DE2746939A1

DE2746939A1 - Glucose isomerierendes enzym

Info

Publication number: DE2746939A1
Application number: DE19772746939
Authority: DE
Inventors: Chin Kee Lee
Original assignee: RJ Reynolds Tobacco Co
Current assignee: RJ Reynolds Tobacco Co
Priority date: 1976-10-20
Filing date: 1977-10-17
Publication date: 1978-04-27
Also published as: FR2368538A1; NL7711563A; NO148297B; BG33589A3; JPS5352684A; PL201627A1; CH635128A5; AR218040A1; DK143947C; CA1107209A; JPS5820269B2; IL53095A; BE859830A; NO148297C; FR2368538B1; IT1086910B; YU243977A; RO73285A; ATA750677A; FI773006A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Enzym, das geeignet ist für die Isomerierung von Glucose zu Fructose sowie die Herstellung des Enzyms und dessen Einsatz in dem Isomerierungsverfahren.

In den letzten Jahren hat sich erhebliches Interesse auf die Enzymumwandlung von Glucose zu Fructose konzentriert - insbesondere in Verbindung mit der Herstellung von Fructose enthaltenden Sirupen aus Maisstärke. Die für diese Umwandlung eingesetzte Glucoseisomerase lässt sich aus Mikroorganismen verschiedener Gattungen einschl. Arthrobacter, Streptomyces, Bacillus und Actinoplanes erhalten. Eine weitere Quelle von Glucoseisomerase ist kürzlich in der US-PS 3.956.066 offenbart worden, die die Herstellung von Glucoseisomerase durch Falvobacterium devorans offenbart.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, dass bestimmte Stämme der Spezies Flavobacterium arborescens in der Lage sind, Glucoseisomerase in erheblichen Mengen abzugeben. Dieses

Enzym selbst ist ausgezeichnet geeignet für die Verwendung in einem Glucoseisomerisierungsverfahren.

Obgleich die hier offenbarten Organismen als Mitglieder der Spezies Flavobacterium arborescens identifiziert sind, wird darauf hingewiesen, dass die richtige Plastifizierung dieser Organismen offenbar kontrovers ist. Auf den Seiten 362-363 der 8. Auflage von Bergeys "Manual of Determinative Bacteriology" ist angegeben, dass die Spezies F.arborescens als Mitglied der Gattung Flavobacterium unrichtig klassifiziert ist. Eine neue Klassifizierung und revidierte Nomenklatur gibt es für diese Organismen jedoch noch nicht. Es soll daher hier die vorliegende Nomenklatur verwendet werden - mit dem Hinweis, dass in der Zukunft bei einer Reklassifizierung für Flavobacterium arborescens eine neue Bezeichnung übernommen werden wird. Es wird schließlich auch darauf hingewiesen, dass Flavobacterium devorans der US-PS 3.956.066 nicht umklassifiziert wird und es sich hier um ein Mitglied einer anderen Gattung handelt.

Die in der Verbindung mit der vorliegenden Erfindung eingesetzten bevorzugten Organismen sind mutierte, aus der Kultur ATCC 4358 isolierte Stämme, die von der America Type Culture collection erhältlich ist. Die bevorzugten Stämme von F.arborescens, die in der Lage sind, erhebliche Mengen Glucoseisomerase zu erzeugen, sind in der permanenten ARS Culture Collection des USDA Northern Regional Research Laboratory in Peoria, Illinois, V.St.A. hinterlegt und als Kulturen NRRL B-11022 und NRRL B-11023 erhältlich.

Die hier offenbarten Mikroorganismen lassen sich in einer Vielzahl von Medien kultivieren, die Kohlenstoffquellen, Stickstoff und anorganische Salze enthalten. Ein typisches Medium weist hydrolysiertes Tierprotein, Maiswasser, Brauereihefeextrakt, Kaliumdiwasserstoffphosphat, Kaliummonowasserstoffphosphat und ein geeignetes Kohlenhydrat auf. Kohlenhydrate, die eingesetzt werden können, sind bspw. Kylose, Glucose, Maltose, Sucrose und Lactose sowie Hydrolysate von Xylan, Stärke und Cellulose. Der Anfangs-pH des Nährmediums ist etwa 7 und die Fermentation erfolgt aerob bei etwa 30 °C in einem geeigneten Fermentationsgefäß oder Schüttelkolben. Die maximale Isomeraseaktivität erhält man im allgemeinen nach etwa 48 bis 72 Std.

Die von den Mikroorganismen erzeugte Isomeraseaktivität wird ermittelt, indem man 30 min lang bei 60 °C eine Mischung inkubiert, die 0,5 Milliliter des enzymhaltigen Präparats und 1,5 Milliliter einer Lösung enthält, die eine ausreichende Menge Dextrose, Tricinpuffer (pH 8) und Magnesiumchlorid zu endgültigen Konzentrationen von 1,0 M, 0, 1M bzw. 0,03 M enthält. Am Ende der Inkubationszeit wird die Isomerisierungsreaktion durch Zugeben von 0,5 Millilitern 1,0 N-Salzsäure beendet. Nach dem Zentrifugieren wird die klare überstehende Fraktion auf geeignete Weise verdünnt und die erzeugte Fructose nach dem von L. Messineo und E. Musarra in Int. J. Biochem. 3 (18), 691-699 (1972) beschriebenen Verfahren bestimmt. Die Isomeraseaktivität wird in Mikroeinheiten ausgedrückt, wobei eine Mikroeinheit der Aktivität definert ist als die Enzymmenge, die ein Mikrogramm Fructose pro Minute unter den oben erläuterten Analysebedingungen bewirkt.

Es hat sich herausgestellt, dass die Isomerasemenge, die die bevorzugten Stämme unter geeigneten Kulturbedingungen abgeben, erheblich und wesentlich größer ist als bei den anderen, Isomerase erzeugenden Mikroorganismen des Standes der Technik. Die Isomeraseproduktion durch die bevorzugten Stämme ändert sich beträchtlich in Abhängigkeit von den eingesetzten Kulturbedingungen. Ein besonders überraschendes und unerwartetes Ergebnis ist, dass die maximale Isomeraseproduktion sich mit Lactose im Nährmedium einstellt. Kultiviert man bspw. NRRL B-11022 in einem Medium mit 2% Lactose, erhält man 2892 Mikroeinheiten Isomerase pro Milliliter Fermentationsbrühe. Die bevorzugten Stämme sind als gegenüber denen des Standes der Technik weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass sie erhebliche (d.h. 500 Mikroeinheiten pro Milliliter Brühe oder mehr) Isomeraseaktivität zeigen, wenn man sie in einem Nährmedium mit Lactose als einziger Kohlenhydratquelle kultiviert.

Eine erhebliche Enzymproduktion erhält man auch, wenn dem Medium keine Kohlenhydrate zugegeben werden. Diese zeigt sich aus den Daten in der Tabelle I auf der Grundlage der Kultivierung von Stämmen von F.arborescens bei 30° in einem Medium mit 1% hydrolisiertem Tierprotein (Bacto-Tryptone; Fa. Difco Laboratories, Detroit, Michigan, V.St.A.). 1% Maiswaser, 1% Hefeextrakt, 1% Kaliummonowasserstoffphosphat, 0,5% Kaliumdiwasserstoffphosphat und 2% Kohlenhydrat, wie angegeben.

Tabelle 1

Isomerase-Produktion von F.arborescens

Die von F.arborescens erzeugte Isomerase zeigt eine nutzbare Aktivität im pH-Bereich von etwa 6 bis 10 und bei einer Temperatur von etwa 45 bis 90 °C. Die Tabelle 2 zeigt die Wirkung des pH-Werts, die Tabelle 3 die Wirkung der Temperatur auf die Isomeraseaktivität von ganzen Zellen, die durch Kultivieren von NRRL B-11022 in einen lactosehaltigen Nährmedium bei 30 °C über 72 Std. erhalten wurden. Die Daten der Tabelle 4 zeigen die Stabilität des Enzyms. Für die Daten in den Tabellen 2 und 3 wurden die geernteten Zellen einmal gewaschen und in Wasser auf die ursprüngliche Zellkonzentration in der Gärungsbrühe erneut suspendiert. Die oben beschriebene Standardanalysemethode wurde zur Messung der Isomeraseaktivität verwendet, wobei jedoch bei der pH-Studie die Pufferlösung und in den Versuchen hinsichtlich der Temperatureffekte die Temperatur geändert wurden. Die Stabilitätsergebnisse in der Tabelle 4 wurden unter Inkubation gewaschener Zellen in 0,05 M Tricin-Pufferlösung (pH) 8, die Magnesiumchlorid (0,004 M) und Analyse der inkubierten Zellen in den angegebenen Intervallen nach dem Standardanalyseverfahren ermittelt.

Tabelle 2

Auswirkung des pH-Werts auf die Isomerase von NRRL B-11.022

Tabelle 3

Auswirkung der Temperatur auf die Isomerase von NRRL B-11.022 bei pH 8,0

Tabelle 4

Stabilität der Isomerase von NRRL B-11022 bei bestimmten Temperaturen

Es ergibt sich aus den Daten der Tabelle 4, dass das Enzym im wesentlichen mindestens 200 Std. bei pH 8 und 60 °C stabil ist, wie aus der Analyse gewaschener Zellen, die das Enzym enthielten, bestimmt wurde. Das Waschzellen-Enzympräparat ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass es nach 200-stündiger Erwärmung bei 70 °C und pH 8 mindestens 85% seiner Aktivität beibehielt.

Mit F.arborescens erzeugte Isomerase ist sehr wirkungsvoll bei der Umwandlung von Glucose in Fructose und zu dieser Umwandlung lassen sich verschiedene Verfahren verwenden, die aus dem Stand der Technik bereits bekannt sind. Die ganzen Zellen lassen sich unmittelbar im Chargenbetrieb verwenden, in dem das Enzympräparat aus den Mikroorganismen abgeleitetes Zellmaterial ist; auch kann man die Zellen in einem Festbett für kontinuierlichen Betrieb immobilisieren. Alternativ kann ein zellfreier Extrakt eingesetzt werden, in dem die Isomerase von den Zellen auf bekannte Weise befreit und lösliches Enzym in einem Chargensystem verwendet oder für den Einsatz in einem Durchlaufverfahren immobilisiert wird. Verfahren zum Einsatz von Enzymen in diesen Formen ist bekannt, wie sich bspw. aus einer Übersicht von W.R. Vieth und K. Venkatasubramanian in Chemtech 3, 677-684 (1973) und 4, 47-55, 309-320 und 434-444 (1974) ergibt.

Unabhängig von der Form, in der die Isomerase für die Glucoseisomerierung verwendet wird, sollte die Reaktion bei einer Temperatur zwischen 45 und 90 °C und vorzugsweise zwischen etwa 60 und 75 °C ausgeführt werden. Der pH-Wert der Glucose enthaltenden Lösung sollte zwischen etwa 6 und 10 und vorzugsweise zwischen etwa 6,5 und 8,0 gehalten werden, um die Bildung von Zersetzungsprodukten bei den hohen Temperaturen gering zu halten. Das Enzym wirkt mit verhältnismäßig reinen Glucoselösungen wie auch mit durch eine Säure- und/oder Enzymbehandlung hergestellten Stärkehydrolysaten. Glucosekonzentrationen von 30 bis 60 Gew.-% werden für den Umwandlungsschritt bevorzugt. Die Enzymaktivität lässt sich verbessern durch Zugabe kleiner Mengen von Magnesiumionen zur glucosehaltigen Lösung. Die bei der Isomerierung erhaltene, Fructose enthaltene Lösung kann nach herkömmlichen Verfahren raffiniert werden - bspw. Behandlung mit aktivierter Kohle und Ionenaustauscherharzen.

Die folgenden Beispiele sollen die Anwendung und Vorteile der vorliegenden Erfindung weiter erläutern.

Beispiel 1

100 Milliliter Nährmedium, die

hydrolysiertes Tierprotein 1,0%

Maiswasser 1,0%

Hefeextrakt 1,0%

K[tief]2HPO[tief]4 1,0%

KH[tief]2PO[tief]4 0,5%

Lactose 2,0%

enthielten, wurde in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben gefüllt, das Medium mit frisch zubereitetem Impfgut von F.arborescens NRRL B-11022 geimpft und das geimpfte Medium mit einem Drehschüttler bei 30 °C umgewälzt. Nach 72 Std. wurden die Zellen abgenommen und gewaschen. Eine Analyse ergab eine Isomeraseaktivität entsprechend 2892 Mikroeinheiten pro Milliliter des Vollnährmediums.

Beispiel 2

Die Isomerierung von Glucose zu Fructose wurden durch Zugeben von 10 g gewaschener Vollzellen (nach dem Verfahren des Bsp. 1 erhalten) in 500 ml eines 50 Gew.-/Vol.-%igen Glucosesirups mit 0,01 M Magnesiumschlorid durchgeführt. Der pH-Wert des Sirups wurde mittels Natriumhydroxid auf 8,0 eingestellt und der Sirup dann unter leichtem Rühren bei 60 °C inkubiert. Nach 20 Std. wurde der Sirup auf seinen Fructoseanteil analysiert; es ergab sich, dass 45% der Glucose zu Fructose umgewandelt worden waren.

Beispiel 3

Das Verfahren des Bsp. 1 wurde nachgearbeitet, wobei jedoch im Nährmedium anstelle von Lactose Xylose verwendet und das Impfgut von F.arborescens ATCC 4358 hergestellt wurde. Nach 72 Std. wurden die Zellen gewonnen; die Analyse zeigte eine Isomeraseaktivität entsprechend 546 Mikroeinheiten pro Milliliter der Vollnährbrühe.

Beispiel 4

Das Verfahren des Beispiels 1 wurde nachgearbeitet, aber die Lactose durch Glucose im Nährmedium ersetzt und das Impfgut von F.arborescens NRRL B-11023 hergestellt. Nach 64 Std. wurden die gewonnenen Zellen analysiert; sie wiesen eine Isomeraseaktivität entsprechend 580 Mikroeinheiten pro Milliliter des Vollnährmediums auf.

Beispiel 5

Die enzymatische Umwandlung von Glucose zu Fructose wurde durch Eingeben von 9 g nach dem Verfahren des Bsp. 4 hergestellter Nasszellen in 500 Milliliter einer 50-gew.-/vol.-prozentigen Glucoselösung mit 0,005 M Magnesiumchlorid hergestellt. Der pH-Wert des Sirups wurde mit Natriumhydroxid auf 8,0 eingestellt und die Lösung unter leichtem Rühren bei 60 °C inkubiert. Die Analyse der Lösung nach 27 Std. ergab einen Fructosegehalt von 38%.

Beispiel 6

F.arborescens NRRL B-11022 wurde 70 Std. bei 30 °C in einem 10-Liter-Fermentationsgefäß (New Brunswick) mit dem im Bsp. 1 beschriebenen Nährmedium kultiviert. Die Zellen wurden gewonnen und nach dem in der US-PS 3.821.086 beschriebenen Flockungsverfahren zu einem getrockneten geflockten Zellaggregat immobilisiert, das 75 Mikroeinheiten pro Gramm Isomeraseaktivität zeigte. Eine Glaskolonne von 25,7 mm (1 in.) Durchmesser mit 5 g des getrockneten Aggregats wurde für eine Durchlauf-Glucoseisomerierung verwendet. Die Kolonne wurde auf 60 °C gehalten und eine 50%ige (Gewicht/Volumen) Glucoselösung mit 0,005 M Magnesiumchlorid, die auf pH 8,0 bis 8,4 eingestellt wurde, mit 26 Millilitern pro Stunde durch die Kolonne geschickt. Der Ausfluß der Kolonne wurde auf Fructose analysiert; der Umwandlungsgrad von Glucose zu Fructose ergab sich zu etwa 45%.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Glucose isomerierenden Enzyms, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus der Spezies Flavobacterium arborescens in einem Nährmedium unter für die Herstellung des Enzyms durch den Mikroorganismus günstigen Bedingungen kultiviert und das Enzym gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus um Flavobacterium arborescens ATCC 4358 handelt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus um Flavobacterium arborescens NRRL B-11022 handelt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus um Flavobacterium arborescens NRRL B-11023 handelt.

5. Glucose isomerierendes Enzym, dadurch gekennzeichnet, dass es nutzbare Aktivität bei einer Temperatur von 45 bis 90 °C und einem pH von 6 bis 10 zeigt und von einem Mikroorganismus der Spezies Flavobacterium arborescens abgeleitet ist.

6. Enzym nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch einen zellfreien Extrakt des Mikroorganismus.

7. Enzym nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch von dem Mikroorganismus erhaltenen Zellmaterial.

8. Enzym nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus um F.arborescens ATCC 4358, NRRL B-11022 oder NRLL B-11023 handelt.

9. Verfahren zum Umsetzen von Glucose zu Fructose, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Glucose enthaltende Lösung mit einem nach einem der Ansprüche 1 bis 4 hergestellten, Glucose isomerierenden oder nach einem der Ansprüche 5 bis 8 definierten Enzym behandelt und eine Fructose enthaltende Flüssigkeit gewinnt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man bei einer Temperatur von etwa 45 bis etwa 90 °C in einem pH-Bereich von etwa 6 bis 10 arbeitet.