DE2419362A1

DE2419362A1 - Verfahren und vorrichtung zum ermitteln der form von zellkernen

Info

Publication number: DE2419362A1
Application number: DE2419362A
Authority: DE
Inventors: Tomas Hirschfeld
Original assignee: Block Engineering Inc
Current assignee: Block Engineering Inc
Priority date: 1973-04-26
Filing date: 1974-04-22
Publication date: 1974-11-07
Also published as: CA999137A; US3907437A; FR2227532B1; GB1467056A; JPS5015458A; CH578730A5; AU6620074A; NL7403020A; FR2227532A1

Description

PATENTANWÄLTE *) -Λ Ιί-,-S? "TIh

DIPL-ING. CURT WALLACH _# „ _Λ ^ _Ä ° ^"bs^ssh a

DIPL-ING. GÜNTHER KOCH 2419362 telefon 240275

DR. TINO HAI BACH

UNSER ZEICHEN: 14 574

BLOCK ENGIHEERIlfGr, INC. Cambridge, Massachusetts, Y.St.A.

Verfahren und Vorrichtung zum Srmitteln der Form von Zellkernen

Die Erfindung betrifft allgemein das Erkennen von Mustern oder Formen und betrifft insbesondere Verfahren und Vorrichtungen zum Klassifizieren von Zellene

Die Klassifizierung einer Population von Zellen beruht gewöhnlich auf fünf optischen Parametern, die auf mikroskopischem Wege ermittelt werden, und zwar der Farbe, der Größe und der Form des Zellkerns nach dem Färben sowie der Farbe und der Größe des gefärbten Zytoplasmas. Zwar ermöglicht dieses Verfahren eine gute Klassifizierung der Zellen, doch beschränkt sich seine Anwendung in der Praxis beispielsweise auf dem Gebiet der Pathologie gewöhnlich auf eine Propenpopulation von wenigen hundert Zellen. Trotz der hochgradigen Redundanz, die- sich beim Identifizieren der Zellen ergibt, können sich bei diesem Verfahren erhebliche Fehler ergeben, da eine begrenzte Population möglicherweise keine statistisch zuverlässige Probe bildet.

Es sind bereits umfangreiche Versuche mit dem Ziel durchgeführt worden, eine Vorrichtung zu schaffen, die automatisch die gleichen Parameter erkennt, mit denen der Pathologe arbeitet. Bei manchen bekannten Vorrichtungen werden z.B. elektronische Bildröhren in Verbindung mit Rechnern benutzt, um eine Muster- oder Fofmerkennung zu

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ermöglichen. Bei solchen Vorrichtungen benötigt man g'edoch regelmäßig eine sehr große Anzahl von Auflösungselementen in Verbindung mit einem entsprechend bemessenen Kechnerspeicher, und daher sind diese Vorrichtungen gewöhnlich sehr teuer und kompliziert, und sie beanspruchen viel Raum.

lerner sind bereits mehrere automatisch arbeitende Vorrichtungen zum Klassifizieren von Zellen in Gebrauch, bei denen nicht mit Abbildungsverfahren gearbeitet wird, sondern bei denen das Klassifizierungsverfahren nur auf der Größe oder nur auf der Farbe der Zellen beruht. Bei diesen Vorrichtungen führt gedoch die regellose Orientierung der Zellen zu erheblichen Schwierigkeiten beim Messen der Zellengröße, so daß beim Klassifizieren von Zellen schwerwiegende Ungenauigkeiten auftreten können. Bei einer dieser Vorrichtungen ist versucht worden, einige dieser Schwierig» keiten durch die Anwendung von Färbeverfahren auszuschalten, die bezüglich der Enzyme bestimmter Arten von Zellen in hohem Maße selektiv sind, doch ist es hierbei erforderlich, mit lebenden Zellen zu arbeiten, die sowohl genetisch als auch stoffwechselmäßig normal sind« Daher versagt dieses Verfahren notwendigerweise bei manchen diagnostisch interessanten, pathologisch abnormen Zellen. Ferner steht dieses Verfahren zum Färben der Enzyme nicht in einer direkten Beziehung zu den gebräuchlichen Standardverfahren, so daß es vielen Pathologen als nicht akzeptabel erscheinen dürfteβ

Bis jetzt ergeben sich beim klassifizierenden Zählen der verschiedenen korpuskularen Bestandteilen von Blut mit Hilfe automatischer Verfahren verschiedene weitere Schwierigkeiten. Beispielsweise sind die verschiedenen Kategorien, denen weiße Blutkörperehen normalerweise zugeordnet werden, in einem gewissen Ausmaß insofern willkürlich, als viele Zellenmerkmale in einem Kontinuum variieren. Daher ist ine sehr genaue Beurteilung erforderlich, wenn bestimmte Zellen klassifiziert werden, bei denen es sich um Grenzfälle handelt. Hierzu kommt die Tatsache, daß die Klassifizierung gerade in Krankheitsfällen weniger eindeutig ist, d.h. gerade

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dann, wenn die Erzielung möglichst genauer Untersuchungsergebnisse erwünscht ist. Schließlich können zahlreiche Krankheiten zum Erscheinen verschiedener ungewöhnlicher Arten von Korpuskeln führen, so daß· ein Bild entsteht, das so kompliziert ist, daß eine Bedienungsperson in den Klassifizierungsvorgang eingreifen muß·

Wird unfraktioniertes Blut verwendet, muß eine sehr große Zahl von Teilchen gezählt werden, damit Gewähr dafür besteht, daß die selteneren Blutkörperchen mit hinreichender Genauigkeit gezählt werden,. Wird die Fraktionierung angewendet, ergibt sich keine vollständige Zuverlässigkeit des Verfahrens bezüglich der auszuscheidenden Teilchen sowie bezüglich der einwandfreien Gewinnung der ausgewählten Teilchen. Dies hat beim Vorliegen pathologischer Bedingungen sogar noch schwerwiegendere Folgen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahren und Vorrichtungen zu schaffen, die es ermöglichen, Zellen auf der Basis der Form ihrer Kerne zu klassifizieren, die Kernform ohne Erzeugung eines Bildes zu messen, eine solche bildlose Messung der Kernform auf eine solche Weise durchzuführen, daß bestimmte Informationen einer Vorverarbeitung unterzogen werden, so daß sich die' Benutzung großer Rechner vermeiden läßt, und die es schließlich ermöglichen, einen Formfaktor eines Zellkerns mit Hilfe einer einzigen Messung zu ermitteln»

Die Erfindung und vorteilhafte Einzelheiten der Erfindung werden im folgenden anhand schematischer Zeichnungen an Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigt:

Fig. i eine perspektivische schematische Darstellung einer Vorrichtung zum Klassifizieren von Zellen, die eine feste Lage zueinander einnehmen;

Fig. 2 eine schematische Darstellung der Schaltung einer Vorrichtung zum Klassifizieren von in einem Strom enthaltenen Zellen;

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Fig. 3 eine schematisciie Darstellung eines optischen Systems zum Gebrauch in Verbindung mit einem Teil der Vorrichtung nach Fig. 2;

Fig. 4 einen Schnitt durch einen Teil eines bevorzugten optischen Systems, das zur Verwendung als Bestandteil der Vorrichtung nach Fig. 2 geeignet ist; und

Fig. 5A und 5B Histogramme, welche die Häufigkeit verschiedener Zellen in Abhängigkeit von ihrer Lichtdurchlässigkeit erkennen lassen.

In der U.S.A.-Patentanmeldung 280 271 vom 14. August 1972 ist eine Vorrichtung beschrieben, bei der eine Einrichtung vorhanden ist, die es ermöglicht, im wesentlichen gleichzeitig die Größe von zwei verschiedenen formabhängigen Funktionen der Zelle oder ihres Kerns zu messen, und zu der eine Einrichtung gehört, die es gestattet, eine Beziehung zwischen diesen beiden Größen zu ermitteln. Beispielsweise kann man die Eigenschaft der Kugelform als den gewünschten Formfaktor betrachten, doch handelt es sich bei der Kugelform natürlich nur um ein Beispiel für eine Form, die aus mehreren willkürlich wählbaren Formen fester Körper ausgewählt worden ist. Jedoch ermöglicht die Wahl der Kugelform eine Vereinfachung der nachstehend zu gebenden Erläuterung, und sie vereinfacht die erforderlichen Berechnungen·

Bei einer genauen Kugelform ergeben sich mehrere verschiedene formabhängige Funktionen, und zwar in einem typischen Fall der Oberflächeninhalt A, das Volumen V, die mittlere Querschnittsfläche S und die mittlere Dicke T. Diese Funktionen lassen sich wie folgt ausdrucken:

A = /Td² (1)

V = ^4 (2)

T = S^ d (4)

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ORfGiNAL INSPECTED

- 5 -Hierin ist d der Kugeldurchmesser.

Der Ausdruck "Funktion" soll hier im mathematischen Sinne verstanden werden, d.h. er bezeichnet eine veränderliche Größe, deren Wert durch eine zweite veränderliche Größe bestimmt ist. Der Ausdruck "verschiedene Funktionen" bezeichnet dann mehrere Funktionen, die sich bezüglich der Gesetze unterscheiden, nach denen sie jeweils von der zweiten veränderlichen Größe abhängen.

Die Beziehung zwischen zwei beliebigen dieser form» abhängigen Funktionen läßt sich wie folgt ausdrücken:

= v

Hierin sind η und m Exponenten, die so gewählt sind, daß 'd, das in erster Linie größenabhängig ist, verschwindet. Gilt z.B. f(ä) = V, <£(d.) = S, m = 1 und η = 2/3, ist der Formfaktor V für einen Zellkern von genauer Kugelform ein leicht zu berechnender Grenzwert, der von Wert von d ziemlich unabhängig ist. Alle gemessenen Abweichungen von diesem Grenzwert sind ein Maß für die Abweichung der Form des Kerns von der willkürlich gewählten Körperform, z.B. der Kugelform, und sie bestimmen daher einen Aspekt der Form. Für den Fall, daß z.B. f(d) = V und φ CcL) = T ist, und daß man m = 1 und η = 1/5 wählt, ist leicht einzusehen, daß der Formfaktor γ wiederum einen leicht zu berechnenden Grenzwert hat, der eine Kugel darstellt, und der in Abhängigkeit von Abweichungen von der Kugelform variierte

Es liegt auf der Hand, daß sich diese Funktionen mit Hilfe verschiedener Verfahren messen lassen. Beispielsweise kann man eine Größe, die zum Volumen eines Zellkerns proportional ist, erhalten, indem man die fluoreszente Eeemission von Licht mißt, das von der Desoxyribonukleinsäure des Zellkerns absorbiert wird, oder indem man auf andere Weise den Kern bei einer Wellenlänge ausmißt, bei welcher der Kern als optisch dünn erscheint, während man eine Größe, die in Beziehung zur Oberfläche des Kerns steht,

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durch Messen des von dek Kern, zurückgestreuten Lichtes erhalten kann. Stehen solche Meßwerte zur Verfügung, kann man eine Einrichtung schaffen, die es ermöglicht, dann einen Formfaktor zu ermitteln, der proportional zu dem Verhältnis der in Beziehung zum Volumen stehenden Größe zu der in Beziehung zur Operfläche stehenden Größe ist.

Ferner ist es beispielsweise möglich, die beiden gemessenen Größen in Beziehung zur scheinbaren Dicke und zum-Volumen eines Zellkerns zu setzen und einen Formfaktor aus einem Verhältnis zwischen diesen beiden Funktionen zu gewinnen. Die Messung kann in diesem Fall unter Ausnutzung

der Iiichtabsorption oder der Fluoreszenz-Eeemission erfolgen. Die wirksame Dicke wird gemessen, indem man die auf die Selbstbeschattung zurückzuführende Verringerung des gemessenen Volumens bei Wellenlängen prüft, bei denen das Teilchen optisch als dick erscheint. Diese Verringerung hat ihre Ursache in der Nichtlinearität der Beziehung zwischen der Durchlässigkeit und der Dicke. Weitere Einzelheiten solcher Vorrichtungen sind in der weiter· oben genannten U.S.A.-Patentanmeldung beschrieben.

In vielen Fällen ist es jedoch möglich, die unabhängige Messung einer volumenabhängigen Größe zu vernachlässigen Innerhalb einer bestimmten Spezies, und wenn man mitotische Zellen vernachlässigt, haben alle Kerne ähnlicher normaler Zellen die gleiche Menge an Desoxyribonukleinsäure (DNS). Somit ist das ^rodukt aus der DNS-Konzentration und dem Kernvolumen für weitaus die Mehrzahl einzelner Zellen eine Konstante, und wenn die Messung irgendwelcher der übrigen formabhängigen Funktionen, die nicht ausschließlich vom Volumen abhängen, auf eine solche Weise durchgeführt wird, daß sie einen zur Konzentration proportionalen Faktor erfaßt, kann der gemessene TSert selbst als Maß für die Form dienen. Die wirksame Dicke, die radiometrisch bei einer Wellenlänge gemessen wird, bei der DNS im optischen Sinne dick ist, enthält gerade einen solchen Faktor und kann daher unter geeigneten Bedingungen als Maß für die Form dienen. Es liegt auf der Hand, daß sich die Kompliziertheit einer automatischen Klassifizierungsvorrichtung

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erheblich verringert, wenn man mit einem solchen auf einer einzigen Messung beruhenden Formfaktor arbeitet© Natürlich kann ein unabhängiges Maß für das ^ernvolumen immer noch erwünscht sein, damit sich das Vorhandensein abnormer oder mitotischer Zellen nachweisen läßt.

Bei der Betrachtung des Grundgedankens der Erfindung ist es ferner zweckmäßig, sich darüber klar zu werden, daß die Durchlässigkeitseigenschaften des Kerns einer Zelle nicht einfach durch die Absorptionseigenschaften der DNS bestimmt werden. Es ist nämlich nicht nur die luenge der DNS von B.edeutung, sondern die Durchlässigkeit wird auch durch Form und Lage der DNS gegenüber dem hindurchgeschickten Licht beeinflußt. Ist die Menge der DNS im wesentlichen konstant, und trifft man Maßnahmen, um den Einfluß der Lage bzw. Orientierung zu beseitigen, sind Änderungen der Stärke des durchgelassenen Signals ein Maß für die Formabweichung des Zellkerns.

Der Begriff der optischen Dicke läßt sich wie folgt erläutern: Das Gesetz von Lambert, das auch als das Gesetz von Bouguer bekannt ist, lautet wie folgt:

¹X ^{= 1}O ^e

Hierin ist I die Strahlungsintensität an einem bestimmten Nullpunkt, I die Strahlungsintensität an einem bestimmten Punkt, der vom Nullpunkt durch die Strecke χ getrennt ist, e die Basis des natürlichen Logarithmus und* der Absorptionskoeffizient in dem zwischen dem Nullpunkt und dem Punkt χ vorhandenen Medium.

Bekanntlich läßt sich die vorstehende Exponentialgleichung in Form einer Reihe ausdrücken, bei der die beiden ersten Glieder linear sind. Bei kleinen Werten des Produktes ■·* χ ergeben die linearen Glieder der Reihenentwicklung eine gute Annäherung an den Wert von I , d.h· die Durchlässigkeit ändert sich im wesentlichen linear mit den Änderungen von x. In diesem Fall wird das betreffende Medium als "optisch dünn" betrachtet. Ist jedoch der wert

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des Produktes χ so groß, daß die lineare Annäherung nicht mehr genau ist, und daß man daher ein oder mehrere bekannte lineare Glieder der lie ine zunehmen muß, um eine hinreichend genaue Annäherung zu erreichen, wird das Medium als "optisch dick" betrachtet. Die Erfindung befaßt sich mit der Fortleitung von Strahlung durch Kerne, die in Beziehung zu den verschiedenen gewählten bestimmten ΐ/ellenlängen optisch dick sind, d.h. bei denen sich die Durchlässigkeit bei Änderungen der Kerndicke nicht linear, sondern exponentiell ändert.

U_m ein Beispiel zu geben, wird die Erfindung bezüglich der Unter r-iieidung zwischen Bandzellen (band cells) und segmentierten Granulozyten in einer Zellenpopulation beschrieben. Wenn eine Bandzelle altert, teilt sich bekanntlich ihr Kern. Beispielsweise ist für die segmentierten neutrophilen Granulozyten die fortschreitende Segmentierung kennzeichnend, die gewähnlich bis zu einem Maximum von 5 Segmenten fortschreitet; eosinophile und basophile se&- mentierte Granulozyten haben gewöhnlich eine kleinere Zahl von Segmenten. Da die Segmentierung ein Zeichen für das fortgeschrittene Alter einer Zelle ist, kommt dem "Verhältnis zwischen den Bandzellen und den segmentieifcen Granulozyten häufig eine erhebliche diagnostische Bedeutung zu. Jedoch ist selbst für einen geübten Pathologen die Unterscheidung zwischen diesen beiden Arten von Zellen möglicherweise schwierig, da die Gefahr besteht, daß der ^ernaufbau durch die Zytoplasmakörner und die Orientierung des Kerns verdeckt wird.

Fig. 1 zeigt eine in erster Linie mit der B-and betätigbare Vorrichtung nach der Erfindung zum Unterscheiden morphologisch verschiedener biologischer Zellkerne in einer Population, die einem bestimmten Individuum entnommen worden ist. Die Vorrichtung nach Fig. 1 dient zum Beobachten von Zellen, die gegeneinander räumlich festgelegt worden sind.

Zu der Vorrichtung nach Fig. 1 gehören eine Strahlungsquelle 20 und ein optisches System, das im wesentlichen aus einem Filter 22 und einer Linse 24 besteht und

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nahe einer Seite eines Probenträgers 26 angeordnet ist« Das Filter 22 ist so gewählt, daß es die Strahlung der Quelle 20 nur in einem gewählten Wellenlängenbereich durchläßt. Die Strahlungsquelle 20 und die Linse 24 sind so angeordnet, daß die Strahlung der Quelle 20 in einem Punkt auf dem Probenträger 26 fokussiert wird.

Auf der entgegengesetzten Seite des ^robenträgers ist eine weitere Linse 25 angeordnet, die ebenfalls scharf auf den Probenträger eingestellt ist. Das durch die Linse 25 fallende Licht wird auf einen Strahlenteiler 28 geleitet, der bewirkt, daß sich die von der Probe auf dem Probenträger 26 durchgelassene Strahlung längs zweier Wege 30 und 32 fortpflanzt. In dem Strahlenweg 30 ist eine Betrachtungseinrichtung angeordnet, z.B. das okkular 34- eines Mikroskops, während in dem Strahlenweg 32 ein photoelektrischer Detektor 36 angeordnet ist«, Mit dem Detektor ist durch eine Leitung 4-0 ein Gerät 38 verbunden, das die von dem Probenträger 26 ausgehende Strahlung anzeigte

Der Frobenträger 26 ist auf einem bewegbaren Schlitten 4-2 bekannter Art angeordnet, zu dem eine ebene Platte gehört, die nach unten ragende seitliche Flächen oder Wände 46 und 48 aufweist. Die Seitenwand 46 ist an ihrer U_nterseite mit Zähnen 50 versehen, die mit einem Zahnrad 52 kämmen, das unter der Platte 44 angeordnet ist und mit Hilfe einer Welle 54 gedreht werden kanne Entsprechend ist die Seitenwand 48 an ihrer Unterseite mit Zähnen 56 versehen, die mit einem Zahnrad 58 kämmen, das unter der Platte 44 angeordnet ist und mit Hilfe einer Welle 60 gedreht werden kann. Die Wellen 54 und 60 sind in nicht dargestellten Unterstützungen drehbar gelagert und an ihren von den Zahnrädern abgewandten Enden mit einem Drehknopf 62 bzw. 64 versehen. Gemäß Fig. 1 ist es durch Drehen der Knöpfe 62 und 64 möglich, die Platte 44 längs der Achsen der Wellen 60 und 54 zu bewegen, so daß sich der Probenträger 26 sowohl in der Längsrichtung als auch in der Querrichtung hin- und herbewegen läßt, damit man einzelne Zellen auf eine noch zu erläuternde Weise untersuchen kann.

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Fig. 2 zeigt eine"Vorrichtung, die es ermöglicht, automatisch Beobachtungen an Zellen durchzuführen, die in einem Strom enthalten sind, welcher sich gegenüber einem Beobachtungspunkt bewegt. Zu dieser Vorrichtung gehört eine Quelle 66 für eine Zellenprobe, die durch eine Rohrleitung und ein Ventil 70 mit einer Mischkammer 72 verbunden werden kann« Die Mischkammer 72 kann ihrerseits über eine Kohrleitung 74- und ein Ventil 76 mit einer Quelle 78 für ein Färbebad verbunden werden. Der Ausgang der Mischkammer 72 ist an eine Verdünnungskammer 80 angeschlossen und bildet den einen Eingang der Verdünnungskammer. Ein zweiter Eingang der Verdünnungskammer 80 kann über eine Bohrleitung und ein Ventil 84- mit einer Quelle 86 für eine Verdünnungsflüssigkeit verbunden werden.

Das der Quelle 86 entnommene, mit Hilfe des Ventils dosierbare Verdünnungsmittel ist vorzugsweise so-gewählt, daß es für die Zwecke d,er Erfindung mehrere vorbestimmte Eigenschaften besitzt. Insbesondere soll das Verdünnungsmittel dann, wenn es der der Mischkammer.72 entnommenen gefärbten Zellensuspension dosiert zugesetzt wird,, eine Abstimmung der Brechungsindizes des Zellenzytop? ^- -mas und des Flüssigkeitsgemisches bewirken; da es sehr erwünscht ist, in der Küvette eine im wesentlichen laminare Strömung bei einer hohen Durchflußgeschwindigkeit aufrechtzuerhalten, muß das Verdünnungsmittel ferner so gewählt sein, daß es dann, wenn es der Zellensuspension dosiert zugesetzt wird, dem Strom eine solche Viskosität verleiht, daß ein laminares Strömen der Flüssigkeit mit hoher Geschwindigkeit möglich ist. Schließlich muß das Verdünnungsmittel so gewählt sein, daß sich beim Zufügen zu der Zellensuspension ein optimaler osmotischer Druck gegenüber den Zellen ergibt, damit die Stabilität der Zellen erhalten bleibt. In manchen Fällen kann man Pumpen vorsehen, damit sich in der Küvette eine hohe Durchflußgeschwindigkeit erzielen läiij. In einem solchen Fall kann das Verdünnungsmittel auch dazu dienen, den osmotischen Druck einzustellen und hierdurch den durch die Pumpen erzeugten hohen statischen Druck auszugleichen.

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Der Flüssigkeitsausgang der Verdünnungskammer 80 ist mit einer Pumpe 88 verbunden, deren Druckseite vorzugsweise an eine zentral angeordnete Einspritzdüse 90 angeschlossen ist, die zu einer Küvette 92 gehört", in welcher der die Probe enthaltende Strom von einem Schutzstrom umgeben ist. Die Küvette 92 kann z.B. so ausgebildet sein, daß sie wie in der Zeitschrift "Nature", 3- Januar 1953* S. 37 in dem Aufsatz von P. Crosland-Taylor beschrieben ist, welcher den Titel "A Device for Counting Small Particles suspended in a Fluid through, a Tube" trägt. Der die zentral angeordnete Düse 90 umgebende Eingraum 94- ist an die Druckseite einer zweiten Pumpe 96 angeschlossen, deren Saugseite mit einer Quelle 98 für die Schutzflüssigkeit verbunden ist. Die Düse 90 und der Eingraum 94 befinden sich am einen Ende der Küvette 92, und der verbleibende Teil der Küvette ist im wesentlichen in Form eines Rohrs oder eip.es anderen langgestreckten, nach außen abgeschlossenen Strömungskanals ausgebildet, der einen optisch durchsichtigen Abschnitt besitzt.

Beim Gebrauch des soeben beschriebenen Teils der Vorrichtung nach Fig. 2 wird die in einer Flüssigkeit suspendierte Zellenprobe zuerst in der Kammer 72 mit einer der Quelle 78 entnommenen konzentrierten Färbstofflösung gemischt» Danach wird die -t'robe in der Kammer 80 mit dem der Quelle 86 entnommenen Verdünnungsmittel verdünnt, damit die Zellen in der Küvette 92 hinreichend voneinander getrennt sind, und um die Lösungskonzentration des Farbstoffs so zu verringern, daß die Konzentration des Farbstoffs in der Trägerflüssigkeit um ein Vielfaches geringer ist als bei einer typischen Zelle.

Hierauf wird die verdünnte Probe mit Hilfe der Pumpe 88 über die Düse 90 in die zur Messung dienende Küvette 92 gepumpt. Der Probenstrom wird durch einen Flüssigkeitsmantel zusammengehalten, der aus der Flüssigkeit besteht, welche durch die Pumpe 96 aus der Quelle 98 zu der Küirette gefördert wird, wobei die Betriebsbedingungen derart sind, daß ein dünner Probenstrom entsteht, der die Küvette 92 mit

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- 12 !hoher Geschwindigkeit durchströmt.

Wie erwähnt, ist die Küvette 92 so ausgebildet, daß ihr die eine Flüssigkeit in Form eines Stroms über die Düse 90 zugeführt wird, und daß die Pumpe 96 dem Ringspalt 94 einen ringförmigen Flüssigkeitsstrom zuführt, der den ersten Strom umschließt. Die Geschwindigkeiten des zentralen Probenstroms und des ringförmigen Umhüllungsstroms werden so eingeregelt, daß dort, wo sich die beiden Ströme vereinigen, laminare Strömungsbedingungen herrschen, so daß sich beide Ströme gemeinsam bewegen und der Umhüllungsstrom den Probenstrom in der gewünschten Weise einschnürt. Die von d ,χ· Quelle 98 aus zugeführte Umhüllungsflüssigkeit ist vorzugsweise so gewählt, daß sie eine solche Viskosität hat, daß bei dem Förderdruck der Pumpe 96 eine laminare Strömung entstehen kann. Außerdem muß die Umhüllungsflüssigkeit so gewählt sein, daß die Brechungsindizes der Umhüllungsflüssigkeit und der die Probe enthaltenden Flüssigkeit genau aufeinander abgestimmt sind.

Das von der Quelle 86 aus zugeführte Verdünnungsmittel und die der Quelle 98 entnommene Umhüllungsflüssigkeit können gegebenenfalls von gleicher Art sein, obwohl sich die an die beiden Flüssigkeiten zu stellenden Anforderungen voneinander unterscheiden können. Beispielsweise ist es erwünscht, den Brechungsindex und/oder die Viskosität beider Flüssigkeiten sowie den osmotischen Druck genau einzuhalten, der an der Oberfläche von Probenzellen zur Wirkung gebracht wird, welche in den Flüssigkeiten suspendiert oder den Flüssigkeiten zugeordnet sind. Z_n diesem Zweck handelt es sich bei den Flüssigkeiten vorzugsweise um wäßrige Lösungen, die sowohl polymere Zusatzstoffe als auch Zusatzstoffe in Form von Salzen enthalten. Um den Brechungsindex einzuregeln, wird die Konzentration des Polymers in der Lösung entsprechend eingestellt. Bei einer bestimmten Konzentration des Polymers kann man die Viskosität der Flüssigkeit dadurch einstellen, daß man einen entsprechenden Polymerisationsgrad, d.h". ein entsprechendes mittleres Molekulargewicht des Polymers wählt, denn dieser Parameter hat nur einen

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relativ geringen Einfluß auf den Brechungsindex_e Ferner hat das Polymer nur eine geringe Wirkung auf den osmotischen Druck, so daß die Flüssigkeit ein komplementäres gelöstes Salz enthalten kann, dessen Konzentration dazu dient, den osmotischen Druck auf einen bestimmten gewünschten Wert einzustellen«

Als polymere Zusatzstoffe für das Verdünnungsmittel und die Umhüllungsflüssigkeit kommen somit Polyäthylenglycol und dergleichen sowie Blutplasma-Streckungsmittel in F_rage, z.B. Dextran, Polyvinylpyrrolidon und dergleichen. Bei dem zugesetzten Salz handelt es sich gewöhnlich und vorzugsweise um Kochsalz.

Die Küvette 92 hat vorzugsweise einen runden Querschnitt und weist ihren größten Durchmesser nahe dem Ausgang der Einspritzdüse 94- auf, von der aus sich die Küvette in der Strömungsrichtung verjüngt. Damit sich der gewünschte zentrale Probenstrom mit einem Durchmesser von 20 Mikron erzielen läßt, verjüngt sich die Kürette zweckmäßig bis auf einen Innendurchmesser von etwa 200 Mikron. Benutzt man eine solche Küvette, bewegen sich die Blutzellen längs der Achse des zentralen Stroms mit hoher Geschwindigkeit einzeln durch die Küvette_o

Die soeben beschriebene Küvette zwingt somit die Blutzellen, sich in Form eines stark eingeschnürten Stroms zu bewegen, so daß die Blutzellen einen bestimmten Punkt im wesentlichen einzeln nacheinander passieren und daher nacheinander untersucht werden können. Da die Blutzellen durch den zentralen Strom außerdem gezwungen werden, sich im wesentlichen längs der Achse der Küvette zu bewegen, ist die Bahn der Blutzellen genau festgelegt, so daß die Zellen mit hoher Genauigkeit im Brennpunkt eines optischen Systems gehalten werden können. Gemäß Figo 2 gehört zu dem dargestellten System ein elektrooptisches Teilsystem, das vorzugsweise eine optische Einrichtung 100 mit Linsen, Spiegeln und dergleichen aufweist, die dazu dient, voneinander getrennte Teile der Küvette 92 mit Hilfe einer

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Spektrallichtquelle 102 zu beleuchten. Der optischen Einrichtung 1CX) ist eine Detektoreinrichtung 104 zugeordnet, welche die durch die optische Einrichtung 100 erzeugte Strahlung in ein elektrisches Signal verwandelt«

Bei einem im optischen Sinne dicken absorbierenden Körper sind die Messungen gewöhnlich orientierungs- bzw. lageabhängig, d.h. selbst dann, wenn die auf eine Zelle auftreffende Strahlung eine konstante Amplitude hat, hängt die mit Hilfe des Detektors nachgewiesene Strahlungsdurchlässigkeit in einem erheblichen Ausmaß von der räumlichen Orientierung der Kernbestandteile ab, wenn diese Bestandteile nicht z.B. symmetrisch angeordnet sind, wie es bei einer Kugel der Fall ist„

Um den Einfluß der Orientierung auf ein Minimum zu verringern, ist es erforderlich, die Zelle aus mehreren verschiedenen Eichtungen zu beleuchten und die Vorrichtung so auszubilden, daß die Summe der Signale, die dem beobachteten Zellen- oder Kernquerschnitt entsprechen, von der Orientierung im wesentlichen und daher im wesentlichen unveränderlich ist· Im Idealfall sind mindestens drei solche Richtungen vorhanden, die im Idealfall im rechten Winkel zueinander verlaufen, und zwischen den mindestens Winkel von 60° vorhanden sind. Beispielsweise zeigt E¹Xg. 3 eine Ausführungsform der Lichtquelle 100 nach Fig. 2 in Gestalt von drei getrennten Strahlungsquellen 132A, 132B und 132C, die so angeordnet sind, daß sie drei getrennte Strahlenbündel entlang zueinander rechtwinkligen Strahlenwegen so aussenden, daß sich die Strahlenbündel an einem gemeinsamen Punkt 13^ schneiden, der vorzugsweise auf der Längsachse der Küvette 92 liegt» Entsprechend gehören zu dem Detektor 104 drei Einzeldetektoren 136A, 136B und 136C, die so angeordnet sind, daß sie auf die Strahlung der drei Strahlungsquellen ansprechen, die vom Kern einer Zelle durc¹ gelassen wird, welche sich an dem Punkt 134- befindet. Die drei Einzeldetektoren, die in Abhängigkeit von der auf sie auftreffenden Strahlung elektrische Ausgangssignale erzeugen, sind sämtlich mit ihren Ausgangsklemmen an eine

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Summierungseinrichtung 138 angeschlossen. Das der Summe aller Eingangssignale entsprechende Ausgangssignal der Summiereinrichtung 138 ist bei einer "bestimmten Anordnung von Teilchen gegebener Form und Größe, die sich an dem Punkt 134- befinden, ohne Rücksicht auf die Orientierung der l'eilchenanordnung im wesentlichen unveränderliche

. Natürlich brauchen sich die von den Quellen 132A, 132B und 132C ausgesandten Strahlen nicht zu schneiden, sondern sie können dazu dienen, nacheinander eine biologische Zelle zu beleuchten, die sich längs der Achse der Küvette 92 bewegt, wenn anzunehmen ist, daß sich die Orientierung der betreffenden Fälle gegenüber den Strahlungsquellen hierbei nicht wesentlich änderte Bei einer solchen Anordnung kann man die Ausgangssignale der verschiedenen Einzeldetektoren 136A, 136B und 136C in der erforderlichen Weise verzögern und speichern, so daß sie in einem späteren Zeitpunkt summiert werden können«

Alternativ kann man eine Einrichtung, z.B. einen spiralförmigen Einlaßkanal für die Küvette 92 vorsehen, um biologischen Zellen, die sich längs der Achse der Küvette nach unten bewegen, eine bekannte Drehung um eine oder mehrere Achsen mitzuteilen. Wird in einem solchen Fall nur eine Lichtquelle benutzt, deren Licht auf einen genügend großen Fleck fokussiert wird, kann die biologische Zelle während aufeinander folgender Zeitspannen aus mindestens zwei und vorzugsweise aus drei zueinander rechtwinkligen Eichtungen von dem Lichtstrahl getroffen werden. Hierbei genügt es, einen einfachen Detektor zu benutzen, der auf die von der biologischen Zelle durchgelassene Strahlung anspricht und die den aufeinander folgenden Pegeln entsprechenden Signale einer Einrichtung zuführt, welche die aufeinander folgenden Signale schließlich summiert.

Natürlich ermöglichen es die beschriebenen Vorrichtungen nur dann, Änderungen auszuschalten, die auf Unterschiede bezüglich der Orientierung zurückzuführen sind, wenn die Gegenstände, z.B. die Zellen,- eine einfache geometrische Form haben und es sich z.B. um Ellipsoide, Zylinder

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und dergleichen handelt. Je geringer die Symmetrie eines Gegenstandes ist, aus desto mehr Liichtungen muß er beleuchtet und beobachtet werden, wenn der Einfluß der Orientierung im wesentlichen beseitigt werden soll. Im äußersten Fall ermöglicht eine einer Halbkugel entsprechende Beleuchtung des Gegenstandes in Verbindung mit dem Sammeln der durchgelassenen Strahlung innerhalb eines halbkugelförmigen Bereichs eine vollständige Ausschaltung von auf die Orientierung zurückzuführenden Änderungen des Ausgangssignals sogar bei Gegenständen von sehr komplizierter Form»

Fig. 4 zeigt eine Einrichtung, bei der jede Zelle innerhalb eines Kegels beleuchtet wird, dessen Öffnungswinkel nahezu 180° beträgt. Zu diesem Zweck kann man ein optisches System 100 nach Fig. 2 und eine Linse 140 mit einem sehr großen öffnungswinkel benutzen, der z.B« größer ist als 90°, und man kann nach dem Immersionsverfahren arbeiten, gemäß welchem der Raum zwischen der Linse 140 nach Fig. 4 und der Wand der Küvette 92 mit einer Flüssigkeit 142 gefüllt ist, die einen hohen Brechungsindex hat, welcher z.B. über 1 liegt und vorzugsweise dem Brechungsindex der lTägerflüssigkeit in der Küvette angepaßt ist. Auf diese V/eise lassen sich Beleuchtungskegel mit einem öffnungswinkel von über 160° erreichen. Bei einem Beleuchtungskegel von großem öffnungswinkel und bei gleichmäßiger Strahlung bleibt die Wechselwirkung zwischen einem absorbierenden Körper von beliebiger Form und der ihn durchdringenden Strahlung von Änderungen der Orientierung nahezu unabhängig, so daß man ein nahezu unveränderliches Signal erhält. Dies ist darauf zurückzuführen, daß ohne Rücksicht auf die Lage des absorbierenden Körpers die Menge des Lichtes, das auf den Körper unter einem bestimmten "Winkel auftrifft, stets die gleiche istο Wenn sich der das Licht absorbierende Körper dreht, treten zwar unter einem bestimmten Winkel verschiedene Strahlen in den Körper ein, doch wird die Gesamtintensität des Strahlenbündels konstant bleiben» Natürlich könnte man auch bei der Vorrichtung nach Fig. 1 auf ähnliche Weise mit einer Beleuchtung einer halbkugelförmigen Zone arbeiten.

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Gemäß Fig. 2 sind Einrichtungen vorhanden, die dazu dienen, die Ausgangssignale des Detektors 104 aufzunehmen und diese Ausgangssignale in verschiedene Gruppen zu unterteilen, welche jeweils der Stärke des Signals entsprechen, welches die Lichtdurchlässigkeit des Zellkerns repräsentiert. Zu diesem Zweck wird das Ausgangssignal des Detektors 104 einer Leitung 106 zugeführt, an welche die Eingänge einer Gruppe von Trenneinrichtungen in Parallelschaltung angeschlossen sind, bei denen es sich z.B. um Verstärker 108, 110, 112 und 114 handelt, von denen jeder auf einen anderen Schwellenwert eingestellt ist. Die Aus-r gänge dieser Verstärker sind jeweils an die Eingänge von zugehörigen Wellenformern oder Impulsgeneratoren angeschlossen, bei denen es sich z.B. um monostabile kult!vibratoren 116, 118, 120 und 122 handelt. Der Ausgang des monostabilen Multivibrators 116 ist mit einem Eingang eines Und-Gatters 124 verbunden, dessen Ausgang an eine erste Zähleinrichtung 126 angeschlossen ist. Der Ausgang des monostabilen Multivibrators 118 liegt an einem Eingang eines Und-Gatters 128 und ist außerdem über einen Inverter 130 mit dem zweiten Eingang des Und-Gatters 124 verbunden. Der Ausgang des Gatters 128 ist an den Eingang einer zweiten Zähleinrichtung 132 angeschlossen. Der Ausgang des monostabilen Multivibrators 120 ist mit einem Eingang eines Und-Gatters und über einen Inverter 136 mit dem zweiten Eingang des Gatters 128 verbunden« Der Ausgang des Gatters 134 ist an den Eingang einer dritten Zähleinrichtung 138 angeschlossen. Schließlich ist der Ausgang des monostabilen Multivibrators 122 mit dem Eingang einer vierten Zähleinrichtung 140 und über einen Inverter 142 mit dem zweiten Eingang des Gatters 134 verbunden.

Beim Betrieb der beiden vorstehend beschriebenen elektrooptischen Systeme wird die Absorption, d.h. der Kehrwert der Durchlässigkeit, der Kerne der Zellen einer Probe dadurch ermittelt, daß die Anzahl der Zellen bestimmt wird, bei denen sich unterschiedliche Pegel für die durchgelassene Strahlung ergeben. Bei DNS ist es bekannt, daß diese Verbindung ein Absorptionsmaximum im ultravioletten Bereich

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in der Nähe von 260 mn zeigt. Daher kann man die Zellkerne "bei "Wellenlängen, die diesem Absorptionsmaximum für DNS genau oder nahezu entsprechen, als optisch dick betrachten. Hierzu ist jedoch zu bemerken, daß eine erhebliche Anzahl von Farbstoffen bekannt ist, die für DNS spezifisch sind und daher dazu führen können, daß die Zellkerne gegenüber Wellenlängen optisch dick sind, die beim Absorptionsmaximum der betreffenden I'arbstoffe oder in deren Nähe liegen. U_7n dies zu berücksichtigen, wird zuerst die DNS im Kern jeder Zelle gefärbt. Das Färben und Fixieren der Zellen auf dem Probenträger 26 nach Fig. 1 wird unter Anwendung beliebiger bekannter Verfahren durchgeführt. Bei der Ausführungsform nach Fig. 2 werden die Zellen natürlich in der Mischkammer 72 mit einem der Quelle 78 entnommenen Färbemittel gefärbt„ Die gefärbten Kerne werden dann ohne Rücksicht darauf, ob sie fixiert oder beweglich sind, vorzugsweise innerhalb eines halbkugelförmigen Bereichs einer Strahlung ausgesetzt, deren Wellenlängen in einem Band liegen, innerhalb dessen die Kerne optisch dicht sind. Hierauf wird die von jedem Kern durchgelassene Strahlung gemessen. Gemäß Fig. 1 wird zu diesem Zweck jede Zelle optisch gegenüber dem Bel· euch tungsstrahl zentriert, und dann wird das Ausgangssignal an dem Anzeigegerät 38 abgelesen. Bei der Ausführungsform nach Fig. 2 wird die durchgelassene Strahlung automatisch gemessen, während sich die Zellen längs der Achse der Küvette 92 bewegen; hierbei bewirkt jede Änderung des durchgelassenen Teils der Strahlung eine entsprechende Änderung des Ausgangssignals des Detektors 104.

Hierauf wird die Durchlässigkeitscharakteristik jedes Kerns entsprechend der jeweiligen Intensität einer bestimmten Kategorie zugewiesen, und dann wird die Anzahl der in diese Kategorie fallenden Kerne ermittelt. Dies geschieht bei der Ausführungsform nach Fig. 1 mit der Hand, während die Ausführungsform nach Fig. 2 eine automatische Durchführung dieses Vorgangs ermöglicht. Wenn bei der Ausführungsform nach Fig. 2 ein Signal über dem Schwellenwert des Verstärkers 108, jedoch unter dem Schwellenwert des Verstärkers 110 liegt, wird das Gatter 124 geöffnet, da an beiden Eingängen

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dieses Gatters starke Signale vorhanden sind, und der durch den monostabilen Multivibrator 116 erzeugte Impuls wird nur durch die Zähleinrichtung 126 gezählt. Befindet sich dagegen z.Bo das Ausgangssignal des Detektors 104 auf einem Pegel, der über den Schwellenwerten der beiden Verstärker 108 und 110, jedoch unter dem Schwellenwert der Verstärker 120 und 122 liegt, bewirkt der entsprechende Impuls des monostabilen Multivibrators 118, der invertiert wird, daß das Gatter 124 gesperrt und das Signal als Eingangssignal dem Gatter 129 zugeführt wird. Da jedoch der monostabile Multivibrator 120 kein Signal erzeugt hat, öffnet das Ausgangssignal des Inverters 136 das Gatter 128, so daß der Impuls des monostabilen Multivibrators 118 durch die Zähleinrichtung 132 gezählt wird. Die Gatt er anordnung nach !'ig. 2, bei der es sich natürlich nur um ein Beispiel handelt, klassifiziert somit praktisch die Durchlässigkeit jedes Zellkerns entsprechend einem willkürlich gewählten Bezugsbereich, und die Gesamtzahlen der einzelnen Klassen oder Kategorien werden in Speichern gesammelt, die gemäß Fig. 2 als Zähleinrichtungen ausgebildet sindo Eine Zelle wird dadurch identifiziert, daß durch Messen oder Berechnen die Durchlässigkeitscharakteristik einer DNS-Menge ermittelt wird, die einen Körper von beliebiger Form, z.B. eine Kugel, bildet. Ein Vergleich des bei der Kugel erhaltenen Meßwertes mit dem "Wert, der der betreffenden Kategorie zugeordnet ist, dient zum Identifizieren der betreffenden Kategorie, d.h. er ermöglicht eine Ermittlung der Kugelform jeder Kategorie« Alternativ braucht.man nur durchschnittliche Keßwerte für eine Anzahl von Lernen von vorher identifizierten Zellen zu gewinnen, um einen Vvert zu erhalten, mit dem die Kategorien verglichen werden können.

Wie erwähnt, kann man bei Zellen, die sich nur bezüglich ihrer Kernform unterscheiden, die Durchlässigkeitschar akteri st iken des Kerns als Maß für die Kernform benutzen. Dies ermöglicht dann eine Unterscheidung zwischen Populationen bestimmter Zellenarten entsprechend einer einzigen Messung, und zwar derjenigen der JJurchlässigkeitscharakteristiken der Zellkerne bezüglich der Strahlung, gegenüber

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der die Kerne optisch, dicht sind. Diese statistische Unterscheidung ist in Pig. 5A graphisch, dargestellt, wo die Menge der Zellen, die zu den verschiedenen Kategorien gehören, in einem Histogramm über der prozentualen Durchlässigkeit aufgetragen sind. Die Zellen, für die Pig. 5A gilt, wurden außerdem zur Nachprüfung durch direkte optische Beobachtung identifizierte Gemäß Pig. 5A waren die segmentierten Granulozyten entsprechend der Hüllkurve 150 verteilt, die eine in einer ersten Richtung schraffierte Fläche abgrenzt. Die Bandzellen fielen in den entgegengesetzt schraffierten Bereich innerhalb der Hüllkurve 152. Sämtliche Zellen, die zur Aufstellung des Histogramms nach ITig. 5-Ä- untersucht wurden, waren gefärbt und auf einem Objektträger fixiert, so daß die Zellenstruktur in einem erheblichen Ausmaß abgeflacht war.

Eine ähnliche statistische Verteilung ist in Pig. 5B dargestellt, wo die Hüllkurve 154- die Verteilung der segmentierten Granulozyten veranschaulicht, die sich, bei einer anderen Probe ergab, während die Hüllkurve 156 die Verteilung sämtlicher bei dieser -^robe identifizierter Bandzellen erkennen läßt. Sämtliche Zellen, für die Pig« 5B gilt, schwammen frei in der Plüssigkeit, so daß jede Zelle im wesentlichen kugelförmig und nur in einem minimalen Ausmaß abgeplattet war. Vergleicht man die in Pig. 5A und 5B wiedergegebenen Histogramme, erkennt man, daß sich in beiden Pällen die beiden Zellenpopulationen leicht voneinander unterscheiden lassen, und zwar nur auf der Basis ihrer prozentualen Durchlässigkeit; die Verschiebung der Populationen nach Pig. 5B an den Platz der Populationen nach Pig. 5A längs der Achse, auf der die Durchlässigkeit aufgetragen ist, ist auf die Abplattung der Zellen zurückzuführen, die vermutlich zu einer gleichmäßxgen Veränderung der Gestalt der -fc-erne führte _o

Das vorstehend beschriebene Verfahren beruht auf der Konstantheit der ^ern-DNS und der Möglichkeit, auf- eine von der Orientierung relativ unabhängige Y/eise eine formabhängige Punktion zu messen, die nicht ausschließlich zum

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Volumen proportional ist und linear von der Konzentration der DNS abhängt. In Fällen, in denen die DNS-Konzentration von Zelle zu Zelle relativ konstant ist, kann man eine beliebige formabhängige !Funktion benutzen, die sich nicht auf das Volumen zurückführen läßt. Abschließend sei bemerkt, daß man in manchen lallen anstelle der Form die DNS-Konzentration als Unterscheidungsmerkmal benutzen kann.

Ansprüche

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Claims

ANSPRÜCHE

|1i VerfaJaren zum Ermitteln der Form von Zellkernen im Vergleich zur Form eines vorbestimmten festen Körpers, dadurch gekennzeichnet , daß für jeden Zellkern die Größe einer formabhängigen !Punktion gemessen wird, die proportional zum Produkt der Konzentration der Desoxyribonukleinsäure und des Volumens der Desoxyribonukleinsäure in jedem Zellkern ist, und daß diese Größe mit einem vorgegebenen Wert einer ähnlichen Messung bei der gleichen Konzentration der Desoxyribonukleinsäure in einem Körper von vorbestimmter Form verglichen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der genannten Form eines Körpers um die Form einer Kugel handelt.
3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß zum Durchführen der Messung auf die Zellkerne eine Strahlung gerichtet wird, für welche die Zellkerne optisch dick sind, und daß nacheinander bei allen Zellkernen das Ausmaß der Absorption der Strahlung durch die Zellkerne ermittelt wird.
M-. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß die Zellkerne gefärbt werden, bevor die Strahlung auf sie gerichtet wird, und daß die Strahlung eine Wellenlänge hat, die mit dem Absorptionsmaximum des Färbemittels übereinstimmt oder ihm benachbart ist.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Strahlung so auf die Zellkerne gerichtet wird, daß die Ermittlung der Absorption von der Orientierung der von der Strahlung getroffenen Zellkerne im wesentlichen unabhängig ist.

/_t 0 0 R 4 B / I 0 i) I
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß jeweils diejenigen Zellkerne gezählt werden, für die das Ergebnis des Vergleichs der genannten Größe mit dem genannten Wert in einen vorbestimmten Bereich fällte
7 ο Vorrichtung zum Ermitteln der Form von Zellkernen im Vergleich zu der'Form eines vorbestimmten festen Körpers, gekennzeichnet durch eine Einrichtung (100, 102), die dazu dient, ein Strahlungsbündel nacheinander auf die zu untersuchenden Zellkerne zu richten, eine Einrichtung (104) zum Messen der Größe der Strahlung, die von jedem Zellkern ausgesandt wird, so daß eine Reihe von Signalen erzeugt wird, die zu einer formabhängigen Funktion des genannten Körpers proportional sind, sowie durch Einrichtungen (126, 132, 13s, 140) zum Zählen jeweils derjenigen Signale, die in jeden von mehreren vorbestimmten Bereichen von Werten fallen.
8. Vorrichtung nach Anspruch 7» dadurch g e k e η η ze ichnet , daß die Größe der Signale zu der genannten formabhängigen Funktion proportional ist, und daß jeder der vorbestimmten Bereiche von Werten einem Bereich von Signalgrößen entspricht<=
9. Vorrichtung nach Anspruch 7» gekennzeichnet durch Einrichtungen (132A bis 132C), die dazu dienen, die genannte Strahlung in mindestens drei zueinander im wesentlichen rechtwinkligen Richtungen auf die Zellkerne zu richten.
10. Vorrichtung nach Anspruch 7> gekennzeichnet durch eine Einrichtung (14-0, 142), die dazu dient, die genannte Strahlung im wesentlichen von einer halbkugelförmigen Zone aus auf die Zellkerne zu richten.
11. Vorrichtung nach Anspruch 9, gekennzeichnet durch eine Einrichtung (104), die dazu dient, im wesentlichen vollständig die Strahlung aufzunehmen, die im Bereich einer Halbkugel von jedem Zellkern ausgesandt wird, wenn die genannte Strahlung auf den betreffenden Zellkern gerichtet wird ο 409845/1091