DE2349271A1

DE2349271A1 - Vorrichtung zum ermitteln von parametern von blutzellen

Info

Publication number: DE2349271A1
Application number: DE19732349271
Authority: DE
Inventors: Tomas Hirschfeld
Original assignee: Block Engineering Inc
Current assignee: Block Engineering Inc
Priority date: 1972-10-02
Filing date: 1973-10-01
Publication date: 1974-04-18
Also published as: CA984175A; FR2201064B1; CH573600A5; GB1424388A; NL7313531A; US3819270A; JPS505098A; FR2201064A1; AU6072373A

Description

DIPL-ΙΝΘ. CURT WALLAOM Telefon a»«*

DIPL-INe. 0PNTHER KOCH

DR. TINO HAIBAQH unser zeichen: 14 4-j Q

!LOOK EHGI1E5EB1-I&, IIO, Cambridge,, Massachusetts, Y,St*A,

Vorrichtung gum Ermitteln vc»n larajnetern von

TJi e Erfindung bezieht si en auf Verfatein und Yor/rightungen zum Erkennen -von Mustern und betrifft in.s.bgs.o,n,ie,r§ ein© Vorrichtung zum Klassifizieren νοϊΐ llutkQrp§3?q|ien ^zw* Blut

TÄe diiraii den PathQlQgen duj'Qiigefilhrti JC!La.§sifizierung einer Population von BlwfczellLen laeruht gmWmltQh mt fünf op tischen bzwo sichtbaren Parametern, die amf miteoslcopisehem Wege ermittelt werden, und zwar der Farbe, &röß:e, und. iQVm des Zellkerns nach einer entsprechenden lärbmig üswie der und Größe des gefärbten Zytoplasinas«? ^war ermBgli.Qht e Yerfahren eine ziemlieh gute Klasiiii^ie^Wifi d€i@h bgsehränkt sich seine Anwendbarkeit gewöhnlieh auf ©ine Population von einigen wenigen hundert Zell§n« irotz der- hochgradigen- Hi-* dundanz, mit der die Zellen identifiziert werden_? können bei diesem Yerfahren schwerwiegende fehler auftreten% ^^a ®$ §ieh bei den begrenzten Populationen möglich^w^ei.s,© nieht vm eine statistisch zuverlässige Probe handelte

Es sind bereits zahlreiche Yersuch.e gemacht worden_? eine Vorrichtung zu schaffen_s die es ermöglicht _% aiit.omatj.sgh die gleichen Parameter zu erkennen _% mit denen der- Patholoie ar·»' beiteta Beispielsweise gibt es bereits verschiedene

tungen, "bei denen elektronische Bildröhren in Verbindung mit Rechnern benutzt werden, um eine Mustererkennung zu ermöglichen· Jedoch "benötigt man "bei allen diesen bekannten Vorrichtungen regelmäßig eine sehr große Anzahl von Auflösungselementen und daher auch einen Rechnerspeicher mit einer entsprechenden Speicherfähigkeit und Größe, so daß diese Vorrichtungen gewöhnlich sehr kostspielig sind, einen komplizierten Aufbau haben und häufig viel Raum beanspruchen.

Bei mehreren bekannten automatischen Vorrichtungen zum Klassifizieren von Blutzellen werden Verfahren angewendet, bei denen keine Bilder erzeugt werden, und diese Klassifizierungsverfahren berücksichtigen daher gewöhnlich entweder nur die Größe oder nur die Farbe der Zellen. Jedoch führt bei diesen Vorrichtungen die regellose Orientierung der Blutzellen zu erheblichen Schwierigkeiten bei der Durchführung radiometrischer Messungen, so daß die Gefahr des Auftretens schwerwiegender Ungenauigkeiten bei der Klassifizierung der Blutzellen besteht _a

Da das Licht, das von optisch dünnen Teilchen durchgelassen wird? die durch einen Strahl beleuchtet werden, der breiter ist als der größte Querschnitt des Teilchens, von der Orientierung des Teilchens unabhängig ist, ist es bis jetzt üblich, die Anwendung photometrischer Verfahren bei gefärbten Zellen auf optisch dünne Zellen zu beschränken und den Farbstoff, die Farbstoffkonzentration oder die Wellenlänge entsprechend zu wählen. Jedoch führt diese Verfahrensweise zu erheblichen Rauschproblemen, da es hierbei erforderlich ist_? eine geringfügige Verkleinerung eines hellen Hintergrundsigaals zu messen» Praktisch handelt man bei dieser Verfahrensweise nur eine Fehlerquelle ₉ nämlich die Qrientierungsabhängigkeit des durchgelassenen Lichtes bei optisch, dicken Teilchen, gegen eine andere Fehlerquelle, nämlich, die Messung eines kleinen Signals in Gegenwart eines Rauschens bzw* von Störgeräuschen, ein*

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Um dieses letztere Problem zu vermeiden, werden gewöhnlich fluoreszierende Farbstoffe verwendet. Wird der Farbstoff auf eine solche Weise verwendet, daß das gefärbte Teilchen im Absorptionsband des Farbstoffs optisch dünn ist, und wird das Teilchen so "beleuchtet, daß auf den Detektor nur das von dem Teilchen abgegebene fluoreszierende Licht wirist, lassen sich die auf Hintergrundgeräusche und die Orientierungswirkung zurückzuführenden Schwierigkeiten vermeiden. Jedoch, ergeben sich "bei der Anwendung dieser Verfahren mehrere weitere Probleme. Erstens sind die Farbstoffe nur zu einem kleinen Prozentsatz fluoreszierend, und von den wichtigeren Farbstoffen, die zum Klassifizieren von Blutzellen verwendet werden, sind viele nicht fluoreszierende Zweitens stehen "bis jetzt offenbar nur wenige oder überhaupt keine chemischen oder klinischen Informationen über die biologischen Eigenschaften der größten Mehrzahl der fluoreszierenden Farbstoffe ziir Verfügung,, Um diese Eigenschaften zu ermitteln und ihren diagnostischen Wert- zu erkennen, müßte man zunächst ein größeres Forschungsprogramm, durchführen., Diese Forschungsarbeiten müßten sich auch mit der.Auslöschung der Fluoreszenz sowie der Energieübertragung befassen. Schließlich haben die Farbstoffstoffe solche Eigenschaften, daß ihre Absorptionsbänder und bei den fluoreszierenden Farbstoffen auch ihre Fluoreszenzbänder einerseits breit sind, wobei die Breite in der Größenordnung von 500 S. liegt, und daß andererseits die Absorptionsbänder in einem begrenzten Bereich des Spektrums liegen, für dessen Breite die Größenordnung von 10 000 % gilt« Sollen mehrere Farbstoffe miteinander kombiniert werden, müssen ihre Spektren gut voneinander getrennt sein; diese Bedingung ist bei fluoreszierenden Farbstoffen unvergleichlich schwerer zu erfüllen, daß sowohl das Absorptionsband als auch das Fluoreszensband eines bestimmten verwendeten Farbstoffs bei einer Kombination das Absorptionsband bzwV das Fluoreszenzband je- des anderen bei der Kombination verwendeten Farbstoffs nicht überschneiden darf_Q

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Der Erfindung liegt nunmehr die Aufgabe zugrunde, eine neuartige Vorrichtung zum Klassifizieren einer Anzahl von Blutzellen zu schaffen, bei der bestimmte Zellenparameter ohne Erzeugung eines Bildes gemessen werden, die den Erfordernissen der Hämatologie entspricht, bei der die betreffenden Blutzellenparameter ohne Erzeugung von Bildern unter Vorverar— beitung von Daten so gemessen werden, daß sich die Benutzung großer Rechengeräte erübrigt, bei der es möglich ist, eine Messung an Blutzellen durchzuführen, die sich in einem sich bewegenden Strom befinden, bei der die gewonnenen Meßwerte nur in einem minimalen Ausmaß mit einem orientierungsbedingten Fehler behaftet sind, bei. welcher ein Formfaktor einer Zelle oder eines Zellkerns aus gleichzeitiger Messung der Werte zweier verschiedener Formfunktionen gewonnen wird, bei welcher der Formfaktor ans der gleichzeitigen Messung von Größen gewonnen wird, die in Beziehung zum Volumen des Kerns und zur Oberfläche des Kerns stehen, bei welcher der Formfaktor aus der gleichzeitigen Messung von Größen ermittelt wird, die in Beziehung zur effektiven Dicke und ziiun Volumen des Zellkerns stehen, bei der die.Messungen so durchgeführt werden, daß die auf Orientierungsunterschiede zurückzuführenden Abweichungen auf ein. Minimum verringert werden, und bei der es daher möglich ist, bestimmte Messungen von Parametern an optisch dicken gefärbten Teilchen auf reproduzierbare Weise durchzuführen.

Die Erfindung und vorteilhafte Einzelheiten der Erfindung werden .im folgenden anhand schematischer Zeichnungen an mehreren Ausführungsbeispielen näher erläutert_o Es zeigt:

Figo 1 ein Blockdiagramm, das die Anwendung der Erfindung bei einer Vorrichtung zum Erzielen eines Differenzzähl— ergebnisses bezüglich bestimmter gewählter Arten von Blutzellen veranschaulicht;

Fig. 2 einen schematischen Längsschnitt einer Ausführangsform eines als Bestandteil der Vorrichtung nach Figo 1 benutzbaren optischen Systems;

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Fig. 3 einen schematisehen Längsschnitt einer anderen Ausführungsform eines "bei der Torrichtung nach Fig. 1 "benutzbaren optischen Systems;

Figo 4 ein sefrematisch.es Schaubild einer elektrischen Schaltung, "bei der es sich um eine Abwandlung eines Teils der Vorrichtung nach Fig. 1 handelt·,

Fig. 5 eine schematische Darstellung einer' Abwandlung eines optischen Systems, das dazu dient, die orientierungsbedingten Schwierigkeiten auf ein Minimum zu verringern; und

Fig· 6 einen teilweise als Ansicht gezeichneten Schnitt durch einen Seil eines bevorzugten optischen Systems für eine orientierungsunabhängige Meßvorrichtung.

Die Vorrichtung nach der Erfindung erfüllt die Erfordernisse der in hämatologischen Laboratorien angewendeten Praxis, es erfordert keine Fraktionierung der Zellen, es ist keine selektive Lysis erforderlich, und man benötigt nur eine geringe Anzahl von Lösungen,, Die untersuchte Probe wird nicht zerstört, so daß sie nach der Messung für weitere mikroskopische Untersuchungen oder andere diagnostische Prüfungen zur Verfügung steht« Von besonderer Bedeutung ist die Tatsache, daß es gemäß der Erfindung möglich ist, Blutzellen auf direktem Wege den HauptZeilenfraktionen zuzuordnen» Hierdurch werden die Fehler verkleinert, da keine Zählergebnisse als Restwerte ermittelt werden, wenn zwei andere Zählergebnisse als Differenz gewonnen werden, wie es z_o B₀ bei dem Verfahren geschieht, bei dem Monozyten als Hicht-Granulozyten bezeichnet werden, bei denen es sich auch um Eicht—Lymphozyten handeln könnte. ·

Der Ausdruck "Funktion" soll hier im mathematischen Sinne verstanden werden_s d» h_e _t er bezeichnet eine variable Größe, deren Wert oder Größe durch eine zweite variable Größe bestimmt ist. -Der Ausdruck "verschiedene Funktionen" bezeichnet

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im folgenden mehrere Funktionen, bei denen sich die Gesetze der Abhängigkeit von der zweiten variablen Größe unterscheidet.

Zur Lösung der genannten Aufgabe ist durch die Erfin- ' dung eine Vorrichtung geschaffen worden, zu der Einrichtungen gehören, die es ermöglichen, im wesentlichen gleichzeitig die V/erte von zwei verschiedenen formabhängigen Funktionen der Zelle oder ihres Kerns zu messen, und bei der eine Einrichtung vorhanden ist, die dazu dient, die Beziehung zwischen den beiden Größen oder Werten zu ermitteln» Beispielsweise kann die Eigenschaft des Vorhandenseins einer Kugelform als der gewünschte Formfaktor betrachtet werden. Für eine vollkommene Kugel gibt es mehrere verschiedene formabhängige Funktionen, und zwar normalerweise die Oberfläche A, den Rauminhalt V, die mittlere Querschnittsfläche X und die mittlere Dicke T. Man kann diese verschiedenen Funktionen wie folgt definieren:

A = Td² . (l)

X = m|)² (3)"

τ = ;r/|) d (4)

Hierin ist d der Durchmesser der Kugel.

Die Beziehung zwischen zwei beliebigen dieser formabhängigen Funktionen läßt sich durch einen Quotienten wie folgt ausdrucken:

CfCd))¹¹ ,,

0 9 8 16/082 S

Hierin sind η und m Exponenten, die so gewählt sind, daß d, das in erster Linie größena*bhängig ist, verschwindet. Ist z_e Bo f(d) gleich V, ist ferner 0(d) gleich S, und wenn m = 1 und η » 2/3 gilt, wird der Formfaktor für einen Zellkern, der eine vollkommene Kugelform hat, ein leicht zu "berechnender Grenzwert, der von der Größe von d ziemlich unabhängig ist. Alle gemessenen Abweichungen von diesem Grenzwert sind Maße für die Abweichung der Form des Kerns von der genauen Kugelform und "bestimmen daher einen Aspekt der Form_e Setzt man "beispielsweise f(d) = V und $(d) = T und wählt man m = 1 sowie η = l/3, nimmt der"Formfaktor 7 wiederum einen leicht zu "berechnenden Grenzwert an, der eine Kugel darstellt und entsprechend den vorhandenen Abweichungen von der genauen Kugelform variiert.

Bei einer Ausführungsform der Erfindung ist eine Einrichtung vorhanden, die dazu dient, eine Größe abzuleiten, die zum Volumen eines Zellkerns proportional ist, und zwar vorzugsweise durch Messen der fluoreszenten Reemission von Licht, das von der DNA des Kerns absorbiert wird, und gleichzeitig eine Größe abzuleiten, die in Beziehung zur Oberfläche des Kerns steht, und zwar vorzugsweise durch Messen der Zerstreuung des Lichtes durch den Kern. Ferner ist eine Einrichtung vorhanden, die dazu dient, einen Formfaktor, darin zu ermitteln, der zu einem Verhältnis zwischen der in Beziehung zum Volumen stehenden Größe und der in Beziehung zur Oberfläche stehenden Größe proportional ist.

Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden die beiden gewonnenen Größen jeweils in Beziehung zu anderen formabhängigen Faktoren gebracht, insbesondere zur schein-* baren Dicke bzw. zum Volumen eines Zellkerns, und ein Formfaktor wird aus dem Verhältnis zwischen diesen beiden Funktionen gewonnene Die Messung kann in diesem Fall auf der Absorption von Licht oder der fluoreszenten Reemission basieren. Die effektive Dicke wird gemessen, indem man die auf die

Selbstbeschattungsreduktion des gemessenen Volumens "bei den Wellenlängen prüft, "bei denen das Zeichnen optisch als dick erscheint. Diese Reduktion ist auf die Nichtlinearität der Beziehung zwischen der Lichtdurchlassigkeit und der Dicke zurü clczuführ en.

Pig. 1 zeigt eine Vorrichtung nach der Erfindung mit einer Quelle 20 für eine Probe von Blutzellen· Die Quelle ·, 20 läßt sich durch eine Rohrleitung 22 und ein Ventil 24 mit einer Mischkammer 26 verbinden. Die Mischkammer kann über eine Rohrleitung 28 und ein Ventil 30 mit einer Quelle 32 für einen Farbstoff oder ein Färbemittelbad verbunden werden. Der Auslaß der Mischkammer 26 ist an einen Einlaß eines Dialysators 34 angeschlossenj ein weiterer Einlaß des Dialysators läßt sich über eine Rohrleitung 36 und ein Ventil 38 mit einer Quelle bzw. einem Vorratsbehälter 40 für eine Dialysierlösung verbinden« Ein Auslaß des Dialysators dient zum Abführen des dialysierten Färbemittelt, und ein zweiter Auslaß des Dialysators ist mit einem Einlaß einer Verdünnungskammer 42 verbundene Ein weiterer Einlaß der Verdünnungskammer kann über eine Rohrleitung 44 und ein Ventil 46 mit einem Behälter 48 verbunden werden, in dem sich eine Verdünnungsflüssigkeit befindet.

Das Verdünnungsmittel, das dem Behälter 48 mit Hilfe des Ventils 46 entnommen und dosiert werden kann, ist vorzugsweise so gewählt, daß es für die Zwecke der Erfindung mehrere grundsätzliche Eigenschaften hat. Das Verdünnungsmittel soll dann, wenn es in einem dosierten Verhältnis der Suspension gefärbter Zellen aus dem Dialysator 34 beigefügt wird, die Brechungsindexwerte des Zellenzytoplasmas und der gemischten Flüssigkeiten einander anpassen; da es sehr erwünscht ist, in der Durchflußküvette eine im wesentlichen laminare Strömung aufrechtzuerhalten, muß das Verdünnungsmittel außerdem so gewählt sein, daß es dann, wenn es der Zellensuspension in dosierten Mengen beigefügt wird, die Viskosität

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des Flüssigkeitsstroms so einstellt, daß ein schnelles laminares Strömen möglich ist. Weiterhin muß das Verdünnungsmittel so gewählt sein, daß es "beim Beifügen zu der Zellensuspension einen optimalen osmotischen Druck "bezüglich der Zellen erreicht, um die Stabilität der Zellen aufrechtzuerhalten· In manchen Fällen kann man Pumpen Vorsehen, um die hohe Geschwindigkeit zu erzielen, mit der die Küvette,durchströmt wirdo In einem solchen Fall kann _{das Verdünnungsmittel auch dazu dienen, den osmotischen Druck einzustellen und hierdurch den durch die Pumpen hervorgerufenen hohen statischen Druck auszugleichen.

Die aus der Verdünnungskammer 42 austretende Flüssigkeit wird gemäß Fig. 1 einer Pumpe 50 zugeführt, welche die Flüssigkeit vorzugsweise zu einer zentral angeordneten Injektionsdüse 51 einer Durehflußküvette 52 fördert, der zusätzlich eine den Flüssigkeitsstrom umschließende weitere Flüssigkeit zugeführt wird. Die Durchflußküvette kann z. Bj so ausgebildet sein, wie es in "Advances in Automatic Analysis", Teehnieon International Congress 1970, Band 1 - Clinical (1971) auf den Seiten_x454 und 455 der Arbeit von Alex M. Saunders u. a. mit dem Titel "A Rapid Automated System for Differentiating and Counting White Blood Cells" beschrieben ist· Der die zentral angeordnete Injektordüse 51 umgebende Ringraum 53 ist an die Förderseite einer zweiten Pumpe 54 angeschlossen, deren Saugseite die Umhüllungsflüssigkeit von einem. Behälter 56 aus zugeführt wird_o Der Injektor 51 und der Ringraum 53 sind an einem Ende der Durchflußküvette 52 angeordnet, die im übrigen im wesentlichen als Rohr oder in Form eines anderen langgestreckten, nach außen abgeschlossenen Strömungskanals ausgebildet ist, der einen optisch durchsichtigen Abschnitt aufweist*

Beim Gebrauch des bis jetzt beschriebenen Teils der Vorrichtung*wird eine Probe von Blutzellen, die in einer Flüssigkeit suspendiert sind, zuerst in der Mischkammer 26

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mit einer konzentrierten Farbstofflösung aus dem Behälter 32 gemischt, "bei der es sich z. B. um ein Gemisch aus stabilisierten Quinacrinsenf und dem Wrightsehen Färbemittel handelte Der überschüssige Farbstoff wird dann durch eine Dialyse mit Hilfe der dem Behälter 40 entnommenen lösung in dem Dialysator 34 beseitigt, bis die Konzentration des Farbstoffs in der Trägerflüssigkeit um ein Vielfaches geringer ist als die Farbstoffkonzentration auf einer typischen Zelle« Hierauf wird die Probe in der Verdünnungskammer 42 mit einem Verdünnungsmittel aus dem Behälter 48 verdünnt, um eine ausreichende Trennung der Blutzellen in der Durchflußküvette 52 zu erreichen. Es ist möglich, daß die Verdünnung allein ausreicht, um die Konzentration des Farbstoffs in der Lösung zu verringern, so daß man ohne die Benutzung des Dialysators 34 auskommt. Es ist sogar erwünscht, die Benutzung des Dialysators zu vermeiden, da auf sein Vorhandensein der größte Teil des gesamten .. Zeitverbrauchs für eine Messung der Parameter einer Probe zurückzuführen ist; natürlich kann der zeitliehe Abstand zwi- sehen aufeinander folgenden Proben erheblich kleiner sein als die für jede Probe benötigte Zeito

Die verdünnte Probe wird dann mit Hilfe der Pumpe 50 durch den Injektor 51 in die Durchflußküvette 52 geförderte Hierbei wird der die Probe enthaltende Strom von einer Flüssigkeit umschlossen, die von dem Behälter 56 aus durch die Pumpe 54 über den Ringraum 53 zugeführt wird, so daß man einen schnell fließenden Probenstrom von kleinem Durchmesser erhält.

Wie erwähnt, ist die Durchflußküvette 52 so ausgebildet, daß ihr die eine Flüssigkeit in Form eines Stroms über die Injektordüse 51 zugeführt werden kann, während die den ersten Strom umschließende zweite Flüssigkeit in Gestalt eines ringförmigen Stroms durch die Pumpe 54 und den Ringraum 53 zugeführt wird« Die Strömungsgeschwindigkeiten des in der Mitte angeordneten Probenstroms und des ringförmigen Stroms bzw· des

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UmhüllungsStroms werden so geregelt, daß an der Vereinigungsstelle der "beiden Ströme eine laminare Strömung entsteht, so daß sich die "beiden Ströme gemeinsam "bewegen und der Umhüllungsstrom den Probenstrom praktisch einschnürt. Die -von dem Behälter 56 aus zugeführte Umhüllungsflüssigkeit ist vorzugsweise so gewählt, daß sie die erforderliche Viskosität hat, "bei der sich unter dem durch die Pumpe 54 erzeugten Druck eine laminare Strömung ausbilden·-kann. Außerdem ist die Umhüllungsflüssigkeit so zu wählen, daß die Werte des Brechungsindex der Umhüllungsflüssigkeit und des Probenstroms einander möglichst weitgehend angepaßt sind.

Gegebenenfalls kann es sich "bei dem Verdünnungsmittel in dem Behälter 4-8 und der Umhüllungsflüssigkeit in dem Behälter 56 um die gleiche Flüssigkeit handeln, obwohl die Erfordernisse, denen die beiden Flüssigkeiten entsprechen sollen, nicht die gleichen zu sein brauchen. Beispielsweise ist es erwünscht, den Brechungsindex und/oder die Viskosität der beiden Flüssigkeiten sowie den osmotischen Druck sorgfältig zu regeln, der an der Oberfläche von Probenzellen herrscht, welche in den Flüssigkeiten suspendiert sein können. Zu diesem Zweck handelt es sich bei den Flüssigkeiten vorzugsweise um wäßrige Lösungen, die beide Zusatzstoffe in Form von Polymerisaten und Zusatzstoffe in Form von Salzen enthalten. Der Brechungsindex wird durch Einstellen der Konzentration des Pollrcnerisats in der Lösung geregelt. Bei einer gegebenen Konzentration des Polymerisats kann man die Viskosität der Flüssigkeit einstellen, indem man einen entsprechenden Polymerisationsgrad, d. h., ein entsprechendes mittleres Molekulargewicht des Polymerisats wählt, d. h., einen Parameter ₉ der sich nur relativ wenig auf den Brechungsindex auswirkte Schließlich hat das Polymerisat auch nur einen geringen Einfluß auf den osmotischen Druck, so daß die Flüssigkeit zur Ergänzung ein gelöstes Salz enthalten kann, dessen Konzentration dazu dient, den osmotischen Druck auf einen bestimmten gewünschten Wert einzustellen_o

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Zu den typischen polymeren Zusatzstoffen zur Verwendung in der Verdünnungsflüssigkeit und der Umhüllungsflüssigkeit gehören somit Pqlyäthylenglycol und dergleichen sowie Blutplasmastreckmittel wie Dextran, Polyvinylpyrrolidon und dergleichen.'Natürlich handelt es sich bei dem beigefügten Salz gewöhnlich und vorzugsweise um gewöhnliches Ko ch-SaIz₀ _ ...

Die Durchflußküvette hat vorzugsweise einen runden Querschnitt, und ihr größter Durchmesser ist dem Austrittsende der Injektordüse 51 "benachbart, von der aus sich die Küvette nach unten verjüngt. Damit sich der gewünschte zentrale Probenstrom mit einem Durchmesser von z. B. 20 Mikron erzielen läßt, verjüngt sich die Durchflußküvette nach unten bis zu einem Innendurchmesser von etwa 200 Mikron. Beim Gebrauch einer solchen Durchflußküvette werden die Blutzellen von dem zentralen Strom mit hoher Geschwindigkeit in Form einer einzigen Reihe mitgeführt₀

Die beschriebene Durchflußküvette hält somit die Blutzellen im wesentlichen in Porm eines sehr dünnen Stroms zusammen, in dem sich die Blutzellen jeweils im wesentlichen einzeln an einem bestimmten Punkt vorbei bewegen, so daß diese nacheinander untersucht werden können. Da sich der zentrale Strom außerdem im wesentlichen axial bewegt, ist die Bewegung der Blutzellen weitgehend auf diese axiale Richtung beschränkt, und daher verbleiben die Zellen mit ausreichender Genauigkeit im Brennpunkt eines auf diesen Punkt' fokussierten optischen Systems· Im Hinblick hierauf weist die Vorrichtung nach der Erfindung ein elektro-optisches Teilsystem auf, das in Fig. 1 schematisch dargestellt ist» Zu diesem Teilsystem gehören vorzugsweise eine oder mehrere optische Einrichtungen 6O₉ z. B. Linsen, -Spiegel und dergleichen, mittels welcher getrennte Teile der Durchflußküvette 52 mit einer Strahlung beleuchtet werden, die mit Hilfe einer oder mehrerer Strahlungsquellen erzeugt wird,

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welche in Fig. 1 insgesamt in form einer Spektralliohtqueile 62 dargestellt sind. Bei einer typischen Anordnung ist -jeder optischen Einrichtung 60 ein Detektor 64 zugeordnet, der dazu dient, gewählte Strahlungsparäffleter der zugehörigen optischen Einrichtung 60 in ein elektrisches Signal zu verwandeln. . .

Der Deutlichkeit halber ist in Pig» 1 nur einer der Detektoren 64 als an weitere Einrichtungen elektrisch angeschlossen dargestellt _o Zu einem typischen Detektor gehören gemäß Pig. 2 eine Strahlungsquelle 62A und ein optisches System, hei dem es sich praktisch um ein umgekehrtes Mikroskop handelt, bei dem eine Okular linse 66 nahe der Strahlungsquel-Ie 62A angeordnet ist, während sich die Öb;jektivlinse 68 in der Nähe der Durchflußküvette 52 befindet« Zwischen den Linsen 66 und 68 ist eine Maske 70 angeordnet, die mehrere Öffnungen, z* B» Schlitze 72, aufweist* Das durch die Linsen 66 und 68 gebildete Mikroskop ist so angeordnet, daß die Strahlung der Quelle 62A durch die Linse 66 und die Maske oder Blende 70 in mehrere scheinbare Lichtquellen umgewandelt und durch die Oboektivlinse 68 an einer entsprechenden Anzahl von Punkten fokussiert wird, die im wesentlichen in axialer Sichtung längs der Mittelachse des zentralen Stroms in der Durchflußküvette 52 fokussiert werden*

Auf der entgegengesetzten Seite der Burchflußkiivett-e und gewöhnlich auf der gemeinsamen optischen Achse der Linsen 66 und 68 ist eine weitere Linse 74 angeordnet:, bei der es sich z. B₀ um ein Mikroskopobjektiv handelt, das die gleiche numerische Apertur hat wie die Linse 68, so daß es die gesamte, von der Quelle 62A kommende, von der Linse 68 durchgelassene Strahlung aufnimmt. Zwischen der Linse 74 und ihrer Brennebene ist eine mit öffnungen versehene Blende 76 angeordnet· Die Öffnungen 78 sind bei der Blende 76 so verteilt, daß das von jeder der öffnungen 72 der Blende 70 kommende Licht im wesentlichen so fokussiert wird, daß es durch eine zugehö-

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rige Öffnung 78 der Blende 76 fällt. Auf der von der Linse 74- angewandten Seite jeder Öffnimg 78 sind optische Umlenkeinrichtungen, z. B. Spiegel oder Prismen 79, angeordnet, die dazu dienen, das durch, jede Öffnung 78 fallende Licht unter einem zugehörigen anderen Winkel bzw. in einer anderen Richtung gegenüber der gemeinsamen optischen Achse der Lin— " sen 66, 68 und 74 umzulenken. Das System nach Fig. 2 kann außerdem mehrere PiIter 80 aufweisen, die jeweils im Weg des von dem zugehörigen Prisma 79 abgelenkten Lichtes angeordnet sind,, MLe PiIter 80 können z. B. so gewählt sein, daß nach Wunsch nur bestimmte Wellenlängen beobachtet werden können. Zum nachweisen der durch die verschiedenen Filter SO durchgelassenen Strahlung sind zugehörige Detektoren 82 jenseits der Filter angeordnet. Bei den Detektoren 82 kann es sich z. B. um Photo dioden mit einer äußerst kurzen Steigzeit oder um Photozellen anderer bekannter Arten handeln.

Bei dem soeben beschriebenen optischen System nach I¹Ig. 2 kann es sich bei der Strahlungsquelle 62A ζ. 2, um eine Quelle für ein bestimmtes Spektrum handeln., z. B. eine Xenonlampe von hoher Intensität, der gegebenenfalls ein Aus— gangsfilter der gewünschten Art zugeordnet ist« Us ist von ziemlich großer Bedeutung, dafür zu sorgen, daß eine Anzahl von Bildern eingestellt wird, die der Anzahl der Öffnungen 72 der Blende TO entsprechen,, und daß diese Bilder einander längs der Achse der Ihirehflußküvette 52 ziemlich nahe benachbart sind» Bei einer solchen Anordnung verkürzt sieh die Zeit, während welcher eine einzige Zelle von einem Bild oder Lichtfleck auf den nächsten übergeht und den zugehörigen Detektor 82 aktiviert, auf ein Minimum, so daß auch die Folgen von Abweichungen bezüglich der Geschwindigkeit der sieh durch die Durchflußküvette 52 bewegenden Zellen mogliehst weitgehend verringert werden» Diese Verringerung des Geschwindig— keitsfehlers auf ein Minimum ist insbesondere in Fällen von Bedeutung, in denen es erwünscht ist, aufeinander folgende Meßwerte der gleichen Zelle in Beziehung zueinander zu set -

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zen, um die Zelle auf der Basis versehiedener Messungen zu charakterisieren.

Ferner ist zu bemerken, daß- die anhand von Pig. 2 beschriebene Anordnung "besonders geeignet ist, sowohl die Absorption als auch die Durchlässigkeitseigenschaften einer Blutzelle zu ermitteln. Um die Streuung zu messen, kann man das in Fig. 3 dargestellte optische System "benutzen, zu dem eine Strahlungsquelle 62B, eine mit einer Öffnung versehene Blende 71 und eine linse 68 gehören. Diese Elemente sind so angeordnet, daß sie die durch die Öffnung der Blende 71 fallende Strahlung in einem Punkt fokussieren, der auf der Achse der Durchflußküvette 52 liegt. Ferner gehören zu dem optischen System nach Fig. 3 eine weitere Linse 74, ein Raster 75 und ein Detektor 82. Bei dem Raster oder Schirm 75 handelt es sich einfach um eine undurchsichtige Fläche mit einer ringförmigen Öffnung 77, die eine lichtundurchlässige zentrale Fläche umgibt. Die Linse 74, der Schirm bzw._:. die Blende 75 und der Detektor 82 sind in Beziehung zueinander sowie zu der Durchflußküvette 52 auf bekannte Weise so angeordnet, daß das Licht, welches durch ein Teilchen in der Küvette innerhalb eines bestimmten Winkelbereichs zerstreut wird, durch den Detektor 82 nachgewiesen wird.

Gemäß Fig. 1 sind den Detektoren 82 jeder Detektoranordnung 64 mindestens zwei Ausgangsleitungen 84 und 85 zugeordnete Das in der Leitung 84 erscheinende Signal ist mit Z bezeichnet, während das in der Leitung 85 erscheindende. Signal mit Y bezeichnet ist. Es kann angenommen werden, daß jedes der Signale X und Y eine andere formabhängige Funktion einer bestimmten Zelle repräsentiert, die durch die betreffende Wahl der Eingangs strahlung "-für die Zelle, die gewählte Ausgangsstrahlung der Zelle, die Lage der Eingangsstrahlung gegenüber der Zelle und die Anordnung des Detektors und der zugehörigen optis chen Systeme gegenüber der Ausgangsstrahlung der Zelle bestimmt ist. Die Leitung 84 dient dazu,

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das Signal X dem Eingang eines Funktionselements 86 zuzuführen, das geeignet ist, aus dem Signal X ein Ausgangssignal zu erzeugen, das ein Exponent!alsignal in der Form. Iⁿ'^m ist, "bei dem η und m ?/erte sind, die· entsprechend der Art der formabhängigen Funktionen gewählt sind, bei denen es sich um X bzw· Y handeln kann. Zu dem Funktionselement 86 kannreine "beliebige Anzahl bekannter elektronischer Schaltungselemente gehören» Beispielsweise kann das Element 86 ein Diodenfunktionsgenerator sein, dessen Ausgangsstrom eine beliebige Funktion einer Eingangsspannung ist. Solche Diodenfunktionsgeneratoren werden unter der Typenbezeichnung SPFX-N/P von der Firma Teledyne Philbrick/Nexus, Dedham, Massachusetts, VoSt₀Aa auf den Markt gebracht und sind in der Druckschrift "Teledyne Philbrick/Nexus Bulletin EM, File No. 1100" beschrieben.

Das Ausgangssignal des Funktionselements 86 wird einem Eingang eines Quotientenmessers 88 zugeführt, dessen zweiter Eingang an eine Leitung 85 angeschlossen ist. Wenn in der Leitung 85 eine Spannung erscheint und das Ausgangssignal des Funktionselements 86 ein Strom ist, muß man Spannung/Strom-Umwandlungseinrichtungen in mindestens eine der Leitungen einschalten, um zu erreichen, daß die beiden Eingangssignale für den Quotientenmesser 88 zu ähnlichen Parametern werden. Bei dem Quotientenmesser 88 handelt es sich um eine Einrichtung bekannter Art, der man zwei verschiedene Eingangssignale zuführen kann, und die ein Ausgangssignal liefert, das dem Verhältnis bzw_o dem Quotienten der beiden Eingangssignale entsprichtο Das Ausgangssignal des Quotientenmessers 88 hat z. B. die Form f(X^r)/f (Y), wobei X* gleich X¹¹'¹¹¹ ist. Somit entspricht das Ausgangssignal des Quotientenmessers 88 einem bestimmten Formfaktor, der für das Teilchen giltο Genau genommen treten natürlich die beiden Eingangssignale für den Quotientenmesser 88 oft nicht gleichzeitig auf, wenn die zugehörigen Detektoren nacheinander getriggert werden,» Daher muß

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man die "beiden Eingangssignale "zeitlich aufeinander abstimmen, ζ. Β«, dadurch, daß man in die Leitung 84- eine Verzögerungsleitung einschaltet, oder daß man ein bekanntes Verfahren zum Abfragen und Pesthalten des Signals anwendet. Diese Verfeinerungen sind in den Zeichnungen der Deutlichkeit halber nicht dargesteilt,und eine nähere Erläuterung dürfte sich erübrigen, da diese Verfeinerungen bekannt sind.

Damit das Ausgangssignal des Quotientenmessers 88 bzw. der Formfaktor zum Klassifizieren von Blutzellen benutzt werden kann, ist gemäß Pig«. 1 eine Schaltung vorhanden, bei der der Ausgang des Quotientenmessers 88 in Parallelschaltung jeweils an den ersten Eingang mehrerer Komparatoren 9Oj 92 und 94 angeschlossen ist. Zu jedem Komparator gehört ein zweiter Eingang, der mit einer zugehörigen Quelle 96 bzw. 97 bzw» 98 für Bezugssignale verbunden ist_c Die Ausgänge der Komparatoren 90, 92 und 94 sind an Zähleinrichtungen 100, und 102 angeschlossen. Die drei Komparatoren sind auf bekannte Weise als mit einem Schwellwert arbeitende Komparatoren ausgebildet, die nur dann einen Ausgangsimpuls liefern, wenn das Eingangssignal größer bzw. kleiner ist als die Amplitude des Bezugssignals, das der zugehörigen BezugsSignalsquelle . entnommen wird. Da solche Komparatoren bekannt sind, dürfte sich eine nähere Erläuterung erübrigen.

Beim Betrieb der vorstehend beschriebenen elektro-optisehen Vorrichtung wird der Formfaktor y als das Verhältnis zwischen zwei beliebigen von mehreren verschiedenen formabhängigen Punktionen abgeleitet» Wenn eine Blutzelle die Durchflußküvette 52 durchläuft, werden somit mindestens zwei formabhängige Punktionen dieser Zelle gemessene

Beispielsweise kann man als die beiden gewünschten formabhängigen Punktionen die mittlere effektive Dicke des Zellkerns und das Volumen des Zellkerns wählen« Um die Werte dieser Punktionen zu ermitteln, braucht man dann nur auf einfache Weise die lichtabsorption der Nukleinsäure in zwei aus-

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gewählten Wellenlängenbereichen zu messen. Bei einem dieser Wellenlängenbereiche (etwa 2 80mji für DNA) sind die Kerne weißer Blutzellen gewöhnlich optisch dicht, während sie bei einigen anderen Wellenlängen optisch dünn sind. Diese Wel— lenlängenbereiche können dadurch gewählt werden, daß man gemäß Figo 2 die Filter 80 und das spektrale Aus gangs signal der Strahlungsquelle 62A entsprechend wählt. Durch die Selbstbeschattung wird daher das Verhältnis zwischen diesen beiden Meßwerten zu einem nichtlinearen, dickenabhängigen Wert gemachte Diese Quotientenmessung liefert ein Maß für die optische Tiefe und daher auch für die mittlere effektive Dicke des Zellkerns. In diesem Fall muß man die Schaltung nach Fig. 1 so abändern, wie es in Fig_s 4 gezeigt ist, bei der eine Quo t i en t enme ß schal tung .104 an die Leitungen 84 und 85 angeschlossen ist, um das Verhältnis Χ/Υ zu ermitteln. Das Ausgangssignal der Quo ti ent enme ß schaltung 104 wird dann als Eingangssignal dem Funktionselement 86 zugeführt. Man kann das Ausgangssignal des'Funktionselements 86 gemäß Fig. 4 als f(Z) oder als Zⁿ'^m betrachten, während man das Ausgangssignal- der Quotientenmeßschaltung 104 als das Glied

f(X)/f(Y) betrachten kann₀ Somit entspricht das Ausgangssignal des Quotientenmessers 88 dem Ausdruck f (Z¹ )/f (Y), wobei Z¹ gleich Zⁿ'^m ist«, Die Messung in dem V/ellenlängenbereich, in dem der Zellkern optisch dünn ist, liefert das Signal Y, das zum Volumen des Zellkerns proportional ist. Dieser Meßwert wird in dem Quotientenmesser 88 in der schon beschriebenen Weise in Beziehung zu den'Angaben des Funk— tionselements 86 über die Dicke gebracht_} so daß man einen die Form der Zelle beschreibenden Faktor erhält,

Messungen,, die an einem optisch dicken, licht absorbierenden Körper durchgeführt werden, sind gewöhnlich orientierungsbzw» lageabhängig, dc, h. selbst wenn die auf die Zelle treffende Strahlung eine konstante Amplitude hat, richtet sich das Ausmaß der durch den Detektor nachgewiesenen Absorption in einem erheblichen Ausmaß nach der räumlichen

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Orientierung der Kernbestandteile, wenn diese nicht z_o B. symmetrisch in Form einer Kugel angeordnet sind·

Um den Einfluß der Orientierung möglichst zu verringern, muß die Zelle mit Hilfe einer entsprechenden Anordnung aus mehreren verschiedenen Richtungen "beleuchtet werden, und diese Anordnung muß so ausgebildet sein, daß die Summe der Signale, die dem "beobachteten Zellen- oder Kernquerschnitt entsprechen, von der Orientierung im wesentlichen unabhängig, d. h. im wesentlichen invariant sind_o Im Idealfall sind mindestens drei solche Eichtungen vorhanden, die im Idealfall außerdem im rechten Winkel zueinander verlaufen, "bzw. zwischen denen jeweils mindestens ein Winkel von 60 vorhanden ist· Als Beispiel zeigt Pig. 5 schematisch die einfachste Form einer solGhen Anordnung, Tdei der drei getrennte Strahlungs— quellen 162A, 162B und 162C vorhanden sind, deren Anordnung derart ist, daß sie drei Lichtstrahlen in zueinander rechtwinkligen Eichtungen so aussenden, daß diese Strahlen einen gemeinsamen Punkt 163 durchlaufen, der vorzugsweise auf der Längsachse der Durchflußküvette 52 liegt. Auf entsprechende V/eise sind drei Detektoren 164A, 164-B und 164C so angeordnet, daß sie die Strahlung nachweisen können, die z.B. vom Kern einer Zelle ausgesandt wird, welche sich an dem Punkt 163 "befindet, und der Strahlung der Strahlungsquellen 162A, 162B und 162C ausgesetzt ist. Die drei Detektoren, die sich nach der von ihnen empfangenen Strahlung richtende elektrische Ausgangssignale erzeugen, sind auf ihrer Ausgangsseite an eine Summierungseinrichtung 166 angeschlossen«, Das von der Summierungseinrichtung abgegebene Signal, das der Summe aller Eingangssignale entspricht, wird "bei' einem bestimmten Aggregat von Teilchen mit einer "bestimmten Form und Größe, das sich an dem Punkt 163 befindet, ohne Rücksicht auf die Orientierung des Teilchenaggregats im wesentlichen invariant sein»

natürlich brauchen sich die Strahlen der Strahlungsquellen 162A, 162B und 162C nicht zu schneiden, sondern sie

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können eine die Durchflußküvette 52 durchlaufende Blutzelle auch nacheinander beleuchten, wenn anzunehmen ist, daß sich die Orientierung der Blutzelle gegenüber den Strahlungsquellen nicht wesentlich ändern wird. Bei einer solchen Anordnung kann man die Ausgangssignale der verschiedenen Detektoren 164A 164B und 164-C auf "bekannte Weise verzögern oder speichern, damit sie in einem späteren Zeitpunkt summiert werden können_o

Alternativ kann man eine Einrichtung, z. B₀ einen spiralförmigen Eingangskanal für die Durchflußküvette 52, vorsehen, um eine bekannte Drehung der sich längs der Achse der Durchflußküvette bewegenden Blutzöllen um eine oder meh-. rere Achsen zu "bewirken. Wenn man "bei einer solchen Anordnung nur eine Lichtquelle benutzt, um ihr licht auf einen ge« nügend großen Fleck zu fokussieren, kann die Blutzelle in aufeinanderfolgenden Zeitpunkten von dem Lichtstrahl nacheinander aus mindestens zwei und vorzugsweise aus drei zueinander rechtwinkligen Richtungen getroffen werden. In diesem Pail genügt ein einfacher Detektor, der auf entsprechende aufeinanderfolgende Pegel der Strahlungsausgangssignale der Blutzelle anspricht, ausreichen, um eine Einrichtung zu speisen, die schließlich die aufeinanderfolgenden Signale summiert.

Natürlich können die vorstehend beschriebenen Vorrichtungen nur diejenigen Abweichungen ausschalten, welche auf die regellose Orientierung zurückzuführen sind, wenn es sich um Objekte von einfacher geometrischer Form handelt, z. B» um Zylinder, Sllipsoide oder dergleichen. Je weniger symmetrisch das Objekt ist, desto größer wird die Anzahl der Beleuchtungs- und Beobachtungsrichtungen, die erforderlich sindj um den Einfluß der Orientierung im wesentlichen zu beseitigen. Im Grenzfall ermöglicht es eine halbkugelförmige Beleuchtung des Objekts in Verbindung mit einer halbkugelförmigen Sammlung der von dem Objekt ausgehenden Strahlung, auf die Orientierung zurückzuführende Abweichungen des Ausgangssignals auch bei den kompliziertesten Formen vollstän-

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dig auszuschalten« Eine Vorrichtung, die dazu bestimmt ist, eine Annäherung an eine solche ideale Arbeitsweise zu ermöglichen, ist in Pig. 6 dargestellt; bei dieser Vorrichtung muß die Beleuchtung durch eine Linse 68 mit einer sehr großen Apertur, die z. B. größer ist als 90°, bewirkt werden, und im Idealfall muß sich der Beleuchtungskegel~einer Apertur von l80 annähern. Dies läßt sich gemäß Fig. 6 durch Anwendung des Immeraionsverfahrens erreichen, bei dem der Raum zwischen der Objektivlinse und der Wand der Durchflußküvette 52 mit einer Flüssigkeit 69 gefüllt ist, die einen hohen Brechungsindex hat, der z_o B. größer ist als 1_? und der vorzugsweise auf den Brechungsindex der Trägerflüssigkeit in der Durchflußküvette abgestimmt ist» Auf diese Weise lassen sich Beleuchtungskegel mit einem Winkel von über 160° erreichen. Bei einem Y/eitwinkelbeleuehtungskegel mit gleichmäßiger Strahlungsdichte ergibt sich zwischen dem die Strahlung absorbierenden Objekt von beliebiger Form und der zu dem Objekt gelangenden Strahlung eine solche Wechselwirkung, daß der Einfluß der Orientierung nahezu vollständig beseitigt wird. Dies ist darauf zurückzuführen, daß ohne Rücksicht auf die Lage des die Strahlung absorbierenden Objekts die auf das Objekt unter einem bestimmten relativen Winkel auftreffende Lichtmenge stets die gleiche ist. Sollte- sich der das Licht absorbierende Körper drehen, enthält ein bestimmter Einfallswinkel zwar verschiedene Strahlen, doch wird die Gesamtintensität der Strahlenbündel konstant sein.

■ Man kann einen Formfaktor auch dadurch erhalten, daß man Messungen bezüglich des Zellkernvolumens und der Zellkernoberfläche durchführt und die gewonnenen Meßwerte so in Beziehung zueinander setzt, daß man einen Formfaktor gewinnt< > Wie erwähntj wird das Zellkernvolumen am besten auf photometrische Weise durch. Messen des DNA-Gehalts ermittelt* Zusätzlich zum Messen unter Ausnutzung der direkten Strahlungsabsorption in einem Bereich, in dem der Kern optisch dünn ist, kann man das Kernvolumen auch dadurch ermitteln,

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daß man die fluoreszente Reemission des absorbierten Lichtes mißto Dies kann in manchen Fällen vorzuziehen sein, denn wenn man "bei Absorptionsmessungen einen guten Störabstand erzielen will, muß ein erheblicher Bruchteil des Lichtes absorbiert werden» Andererseits läßt sich bei Fluoreszenzmessungen der gleiche Störabstand schon bei erheblich kleineren Signalen erreichen. Ist ein guter Umwandlungswirkungsgrad zwischen der Absorption und der nachfolgenden Fluoreszenzemission vorhanden, kommt man bei Fluoreszenzmessungen mit einer erheblich geringeren Absorption aus. Eine solche geringe Absorption ist erwünscht, da sie die Wirkung der Selbstbeschattung eines Teils des Kerns durch einen anderen Teil verringert, die zu einer Verfälschung der Beziehung zwischen den Meßwerten und dem gesamten DBA—Gehalt führt. Fluoreszenzmessungen sind a/ußerdem bei nicht kugelförmigen Zellkernen in einem geringeren Ausmaß orientierungsabhängig.

Wenn die Abmessungen der Teilchen in der Größenordnung von nur wenigen Wellenlängen liegen, ist es möglich, die in Beziehung zur Oberfläche stehende Größe mit Hilfe der Zerstreuung des Lichtes durch das Molekulargefüge des Zellkerns zu messen. Da sich die Streuung o"e Raumeinheit eines Teilchens verstärkt, wenn das Teilchen kleiner wird, zerstreut eine Gruppe von kleinen Teilchen daher mehr Licht als ein einziges Teilchen des gleichen Körpers. In diesem Fall muß man jedoch die Störstreuung ausschalten. Eine solche Störstreuung ist gewöhnlich auf zwei Ursachen zurückzuführen, und zwar erstens auf die Streuung durch das Zytoplasma der Blutzellen, die man ausschalten kann, indem man den Brechungsindex der die Blutzelle mitführenden Flüssigkeit in der weiter oben beschriebenen Weise an das Zytoplasma anpaßt, zweitens auf die Streuung an der Membran der Blutzelle, die sich bei ziemlich dicken Membranen, wie sie bei Erythrozyten anzutreffen sind, sowie drittens auf die Kolloidstreuung, die durch die gesamte Zelle und das sie umgebende Lösungsmittel zurückzuführen ist. Man kann die Streuung durch die Erythrozyten aus-

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schalten, indem man- einen Detektor 64 "benutzt, der Hämoglobin nachweist, und indem man das Ausgangssignal dieses Detektors verwendet, um eine auf Erythrozyten zurückzuführenden Signale auszutasten. Die Kolloidstreuung ist in der Vorwärtsrichtung sehr stark konzentriert, und daher,ermöglicht es die Benutzung einer Detektor optik, "bei der ein Nachweis des vollständig nach vorn gestreuten Lichtes vermieden wird, den Einfluß der Kolloidstreuung auf ein Minimum zu verringern«.

Das Streuungsverhalten kleiner Teilchen von "beliebiger Form und Größe in der Größenordnung von nur wenigen Wellenlängen ist äußerst kompliziert. Jedoch "best'eht bezüglich des zu ermittelnden formabhängigen Faktors nicht die Notwendigkeit, für eine besondere Linearität oder Genauigkeit zu sorgen, so daß unter der Voraussetzung, daß die Streuungswir— kung bei kleineren Teilchen zunimmt, die Möglichkeit besteht, zwischen einem großen Teilchen mit einem bestimmten Volumen und einer Gruppe kleinerer Teilchen zu unterscheiden, die das gleiche Gesamtvolumen hat„ Daher besteht die einzige zu erfüllende Forderung bezüglich der größenabhängigen Funktion, die auf der Streuung beruht, darin, daß sie einen Anstieg aufweist, der sein Vorzeichen nicht ändert. Insbesondere dann, wenn die Streuung ausgenutzt wird, um einen formabhängigen Faktor zu bestimmen, ist es wichtig, eine- Strahlungsquelle mit großer Bandbreite zu benutzen, d. h., eine Strahlungsquelle, deren Strahlung bei Amplituden, die über einem bestimmten Mindestpegel liegen, mindestens eine Wellenlängenoktave überstreicht. Natürlich muß auch der benutzte Detektor im wesentlichen eine der Bandbreite der Strahlungsquelle entsprechende Empfindlichkeit haben. Durch Benutzen einer solchen Breitband-Strahlungsquelle, und eines Breitbanddetektors erzielt man eine Glättung der Streuungsfunktion vorzugsweise in Form einer Kurve, deren Anstieg ein im wesentlichen invariantes Vorzeichen hat.

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Sobald man die beiden Punktionen Σ und Y bzw. Z und Y gewonnen hat und diese durch das Punktionselement 86 normalisiert und durch den Quotientenmesser 88 verarbeitet worden sind, läßt sich ein Kernformfaktor für jede die Durchflußküvette 52 durchlaufende weiße Blutzelle festlegen. Durch Vergleichen der Größe jedes solchen Faktors mit Hilfe der Komparatoren 90, 92 und 94 mit entsprechenden verschiedenen Bezugsgrößen, die einer zugehörigen Bezugssignalquelle entnommen werden, ist es dann nach Bedarf möglich, diejenigen Formfaktoren zu zählen, die 'bei dem gewählten Klassifizierungsschema z. B. jeweils ausgesprochen kugelförmige Zellen bzw. sehr wenig kugelförmige Zellen bzw. Zellen mit einem mittleren Grad der Kugelförmigkeit repräsentieren. Eine solche Klassifizierung beschränkt sich natürlich nicht notwendigerweise auf eine bestimmte Anzahl von Klassen. In der Praxis brauchen die Ausgangssignale der Komparatoren nicht direkt gezählt zu werden, sondern sie können Zähleinrichtungen entsprechend ihrer jewd ligen Zuordnung zu weiteren Merkmalen der Blutzellen zugeführt werden, die sich z. B. mit Hilfe weiterer Detektoren 64 ermitteln lassen.

Ansprüche;

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Claims

ANSPRÜCHE

γ ld Vorrichtung zum Ermitteln von Parametern, einer in einem sich axial 'bewegenden Strom suspendierten Blutzelle, dadurch gekennzei c h η e t , daß ein erstes optisches System (62, 60) zum Beleuchten der Blutzelle mit einer bestimmten Strahlung vorhanden ist, daß ein zweites optisches System (64) vorhanden is"fe, dessen numerische Apertur gleich derjenigen des ersten optischen Systems oder größer ist, und das dazu dient, die Strahlung zu sammeln, die von der Blutzelle als folge davon ausgesandt wird, daß sie von der Strahlung des ersten optischen Systems gebrochen wird, daß eine Petektoreinrichtung (82) vorhanden ist, die ein Signal erzeugt, das der gesamten von dem zweiten optischen System gesammelten Strahlung entspricht, und daß das erste optische System so ausgebildet ist, daß es die Blutzelle aus mehreren verschiedenen Sichtungen "beleuchtet, so daß das Signal von der Orientierung der llutzelle im we-> s ent liehen umabhangig ist«

2_Q Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η <zeichnet, daß das' optische System (l62A, 162B_? 1620) so ausgebildet ist, daß es. mindestens drei voneinander unabhängige StrahlungsTDundel erzeugt, die sich im wesentlichen rechtwinklig zueinander erstrecken,

3« Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zu dem zweiten optischen System mehrere optische Lichtsammeieinrichtungen (l64A, 164B, 164C) gehören, deren Anzahl der Anzahl der Strahlungs"bündel entspricht, und von denen jede so angeordnet ist, daß sie die Strahlung sammelt, die von der Blutzelle ausgesandt wird, da sie von dem zugehörigen StrahlungsMndel getroffen wirdo

4. Vorrichtung nach Anspruch 3* dadurch gekennzeichnet, daß eine Einrichtung (166) zum Summieren

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der gesamten. Strahlung vorhanden ist, welche durch die Sammeleinrichtungen (l64A, 164B, 164G) gesammelt wird, und daß zu der Einrichtung zum Nachweisen der Strahlung ein Detektor gehört, der im wesentlichen für die gesamte Strahlung empfindlich ist.

5. Vorrichtimg nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß zu der Detektoreinrichtung eine entsprechende Anzahl von Detektoren (64, 82) gehört, von denen jeder im wesentlichen für die· Strahlung empfindlich ist, die durch die zugehörige lichtsammeleinrichtung gesammelt wird, so daß ein entsprechendes Signal erzeugt wird, und daß eine Einrichtung (166) zum Summieren aller Signale der Detektoren vorhanden ist,

6. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zu der ersten optischen Anordnung eine iünrichtung (68) gehört, die dazu dient, eine Strahlung innerhalb eines vorbestimmten Y/ellenlängenbandes innerhalb eines Strahlungskegels mit einem Öffnungswinkel, von mehr als 90° auf mindestens einen im wesentlichen auf der Achse des sich "bewegenden Stroms liegenden Brennpunkt richtet, und daß die Detektoreinrichtung im wesentlichen für eine Strahlung innerhalb des gesamten genannten Wellenlängenbandes empfindlich ist, so daß sie ein der nachgewiesenen Strahlung entsprechendes Signal erzeugt.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß zu der Einrichtung zum Aussenden der gerichteten Strahlung ein einziges Brechungselement (68) gehört, das dazu dient, mehrere Strahlungskegel auf eine entsprechende Anzahl von Brennpunkten ^u richten, die einander benachbart, jedoch längs der Achse einer Durchflußküvette (52) durch Abstände getrennt sind, daß zu der Detektoranordnung mehrere entsprechende Detektoren gehören, die im wesentlichen für die Strahlung, empfindlich sind, welche von den zugehörigen Brennpunkten ausgeht, und daß zu dem

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zweiten optischen System eine Einrichtung gehört, die dazu dient, die von jedem Brennpunkt ausgehende Strahlung zu sammeln und die von jedem Brennpunkt ausgehende Strahlung einem zugehörigen !Detektor zuzuführen.

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