DE2600526C3 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung von mit Sauerstoff unter Oxidaseeinwirkung H↓2↓O↓2↓ bildenden Substanzen und Reagens zu seiner Durchführung - Google Patents

Verfahren zur quantitativen Bestimmung von mit Sauerstoff unter Oxidaseeinwirkung H↓2↓O↓2↓ bildenden Substanzen und Reagens zu seiner Durchführung

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Description

schlechtere Brauchbarkeit im Rahmen eines derartigen Verfahrens zu erwarten war.
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich grundsätzlich für alle Bestimmungen anwenden, bei welchen HaO2 gebildet wird. Die HjiVBildung wird bei enzymatischer Katalyse durch Oxidasen bewirkt, so daß generell das Verfahren zur Bestimmung aller Substrate von Oxidasen geeignet ist Unter Oxidasen werden dabei im Rahmen der Erfindung solche Enzyme verstanden, welche ihr Substrat mit molekularem Sauerstoff unter Bildung von H2O2 zu oxidieren vermögen.
Typische Beispiele für derartige Oxidasen sind Uricase, Glucoseoxidase und Cholesterinoxidase. Die zugehörigen Substrate sind Harnsäure, Glucose bzw. Cholesterin.
CH3
-NH2 + HCHO
= CH =
Die Durchführung des Verfahrens kann nach den aus den eingangs erwähnien Literaturstellen bekannten Bedingungen erfolgen. Die Umsetzung der zu bestimmenden Substanz mit der entsprechenden Oxidase, wie Uricase, Cholesterinoxidase oder Glucoseoxidase erfolgt in der dem Fachmann hierfür bekannten Weise. Das gebildete H2O2 wird mit Methanol und Katalase umgesetzt unter Bildung von Formaldehyd und Wasser. Diese Reaktion ist ebenfalls dem Fachmann geläufig und braucht hier nicht näher beschrieben zu werden. Der gebildete Formaldehyd wird nun in Gegenwart eines Oxidationsmittels mit SMBTH umgesetzt unter Bildung eines Farbstoffes mit λ max. bei 620 und 670 nm ε ~ 60 000.
Die Reaktion der Farbsioffbildung wird durch folgende Formelgleichung wiedergegeben:
HSO3
SO3H
Beispiele für im Rahmen der Gründung besonders geeignete Oxidationsmittel sind Kaliumcy. noferrat (III), FeCI3 oder (NH4J4Ce(SO4J4. Vorzugsweise werden diese Oxidationsmittel als 0,2- bis 5%ige Lösung in verdünnter Säure, insbesondere in Schwefelsäure, eingesetzt Bei der Wahl des Lösungsmittels ist zu beachten, daß der Extinktionskoeffizient des gebildeten Farbstoffes vom pH-Wert abhängt und am stärksten in saurem Milieu bei pH-Werten unter 3 ist Vorzugsweise wird daher zwischen pH 03 und 3 gearbeitet Zur Erzielung dieses pH-Wertes wird zweckmäßig in starken Mineralsäuren, wie Schwefelsäure, Salzsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure und dergleichen gearbeitet
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagens zur quantitativen Bestimmung von mit Sauerstoff unter Oxidaseeinwirkung H2O2 bildenden Substanzen im Serum, welches eine Oxidase, Katalase, Methanol, Puffer, ein Oxidationsmittel und Säure enthält und gekennzeichnet ist durch einen Gehalt an 3-Methyl-2-(sulfonyl)-benzothiazolonhydrazon.
Das Reagens kann in trockener Form oder als Lösung vorliegen. Die jeweils verwendete Puffersubstanz ist auf die verwendeten Enzyme abgestimmt und für den am besten geeigneten pH*Wert eingerichtet Beides ist dem Fachmann bekannt Beispielsweise eignen sich bei Verwendung von Uricase mit Katalase pH-Werte zwischen etwa 7 und 9, vorzugsweise zwischen 8,0 und 8,6. Boratpuffer wird bevorzugt. Bei Cholesterinoxidase und Katalase eignen sich pH-Werte zwischen 6,0 und 8,5, vorzugsweise zwischen 63 und 73· Hier wird Phosphatpuffer bevorzugt.
Die Methanolkonzentration soll etwa 2 bis 8 Volumprozent betragen. Es können jedoch auch höhere oder niedrigere Konzentrationen geeignet sein.
js Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
A) Herstellung des erfindungsgemäß verwendeten Hydrazons
1580 ml Schwefelsäure reinst (95-93%) werden unter Eiskühlung und Rühren langsam mit 1000 ml rauchender Schwefelsäure mit mindestens 65% SO3-Gehalt versetzt Die erhaltene Mischung wird auf 0 bis VC gekühlt und mit 500 g N-methylbenzthiazolonhy drazonhydrochlorid (MBTH · HCI) portionsweise ver setzt Es wird darauf geachtet, daß die Temperatur 10 bis 13°C nicht überschreitet Die Zugabe ist nach einer Stunde beendet Danach wird noch 13 Stunden bei ca. plus 100C gerührt, bis die Lösung vollkommen klar und leicht gelb gefärbt ist
Der Ansatz wird vorsichtig auf 201 Eis gegossen und die Temperatur durch weitere Eiszugabe auf 0° gebracht Nach zweistündigem Stehen werden die gebildeten Kristalle abgesaugt, und mit kaltem, destil lierten Wasser gewaschen und diese Waschung wiederholt, bis das Waschwasser sulfatfrei ist
Zur Umkristallisation der gebildeten freien Säure wird die noch feuchte Substanz in ca. 41 destilliertem Wasser suspendiert und unter gutem Rühren mit ca.
μ 400 ml frisch bereiteter 30%iger KOH auf pH 8,0 gebracht Dabei geht der gesamte Niederschlag in Lösung. Dann wird über eine Filterhilfe (Kristalllheorit) klarfiltriert und mit IO η-Schwefelsäure unter gutem Rühren auf pH 1,5 angesäuert. Der Niederschlag wird
«>5 eine Stunde stehengelassen, abgesaugt und, wie oben beschrieben, säurefrei gewaschen. Anschließend wird im Vakuum bei 4O0C über CaCl2 getrocknet. Ausbeute: 500 bis 540 g.
Zur Herstellung des Kaliumsalzes wird die so erhaltene Säure in 1,51 heißem Wasser suspendiert und mit ca. 40C ml frisch hergestellter 30%jger KOH auf pH 8 gebracht. Die Lösung wird auf 8O0C erhitzt und mit ca. 41 Isopropanol von Siedetemperatur unter Rühren versetzt, bis eine leichte Trübung auftritt. Dann wird die Mischung im Eisbad abgekühlt und bei minus 200C zur Kristallisation gebracht. Das Kristallisat wird abgesaugt, mit Methanol gewaschen und erneut im Vakuum bei erhöhter Temperatur über CaCI2 bis zur Gewichtskonstanz getrocknet Ausbeute: 500 bis 520 g Kaliumsalz (72 - 75% der Theorie).
Beispie] 1
Bestimmung der Harnsäure
Die Reaktion verläuft gemäß nachfolgenden Gleichungen:
I. Harnsäure + O2
II. H2O2 + CH3OH
LJ ri case
Allantoin + H2O,
Katalase
-> HCHO + 2 H2O
III. HCHO + 2 SMBTH .l^
Reagenzien
1. Enzvmreagens:
Uricase > 0,12 U/ml
Katalase > 900 U/ml
0,05 M Boratpuffer pH 83
4% (v/v) Methanol
0,04% Hydroxypolyaethoxydodecan.
2. Chromogenreagens:
0,1 %ige SMBTH-Lösung in Wasser
3. Oxidationsreagens:
l%ige Kaliumcyanoferrat (Ill)-Lösung in 0,45 N-Schwefelsäure.
Die Bestimmung wird auf einem AutoAnalyzer® der Firma Technicon in folgender Weise durchgeführt. Mittels einer Schlauchpumpe wird 1 ml Enzymreagens/min in ein Fließsystem gepumpt Dem Reagens werden mittels der gleichen Schlauchpumpe 0,1 ml/min an zu bestimmender Harnsäureprobe zugefügt Das Gemisch, das mit Hilfe einer geeigneten Vorrichtung durch Luftblasen segmentiert wurde, strömt anschließend durch eine Glasspirale mit 20 Windungen. Hier laufen die Reaktionen I und II ab. Danach gelangt das Gemisch in einen Dialysator. Dieser kontinuierlich durchströmte Dialysator ist so beschaffen, daß ihn zwei Ströme, die nur durch eine semipermiable Membran getrennt sind, durchlaufen können. Moleküle mit einem Molekulargewicht unter ca. 600 dalysieren aus dem bereits beschriebenen Gemisch in eine Aufnahmelösung, die aus dem Chromogenreagens besteht, die wiederum mittels der gleichen Schlauchpumpe gefördert wird. Die Pumpgeschwindigkeit ist 1,0 ml/min. Auch dieser Fluß wird mit einer geeigneten Vorrichtung durch Luftblasen segmentiert.
Der in die Aufnahmelösung dialysierte Formaldehyd wird, nachdem das Oxidationsreagens mit einer Pumpgeschwindigkeit von 0,23 ml/min zugemischt worden ist, beim Durchfließen weiterer Glasspiralen zu dem bereits beschriebenen Farbstoff wmgesetzt. Dessen Extinktion wird bei 620 oder 670 um in einem geeigneten Photometer, das mit einer Durchflußküvette ausgestattet ist (nach Entfernung der Luftblasen), gemessen. Nach Eichung mit einem Harnsäure-Standard bekannter Konzentration lassen sich mit diesem Verfahren die Harnsäure-Konzentrationen in unbekannten Proben bestimmen. Verbindet man den
in Apparat mit einem Probengeber, so kann man 60 verschiedene Proben in der Stunde bestimmen.
Der Varialionskoeffizient bei einer Vielfachbestimmung der gleichen Probe liegt bei 1%.
Es besteht eine lineare Beziehung zwischen der
i~> Extinktion und der Harnsäure-Konzentration bis zu 20 mg/100 ml Probelösvng, womit der gesamte für die klinische Diagnostik interessante Bereich abgedeckt ist.
Führt man einen Methodenvergleich mit einer als
störungsfrei anerkannten Harnsäure-Bestimmungsmethode im Serum (N. Kageyama, Chlin. Chim. Acta 31 [1971], 421 und H. Mathies et al, Med. Clin. 69 [1974] 607) durch, so erhält man eine Korrelationsgerade der G'sichung y = 0,98* + 03: mit einem Korrelationskoeffizienten 0393. Die x-Werte repräsentieren die Vergleichsmethode, die y-Werte die der beschriebenen Methode. Das Ergebnis beweist eine sehr gute Übereinstimmung.
Beispiel 2
Cholesterinbestimmung
Die Bestimmung erfolgt, je nachdem, ob freies
Cholesterin oder Cholesterinester bestimmt werden sollen, entsprechend den nachstehenden Gleichungen ia und !bin Verbindung mit den Gleichungen Il und III von Deispief 1.
, ~l. , , · . Cholesterinesterase ™ . , . ,,-,...
la Cholestennester » Cholesterin + Fettsäuren
,. _, , , . ,„ Cholesterinoxidase , „, . , , ,. _
Ib Cholesterin+0. * 4-Cholestenon + HiOi
Reagenzien
I. F.nzymreagens:
Cholesterinoxidase > 0.07 U/ml
Cholesterinesterase > 0,07 U/ml
Katalase 900 I "ml
0.4 M Phosphat Puffer pH 7.0
4% (v/v) Methanol
0,3% Hydroxy poly ac thoxydndccii n
2. Chromogenreagens:
O,l°/oigeSMBTH-Lösung in Wasser
3. Oxidationsreagens:
I %ige FeCli-Lösung in 0,45 N-Schwefelsäure.
Der apparative Aufbau gleicht dem in Heispiel 1 beschriebenen weitgehend. Einziger Unterschied: nach Zusammenmischen der Probe und des Enzymreagens läuft die Lösung durch ein Heizbad von 37.51C. Hier laufen die Reaktionen la, Ib, Il ab. Die anschließenden Vorgänge sind denen bei der Harnsäure-Bestimmung von Beispiel 1 gleich. Bei der Durchführung der Analysen müssen die Proben I : 25 vorverdiinnt werden.
da andernfalls zu hohe F.xtinktinncn erhalten würden.
Der Bereich linearer Abhängigkeit /wischen Extinktion und Cholesterin-Konzentration geht bis 600mg Cholesterin in 100 ml Probe (Serum).
Der Variationskoeffizient bei Vielfachbestimmung der gleichen Probe liegt bei I %.
(•!in Methodenvergicich mit einer als richtig und störungsfrei angeschenen Referenzmethode (P. Roe· schlau ct. al. Z. din. them. Clin. Biochem. 12 [1974] 226) ergibt eine Korrclationsgerade der Gleichung γ = 0,98 .v + 5,4 mit einem Korrelationskoeffizienten von 0.4S. Die \-Werte repräsentieren die Vergleichsmethode und clic v-Wcrte die beschriebene Methode. Die Korrelationsgeradc beweist eine sehr gute Übereinstimmung /wischen beiden Methoden.

Claims (10)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von mit Sauerstoff unter Oxidaseeinwirkung H2O2 bildenden Substanzen im Serum durch Oberführung des gebildeten HjO2 in Gegenwart von Methanol und Katalase in Formaldehyd, Umsetzung des Formaldehyds mit einem Hydrazon in Gegenwart eines Oxidationsmittels und photometrische Bestimmung des hierbei gebildeten Farbstoffes, dadurch gekennzeichnet, daß als Hydrazon 3-Methyl-2-(sulfonyl)-benzothiazolonhydrazon verwendet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Harnsäure, Glucose bzw. Cholesterin bestimmt wird und als Oxidase Uricase bzw. Glucoseoxidase bzw. Cholesterinoxidase verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Oxidationsmittel Kaliumcyanoferrat (III), FeCb oder (NH4^Ce(SO4)* verwendet wird.
4. Verfahren nach Ansprach 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Oxidationsmittel als 0,2- bis 5°/oige Lösung in verdünnter Säure eingesetzt werden.
5. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß die Farbstoffbildung bei einem pH-Wert zwischen 0,5 und 3 durchgeführt wird.
6. Reagens zur quantitativen Bestimmung von mit Sauerstoff unter Oxidaseeinwirkung H2O2 bildenden Substanzen im Serum, welches eine Oxidase, Katalase, Methanol, Puffer, ein Oxidationsmittel und Säure enthält, gekennzeichnet durch einen Gehalt an 3-Methyl-2-(sulfonyl)-benzothiazolonhydrazon.
7. Reagens zur Bestimmung der Harnsäure, dadurch gekennzeichnet, daß es
mehr als 0,1 U/ml Uricase,
mehr als 800 U/ml Katalase,
0,02 - 0.1 M Puffer pH 7 -9,
2-8VoI.-% Methanol,
0,01—0,1% eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels und getrennt davon
0,03 - 0,5% 3-Methyl-2-(sulfonyl)-benzothiazolonhydrazon,
03-3% Kaliumcyanoferrat(III),
in verdünnter Schwefelsäure enthält
8. Reagens zur Bestimmung von Cholesterin, dadurch gekennzeichnet, daß es
mehr als 0,05 U/ml Cholesterinoxidase,
mehr als 0,05 U/ml Cholesterinesterase,
mehr als 800 U/ml Katalase,
0,2-l.OM Puffer pH 6,0-8,5,
2-8Vol.-% Methanol,
0,1—0,8% nichtionisches oberflächenaktives
Mittel und getrennt davon 0,03 - 03% S-Methyl^-isulO
thiazolonhydrazon 03-3,0% FeCI3
in verdünnter Schwefelsäure enthält
9. Reagens nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es als Puffer Boratpuffer pH 8,0 bis 8,6 enthält.
10. Reagens nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es a's Puffer Phosphatpuffer pH 6,5 bis 7,5 enthält.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von mit Sauerstoff unter Oxidaseeinwirkung H2O2 bildenden Substanzen im Serum durch Überführung des gebildeten H2O3 in Gegenwart von Methanol und Katalase in Formaldehyd, Umsetzung des Formaldehyds mit einem Hydrazon in Gegenwart eines Oxidationsmittels und photometrische Bestimmung des hierbei gebildeten Farbstoffs. Aus der FR-PS 21 98 642 ist ein Verfahren zur Bestimmung von Harnsäure durch Umsetzung mit Uricase unter Bildung von H2O2, Umsetzung des H2O2 mit Katalase und Methanol unter Bildung von Formaldehyd und Reaktion des Formaldehyds mit 3-Methylbenzothiazolonhydrazon (MBTH) und FeCl3 unter Bildung eines Farbstoffs, der photometrisch bestimmt werden kann, bekannt. Ein entsprechendes Verfahren ist aus Chem. Pharm. Bull. 17, 1304-1305 (1969) für die Glucosebestimmung unter Verwendung von Glucoseoxidase bekannt Ein Vorteil dieses Verfahrens ist die relativ geringe Störanfälligkeit gegenüber Medikamenten und sonstigen Fremdsubstanzen. Ein erheblicher Nachteil ist jedoch die geringe Stabilität von MBTH und die relativ schlechte Wasserlöslichkeit des bei der Farbreaktion gebildeten Farbstoffs. Dies führt zu relativ hohen Verschleppungen zwischen den einzelnen Bestimmungen, so daß sich das Verfahren insbesondere für die Durchführung an Analysenautomaten nur wenig eignet Dieser Effekt wird noch verstärkt, da bei dem zur Farbentwicklung
jo nötigen Oxidationsschritt Nebenreaktionen auftreten, bei denen ein unlösliches Produkt gebildet wird. In Analysenautomaten schlägt sich dieses in den Leitungen, z. B. den Schläuchen und Glasspiralen, nieder und erhöht damit die Verschleppung noch weiter. Außerdem führt dies zu einer instabilen, d. h. triftenden Basislinie.
Um dieses bekannte Verfahren trotz dieser Nachteile anwenden zu können, mußte die Analysendauer erheblich verlängert werden und eine relativ häufige Spülung der Apparatur vorgenommen werden. Die Triftanfälligkeit der Basislinie schließlich mußte in Kauf genommen werden.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, bei einem Verfahren der eingangs erwähnten Art die oben beschriebenen Nachteile zu beseitigen.
4-, Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von mit Sauerstoff unter Oxidaseeinwirkung H2O2 bildenden Substanzen im Serum durch Oberführung des gebildeten H2Oz in Gegenwart von Methanol und Katalase in
•so Formaldehyd, Umsetzung des Formaldehyds mit einem Hydrazon in Gegenwart eines Oxidationsmittels und photometrische Bestimmung des hierbei gebildeten Farbstoffes, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß als Hydrazon 3-Methyl-2-(sulfonyl)-benzothiazolonhydra zon (SMBTH) verwendet wird.
Überraschenderweise wird beim erfindungsgemäßen Verfahren ein sehr gut löslicher Farbstoff gebildet, so daß die oben beschriebenen Schwierigkeiten, die auf die Unlöslichkeit des bei der Farbstoffbildung entstehenden Oxidationsproduktes zurückzuführen sind, nicht mehr auftreten. Dies ist überraschend, da MBTH selbst eine gute Löslichkeit in wäßrigem Medium aufweist (4,8 g/ 100 ml bei pH I) und in dieser Richtung nicht zu beanstanden ist, während das erfindungsgemäß verwen-
h<; dete SMBTH eine weit schlechtere Löslichkeit als MBTH aufweist, nämlich 0,6 g/100 ml bei pH I, so daß auch von dem gebildeten Oxidationsprodukt eine noch weiter verringerte Löslichkeit und entsprechend ver-
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