mit Wasserstoffsuperoxyd in Gegenwart der Peroxydase eine Farbe erzeugt; und eine Pufferverbindung, welche den pH-Wert der Reagenzkomposition im Bereich von etwa 4 bis etwa 6 in der Gegenwart von biologischen Flüssigkeiten hält j miteinander gemischt werden.

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Die bevorzugte Glukoseoxydase, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Kompositionen verwendet wird, ist eine Glukoseoxydase, die aus Formen erhalten wird. Solche Glukoseoxydasen sind allgemein bekannt, siehe beispielsweise US-PS
2 981 606.

Peroxidase ist ebenfalls eine allgemein bekannte Klasse von
Enzymen, und jede der bekannten Peroxidasen, wie diejenigen,
die in der US-PS 2 981 606 beschrieben sind, kann zur Herstellung der erfindungsgemäßen Kompositionen verwendet werden.
Meerrettich-Peroxidase ist eine bevorzugte Peroxidase zur Herstellung der erfindungsgemäßen Indikatoren.

Verbindungen, welche eine Farbe entwickeln, wenn sie durch Wasserstoffsuperoxid oxidiert werden, sind ebenfalls bekannt, beispielsweise aus den US-PS 2 981 606 und 3 721 607. Diese Patente beschreiben farbenbildende Substanzen, welche in der Gegenwart von Wasserstoffsuperoxyd und Peroxidase eine Farbe erzeugen. Beispiele von derartigen Verbindungen, welche bei den Glukoseindikatoren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind:

1. Monoamine wie Anilin und seine Derivate, Ortho-Toluidin,
Para-Toluidin usw.;

2. Diamine, wie Ortho-Phenyldiamin, Ν,Ν'-Dimethyl-Para-Phenyldiamin, Ν,Ν'-Diäthyl-Phenyldiamin, Benzidin (das eine blaue oder eine braune Farbe erzeugt), Dianisidin (das grün oder
braun wird), usw.;

3. Phenole, wie Phenol selbst (erzeugt eine gelbe Farbe), Thymol, Ortho-, Meta- und Para-Cresole (die eine grün-gelbe Farbe, eine roga Farbe bzw. eine milchartige Suspension ergeben), Alpha-Naphthol (das eine fuchsinrote Farbe erzeugt), Beta-Naphthol (das eine weiße Ausfällung ergibt), usw.;

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4. Polyphenole, wie Katechine, Guajakol (das eine orange Farbe bildet), Orzin, Pyrogallol (das eine rötliche oder gelbe Farbe bildet), p, p-Dihydroxydiphenyl und Phlorogluzin;

5. Aromatische Säuren, wie Salicylsäure, Brenzcatechin und Gallussäure;

6. Leuko-Farben, wie Leukomalachitgrim (zur Erzeugung von Malachitgrün) und Leuteophenölpfatnalein {zweekmSJdgerweise angewandt in alkalischem Medium);

7* Farbige Farbstoffe, wie 2,6-Dichlorphenolindophenol;

8. Verschiedene biologische Substanzen, wie Adrenalin, die Flavone, Tyrosin, Dihydroxyphenylalanin (das eine orange-rötliche Farbe gibt) und Tryptophan; und

9. Andere Substanzen wie Gua^eharz, Nadi-Reagenz (erzeugt eine bläuliche Farbe), Kalium-, Natrium- und andere wasserlösliche Jodverbindungen und Bilirubin (erzeugt eine grünliche Farbe).

Pufferlösungen, die bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendet werden können, sind allgemein bekannt und enthalten beispielsweise Mischungen von Natriumphosphat mit Natriumphosphatmonohydrat und Mischungen von Zitronensäure mit Trinatrium-Zitrat.

Die einzelnen Bestandteile der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden unter Anwendung üblicher Techniken vermischt, vorzugsweise in der Gegenwart eines Lösungsmittels wie z.B. Wasser. Die Reihenfolge der Zumischung ist nicht kritisch, obgleich vorzugsweise die Gegenwirkverbindung zuerst zugefügt wird. Die Lösungen der erfindungsgemäßen neuen Kompositionen können dann dazu verwendet werden, um die Kompositionen auf Träger aufzubringen, und die erfindungsgemäßen Indikatoren herzustellen.

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Repräsentative bevorzugte erfindungsgemäße Kompositionen haben die folgenden Bestandteile: Etwa 40 oder mehr IE von Glukoseoxidase, etwa 60 oder mehr Purpurogallineinheiten von Peroxidase, zwischen etwa 0,05 und etwa 15 mg der Verbindung, welche bei Oxydation eine Farbe bildet, und etwa 0,01 bis etwa 5>0 mg der Gegenwirkverbindung, und zwar alles pro 100 Mikroliter Reagenz. Die Pufferlösung wird in ausreichender Menge zugegeben, um die Reagenzkomposition auf einen pH-Wert zwischen 4 und 6 in der Gegenwart von biologischen Flüssigkeiten zu halten.

Die genaue Konzentration von Glukose in der Lösung, die durch einen Farbwechsel während der Reaktion der Reagenzkompositionen der Erfindung angezeigt wird, ist bestimmt durch den Anteil der Gegenwirkverbindung, die bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Kompositionen verwendet wurde. Die Anzeige einer Mindestkonzentration von Glukose erfolgt, wenn eine gegebene Proportion der Gegenwirkverbindung durch Reduktion der Indikatorfarbe verbraucht ist. Durch Veränderung der Proportion der Gegenwirkverbindung kann man Reagenzkompositionen herstellen, welche verschiedene Mindestkonzentrationen der in Lösung befindlichen Glukose anzeigen. Die richtige Proportion von Gegenwirkverbindung, die nötig ist, um eine Reagenzkomposition zu erhalten, die die Anwesenheit einer spezifischen Konzentration von in Lösung befindlicher Glukose anzeigt, kann mathematisch berechnet oder empirisch bestimmt werden und steht in Beziehung zu der Menge von Glukose, die normalerweise in der üblichen stoichiometrischen Weise reagiert.

Die folgenden Beispiele beschreiben die Art und das Verfahren zur Herstellung und zur Verwendung der erfindungsgemäßen Indikatoren, ohne daß die Erfindung auf diese Beispiele beschränkt sein soll. Alle Teile sind Gewichtsteile, wenn nicht anders angegeben.

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Beispiel 1

A) In ein Gefäß werden eingefüllt: 300 Mikroliter einer Lösung von Glukoseoxidase (Glukoseoxidase aus Formen mit einer Aktivität von 1200 IE/ml), 150 Mikroliter einer Lösung von Meerrettichperoxidase (hergestellt durch Auflösung von 37 _a 5 Milligramm Meerrettichperoxidase in 1,0 Millilitern von 0,01M Zitratpuffer (pH 5,5)), 300 Mikrolitern von 2,2'-Azino-di-(3-Äthyl-Benzothiazolin-6-Sulphonsäure) in Lösung (hergestellt durch Auflösung von 50 Milligramm dieser Verbindung in 1,0 Milliliter von O,1M Zitratpuffer, pH 5,5), 50 Mikroliter von l%iger Arbeitslösung von 2,5-DHBS, (siehe unten unter B), wobei diese Menge ausreicht, um insgesamt 1,250 Mikroliter zu bilden. Die Bestandteile werden innig gemischt, um eine Glukose anzeigende Reagenzlösung zu erhalten.

B) In einem Gefäß werden 0,5 Gramm von 2,5-DHBS in 4 Millilitern Wasser aufgelöst. Dem Brei wird unter Rühren eine Lösung aus 20/Sigem Natriumhydroxid in Wasser zugegeben, bis sich eine klare Lösung ergibt. Diese wird als 10#ige Lösung auf Lager genommen. Eine l#ige Arbeitslösung, die vorstehend unter

A) erwähnt wurde, wird durch entsprechende Verdünnung mit O,1M Zitratpuffer pH 5,5 erzeugt.

C) Vier getrennte Gefäße werden jeweils mit 75 Mikrolitern der ReagenzlösTing gemäß A) gefüllt. In jedes Gefäß werden unter Rühren verschiedene Proportionen der l$igen 2,5-DHBS-Lösung gemäß B) und unterschiedliche Mengen von Pufferlösung wie in A) beschrieben, zugegeben, um Glukose anzeigende Reagenzlösungen zu erzeugen, von denen jede, wenn sie verschiedenen Minimumkonzentrationen von in Lösung befindlicher Glukose ausgesetzt ist, durch einen Wechsel von im wesentlichen farblos zu farbig eine visuelle Anzeige macht. Die vier Gefäße werden durch die Buchstaben A) bis D) bezeichnet. Die Konzentration von 2,5-DHBS und Pufferlösung in jedem Gefäß und die minimale Glukosekonzentration einer Lösung, die jede Reagenzkomposition A bis D durch einen Farbwechsel anzeigt,

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sind in der nachfolgenden Tabelle I angegeben.

Tabelle I

Minimalkonz entrat ion in % der Glukose in Lösung, die nötig

Puffer 2,5-DHBS Konzentration ist, um Farbwechsel Gefäß (Mikroliter)(Mikroliter) von 2,5-DHBS zu erzeugen

A	25	O	0,3?	0,1?
B	21	4	0,752	0,25?
C	13	12	1,5%	0,5?
D	O	25	2,8?	2,02

Glukose-anzeigende Reagenzlösungen, welche für die Herstellung der erfindungsgemäßen Indikatoren brauchbar sind, werden auch dadurch erzeugt, daß im Teil a) dieses Beispiels die 2,5-DHBS durch eine äquivalente Proportion von Indoxylsulfat; Harnsäure; 3>4-Dihydroxymandelsäure; 3-Methoxy-4-Hydroxymandelsäure; 3,4-Dihydroxyphenylessigsäure; 3-Methoxy-4-Hydroxyphenylessigsäure; 3,4-Dihydroxyphenylalanin; 3-Methoxy-4-Hydroxyphenylalanin; 5-Hydroxyindol-3-Essigsäure; 5-Hydroxyindol-2-Karboxylsäure; 5-Hydroxytryptophan; Kreatinin; 2,5-Dihydroxyphenylessigsäure; o-Hydroxytramiry ersetzt wird.

oder 5-Hydroxytryptamin Beispiel II

Es wird eine Serie von fünf Sätzen von kreisförmigen Scheiben hergestellt, wobei jeder Satz aus vier Scheiben besteht und jede Scheibe aus einem Filterpapier ausgeschnitten ist und einen Durchmesser von 4 mm aufweist. Jede Scheibe in jedem Satz wird dann mit etwa 0,002 ml einer anderen der Reagenzlösungen A, B, C und D gemäß Beispiel I befeuchtet. Die feuchten Scheiben läßt man an der Luft trocknen. Jede Scheibe enthält beim Trocknen etwa 0,6 IE Glukoseoxidase, l,2pE* Peroxidase, 18 Mikrogramm Zitrat-Puffer, 24 Mikrogramm von 2,2'-Azin-di-

3E P_urpurogallin-Einheiten ₁g

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(3-£thyl-Benzothiazolin-6~Sulfosäure) und unterschiedliche Anteile von 2,5-DHBS.

Die getrockneten Scheiben jedes Satzes werden dann auf einem einzigen Papierstreifen angebracht und jede Scheibe wird entsprechend seinem Gehalt an Reagenz A, B, C und D mit a, b, c oder d bezeichnet. Vier Papierstreifen, von denen jeder einen eigenen Satz der vier Scheiben a bis d trägt, werden dann jeweils in eine von vier wässrigen Lösungen eingetaucht, die 0,1$, 0,25$, 0,5 bzw. 2% Glukose enthalten. Der fünfte Streifen ist ein Kontrollstreifen und wird in destilliertes Wasser getaucht. Jeder Streifen wird etwa eine Sekunde lang in die Lösung getaucht und dann herausgezogen. Innerhalb etwa einer Minute nach dem Eintauchen wird jeder Streifen auf einen Parbwechsel in den Scheiben beobachtet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II angegeben, wobei die ange gebene, in jeder Scheibe enthaltene Menge von 2,5-DHBS rechne risch ermittelt wurde.

Tabelle II

Menge von 2.5-

Streifen % Glukose in DHBS (in 10~° g) Parb-Nr. Testlösung Scheibe pro Scheibe wechsel

a 0,6 ja

b 1,4 nein

c 3,0 nein

d 5,6 nein

0,25$

a 0,6 ja

b 1,4 ja

c 3,0 nein

d 5,6 nein

0,5%

a 0,6 ja

b 1,4 ja

c 3,0 ja

d 5,6 nein

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Tabelle II (Fortsetzung)

	Testlösung	Scheibe	Menge von 2,5	g)	Farb
	2,02		DHBS (in 10"6		wechsel
Streifen % Glukose in		a	pro Scheibe
Nr		b			Ja
4		C	0,6		Ja
		d	1,4		Ja
	(Kon- 0,0%		3,0		Ja
	trolle)	a	5,6
		b			nein
5		C	0,6		nein
		d	1,4		nein
		3,0		nein
		5,6

Die festgestellten Farbänderungen waren durch ein starkes und deutlich erkennbares Dunkelwerden erkennbar. Die Anzeigen blieben mindestens 72 Stunden lang stabil, im Gegensatz zu den handelsüblichen Glukose-Indikatoren, die im allgemeinen innerhalb von Minuten ausgewertet werden müssen.

Verschiedene erfindungsgemäße Indikatoren sowie ihre Herstellung werden im folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben.

In Fig. 1 ist ein erster erfxndungsgemäßer Indikator 20 in perspektivischer Ansicht dargestellt. Der Indikator 20 weist einen streifenförmigen Träger 20 auf, der vorzugsweise aus einem saugfähigen Material, wie Filter- oder Löschpapier besteht. Der Streifen 18 ist mit Reagenzien 11, 12, 13 und 14 in der Form der Zahlen 1, 2, 3 und 4 imprägniert. Die Reagenzie 11 hat die Zusammensetzung A von Beispiel I und zeigt durch einen Farbwechsel an, wenn eine Mindestkonzentration von Glukose von 0,1$ in einer Lösung enthalten ist, die mit den Reagenz in Kontakt gebracht wird. Die Reagenzien 12, 13 und 14 entsprechen den Reagenzzusammensetzungen B, C und D von Beispiel I und zeigen Glukose-Mindestkonzentra-

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tionen von 0,25%, 0,5*'und 2,0% in einer Lösung an. Selbstverständlich kann die Imprägnierung durch die verschiedenen Reagenzien auch andere Formen als die angegebenen Zahlen 1 bis 4 annehmen. Beispielsweise kann die Imprägnierung durch die Reagenzie 11 in Form von "0,l#", diejenige durch das Reagenz 12 in der Form von "0,25$" usw. erfolgen, um die vorhandene Glukose-Konzentration direkt ablesen zu können. Andererseits ist es üblich, eine 0,l$ige Konzentration von Glukose in Urin als "plus 1", eine O,25#ige Konzentration als "plus 2", eine O,5#ige Konzentration als "plus 3" und eine 2#ige Konzentration als "plus 4" zu bezeichnen.

Vor der Benutzung sind die Symbole 1, 2, 3 und 4 in der Ausführung gemäß Fig. 1 unsichtbar oder aufgrund einer geringfügigen Färbung oder Entfärbung auf dem Streifen 18 schwach sichtbar. Die gestrichelten Linien, welche die Zahlen 3 und 4 darstellen, sollen zeigen, daß die Zahlen 3 und 4 ursprünglich nicht klar sichtbar sind. Wenn der Streifen jedoch in eine Glukoselösung eingetaucht wird, reagieren die Reagenzien chemisch und erzeugen eine Farbe. Wenn die Glukosekonzentration in der überprüften Flüssigkeit die Mindestglukosekonzentration übersteigt, für welche das betreffende Reagenz eine Farbanzeige gibt, tritt diese Farbänderung ein. In Fig. 1 sind die Zahlen 1 und 2 in deutlichen dunklen Tönen dargestellt und sie zeigen an, daß die Glukoselösung, in welche der Indikator 20 eingetaucht wurde, eine Glukosekonzentration zwischen 0,25 und 0,5$ aufweist. Die Reagenzien 11 und 12 haben reagiert, um eine "plus 2" Konzentration anzuzeigen entsprechend der höchsten entwickelten Nummer. Die Entwicklung der Reagenzien 11 und 12 zur Erzeugung einer klaren und deutlichen Farbänderung in Form von Zahlen gibt dem Benutzer direkt Auskunft über die Mindestkonzentration an Glukose in der untersuchten Lösung. Der Benutzer braucht keinen Vergleich der Farbänderung mit einer Standard-Farbskala durchzuführen, um den Glukosegehalt feststellen zu können. Wenn die

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bevorzugte Zusammensetzung für die Reagenzien 11, 12, 13 und 14 verwendet wird, werden klare und deutliche Anzeigen der Glukosekonzentration innerhalb etwa einer Minute erzeugt. Die Anzeigen sind stabil und bleiben über eine relativ lange Zeit bestehen, so daß bis zu mindestens 72 Stunden nach dem Eintauchen und Herausziehen des Indikators aus der betreffenden Lösung der Benutzer immer wieder das Ergebnis überprüfen kann. Dies ist mit anderen bekannten Indikatoren nicht möglich.

Das Ausführungsbeispiel von Fig. 1 kann offensichtlich in vieler Hinsicht abgeändert werden, beispielsweise durch Änderung der Empfindlichkeit jeder Reagenzie, um speziellen Anforderungen zu genügen. Unterschiedliche Bereiche und Empfindlichkeiten der Indikatoren können durch Auswahl der Reagenz-Empfindlichkeiten und der Anzahl von unterschiedlichen Reagenz-Zusammensetzungen erreicht werden, die auf dem Träger angebracht werden. Obgleich der Indikator gemäß Fig. 1 besonders gut geeignet ist zur Untersuchung von Urin auf Glukosegehalt, ergibt eine geeignete Auswahl der Reagenzzusammenset zwingen des Indikationsbereiches und der Anzeigeform Indikatoren, die geeignet sind zur Untersuchung anderer biologischer Flüssigkeiten, wie Blut, Schweiß, Urin und dergleichen auf Glukose, Albumin, Ketone und andere Substanzen, die normalerweise darin festgestellt oder auch nicht festgestellt werden. Der Träger, also der Streifen 18, kann eine bestimmte Farbe haben, um entweder eine Mischfarbe mit den Reagenzzusammensetzungen vor der Benutzung zu ergeben oder um einen sehr scharfen Kontrast zu geben, wenn das Reagenz reagiert hat, um eine Anzeige zu geben.

Als Beispiel einer Abwandlung der Ausführung gemäß Fig. 1 ist in Fig. 2 ein Indikator 22 in perspektivischer Darstellung gezeigt, der einen Träger 18 gemäß dem Beispiel von Fig. 1 aufweist, auf welchem ^tfplus"-förmige Blöcke 5 aus einem saugfähigen Material aufgebracht sind. Jeder Block 5 wurde mit einer Lösung eines Reagenz 11, 12, 13 bzw. 14 entsprechend dem ersten Ausführungsbeispiel getränkt und dann vor der Be-

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festigung auf dem Träger 18 getrocknet. Wenn der Indikator 22 kurz in eine Glukose enthaltende Lösung eingetaucht wird, reagieren die in den Blöcken 5 enthaltenen Reagenzien in der vorher beschriebenen Weise, und wenn der Glukosegehalt den Mindestwert übersteigt, bei welchem eine bestimmte Reagenzie anspricht, wird in dem Block 5, der diese Reagenzie enthält, eine Farbänderung sichtbar. Durch Zählen der plus-Zeichen, welche ihre Farbe geändert haben, kann der Benutzer den Indikator direkt auswerten. Von dem Indikator 22 wird in Fig. 2 eine "plus-2" angezeigt, d.h. der Indikator war einer Lösung ausgesetzt, die zwischen 0,25 und 0,5% Glukose enthielt.

Die Ausführung von Fig. 3 entspricht derjenigen von Fig. 2 mit der Ausnahme, daß die Form der saugfähigen Blöcke 6 nicht plus- oder kreuzförmig, sondern rechteckig ist. Dieser Indikator wird in der gleichen Weise verwendet wie derjenige von Fig. 2. Seine Anzeige läßt erkennen, daß er einer Lösung mit einer Glukose-Konzentration von plus 3 ausgesetzt war, d.h. die untersuchte Lösung hatte einen Glukosegehalt zwischen 0,5? und 2%.

Die Ausführungen von Fig. 2 und 3 sind besonders vorteilhaft, wenn der Träger 18 aus einem hydrophoben Material, beispielsweise Polyäthylen, besteht. Die Blöcke 5 und 6 saugen dann beim Eintauchen in die zu untersuchende biologische Flüssigkeit ein vorbestimmtes Volumen dieser Flüssigkeit auf. Wenn die Indikatorreagenzien 11, 12, 13 und 14 durch Sättigung der Blöcke 5 und 6 in diese eingebracht wurden und dann das Lösungsmittel entfernt wurde, ist das Volumen der in die Blöcke 5 und 6 beim Eintauchen absorbierten Testlösung im wesentlichen gleich dem Volumen des Lösungsmittels, das von den Blöcken 5 und 6 zwecks Ablagerung der Indikatorreagenzien verdampft wurde. Dies ist das bevorzugte Verhältnis des Volumens des Reagenz zum Volumen der absorbierten Testlösung, welches, wie vorher beschrieben, zu einer sehr genauen Anzeige führt.

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Die Herstellung der in Pig. 2 und 3 gezeigten Indikatoren ist verhältnismäßig teuer, da saugfähige Körper bestimmter Abmessungen hergestellt, diese Körper mit einem bestimmten Volumen einer Reagenzlösung, die eine bestimmte Konzentration der Indikatorreagenzie enthält, getränkt und dann auf einem Träger getrocknet werden müssen. Durch ein erfindungsgemäßes Verfahren können sehr genaue Indikatoren entsprechend Fig. 2 und 3 hergestellt werden, wobei einige der vorstehend erwähnten Notwendigkeiten entbehrlich werden, was zu einer Verringerung der Herstellungskosten führt.

Das verbesserte Herstellungsverfahren besteht darin, daß das saugfähige Material zusammen mit dem Indikatorreagenz aufgelöst oder zu einem Brei verarbeitet wird, dann die Lösung oder der Brei auf eine» hydrophoben Träger aufgebracht und schließlich das Lösungsmittel verdampft wird, um einen Rückstand, bestehend aus trockener Mischung von Indikatorreagenz und saugfähigem Material zurückzulassen, der an dem Träger haftet. Der Brei aus saugfähigem Material und Indikatorreagenzie in einem Lösungsmittel kann dadurch erzeugt werden, daß das saugfähige Material in fein zerkleinerter Form mit dem Reagenz unter Benutzung üblicher Apparaturen gemischt wird. Beispielsweise kann ein Brei aus Zellulosepulver oder eine Lösung aus einem anderen saugfähigem Material mit den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, die in Wasser aufgelöst sind, hergestellt werden, der dann auf einen Polyäthylen-Stab aufgebracht und schließlich getrocknet wird.

Fig. 4a, 4b, 4c und 4d zeigen eine weitere Ausführungsform der Erfindung. Der Indikator ist in diesen Figuren mit 24 bezeichnet. In Fig. 4a weist der Indikator 24 einen Träger 18 wie bei den vorhergehenden Beispielen auf, der die Reagenzien 11, 12, 13 und 14 in dieser Reihenfolge enthält, wobei das Reagenz 11 in Form der Zahl 1 angebracht ist, das Reagenz 12 jedoch nicht nur in Form der Zahl 2, sondern auch in einer die Zahl 1 umgebenden Zone angebracht ist. In entsprechender Wei-

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se ist das Reagenz 13 in Form der Zahl 3 angebracht und außerdem in einer die Zahl 2 umgebenden Zone. Das Reagenz 14 ist sowohl in Form der Zahl 14 als auch in der das Symbol 3 umgebenden Zone vorhanden. Bei diesem Ausführungsbeispiel ergibt ein Eintauchen des Indikators in eine Lösung mit einem bestimmten Glukosegehalt eine numerische Anzeige der Mindestkonzentration von Glukose in der Lösung, wobei die Zahlen oder Symbole ausgelöscht werden, die eine niedrigere Konzentration von Glukose anzeigen. Der Indikator 24 in Fig. 4a zeigt nur die Zahl 1 in deutlicher Form, das bedeutet, daß der Indikator in eine Lösung eingetaucht wurde, die mindestens 0,1? Glukose, jedoch weniger als 0,25$ Glukose enthält.

Der in Fig. 4b dargestellte Indikator 24 wurde in eine Lösung eingetaucht, die zwischen 0,25 und 0,5% Glukose enthält, wie aus dem Sichtbarwerden der Zahl 2 und dem Löschen oder überdecken der ebenfalls entwickelten Zahl 1 hervorgeht. Diese Anzeige sagt dem Benutzer deutlich, daß in der untersuchten Lösung eine "plus 2" Glukosekonzentration enthalten ist. Fig. 4c veranschaulicht die Anzeige, die sichtbar wird, wenn der Indikator 24 in eine Lösung eingetaucht wurde, die zwischen 0,5 und 2,0Ji Glukose enthält, und Fig. 4 zeigt die Anzeige bei einer Lösung, die mehr als 2,0$ Glukose enthält.

Fig. 5 ist eine perspektivische Darstellung eines weiteren erfindungsgemäßen Indikators 26 nach dem Eintauchen in eine Lösung, die zwischen 0,25 und 0,5% Glukose enthält. Dieser Indikator ist besonders nützlich bei Urinuntersuchungen und er weist einen Träger 30 aus saugfähigem Material auf, der auf einen Streifen 32 aus einem steifen Material, beispielsweise einem Polymerkunststoff wie Polyäthylen, Polypropylen oder dergleichen, aufkaschiert ist. I_n den Streifen 32 sind öffnungen 35 _s 36, 37 und 38 in der Form von Pluszeichen in den Bereichen des Trägers 30 eingeschnitten, die mit den verschiedenen Reagenzien 11, 12, 13 und 14 imprägniert sind. Die verschiedenen Bereiche des Trägers 30, welche die Reagenzien 11, 12, 13 und 14 enthalten, wer-

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den also durch die öffnungen 35> 36, 37 und 38 sichtbar. Zusätzlich ist ein Bereich des Trägers 30 mit einem Reagenz 9 imprägniert, die auf einen sauren pH-Wert anspricht. Diese mit dem Reagenz 9 imprägnierte Zone des Trägers 30 ist durch die öffnung 39 im Streifen 32 sichtbar, sie dient lediglich als Kontrolle. Wenn der Indikator 26 in Urin eingetaucht wird, um dessen Glukosegehalt zu bestimmen, ergibt ein Kontakt des Urins mit dem Reagenz 9 eine Farbänderung. Der Benutzer ist dann sicher, daß alle Reagenz-Zonen unterhalb des Reagenz 9 auf dem Träger 30 in Kontakt mit dem Harn gekommen sind und demzufolge die Reagenzien 11, 12, 13 und Ik der Harnlösung ausgesetzt waren.

Fig. 6 ist ein Querschnitt entlang Linie 6-6 in Fig. 5 und zeigt im einzelnen die Anordnung des Trägers 30 hinter oder unter den Öffnungen 35» 36, 37, 38 und 39 in dem steifen Haltestreifen Diese Ausführung gibt dem Benutzer nach dem Eintauehen in Urin unverzüglich eine visuelle Anzeige des Glukosegehalts in Form von Pluseinheiten, der durch Abzählen der dunkel gewordenen Zeichen festgestellt wird. In der dargestellten Form zeigt der Indikator 26 eine "plus 2" Konzentration von Glukose an.

Fig. 7 zeigt in perspektivischer Darstellung ein sechstes Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Indikators, der besonr ders nützlich ist zur genauen Feststellung der Konzentration einer in Flüssigkeiten gelösten Substanz, die einen breiten Bereich von möglichen Konzentrationen enthalten kann. Der Indikator 70 ist beispielsweise brauchbar zur Feststellung der Glukosekonzentration in Blutproben von Säugetieren. Er weist einen durchsichtigen oder durchscheinenden Träger 72, beispielsweise ein Blatt aus durchsichtigem Zelluloseazetat, einen Film aus Polyäthylen, durchscheinendes Papier oder dergleichen auf. Auf dem Träger 72 ist eine Vielzahl von Reagenzien, wie die vorher beschriebenen Reagenzien 11, 12, 13 und 14, aufgebracht, wobei Reagenzzusammensetzung von dazwischenliegenden Empfind-

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lichkeiten zwischen ihnen angeordnet sind, wie dies in der Zeichnung dargestellt ist. Bevor die von den verschiedenen Reagenzzusammensetzungen bedeckten Zonen einer Glukose enthaltenden Lrösung-s beispielsweise Blutserum^ ausgesetzt sind, sind sie verhältnismäßig farblos* Mira nun das zu untersuchende Blutserum über die Oberfläche des Trägers 72 gestrichen , so erfahren diejenigen Reagenzien» welche hei der vorhandenen Glukose-Konsentration in der Blutprobe reagieren, eine sichtbare Farbänderung. Der Indikator 70 wird ausgewertet,, indem er entweder gegen eine Lichtquelle gehalten oder in einen Projektor mit einem Raster 75 eingesetzt wird. Dadurch wird ein Bezugsgitter projiziert, weiches durch die Projektion des Indikators 70 überlagert wird, wodurch die von dem Indikator 70 gegebene Anzeige in einem vergrößerten Bild sichtbar ist. Wenn der Indikator 70 direkt ohne Benutzung eines Liehtprojektors ausgewertet werden soll_s ist es selbstverständlich nicht nötig, daß der Träger IZ durchsichtig ist*

Das Ausführungsbeispiel gemäß Fig« 7 ist repräsentativ für eine weitere Auswertungsmöglichkeit, welche die Verwendung von optischen und elektromechanischen Einrichtungen umfaßt, welche die Auswertung der erfindungsgemäßen Indikatoren erleichtern. Wie vorher beschrieben, arbeiten die erfindungsgemäßen Indikatoren grundsätzlich auf der Basis einer Farbänderung, eines Dunkelwerdens oder eines Undurchsichtigmachens einer Zone auf dem Träger des Indikators» Die Auswertung des Indikators erfolgt durch eine Beobachtung einer bestimmten Anzahl von reagierenden oder anzeigenden Zone. Die tatsächliche Auswertung der Indikatoren kann daher mechanisch mit Instrumenten durchgeführt werden, die in der Lage sind, Symbole mittels Linsen, Spiegel, Filter, Projektoren, Detektoren und dergleichen zu zählen, die Unterscheidungen hinsichtlich Lichtdurchgang, Lichtreflexion, Lichtstreuung, elektrische Leitfähigkeit, Radioaktivität usw. machen können. Demzufolge kann die Auswertung der erfindungsgemäßen Indikatoren mechanisch mit Hilfe von Foto-Abtastern und dergleichen durchge-

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führt werden. Dieser Gesichtspunkt der Erfindung ist besonders vorteilhaft bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Indikatoren, die eine große Anzahl von verschiedenen Reagenz-Zonen aufweist, wobei jede Zone so klein ist, daß sie mit bloßem Auge nicht sichtbar ist. Der Vorteil derartiger Indikatoren
liegt darin, daß sie ein Minimum an Reagenzmaterial benötigen, sehr klein sind und Anzeigen von großer Genauigkeit über breite Bereiche von möglichen Substanzkonzentrationen in den zu untersuchenden Lösungen ermöglichen.

Die Verwendung der erfindungsgemäßen Indikatoren ist nicht auf die vorstehend beschriebenen Beispiele beschränkt. Beispielsweise können sie vor oder nach Berührung mit der zu untersuchenden Lösung Reagenzien ausgesetzt werden, die vorher nicht in
den reaktiven Zonen eingelagert waren, oder einem Trocknungsprozeß unterworfen oder anderen chemischen oder physikalischen Prozessen ausgesetzt werden, die zu dem Zweck ausgewählt wurden, das Erscheinen von visuell oder auf andere Weise feststellbaren Anzeigen zu entwickeln oder zu steigern.

- Patentansprüche - 26 -

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Claims

Patentansprüche

1., Indikator zur quantitativen Pest stellung von in biologischen ■~^ Flüssigkeiten gelösten Stoffen, gekennzeichnet durch einen Träger (18) und eine Mehrzahl von Indikatorreagenzien (11,12,13,14) für diese Stoffe, von denen jede in einer eigenen Zone des Trägers angeordnet ist und von denen zumindest zwei auf verschiedene Konzentrationen des Stoffes in der Lösung, beispielsweise durch Sichtbarmachung von geeigneten Symbolen einschließlich Ziffern, ansprechen.

2. Indikator nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger (18) aus einem hydrophoben Material besteht und die Zonen (5>6) aus einem saugfähigen Material bestehen.

3. Indikator nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien (11,12,13,14) auf dem Träger (18) in der Form von Zahlen aufgebracht sind, die der Konzentration des Stoffes, auf die sie ansprechen, entsprechen.

4". Indikator nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien (11,12,13^4) auf dem Träger (18) in der Reihenfolge ihrer Empfindlichkeit angeordnet sind.

5. Indikator nach Anspruch 1 zur Feststellung der Anwesenheit von Glukose, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien ein Enzym enthalten, das eine Glukoseoxydaseaktivität hat, sowie Peroxydase, einen Indikator, der einer Farbänderung in der Gegenwart von Wasserstoffsuperoxyd und Peroxydase unterworfen ist, und eine Verbindung, die in jeder Weise die Ansammlung von oxydiertem Indikator solange verhindert, bis die Verbindung in dieser Reaktion vollkommen verbraucht ist.

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6. Indikator nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger (30) auf einer Versteifung (32) angebracht ist, die Öffnungen (35*36,37*38) aufweist, durch welche die einzelnen Zonen des darunter liegenden Trägers sichtbar sind, wobei die Öffnungen in Form von Zahlen oder anderen Symbolen ausgeführt sind.

7. Indikator nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Versteifung (32) aus einem Streifen aus polymerem Material besteht.

8. Indikator nach Anspruch 1 zur Peststellung von Glukose, dadurch gekennzeichnet, daß auf dem Träger (30) zusätzlich in einer eigenen Zone ein Reagenz (9) angebracht ist, welches in saurer Atmosphäre einer Farbänderung unterworfen ist.

9. Indikator nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger (18) aus einem durchscheinenden oder durchsichtigen Blatt besteht.

10. Indikator nach Anspruch 1 zur Feststellung von Glukose, dadurch gekennzeichnet, daß die Indikatorreagenzien folgende Zusammensetzung aufweisen: Glukoseoxydase, Meerrettichperoxidase, eine Verbindung, die bei Oxydation durch Wasserstoffsuperoxyd eine Farbe bildet, eine der folgenden Verbindungen: Indoxylsulfat, Harnsäure, 3»4-Dihydroxy_jnandelsäure, 3-Methoxy-4-Hydroxymandelsäure; 3j4-Dihydroxyphenylessigsäure; 3-Methoxy-4-Hydroxyphenylessigsäure; 3,4-Dihydroxyphenylalanin; 3-Methoxy-4-Hydroxyphenylalanin; 5-Hydroxyindol-3-Essigsäure; 5-Hydroxyindol-2-Carboxylsäure; 5-Hydroxytryptophan; Kreatinin; 2,5-Dihydroxyphenylessigsäure; o-Hydroxytyramin; 5-Hydroxytryptamin; und 2,5-DihydroxybenzoÄsäure; und eine Puffer-Verbindung, welche in Gegenwart einer biologischen Flüssigkeit den pH-Wert der Reagenzien zwischen etwa 4 und etwa 6 hält.

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11. Indikator nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die ausgewählte Verbindung 2,5-£i&ydroxybenzoesäure ist,

12. Indikator nach Anspruch 10 _s dadurch gekennzeielmet _s daß der Anteil der Komponenten der besagten Reagenzien wie folgt ist:

mindestens 40 IE ölukoseoxydase,
mindestens 60 PE Peroxyclase.,

Oj05 bis 15 mg der farbbildenden Verbindung und 0,01 bis 5 mg der ausgewählten Verbindung, alle zusammen in einem Endvolumen von etwa 100 f€ikrolitern₅ wobei O₅Ol bis 10 Mikroliter davon auf jeder empfindlichen Zone aufgebracht sind.

13. Vorrichtung zur Bestimmung von in einer biologischen Flüssigkeit gelösten chemischen Substanz, gekennzeichnet durch

A) einen Indikator, der einen Träger und eine Mehrzahl von Indikatorreagenzien für diese Substanz aufweist, von denen jede in einer eigenen Zone des Trägers angeordnet ist und von denen jede, wenn sie der Lösung dieser Substanz ausgesetzt ist, visuell durch Dunkelwerden anzeigt, ob eine unterschiedliche Mindestkonzentration

.der Substanz in der Lösung vorhanden ist, und

B) ein Netzwerk zum Auflegen auf den Indikator, das ein Bezugsgitter aufweist, welches der Anordnung entspricht, in welcher die Reagenzien auf dem Träger angeordnet sind.

14. Verfahren zur Peststellung der Konzentration einer chemischen Verbindung in einer biologischen Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß in die Lösung ein Indikator eingetaucht wird, der einen Träger und eine Mehrzahl von Indikatorreagenzien für diese Verbindung enthält, von denen jede in einer eigenen Zone des Trägers angeordnet ist, und von denen zumindest zwei die Anwesenheit von unterschiedlichen Konzentrationen der Verbindung in der Lösung anzeigen, daß dann der Indikator aus der Lösung herausgenommen und schließlich die Anzeige ausgewertet wird«

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15· Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der in der Flüssigkeit gelösten Substanz visuell durch Abzählen der aktivierten Zonen bestimmt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die aktivierten Zonen in einem elektromechanischen Gerät gezählt werden.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Zonen linear angeordnet und dadurch gezählt werden, daß der Indikatorstreifen durch die Abtastzone eines elektromechanischen Zählwerks geführt wird, das in der Lage ist, bestimmte Zonen aufgrund ihrer Lichtundurchlässigkeit, Reflexion, Radioaktivität, Fluoreszenz, Lumineszenz, elektrische Leitfähigkeit oder andere elektromagnetische, absorbierende oder radioaktive Eigenschaften festzustellen.

18. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der in der Flüssigkeit gelösten chemischen Substanz durch visuelles Ablesen des höchsten digitalen Konzentrationswertes bestimmt wird, der durch eine aktivierte Zone angezeigt wird.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß der digitale Konzentrationswert durch eine mechanische Lesevorrichtung abgelesen wird.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 19, gekennzeichnet durch seine Anwendung auf die Bestimmung von Glukose.

21. Chemisches Analyseverfahren unter Verwendung des Indikators gemäß Anspruch 1, wobei die aktivierten Zonen in beliebiger Weise gezählt werden und das Verhältnis der gezählten Zonen für jede untersuchte Substanz zu den Zonen festgestellt wird, die gezählt werden, wenn eine Eichlösung untersucht wird.

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22. Glukose anzeigende Zusammensetzung, bestehend aus Glukoseoxydase, Meerrettichoxydase, einer Verbindung, welche bei Oxydation durch Wasserstoffsuperoxyd eine Farbe bildet, eine der folgenden Verbindungen:

Indoxy!sulfat, Harnsäure, 3,4-Dihydroxymandelsäure, 3-Methoxy-4-Hydroxymandelsäure; 3j4-Dihydroxyphenylessigsäure;· 3-Methoxy-4-Hydroxyphenylessigsäure; 3»4-Dihydroxyphenylalanin; 3-Methoxy-4-Hydroxyphenylalanin·; 5-Hydroxyindol-3-Essigsäure; 5-Hydroxyindol-2-Carboxylsäure; 5-Hydroxytryptophan; Kreatinin; 2,5-Dihydroxyphenylessigsäure; o-Hydroxytyramin; 5-Hydroxytryptamin; und 2,5~Dihydroxybenzo4säure; und eine Pufferverbindung, welche den pH-Wert der Glukose anzeigenden Zusammensetzung in der Gegenwart von biologischen Flüssigkeiten innerhalb des Bereiches von etwa 4 bis etwa 6 hält.

23. Zusammensetzung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die ausgewählte Verbindung 2,5-Dihydroxybenzoesäure ist.

24. Zusammensetzung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil der Komponenten folgender ist: mindestens 40 IE Glukoseoxydase,

mindestens 60 PE Peroxydase,

0,05 bis 15 mg der Farbe bildenden Verbindung, und 0,01 bis 5,0 mg der ausgewählten Verbindung, pro 100 Mikroliter der Pufferlösung.

25. Zusammensetzung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die ausgewählte Verbindung 2,5-Dihydroxybenzoesäure ist.

26. Verfahren zur Herstellung eines Indikators zum Messen von in Flüssigkeiten gelösten Substanzen, der einen hydrophoben Träger aufweist, auf welchem ein Indikationsreagenz

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für die Substanz gemischt mit einem saugfähigen Material aufgebracht ist, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mischung aus dem saugfähigen Material und dem Reagenz in einem Lösungsmittel für das Reagenz gemischt ist, der Brei auf den Träger aufgebracht und schließlich das Lösungsmittel verdampft wird.

27. Analysesystem nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Indikatorzonen zusätzlichen Reagenzien ausgesetzt werden, dann gewaschen, getrocknet oder einem physikalischen Einfluß, beispielsweise Hitze, an irgendeiner Stelle des Analysezyklus ausgesetzt wird, und zwar vor oder nach der Einführung der zu untersuchenden Probe.

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