DE2551026C3 - Verfahren zur Analysieren von Teilchen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Analysieren von Teilchen, z. B. von biologischen Zellen, nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Bei allen derartigen Verfahren werden die Teilchen aufgrund ihrer Bewegung durch die Meßzone quasi schichtweise abgetastet. Der bei dieser Abtastung erzeugte elektrische Primärimpuls entspricht deshalb in seinem Profil dem bei der Abtastung »gesehenen« Profil des jeweiligen Teilchens und damit dessen Größe und Form. Am häufigsten werden Abtasl-Einrichtungen nach dem sogenannten Coulter-Prinzip verwendet, vgl. US-PS 26 56 508 und US-PS 28 69 078. Hierbei befinden sich die untersuchten Teilchen in einem Elektrolyt in Suspension und werden durch ein elektrisches Feld geleitet, in dem bei Durchgang der einzelnen Teilchen eine Impedanzänderung auftritt, die elektrisch erfaßt und als Primärimpuls dargestellt wird.

Um Aussagen über Identität und Eigenschaften der untersuchten Teilchen machen zu können, namentlich bei der Untersuchung biologischer Zellen und Zeil-Populationen, müssen die Primärimpulse einer Auswertung zugeführt werden.

Bei dem Verfahren der eingangs genannten Art, das aus der US-PS 29 96 624 bekannt ist, wird jeder Primärimpuls in einem bestimmten vorgegebenen zeitlichen Abstand seit seinem Beginn hinsichtlich seiner Amplitude abgetastet und hierbei ein Sekundärimpuls erzeugt, dessen Höhe der momentanen Amplitude des Primärimpulses entspricht. Gemäß der US-PS soll der zeitliche Abstand so gewählt werden, daß der Primärimpuls nach Möglichkeit an seinem Maximum abgetastet wird. Die erzeugten Sekundärimpulse geben entsprechend nur die Größe (Volumen oder Durchmesser) der einen, gerade abgetasteten Schicht der Teilchen wieder. Bei einer anschließenden Klassierung der Sekundärimpulse ihrer Größe nach entsteht eine auf dieser »herausgegriffenen« Größe beruhende Häufigkeitsverteilung, die nur sehr bedingte Aussagen über die untersuchten Teilchen zuläßt, weil der überwiegende Teil der in den Primärimpulsen steckenden Information unterdrückt ist. So kann z. B. praktisch keine Aussage

ίο über die Gestalt der untersuchten Teilchen gemacht werden. Weiterhin ist das Verfahren ohne signifikantes Ergebnis, wenn die der Abtastung entsprechende Größe der Teilchen oder ihre Größe überhaupt innerhalb der untersuchten Teilchen-Menge oder -Population nur sehr wenig streut.

Aus der DE-PS 20 17 513 ist ein ähnliches Verfahren bekannt, bei dem letztlich ebenfalls nur eine die Größe der Teilchen betreffende Häufigkeitsverteilung erhalten wird. Es ist jedoch in der elektrischen Auswertung der Primärimpulse ein Schritt zwischengeschaltet, der die Unterscheidung der Primärimpulse hinsichtlich der Anzahl ihrer Maxima und Minima und hieran anknüpfend die selektive Verwertung nur solcher Primärimpulse für die Bildung der Häufigkeitsverteilung ermöglicht, die eine bestimmte, festgelegte Konfiguration ihrer Maxima und Minima haben, was bedeutet, daß auch nur Teilchen bestimmter Gestalt in die Häufigkeitsverteilung eingehen. Hierzu werden von jedem einzelnen Primäriinpuls in bestimmten Schritten seiner Amplitude, nicht seines zeitlichen Verlaufs, Sekundärimpulse getriggert, die jeweils in einen von mehreren, den verschiedenen Amplitudenschritten zugeordneten Speichern gelangen. Die Zählstellung dieser Speicher nach Ablauf des Primärimpulses läßt dessen Konfiguration hinsichtlich der Maxima und Minima erkennen und kann, über eine Verknüpfungsschaltung ausgewertet, dafür benutzt werden, den Maximalwert des jeweiligen Primärimpulses für die Bildung der Häufigkeitsverteilung weiterzuleiten oder nicht. Das Verfahren kann nur mit großem apparativem Aufwand durchgeführt werden. Trotzdem liefert es, abgesehen von der »Vorsortierung« der Primärimpulse und damit Teilchen, auch keine weitergehenden Informationen als das bekannte Verfahren nach der US-PS 29 96 624.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, das Verfahren der eingangs genannten Art so auszugestalten, daß in seine Ergebnisse nicht nur eine bestimmte Größe der Teilchen, sondern auch Feinheiten ihrer Gestalt eingehen, ohne daß damit ein großer apparativer Mehraufwand für die Durchführung des Verfahrens verbunden ist.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit dem im Anspruch 1 und bezüglich vorteilhafter Ausgestaltungen in den Unteransprüchen gekennzeichneten Verfahren gelöst.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden für jede untersuchte Teilchen-Population mindestens zwei Größen-Häufigkeitsverteilungen erzeugt. Hierdurch geht nicht nur eine bestimmte Größe, sondern auch die Gestalt der Teilchen in die Untersuchung ein, und zwar — bei geeigneter Wahl der Abtastzeitpunkte — sogar in einer solchen Differenzierung, daß anhand der Verfahrens-Ergebnisse Teilchen-Populationen unterschieden bzw. erkannt werden können, die sich in der Grundform bzw. Konfiguration (Art und Anzahl der Maxima und Minima) der von ihnen erzeugten Primärimpulse an sich gleichen. Ferner werden auch dann noch aussagekräftige, in ihrer Aussage auf der gegenseitigen Relation der

erzeugten Häufigkeitsverteilungen beruhende Ergebnisse gewonnen, wenn die einzelnen Häufigkeitsverteilungen sehr wenig streuen, also Teilchen-Population mit sehr einheitlicher Größe und Gestalt untersucht werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist deshalb ganz besonders zur Untersuchung der Dynamik des Zellwachstums und sonstiger Änderungen und Änderungsgeschwindigkeiten lebender Zeil-Populationen geeignet, wo die bekannten Verfahren weitgehend versagen oder jedenfalls nur noch eine »grobe« Untersuchung ermöglichen. Trotz dieser Möglichkeit der Erzielung differenzierter Ergebnisse erfordert das bekannte Verfahren keinen oder nur einen geringen apparativen Mehraufwand, insbesondere wenn man das Verfahren in der Weiterbildung nach Anspruch 3 durchführt, anstatt, was auch möglich und bei raschen Änderungen der untersuchten Teilchen-Population vorzuziehen ist, zu jedem Primärimpuls sogleich die zwei oder mehr Sekundärimpulse zu erzeugen.

Im übrigen erbringt das erfindungsgemäß^ Verfahren schon mit zwei Sekundärimpulsen pro Primärimpuls differenzierte Aussagen ermöglichende Ergebnisse. Nur in Ausnahmefällen wird es lohnenswert sein, pro untersuchter Teilchen-Population mehr als zwei Häufigkeitsverteilungen zu erzeugen.

Im folgenden ist die Erfindung anhand eines schematisch dargestellten Ausführungsbeispiels näher erläutert. Es zeigt

Fi g. 1 ein Funktions-Schemabild einer beispielhaften Analysiereinrichtung für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens,

F i g. 2 ein Blockschaltbild der Analysiereinrichtung nach Fig. 1,

F i g. 3 eine Schemaansicht einer für die Analysiereinrichtung nach F i g. 1 und 2 geeigneten optischen Abtast- hzw. Fühlvorrichtung,

Fig.4 eine Schemaansicht einer anderen geeigneten optischen Fühlvorrichtung,

F i g. 5 eine graphische Darstellung eines in der Analysiereinrichtung auftretenden Primärimpulses, zu dem zwei Sekundärimpulse erzeugt werden,

F i g. 6 eine graphische Darstellung verschiedener, mit der Analysiereinrichtung zu gewinnender Häufigkeits-Verteilungen,

Fig. 7 eine graphische Darstellung nach der Erfindung erzielter Häufigkeitsverteilungen für normale Fundulus hetiioclitus-Blutzellen,

Fig. 8 eine graphische Darstellung nach der Erfindung erzielter Häufigkeitsverteilungen für Fundulus heteroclitus-Blutzellen mit Verunreinigungen aufgrund eines 24stündigen Aufenthalts in cadmiumhaltigem Wasser.

Gemäß F i g. 1 wird ein elektrolytisches Fluid, welches eine Probe zu analysierender Teilchen 10 enthält, durch die Meßzone einer Fühl- bzw. Abtastvorrichtung 12 hindurchgeleitet, die ?. B. nach dem sogenannten Coulter-Prinzip arbeitet, das in den eingangs erwähnten US-Patentschriften näher erläutert ist. Die Fühlvorrichtung 12 erzeugt bei jedem Durchgang eines Teilchens durch die Meßzone aufgrund entsprechender Potentia- !änderungen in dieser einen von der Größe und Form des Teilchens abhängigen Primärimpuls, der mittels eines geeigneten Verstärkers 14 verstärkt und dann in einem mehrkanaligen Analysierer 16 ausgewertet wird. An den Ausgang des Analysierers 16 ist eine Datenverarbeitungseinrichtung 18 angeschlossen, mit der die ermittelten Ergebnisse angezeigt und/oder aufgezeichnet werden können.

Weitere Einzelheiten gehen aus Fig.2 hervor. Hiernach umfaßt der Mehrkanal-Analysierer, dem die einzelnen Primärimpulse zugeführt werden, einen Sekundärimpuls-Generator 20, der zu jedem Primärimpuls durch Triggerung in einem vorgegebenen zeitlichen Abstand seit Beginn des Primärimpulses einen Sekundärimpuls fester Dauer und einheitlicher Gestalt erzeugt, dessen Höhe bzw. Amplitude der momentanen Amplitude des Primärimpulses im Zeitpunkt der Triggerung entspricht Die so erzeugten Sekundärimpulse werden einem Umsetzer 22 zugeleitet, welcher den Impulshöhen proportionale Kanalnummer-Adressen zuweist. Diese werden in einer an den Ausgang des Umsetzers 22 angeschlossenen Impulshöhen-Analysiereinrichtung 28 erkannt, die ihrerseits entsprechend eine Datenspeichereinheit 24 beaufschlagt, in der die Zahl der angefallenen Sekundärimpulse, getrennt nach zugewiesener Adresse und damit Höhe, in beispielsweise 200 verschiedenen Speicherbereichen bzw. Kanälen gespeichert wird.

Anhand der in der Datenspeichereinheit 24 enthaltenen Daten bzw. Zählungen kann eine Häufigkeitsverteilung der Sekundärimpulse hinsichtlich ihrer Höhe erzeugt werden, bei der über der X-Achse die Kanal-Adresse bzw. Impulshöhe und über der K-Achse die Anzahl der Sekundärimpulse der jeweiligen Höhe aufgetragen ist. Die Häufigkeitsverteilung wird mittels eines X- Y-Plotters 32 in analoger Form aufgezeichnet, der hierzu über bzw. von dem Impulshöhenanalysierer 28 zwei der Kanalnummer bzw. -adresse und der Gesamtzählung im jeweiligen Kanal proportionale Gleichspannungen erhält. Die Entwicklung der Häufigkeilsverteilung während des Meßdurchgangs kann mit einem oszillographischen Monitor 30 verfolgt werden, der in gleicher Weise wie der X-K-Plotter 32 über den Impulshöhen-Analysierer 28 angesteuert wird. Schließlich ist eine permanente Speicherung der gewonnenen Daten mittels einer an die Datenspeichereinheit 24 angeschlossenen digitalen Speichereinheit 34, z. B. einem Magnetbandgerät, möglich.

Zur Durchführung einer Messung wird eine Probe von Teilchen mit einer absolut genau festliegenden Geschwindigkeit in dem elektrolytischen Fluid durch die Meßzone der Coulter-Fühlvorrichtung 12 hindurchgeleitet. Die Geschwindigkeit und die übrigen Parameter der Fühlvorrichtung sind so gewählt, daß hierbei für kugelförmige Teilchen mit einem Durchmesser von 1 μΐη Primärimpulse von ungefähr 20 μsec Dauer entstehen. Aus diesen werden durch Triggerung in einem zeitlichen Abstand von z. B. 8 μβεΰ seit Beginn des jeweiligen Primärimpulses in der oben erläuterten Weise Sekundärimpulse erzeugt und letztere nach ihrer Höhe klassiert. Nach Durchgang der gesamten Probe wird der zeitliche Abstand der Abtastung auf einen anderen Wert, z. B. 25 μ5εΰ, eingestellt und die gleiche Probe erneut durch die Meßzone hindurchgeleitet. Die hierbei entstehenden weiteren Sekundärimpulse werden für sich klassiert, d. h., es wird aus ihnen eine zweite Häufigkeitsverteilung gebildet. Anhand der beiden so gewonnenen Häufigkeitsverteilungen kann unter Bezugnahme auf Häufigkeitsverteilungen, die mit standardisierten Proben gewonnen wurden, auf die Identität und/oder bestimmte Eigenschaften der untersuchten Teilchen^Population geschlossen werden.

Anstatt eine Probe in zwei aufeinanderfolgenden Meßdurchgängen mit unterschiedlichen zeitlichen Abständen der Triggerung der Binärimpulse zu untersuchen, kann jeder Primärimpuls auch sogleich in zwei

(oder mehr) zeitlichen Abständen seit seinem Beginn getriggert werden, wobei die so gewonnenen Sekundärimpulse getrennt nach Trigger-Zeitpunkt klassiert werden.

Anhand eines konkreten Beispiels sei das erfindungsgemäße Verfahren weiter verdeutlicht. F i g. 5 zeigt einen Primärimpu'ls 40, wie er normalerweise durch eine Fühlvorrichtung 12 erzeugt wird, wenn Proben menschlicher Erythrozyten durch deren Meßzone geleitet werden, die in einer 0,9%igen (Gewicht in Volumen), teilchenfreien Saline gelöst sind. Da die Erythrozyten sehr konform sind, entsteht eine Serie von Primärimpulsen, die sich nur sehr wenig voneinander unterscheiden. Bei Einsteilung des Sekundärimpuls-Generators 20 derart, daß jeder Primärimpuls 8 μsec nach seinem Beginn getriggert wird, also im Zeitpunkt a in F i g. 5, entstehen Sekundärimpulse 42, deren Höhen der Primärimpuls-Amplitude im Zeitpunkt a proportional sind. Die Klassierung dieser Sekundärimpulse 42 nach ihrer Höhe ergibt die Häufigkeitsverteilung 52 in F i g. 6. Wegen der geringen Streuung der Probe handelt es sich um eine schmale, undifferenzierte und daher für sich allein genommen wenig aussagekräftige Kurve.

Durch eine weitere Triggerung aller Primärimpulse in einem zeitlichen Abstand von 25 μ-sec seit ihrem Beginn wird eine weitere Serie von Sekundärimpulsen 44 erzeugt, deren Höhe der Amplitude des jeweiligen Primärimpulses im Zeitpunkt b entspricht. Auch diese Sekundärimpulse 44 werden getrennt von den Sekundärimpulsen 42 klassiert und ergeben hierdurch eine Häufigkeitsverteilung, die durch die Kurve 52i in F i g. 6 dargestellt ist. Auch diese Kurve ist sehr schmal und daher für sich genommen nicht besonders aussagekräftig. Aus ihrer relativen Lage zu Kurve 52 können aber wesentliche Aufschlüsse über die untersuchte Erythrozyten-Probe gewonnen werden.

Handelte es sich um eine halb zufällig gemischte Teilchen-Population bzw. Primärimpuls-Gesamtheit, würde z. B. bei der zweiten 25^sec-Triggerung eine Häufigkeitsverteilung gemäß der Kurve 54 in Fig. 6 erhalten werden.

Zur Auswertung der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Häufigkeitsverteilungen geht man zweckmäßigerweise so vor, daß man sich von standardisierten Proben standardisierte, z. B. auf der 8^sec-Triggerung beruhende Häufigkeitsverteilungen herleitet und die bei einer individuellen Untersuchung gewonnenen Häufigkeitsverteilungen mit diesen standardisierten Häufigkeitsverteilungen auf empirischer Basis vergleicht.

Es folgt als Beispiel die Anwendung des erfindungsgernäßen Verfahrens auf die Untersuchung normalen ganzen Blutes des Fisches Fundulus heteroclitus. Die Analysiereinrichtung war auf eine 8^sec-Triggerung der Primärimpulse und eine 5 χ 10⁴-Verdünnung des Blutes in 0,9%iger (Gewicht in Volumen), teilchenfreier Saline geeicht In der Fühlvorrichtung wurde eine lOO^m-Öffnung verwendet Fig.7 zeigt zwei Kurven 56 und 58, die das Resultat der ersten Triggerung im zeitlichen Abstand von Sjisec und einer weiteren Triggerung im zeitlichen Abstand von 25 psec sind. Es handelt sich um zwei ganz verschiedene, bestimmte Häufigkeitsverteilungen. Anschließend wurde unter Beibehaltung aller Vorrichtungs- und Verfahrensparameter eine Probe untersucht die vom Blut von Fischen abgeleitet war. die für 24 Stunden in Wasser gehalten worden waren, das mit 20 :1 000 000 Cadmium verunreinigt war. Hierbei ergaben sich die Kurven 60 und 62 gemäß F i g. 8. Ein Vergleich mit den Kurven 56 und 58 nach F i g. 7 macht deutlich, daß das erfindungsgemäße Verfahren den Erhalt aussagekräftiger Daten mit einem Minimum an Untersuchungsdurchgängen für jede untersuchte Probe ermöglicht. Die allgemeinen Formen oder Gestalten der Teilchen-Verteilungen erhalten aufgrund der mehrfachen Triggerung eine besondere Betonung, so daß eine Charakterisierung der untersuchten Teilchen leicht zu erhalten ist.

ίο Anstatt einer Fühlvorrichtung nach dem Coulter-Prinzip kann auch eine optische Fühlvorrichtung verwendet werden. Zwei solcher optischen Fühlvorrichtungen sind in den F i g. 3 und 4 dargestellt.
Gemäß F i g. 3 umfaßt eine Fühlvorrichtung 70 eine Lichtquelle 72 geeigneter Ausbildung, z. B. eine Wolfram- oder Xenon-Lampe mit geeigneter Ansprechzeit und spektraler Charakteristik. Eine Fokussiereinrichtung, z. B. ein Präfokussier-Reflektor 74 und ein Fokussier-Reflektor 76 fokussieren das Licht 78 von der Quelle 72 durch einen geeigneten Begrenzungsschlitz 80 in ein transparentes Rohr 82, durch welches eine Flüssigkeit 84 fließt, in welcher sich die Untersuchungsprobe 86 in Suspension befindet. Die Flüssigkeit 84 bzw. das Fluid 84 kann von jeder geeigneten Art sein einschließlich eines gasförmigen Mediums oder eine bekannte Suspension, z. B. eine isotonische Natriumchlorid-Lösung, wobei zu gelten hat, daß die Steuerungseigenschaft des benutzten Fluids derart ist, daß es für die Wellenlängen des Lichtes von der Quelle 72 transparent ist. so daß das Fluid selber keine Zufalls- und Störsignale während der Untersuchung beisteuert. Natürlich darf das benutzte Fluid auch keine unerwünschten physikalischen Änderungen an den in ihm in Suspension befindlichen Körpern hervorrufen. Die Fühlzone des Fühlers 70 im Rohr 82 befindet sich an und in der Zone, welche den Brennpunkt 85 des Lichtstrahles umgibt. Wenn der Fühler nach dem optischen Reflexionsprinzip arbeitet, ist ein geeigneter Photodetektor 88 mit einer entsprechenden Anbringung 90 und Kollimations-Schlitzen 92 und 94 vorgesehen, um einen elektrischen Ausgangsbzw. Primärimpuls zu erzeugen, der eine Funktion des Lichtes 96 ist. das von einem Teilchen, welches durch die Fühlzone 85 hindurchgeht reflektiert wird. Die Ausgangssignale des Detektors 88 liegen in der Form von Primärimpulsen vor, dessen Höhe oder Amplituden eine Funktion der Größe, der optischen Eigenschaften und dgl der Teilchen sind.

Es können auch optische Fühlvorrichtungen verwendet werden, die nach dem Refraktions- und Absorptions-Prinzip arbeiten, um Primärimpulse zu erzeugen, die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendbar sind. Solche Einrichtungen sind in Fig.3 gestrichelt dargestellt und können Elemente wie einen Photodetektor 100, eine Haube 102, Kollimationsschlitze 104 und 106 sowie eine Ausgangs-Schnittstelle bzw. einen Ausgangs-Anschluß 108 umfassen. Der Photodetektor 100 ist im Strahlengang des Lichtes hinter der Lichtquelle 72 so angeordnet daß die durch die Fühlzone hindurchgehenden Untersuchungsteilchen das auf den Photodetektor auffallende Licht unterbrechen oder beugen und dadurch zu Ausgangsimpulsen führen. Eine Lichtfalle 110 geeigneter, bekannter Ausbildung ist vorgesehen, um Streulicht zu absorbieren und dessen Störeffekte dadurch auf ein Minimum herabzusetzen.

Bei der Ausführungsform gemäß Fig.4 wird ein geeigneter Laser 112 als Lichtquelle einer Fühlvorrichtung 170 verwendet Der Ausgangsstrahl 114 des Lasers

ist durch einen geeigneten Begrenzungsschlitz 80 in ein transparentes Rohr 82 gerichtet, durch welchen ein Fluid 84 fließt, in welchem sich Untersuchungsproben 86 in Suspension befinden. Das Fluid 84 ist von geeigneter Art und hat die gleichen Eigenschaften wie das in Verbindung mit der Ausführungsform nach Fig.3 erläuterte Fluid. Die Fühlzone des Fühlers 170 befindet sich im Bereich 185 im Rohr 82, durch weichen der Laserstrahl 114 hindurchgeht. Wenn der Fühler nach dem optischen Reflektionsprinzip arbeitet, ist ein geeigneter Photodetektor 88 mit einer geeigneten Haube und Schlitzen 92 und 94 vorgesehen, um einen elektrischen Ausgangs- oder Primärimpuls zu erzeugen, der eine Funktion des Lichtes 196 ist, welches von einem Teilchen in der Fühlzone 185 reflektiert wird. Die Primärimpulse vom Detektor 88, welche das analysierte Teilchen charakterisieren, werden über eine Ausgangsleitung 98 einem Verarbeitungsgerät zugeführt, wie es zuvor als zur Durchführung der Erfindung geeignet erläutert wurde.

Optische Fühlvorrichtungen nach dem Refraktionsprinzip, wie sie zuvor erläutert wurden, haben einen geeigneten Photodetektor 100, eine Haube 102, Schlitze 104 und 106 und einen Ausgangsanschluß 108, vgl. gestrichelte Darstellung in Fig. 14. Eine Lichtfalle 110 geeigneter Art ist zur Absorption von Streulicht vorgesehen, damit dessen nachteilige Effekte auf ein Minimum herabgesetzt werden. Im Betrieb unterbrechen oder beugen durch die Fühlzone 185 hindurchgehende Teilchen den auf den Photodetektor 100

ίο auffallenden Laserstrahl 114, so daß sich durch die Erfindung verwertbare Ausgangsimpuise ergeben.

Die Fühlzonen 85 und 185 der Fühlvorrichtungen 70 und 170 können an die Photodetektoren 88 mittels bekannter, kommerziell erhältlicher Glasfaser-Optiken angekoppelt sein, z.B. mittels einer Lichtleitung oder eines optischen Wellenleiters. Bei einer solchen, nicht gezeigten Auslegung ist ein geeignetes Glas- oder Kunststoff-Faseroptik-Kabel mit seinem Eingangsende freiliegend an der Fühlzone 85 oder 185 angeordnet und mit seinem Ausgangsende auf die photoempfindliche Fläche des Photodetektors 88 gerichtet.

Hierzu 5 Blatt Zeichnungen

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Analysieren vori Teilchen, z.B. von biologischen Zellen, bei welchem eine in einem Fluid in Suspension befindliche Probe der Teilchen durch eine Meßzone geleitet wird, hierbei für jedes Teilchen ein von dessen Größe und Form abhängiger Primärimpuls erzeugt wird, für jeden Primärimpuls in einem vorgegebenen zeitlichen Abstand seit seinem Beginn ein Sekundärimpuls erzeugt wird, dessen Höhe der momentanen Amplitude des Primärimpulses entspricht, und die Sekundärimpulse nach ihrer Höhe klassiert werden, dadurch gekennzeichnet, daß für jeden Primärimpuls (40) in mindestens einem weiteren vorgegebenen zeitlichen Abstand je ein weiterer Sekundärimpuls (42 oder 44) erzeugt wird, und daß die jeweils einem bestimmten zeitlichen Abstand zugeordneten Sekundärimpulse (42 bzw. 44) für sich klassiert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Sekundärimpulse (42, 44) einer festen Dauer und einheitlichen Gestalt erzeugt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine gegebene Probe in mindestens zwei Durchgängen wiederholt durch die Meßzone geleilet wird, und daß bei den Durchgängen unterschiedliche zeitliche Abstände, in denen die Sekundärimpulse (42,44) erzeugt werden, angewendet werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß zwei Sekundärimpulse (42, 44) pro Primärimpuls (40) erzeugt werden.