DE3123808C2

DE3123808C2 - Verfahren zur Herstellung von L-Typtophan oder einem seiner Derivate

Info

Publication number: DE3123808C2
Application number: DE3123808A
Authority: DE
Inventors: Akio Mimura; Mitsuru Yokohama Kanagawa Shibukawa; Yasuyuki Takahashi; Katsumi Fuji Shizuoka Yuasa
Original assignee: Asahi Kasei Kogyo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1980-06-17
Filing date: 1981-06-16
Publication date: 1984-07-05
Also published as: DE3123808A1; FR2484450A1; FR2484450B1; JPH0355116B2; JPS578792A; US4349627A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan oder einem seiner Derivate und eine dafür verwendbare biologisch reine Kultur eines Mikroorganismus.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan oder einem seiner Derivate, wie es im Patentanspruch 1 angegeben ist. Der Anspruch 2 nennt eine Abänderung dieses Verfahrens.

L-Tryptophan ist eine der essentiellen Aminosäuren, die die Körper von Tieren bilden und es ist als Medikament, Nahrungsmittel oder als Zusatzstoff zu Tierfutter wichtig. Einige L-Tryptophanderivate wirken als Antagonisten gegen den Metabolismus von L-Tryptophan und umfassen physiologisch aktive Substanzen, die man zur Herstellung von Pharmazeutika verwenden kann, die auf das Zentralnervensystem einwirken. L-Tryptophan und diese seine Derivate kann man mit bekannten Methoden der Synthese, biologischen Methoden und vielen anderen Methoden herstellen. Bekannte Methoden zur Herstellung von L-Tryptophan unter Verwendung von Mikroorganismen sind beispielsweise: (1) Direkte Fermentation unter Verwendung von Zuckern zur Erhöhung der L-Tryptophankonzentratlon in einer Kultur; und (2) Zugabe von Indol oder Anthranilsäure gleichzeitig mit Zucker zu einer Kultur und Ansteigenlassen der L-Tryptophankonzentration in der Kultur. L-Tryptophan kann man ferner aus Indol und Serin oder aus Indol, Brenztraubensäure und Ammoniumionen unter Verwendung einer Tryptophanase (Enzym) herstellen, die durch einen Mikroorganismus erzeugt wurde. Diese Methode unter Verwendung von Tryptophanase hat den Vorteil, daß man durch Variieren der Indolverblndung verschiedene entsprechende L-Tryptophanderivate herstellen kann und daß man daher eine Reaktion auswählen kann, die am besten dem speziellen Zweck angepaßt 1st.

Viele Methoden sind zur Herstellung von L-Tryptophan unter Verwendung von Tryptophanase bekannt. In der JP-Patentveröffentlichung Serien-Nr. 46 917/74 Ist eine Methode beschrieben, wobei man L-Tryptophan aus Indol und Serin oder aus Indol, Brenztraubensäure und Ammoniumionen unter Verwendung eines Mikroorganismus vom Genus Escherlchia, Genus Proteus, Genus Pseudomonas, Genus Aerobacter oder Genus Erwlnia herstellt; und In der FR-PS 12 07 437, der JP-OS 39 693/72 (OPI) und der JP-Patentveröffentllchung Serien-Nr. 1 836/78 ist eine Methode beschrieben, wobei man L-Tryptophan aus Indol und Serin unter Verwendung eines Mikroorganismus vom Genus Escherlchia, Genus Claviceps, Genus Neurospora, Genus Saccharomyces, Genus Bacillus, Genus Achromobacter oder Genus Alcallgenes herstellt. Verschiedene Methoden sind ferner zur Herstellung von L-Tryptophanderivaten bekannt, die verschiedenen Indolverbindungen entsprechen: In der JP-Patentveröffentlichung Serien-Nr. 46 917/74 ist eine Methode zur Herstellung von 5-Hydroxytryptophan beschrieben, wobei man einen Mikroorganismus vom Genus Proteus, Genus Escherlchia, Genus Pseudomonas, Genus Aerobacter oder Genus Erwlnia verwendet; In der JP-Patentveröffentlichung Serlen-Nr. 1 835/78 1st eine Methode zur Herstellung von 5-Hydroxytryptophan unter Verwendung eines Mikroorganismus vom Genus Achromobacter, Genus Escherlchia, Genus Pseudomonas, Genus Alcallgenes oder Genus Proteus beschrieben; und In den JP-Patentveröffentllchungen Serien-Nr. 5 479/76 und 8 400/77 ist eine Methode zur Herstellung von 5-Hydroxytryptophan und Methoxytryptophan unter Verwendung eines Mikroorganismus vom Genus Corynebacterlum oder Genus Brevibacterium beschrieben.

Diese Methoden, die Mikroorganismen verwenden, weisen gegenüber der Methode zur Herstellung von L-Tryptophan oder seinen Derivaten durch chemische Synthese den Vorteil auf, daß sie nur Verbindungen der

so L-Form erzielen, die optisch aktiv sind. Sie machen eine Herstellung In großen Mengen von L-Tryptophan oder L-Tryptophanderlvaten aus technischen Ausgangsstoffen möglich, wie z. B. Indolverbindungen, Serin oder Brenztraubensäure.

Es 1st bekannt, daß Mikroorganismen der Gattung Klebslella Tryptophanase erzeugen (s. Bergey's Manual of Determinative Bacteiiology, 8. Ausgabe, 1974, S. 294). Es ist ferner bekannt, daß verschiedene Mikroorganismen Tryptophanase erzeugen, die L-Tryptophan zersetzt und Indol bildet. Jedoch haben nicht alle Mikroorganismen, die Tryptophanase erzeugen, die Fähigkeit, eine merkliche Menge von L-Tryptophan zu erzeugen. Mikroorganismen, die Tryptophanase erzeugen, und die rationell bzw. wirksam L-Tryptophan oder seine Derivate aus Indolverbindungen und Serin oder aus Indolverbindungen, Brenztraubensäure und/oder Ihrem Salz und Ammonium-Ionen erzeugen, müssen den Anforderungen entsprechen, daß die Im Mikroorganismus erzeugte Tryptophanase eine hohe Aktivität aufweist, daß der Mikroorganismus nicht die Ausgangsstoffe zersetzt, wie z. B. die Indolverbindungen, das Serin und die Brenztraubensäure, und daß der Mikroorganismus nicht das erhaltene L-Tryptophan oder seine Derivate zersetzt, außer durch die Tryptophanase.

Aufgabe der Erfindung 1st es einerseits, einen Mikroorganismus zu finden, der im Verfahren des Oberbegriffs des Patentanspruchs 1 vorteilhaft einsetzbar 1st. Die Lösung dieser Aufgabe besteht darin, daß man hierzu den Stamm Enterobacter sp. ATCC 31901, den man Im Waldboden In Fuji, Shizuoka, Japan, gefunden hat, nimmt. Andererseits soll auch noch die Ausbeute bei bestimmten Derivaten besonders erhöht werden. Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt mit den Maßnahmen des Anspruchs 2.
Die Erfindung betrifft also einerseits ein Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan oder einem seiner Derl-

vate, wobei man eine Indolverblndung mit Serin oder mit Brenztraubensäure und/oder Ihrem Salz und Ammonlumlonen In Gegenwart einer Kultur eines Mikroorganismus umsetzt und das !gebildete L-Tryptophan oder eines seiner Derivate auf übliche Weise Isoliert, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Mikroorganismus den Stamm Enterobacter sp. ATCC 31901 einsetzt; in Abänderung dieses Verfahrens werden ebenfalls erfindungsgemäß die Maßnahmen des Anspruchs 2 durchgeführt.

Mit der Bezeichnung Enterobacter sp. AST 49-4 wurde dieser Mikroorganismus beim Fermentation Research Institute, the Agency of Industrial Science and Technology (FERM) unter der Bezeichnung FERM-P 5543 am 28. Mal 1980 hinterlegt und später von dort direkt zur ATCC transferiert, wo er die Bezeichnung ATCC 31901 erhielt.

Die mykologlschen Eigenschaften von Er.terobacter sp. ATCC 31901 (AST 49-4) sind nachstehend angegeben.

(A) Morphologische Eigenschaften (Inkubation in Nährbrühe bei 32° C 24 h lang):

Gestalt: kurze Stäbchen, einzelne Stäbchen oder eine Kette von zwei Stäbchen, mit peritrlchaartiger Geisel (zahlreichen, den Zelleib umgebenden Geiseln).

Größe: 1,0 bis 1,2 μπι χ 1,5 bis 3,0 μίτι ^]5

Beweglichkeit: vorhanden

Gramfärbung: negativ

Saurefestlgkeit: negativ

Sporen: nicht gebildet

Pleomorphismus: keiner

(B) Wachstum im Medium (32° C):

Nährbrühe: gut, Bildung eines relativ dicken Filmes, mit Niederschlag von agglomerierten Zellen, transparente Flüssigkeit, keine Pigmentbildung

Nährbrühe/Agarplattenkultur: gut, unregelmäßige Kontur, rauhe und welllgi: Oberfläche, erhaben bzw. erhöht, welliger Rand, mit Glanz, schwache Färbung von Manilapapier (d. h. leicht bräunlich oder lederfarben), keine Pigmentbildung, leicht viskos

Nährbrühe/Agarkellkultur: gut, fadenförmig, mit Glanz, schwache- Färbung von Manilapapier, keine Pigmentbildung

Nährbrühe/Gelatinestichkultur (20° C): gutes Wachstum Im oberen Teil, schwache Färbung von Manilapapier, grau im gestochenen Teil, keine Gasbildung im gestochenen Teil, keine Verflüssigung

(C) Physiologische Eigenschaften:

Wachstumstemperatur: Wachstum bei 13 bis 42° C, kein Wachstum bei 45° C Wachstums-pH-Wert: 5 bis 9

Sauerstoffbedarf: wahlweise anaerob

OF-Test (Hug Leifson's-Medium): Fermentation Gaserzeugung (Glukosemedium): Gaserzeugung

Lackmusmilch: gutes Wachstum, Bildung eines relativ dicken Filmes auf der Oberfläche, Entfärbung des Lackmus, Milch koaguliert

Verflüssigung von Gelatine: keine Verflüssigung

Erzeugung von Hydrogensulfid: keine Erzeugung Zersetzung von Stärke: keine Zersetzung

Reduktion von Nitrat: Erzeugung von salpetriger Säure

Catalase-Aktivltät: positiv

Oxldase-Aktlvität: negativ

Urease-Aktlvltät: negativ Phenylalanlndeamlnase-Aktlvltät: negativ

Lyslndecarboxylase-Aktlvltät: negativ

Alglnlndlhydrolase-Aktlvität: negativ

Ornlthindecarboxylase-Aktlvltät: negativ

Erzeugung von Indol: positiv Erzeugung von Ammoniak: positiv

VP-Reaktion: positiv

MR-Test: negativ

Denitrifikation: positiv

Verwendung von Zitronensäure:

Koser-Medlum: verwendet

Christensen-Medlum: verwendet

Natriumchloridbeständigkeit: Wachstum In NaCl-Konzentratlon bis zu 2% Pigmentbildung (King A-Medlum): keine Erzeugung

Verwendung von Stickstoffquellen: Verwendung von Ammoniumsalz und Nitnit Verwendung von Zuckern und Erzeugung von Säure und Gas: s. Tabelle 1

Tabelle 1:

Wachstum Säureer- Gaserzeugung zeugung

D-GI υ lose + + +

D-Fruktose + + +

D-Mannose + + +

D-Galaktose + + +

D-Rhamnose + + +

D-Arabinose _ _ _

L-Arabinose + + +

D-Xylose + + +

Saccharose + + +

Laktose + - -

Maltose + + +

Trehalose + + +

Raffinose - - -

D-Inosit + + +

D-Mannit + + +

D-Adonit -

D-Sorbit + + +

Salicin + + +

Glycerin + - -

Äthanol - -

Isoliert aus: Waldboden bei Fuji-shi, Shizuoka, Japan. 35

Die genannten Daten geben die mykologischen Eigenschaften von Enterobacter sp. ATCC 31901 (AST 49-4) gemäß der Erfindung wieder. Die Identifizierung gemäß Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, 1974, zeigte das folgende Ergebnis: Der Mikroorganismus gehört zur Familie Enterobacteriaceae, weil er ein Gram-negativer Bazillus ist, eine perltrichaartige Geisel hat, wahlweise anaerob ist, eine positive Catalase-Aktivität und eine negative Oxldase-Aktivität aufweist, eine Säure aus Glucose erzeugt und Salpetersäure zu salpetriger Säure reduziert, und man ordnet ihn am vernünftigsten dem Genus Enterobacter zu, weil er eine positive VP-Reaktion zeigt, im MR-Test negativ ist, eine negative Phenylalanindeaminase-Aktlvltät zeigt, in einem Temperaturbereich von 13 bis 42° C wächst und eine Beweglichkeit aufweist. Enterobacter aerogenes ATCC 8724 und Enterobacter liquefaclens AJ 2661 sind die einzigen beiden Bakterien vom Genus Enterobacter, von denen bekannt ist, daß sie L-Tryptophan aus Indol, Brenztraubensäure und Ammoniumionen erzeugen (s. Agricultural and Biological Chemistry, Bd. 36, S. 2523, 1972). In Tabelle 2 werden die Eigenschaften von Enterobacter sp. ATCC 31901 (AST 49-4) mit jenen der genannten beiden Bakterien und von Enterobacter cloacae verglichen, einem anderen Bakterium vom Genus Enterobacter, das in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, beschrieben ist.

Tabelle 2:

Mikroorganismus

Taxonomische Eigenschaften ATCC 31901 Enterobacter Enterobacter Enterobacter

cloacae aerogenes liquefaciens

Indolerzeugung + - + ~ - *)

Gelatineverflüssigung - schwach + schwach +

Lysindecarboxylase-Aktivität - - +

Alginindihydrolase-Aktivität - + —

Ornithindecarboxylase-Aktivität - + +

Verwendung von Malonat + -t

Verwendung von Äsculin +

Säureerzeugung:

Inosit +

Fortsetzung

Mikroorganismus

T.ixononiische Eigenschaften ATCC 319Oi Enlerubacler liiilerobacler Enterobacter

cloacae aerogenes liquefaciens

Glycerin - - + +

D-Arabinose - + + +

Raffinose + + +

Adonit - +--*) +

Laktose - + *) + +

Gaserzeugung: ¹^

Inosit + - + +

Glycerin - - + +

"I Diese Spezies umfassen verschiedene Stämme, von welchen manche »+«-Wert und manche »-«-Werte aufweisen.

Diesen Daten der taxonomischen Eigenschaften 1st zu entnehmen, daß Enterobacter sp. ATCC 31901 ein Mikroorganismus ist, der sich von allen Bakterien vom Genus Enterobacter unterscheidet, die in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, beschrieben sind. Wie in der nachstehenden Tabelle 3 gezeigt ist. erzielt der Enterobacter sp. ATCC 31901, der erfindungsgemäß verwendet wird, eine bedeutend höhere Ausbeute an L-Tryptophan als Enterobacter aerogenes ATCC 8724 und Enterobacter liquefaciens AJ 2661. die in Agricultural and Biological Chemistry, Bd. 36, S. 2523, 1972, beschrieben sind, unter den gleichen Reakiionsbedingungen, was den technischen Wert des erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismus zeigt.

Tabelle 3 Mikroorganismus Ausbeute an

L-Tryptophan * (g/t)

Enterobacter aerogenes ATCC 8724 11 Enterobacter liquefaciens AJ 2661 10 Enterobacter sp. ATCC 31901 18,6

* Menge, die aus 20 g Indol/1 erzeugt wurde.

Den erfindungsgemäß einzusetzenden Mikroorganismus kann man auf einem üblichen synthetischen oder natürlichen Medium kultivieren. Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Zucker, wie z. B. Glukose, Fruktose, Mannose. Saccharose, Galaktose, Xylose und Melasse; Zuckeralkohole, wie z. B. Glycerin, Sorbit und Mannit; und organische Säuren, wie z. B. Essigsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Apfelsäure und Bernsteinsäure. Diese Kohlenstoffquellen gibt man zu dem Medium im allgemeinen in einer Menge von etwa 0,1 bis 10 Gew.-96 zu. Stickstoffquellen sind beispielsweise Ammoniumverbindungen, wie z. B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat und Ammoniakwasser; und organische Stickstoffquellen, wie z. B. Harnstoff, Fleischextrakt, Pepton, Kaseinhydrolysat, Maiswasser, entfettetes Sojabohnenmehl und Proteinhydrolysat. Stoffe, die das Wachstum des verwendeten Mikroorganismus fördern, verwendet man vorteilhaft und gibt sie zu dem Medium zu. Die Stoffe können anorganisch oder organisch sein. Anorganische Stoffe sind ζ B. Kaliummonophosphat, Kallumdiphosphat, Phosphorsäure, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat und Natriumchlorid, sowie Metallionen, wie z. B. Eisen-, Zink-, Mangan-, Kupfer- und Calciumionen. Organische Stoffe sind z. B. Aminosäuren, Vitamine, organische Säuren, aliphatlsche Säuren, sowie natürliche Stoffe, beispielsweise Pepton, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Trockenhefe, Maiswasser, Kasein und Hydrolysat von entfetteten Sojabohnen.

Tryptophanase, die durch Enterobacter sp. ATCC 31901 erzeugt wurde, betrachtet man als anpassungsfähiges Enzym, und man gibt L-Tryptophan vorzugsweise zu dem Medium zur Herstellung einer Kultur des Mikroorganismus in einer Menge von etwa 0,1 bis 0,7 Gew.-% zu. Den Mikroorganismus inkubiert man in dem erhaltenen Medium bei 25 bis 37° C 16 bis 36 h lang.

Die derart hergestellte Kultur des Mikroorganismus weist ein Enzymsystem auf, das L-Tryptophan oder seine Derivate aus einer Indolverbindung und Serin oder aus einer Indolverblndung, Brenztraubensäure und/oder ihrem Salz und Ammoniumionen erzeugt. Die Kultur kann man unmittelbar In der gewünschten enzymatischen Reaktion verwenden, oder man kann sie nach geeigneten Vorbehandlungen verwenden. Beispielsweise kann man üie Zellen des Mikroorganismus aus der Kultur z. B. durch Zentrifugieren abtrennen. Die Zellen kann man auch trocknen, mit Ultraschallwellen behandeln, autolysieren oder homogenisieren. Anstatt dessen kann man aucr die erzeugte Tryptophanase auf übliche Welse extrahieren und reinigen. Wahlweise dazu kann man die its .:;n:-i:s- Zeilen oder das Enzym als immobilisierte Zelen oder immobilisiertes Enzym verwenden, wie man

sie durch Ihre Polymerisation mit beispielsweise einem Acrylsäureamid-Monomeren erhalten hat. Die Zellen mit einem Tryptophanasegehalt, die behandelten Zellen oder die Immobilisierten Zellen, die man so erhalten hat, sowie die gereinigte Tryptophanase oder die Immobilisierte Tryptophanase verwendet man als Katalysator für die enzymatische Reaktion in einer Reaktionsflüssigkeit, die eine Indolverblndung und Serin oder eine Indolverbindung, Brenztraubensäure und/oder Ihr Salz und Ammoniumionen enthält, zur Erzeugung von L-Tryptophan oder seinen Derivaten. Zusätzlich zu den Indolverbindungen, Serin, Brenztraubensäure und/oder ihrem Salz und Ammoniumlüncn, die mar. als Substrat verwendet, enthüll die R.caktlonsflüsslgkelt vorzugr'.velse Äthylendiamlntetraesslgsäure und Pyrldoxalphosphat, und man erzielt dadurch eine höhere Ausbeute an L-Tryptophan oder seinen Derivaten. Es gibt keine spezielle Begrenzung bezüglich der Menge des verwendeten Substrats, und

im allgemeinen liegt die Menge des Substrats Im Bereich von 0,1 bis 10 Gew.-96. Die enzymatische Reaktion führt man im allgemeinen bei einem pH-Wert von 5 bis 11 und bei einer Temperatur von 10 bis 6O⁰C durch.

Beispiele für die Indolverbindung, die man dem Reaktionssystem zugibt, sind Indol, 5-Hydroxylndol, 5-Chlorindol, 5-Bromindol, 5-Aminolndol, 5-Methoxyindol, 5-Methoxy-2-methyltndol und 2-Methyllndol.

Das L-Tryptophan oder seine Derivate, die man in der Reaktionsflüssigkeit erzeugt hat, kann man auf übliche

Weise Isolieren, beispielsweise durch Adsorption an beispielsweise einem Ionenaustauscherharz oder Aktivkohle. Das erhaltene L-Tryptophan und seine Derivate kann man durch Hochdruck-Flüsslg-Chromatographie oder Dünnschichtchromatographie an Stltciumdloxldgel qualitativ und quantitativ bestimmen.
Nachstehend wird die Erfindung durch Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

5 ml eines Mediums mit dem Ansatz gemäß Tabelle 4 setzte man In ProberOhrchen mit einem Durchmesser von 18 mm ein und sterilisierte bei 12O⁰C 10 min lang. Jedes der sterilisierten Medien beimpfte man mit einer Schlingenfüllung von Enterobacter sp. ATCC 31901 und kultivierte bei 32° C 20 h lang unter Schütteln. 5 ml der

so gekeimten Kultur überführte man in ein Fermentationsmedium, das man durch Sterilisieren von 100 ml eines Mediums (dem gleichen wie in Tabelle 4) bei 120° C 10 min lang in einem 500-ml-Schüttelkolben erhalten hatte; und man führte die Fermentation bei 32° C 20 h lang unter Schütteln durch. Nach Beendigung der Fermentation zentrifugierte man 11 der Kultur und erhielt die Zellen des Mikroorganismus; die Zellen suspendierte man in 200 ml einer Reaktionsflüssigkeit (Ansatz gemäß Tabelle 5), erwärmte danach bei 32° C 48 h lang unter

Schütteln und bewirkte eine enzymatische Reaktion. Nach Beendigung der Reaktion mischte man 10 ml der Suspension mit 10 ml Methanol unter heftigem Rühren und zentrifugierte die Mischung. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit unterwarf rr.^r. der Hochdruck-Flüssig-Chromatographle; 18,6 g/l Tryptophan hatte man In der Reaktionsflüssigkeit erzeugt.

Tabelle 4

Nach Beendigung der Reaktion gab man 200 ml Natriumhydroxid (Ätznatron) zu der Reaktionsflüssigkeit, brachte den pH-Wert auf 10, zentrifugierte danach, entfernte die Zellen des Mikroorganismus und erhielt eine überstehende Flüssigkeit mit einem Gehalt an L-Tryptophan. Die überstehende Flüssigkeit führte man durch eine Säule eines stark sauren Ionenaustauscherharzes, die mit Ammoniumionen beladen war, und elulerte das adsorbierte L-Tryptophan mit 2 η Ammoniakwasser. Das Eluat engte man ein, bildete rohe L-Tryptophankristalle, die man mit Aceton wusch und trocknete, und man erhielt 2,8 g L-Tryptophankristalle.

Beispiel 2

Enterobacter sp. ATCC 31901 fermentierte man wie In Beispiel 1 auf einem Medium, das den Ansatz gemäß

	Gew.-%
Pepton	2
Kaseinhydrolysat	1
Hefeextrakt	0,5
Malswasser	5
L-Tryptophan	0,2
KH₂PO₄	0,05
MgSO₄ · 7H₂O	0.05
FeSO₄ · 7H₂O	0,003
MnSO₄ - 4H₂O	0,003
pH-Wert	7,2
	Tabelle 5
Indol	20 g
Natriumpyruvat	20 g
Ammoniumacetat	20 g
Pyridoxalphosphat	100 mg
Äthylendlamlntetraessigsäure	2g
Wasser	11
pH-Wert	9,0

Tabelle 4 aufwies. Nach Beendigung der Fermentation zentrifugierte man 1 1 der Kultur, gewann die Zellen des Mikroorganismus und suspendierte die Zellen In 200 ml einer Reaktlonsflüsslgkelt mit einem pH-Wert von 9,0, die aus 2 g Indol, 3 g L-Serln, 10 mg Pyrldoxalphosphat, 200 mg Äthylendiamlntetraesslgsäure und 100 ml Wasser bestand. Die Suspension erwärmte man bei 32° C 36 h lang unter Schütteln und bewirkte eine enzymetlsche Reaktion. Nach Beendigung der Reaktion mischte man 10 ml der Suspension mit 10 ml Methanol unter heftigem Rühren und zentrifugierte die Mischung. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit unterwarf man der Hochdruck-Flüsslg-Chromatographle; 21,5 g/l L-Tryptophan hatte man In der Reaktionsflüiislgkeit erzeugt.

Beispiel 3

Enterobacter sp. ATCC 31901 fermentierte man wie In Beispiel 1 auf einem Medium mit dem Ansatz gemäß Tabelle 4. Nach Beendigung der Fermentation zentrifugierte man 2 1 der Kultur und gewann die Zellen des Mikroorganismus; die Zellen suspendierte man In 210 ml einer Reaktionsflüsslgkelt mit einem pH-Wert von 9,0, die aus 2 g Natriumpyruvat, 2 g Ammoniumacetat, 10 mg Pyrldoxalphosphai:, 200 mig Äthylendlamlntetraessigsäure und 100 ml Wasser bestand. Die Suspension teilte man In 7 gleiche Mengen und mischte 30 ml jeder Suspension mit 600 mg einer der Indolverblndungen gemäß Tabelle 6; jede Mischung erwärmte man bei 32° C 60 h lang unter Schütteln und bewirkte eine enzymatlsche Reaktion. Nach Beendigung der Reaktion führte man eine Analyse der erzeugten L-Tryptophanderlvate durch Hochdruck-Flüssig-Chormatographie wie in Beispiel 1 durch. Man erzeugte L-Tryptophanderlvate entsprechend den Iodverbindungen, und Ihre Mengen sind In der nachstehenden Tabelle 6 angegeben:

Tabelle 6

Indolverbindung	erzeugtes L-Tryptophan-	Menge
	derivat	(g/l)
5-Hydroxyindol	5-Hydroxytryptophan	3,8
5-Chlorindol	5-Chlortryptophan	1,9
5-Bromindol	5-Bromtryptophan	1,7
5-Aminoindol	5-Aminotryptophan	2,1
5-Methoxyindol	5-Methoxytryptophan	1,2
5-Methoxy-2-	5-Methoxy-2-methyl-	1,3
methylindol	tryptophan
2-Methylindol	2-Methyltryptophan	2,4
	Beispiel 4

Enterobacter sp. ATCC 31901 fermentierte man wie In Beispiel 1 auf einem Medium mit dem Ansatz gemäß Tabelle 4. Nach Beendigung der Fermentation zentrifugierte man 21 der Kultur und gewann die Zellen des Mikroorganismus; die Zellen suspendierte man in 210 ml einer Reaktionsflüsslgkelt min einem pH-Wert von 9,0, die aus 1,5 g L-Serin, 10 mg Pyrldoxalphosphat, 200 mg Äthylendiamintetraessigaiure und 100 ml Wasser bestand. Die Suspension teilte man in 7 gleiche Mengen und mischte 30 ml jeder Suspension mit 600 mg einer der Indolverbindungen gemäß -Tabelle 7; jede Mischung erwärmte man bei 32° C 60 h lang unter Schütteln und bewirkte eine enzymetische Reaktion. Nach Beendigung der Reaktion führte man die Analyse der erhaltenen L-Tryptophandertvate durch Hochdruck-Flüssig-Chromatographle wie In Beispiel 1 durch. Man erzeugte L-Tryptophanderivate, die den Indolverbindungen entsprachen, und ihre Mengen sied in der nachstehenden Tabelle 7 angegeben.

Tabelle 7

Indolverbindung erzeugtes L-Tryptophan- Menge
derivat (g/l)

5-Hydroxyindol 5-Chlorindol 5-Bromindol 5-Aminoindol 5-Methoxyindol 5-Methoxy-2-

methylindol 2-Methylindol

5-Hydroxytryptophan 5,2

5-Chlortryptophan 2,6

5-Bromtryptophan 2,5

5-Aminotryptophan 2,7

5-Methoxytryptophan 1,8

S-Methoxy^-methyl- 1,6 tryptophan

2-Methyltryptophan 3,4

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan oder einem seiner Derivate, wobei man eine Indolverblndung mit Serin oder mit Brenztraubensäure und/oder ihrem Salz und Ammoniumionen in Gegenwart einer Kultur eines Mikroorganismus umsetzt und das gebildete L-Tryptophan oder eines seiner Derivate auf übliche Welse isoliert, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus den Stamm Enterobacter sp. ATCC 31901 einsetzt.

2. Abänderung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus den Stamm Enterobacter sp. ATCC 31901 und als Indolverblndung Indol, 5-Hydroxylndol, 5-Chlorlndol, 5-Bromindol, 5-Aminolndol, 5-Methoxyindol, 5-Methoxy-2-methylindol oder 2-Methylindol einsetzt.