DE2406811A1

DE2406811A1 - Verfahren zur enzymatischen hydrolyse von ribonucleinsaeure

Info

Publication number: DE2406811A1
Application number: DE19742406811
Authority: DE
Inventors: Yuh Norimoto; Shigeru Ohmura; Yoshiaki Shimizu; Toshio Tatano
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1973-02-14
Filing date: 1974-02-13
Publication date: 1974-08-22
Also published as: FR2217332A1; FR2217332B1; DE2406811B2; DE2462314A1; CA1023290A; DE2462314B2; US3920519A

Description

u.Z.: K 662 (Vo/Mü/kä)
Case 150-4

KYOm HAKIiO KOGYO CO., LTD.
Tokyo, Japan

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" Verfahren zur enzymatisehen Hydrolyse von Ribonucleinsäure "

Priorität: 14. Februar 1973, Japan, Nr. 17 449/73 24. März 1973, Japan, Nr. 33 088/73

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Ribonucleinsäure (RNS) unter Bildung von Nucleosid_r2^l-,3^I-cyclophosphaten und/oder Nucleosid-3¹,^'-cyclophosphaten.

Adenosin-2^f, 3'-cyclophosphat (2', 3' -c-ΑίίΡ), ein Nucleosid-2', 3'-cyclophosphat, war in letzter Zeit Gegenstand zahlreicher v/issenschaitlicher Untersuchungen. Die Bedeutung von 2',3'-C-AMP ist darauf zurückzuführen, daß es im Zentralnervensystem von höheren Tieren zu finden ist. Obwohl die Rolle von 2',3^!-c-AMP im Zentralnervensystem noch nicht vollständig geklärt ist, wird angenommen, daß diese Verbindung eine wichtige Rolle bei. der Nerven-

25' leitung spielt. Deshalb gelten 2',3'-C-AMP und andere Nucleosid- ■ 2'^'-cyclophosphate als wertvolle Arzneistoffe und werden gegenwärtig bei verschiedenen in vivo-Tierversuchen verwendet. Ferner sind diese Produkte wertvolle biochemische Reagentien zur Untersuchung von Stoffwec'hselvorgängen.

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ORIGINAL INSPECTED

Es ist "bekannt, daß bei der Umsetzung von RNS mit "bestimmten Ribonucleasearten, z.B. Ribonucleat-nucleotido-2'-transferase, wie Ribonuclease T₀, saure Ribonuclease und Blatt-Ribonuclease, die RNS zuerst zu Zwischenprodukten hydrolysiert, beispielsv?eise zu Nucleosid-2',3'-cyclophosphaten, wie Adenosin-2^f,3'-cyclophosphat (2',3'-c-AMP), Guanosin-2', 3'-cyclophosphat (2',3^f-c-GMP), Uridin-2^!,3'-cyclophosphat (2',3'-C-UI-IP) und Cytidin-2',3^f-cyclophosphat (2·,3'-c-CHP). Diese Zwischenprodukte v/erden schließlich zu Nucleosid-3-phosphaten zersetzt, d.h. zu Adenosin-3^f-phosphat, Guanosin-3¹-phosphat, Uridin-3¹-phosphat und Cytidin-3'-phosphat.

Ferner ist es bekannt, daß die Anwesenheit eines Chelatbildners bei der enzymatischen Hydrolyse von RNS die Spaltung von Nucleosid-2^!,3'-cyclophosphaten zu Nucleosid-3¹-phosphaten hemmt. Beispielsweise ist es bekannt,. RNS durch kristalline Ribonuclease aus Rhizopus nivens in Gegenwart eines Chelatbildners zu Nucleosid-2¹^'-cyclophosphaten zu hydrolysieren, vgl. S. Mantani et al., Agr. Biol. Chem., Bd. 36, Nr. 2 (1972),

S. 242 bis 248. Jedoch ist die Verwendung von gereinigter oder teilweise gereinigter Ribonuclease bei der Hydrolyse von RNS nicht zweckmäßig, da zu ihrer Herstellung komplizierte Verfahrensschritte notwendig sind und da sich im Reaktionsgemisch zusätzlich zu den gewünschten Produkten eine Reihe von Nebenprodukten bilden.

Adenosin-3^f,5'-cyclophosphat hat bekanntlich eine Mittlerrolle bei hormonbedingterr Stoffwechselvorgängen. 3',5'-c-AMP und die übrigen Nucleosid-3', 5'-cyclophosphate sind neben ihrer Bedeu-

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tung als Reagentien für biochemische und medizinische Untersuchungen auch als Arzneistoffe von Bedeutung.

Bisher wurde die enzymatic·ehe' Hydrolyse von IiNS zu Nucleosid-5" 3^f,5'-cyclophosphaten in der Literatur nicht beschrieben. Es ist lediglich bekannt, daß 3' ,5'-C-ZiIiP durch Umsetzung von Adenosintriphosphat mit Adenylcyclsse, die aus Mikroorganismen oder durch fermentative Verfahren' erhalten worden ist, entstehen.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur enzymatisehen Hydrolyse von RKS zur Verfügung zu stellen, das sich leicht großtechnisch durchführen läßt.

Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß bei der Einwirkung von intakten Mikroorganismenzellen, die eine Ribonucleaseaktivität aufweisen, in Gegenwart eines Chelatbildners auf RNS in hohen Ausbeuten Nucleosid-2 ', 3^t-cyclophosphat~~ ohne nennenswerte Bildung von Nebenprodukten als Kydrolyseprodukte entstehen. Ferner wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß bei der vorgenannten Hydrolyse von FiIiS mit intakten Mikroorganismenzellen neten Nucleosid-2', 3'-cyclophosphaten auch Nucleosid-3',5'-cyclophosphäte in -vorbestimmten Verhältnissen erhalten v/erden können, wenn die Phosphationenkonzentration im Reaktionsmedium in geeigneter Weise eingestellt wird.

Fig. 1 zeigt Papierchromatogramme von Reaktionsgemischen, die ncch Hydrolyse von RNS mit (a) intakten Zellen von Escherichia coli und (b) teilweise gereinigter E-ibonuclease. die zerstörte

erhalten worden sind Lscherichia coli-Zellen enthält/ Zu Vergleichszwecken ist die ,

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entsprechende'Chromatographie auch mit 2',3'-C-AHP, 2',3' -c-GMP, 2^f ,3'-C-UI-IP und 2',3' -c-GMP durchgeführt.

Dieses Papierchromatograrnm von Fig. 1 wurde auf folgende Weise erhalten: Escherichia coil ATCC 10798 wird 16 Stunden bei 38°C in einem 30 mg/ml Glucose, 6 mg/ml Hefeextrakt, 8,5 mg/ml Kaliumdihydrogenphosphat, 11 mg/ml DikaliumhjTlrogenphosphat und 0,25 mg/ml Magnesiumsulfat enthaltenden Medium vom pH-Wert 6,8 gezüchtet. Anschließend werden die Zellen abzentrifugiert. 25 mg/ml (als trockene Zellen) der Zellen werden in einer 15 mg/ml RNS enthaltenden wäßrigen Lösung, die 15 millimolar an Äthylendjamintetraessigsäirrc? ist, suspendiert. Das erhaltene Gemisch wird anschließend 48 Ctunden bei AO⁰C umgesetzt.

Eine ähnliche Umsetzung wird mit aufgebrochenen Zellen durchgeführt. Dabei werden 25 mg/ml (als trockene Zellen) der vorgenannten Zellmasse durch lOstimdige Ultraschallbehandlung bei 8⁰C mit 28 kHertz/Sek. behandelt.

Die Reaktionsgemische werden 16 Stunden bei 25°C aufsteigend chromatographiert. Als Laufroittel dient die obere Phase eines Gemisches aus Isobuttersäure, n-Butanol und 0,5 η Ammoniaklösung (1:1:1).

Aus Fig. 1 geht hervor, daß bei der Verwendung von intakten Mikroorganismenzellen zur Hydrolyse von HIiS das Reaktionsgemisch nur die gewünschten Nucleosid-2¹,3'-cyclophosphate neben nicht umgesetzter RWS enthält. Andererseits entstehen bei Verwendung von teilweise gereinigter Ribonuclease außer den gewünschten

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Nucleosid-2'^'-cyclophosphaten verschiedene Nebenprodukte im Reaktionsgemisch.

Es wird angenommen, daß die gereinigte Ribonuclease durch andere Enzyme verunreinigt ist, weshalb verschiedene Nebenprodukte entstehen. Demgegenüber wird angenommen, daß bei der Verwendung von intakten Mikroorganismenzellen nach dem er"findungsgemäßen Verfahren die FINS durch die Wirkung einer Ribonuclease hydrolysiert" wird, die an der Oberfläche der Mikroorganismenzellen vorhanden ist, so daß die gewünschten 2¹,3^f"-Cyclop'hosphate praktisch selektiv gebildet werden.

Wie bereits erwähnt, läßt sich nach dem erfindungsgemäßen Verfahrren durch die Kontrolle der Konzentration der Phosphationen im Reaktionsmedium das Verhältnis der gebildeten Nucleosid-2¹ _t3^f-CAfclophosphate zu dem Nucleosid-3¹,5'-cyclophosphaten vorher bestimmen. Beispiele für Nucleosid-3¹,5'-cyclophosphate, die sich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten lassen, sind 3',5'-Cyclophosphat (3',5'-C-MP), Guanosin-3^f,5^l-cyclophosphat (3',5'-C-GMP), Uridin-3^f ,5'-cyclophosphat (3' ,5'-C-Ui-IP) und Cytidin-3",5'-cyclophosphat. Vienn das erfindungsgemäße Verfahren in Abwesenheit oder in Gegenwart von sehr geringen Konzentrationen an Phosphationen durchgeführt wird, wird die RNS selektiv zu 2',3'-Cyclophosphaten gespalten. Bei der Durchführung der Reaktion bei höheren Phosphationenkonzentrationen werden selektiv Nucleosid-3',S'-cyclophosphate gebildet. Bei der Einhaltung einer mittleren Phosphationenkonzentration entstehen sowohl die 2',3'- als auch die 3',5'-Cyclophosphate.

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Im erfihdungsgemäßen Verfahren können alle Mikroorganismen eingesetzt werden, die eine Ribonuclease-Aktivität aufweisen. Um festzustellen, ob ein bestimmter Mikroorganismus eine Ribonuclease-Aktivität aufweist, können übliche Verfahren angewendet werden. Die Erfindung erstreckt sich auf alle Mikroorganismen, die diese Aktivität aufweisen.

Bevorzugte Mikroorganismen sind gram-negative Bakterien, insbesondere solche der Gattungen Escherichia, Salmonella, Aerobacter und Pseudomonas. Die Gattung Aerobacter läßt sich im allgemeinen folgendermaßen charakterisieren: kurze Stäbchen; beweglich oder unbevreglich, wobei die beweglichen Species ringsherum behaarte Geiseln aufweisen; gram-negativ; gutes Wachstum auf gewöhnlichen Nährmedien; Verwertung von Glucose und Lactose unter Bildung von Säure und Gas; aus Glucose wird die 2- oder mehrfache Menge Kohlendioxid im Vergleich zu Wasserstoff gebildet; Methylrot-Test negativ; Voges-Proskauer-Test positiv; keine Bildung von Trimethylenglykol aus Glycerin durch anaerobe Gärung; Verwertung von Citronensäuren und deren Salzen als alleinige Kohlenstoffquellen; aerob, gegebenenfalls anaerob.

Die Gattung Escherichia läßt sich im allgemeinen folgendermaßen charakterisieren: kurze Stäbchen; beweglich oder nicht beweglich; gram-negativ; Verwertung von Glucose und Lactose unter Bildung von Säure und Gas; keine Bildung von Acetylmethylcarbinol; Methylrot-Test positiv; aus Glucose werden etwa gleiche Volumina Kohlendioxid und Wasserstoff gebildet; im allgemeinen kann Harnsäure nicht als alleinige Stickstoffquelle verwertet werden.

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Die Gattung Salmonella läßt sich im allgemeinen folgendermaßen charakterisieren: Stäbchen, die im allgemeinen mit Hilfe einer ringsherum behaarten Geisel beweglich sind, wobei auch nicht bewegliche Formen auftreten können; gram-negativ; keine Verflüssigung von Gelatine; keine Indolbildung; variable Schwefelwasserstoff bildung ; Säurebildung aus Glucose, Mannit, Maltose und Sorbit; im allgemeinen Gasbildung (Ausnahmen sind Salmonella typhosa und Salmonella gallinarum, wobei die Gasbildung auch bei anderen Species oder Serotypen ausbleiben kann); Lactose, Saccharose, Salicin und Adonit werden nicht angegriffen; die Verwertung von anderen Kohlenhydraten ist variabel; keine Bildung von Acetylmethylcarbinol; Methylrot-Test positiv; Bildung von Nitriten aus Nitraten: im allgemeinen wird Ammoniumeitrat verwertet; keine Hydrolyse von Harnstoff; negative KCN-Empfindlichkeit.

Die Gattung Pseudomonas läßt sich im allgemeinen folgendermaßen charakterisieren: monotriche, lophotriche oder unbewegliche Zellen; gram-negativ; häufig Entwicklung von fluoreszierenden diffundierenden Pigmenten mit grünlicher, bläulicher, violetter, lilafarbener, rosafarbener, gelber oder einer anderen Farbe;

gelegentlich leuchtend rotes oder gelbes und nicht diffundierendes Pigment; viele Arten ohne jegliche Pigmentbildung; die meisten Arten oxidieren Glucose zu Glukonsäure, 2-Ketoglukonsäure oder . anderen Zwischenprodukten; im allgemeinen inaktiv bei der Oxidation von Lactose; Nitrate werden häufig zu Nitriten, Ammoniak oder freiem Stickstoff reduziert.

Ferner werden gram-positive Hefen der Gattungen Hansenula, Kloeckera und Torulopsis bevorzugt. Die Gattung Hansenula gehört_,

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zur Unterfamilie Saccharomycetaideae und läßt sich im allgemeinen durch folgende Eigenschaften charakterisieren: Bildung von Sproßzellen und Pseudomycel; hutförmige, saturnförmige oder' runde Sporen; 1 bis 4 Asci, dissimilativ oxidativ (Häutehenbildung)-auch fc*-mentativ;
Nitratassimilation.

Die Gattung Torulopsis gehört zur Familie Cryptococcaceae und läßt sich im allgemeinen folgendermaßen charakterisieren: · multilateraler. Sprossen; kein Pseudomycel oder· Mycel: keine Bildung von stärkeähnlichen Verbindungen; stark ferment«tiv.

Die Gattung Kloeckera gehört ebenfalls zur Familie Cryptococcaceae und läßt sich im allgemeinen folgendermaßen charakterisieren: bipolares Sprossen; zitronenförmige Zellen und fermentativ.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Mikroorganismen werden nach üblichen Züchtungsverfahren für Bakterien oder Hefen gezüchtet. Beispielsweise können die Mikroorganismen in einem eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und andere Nährstoffe enthaltenden Nährmedium gezüchtet v/erden. Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Kohlenhydrate, wie Glucose und Saccharose. Organische Säuren, Alkohole und Kohlen-Wasserstoffe können ebenfalls verwendet werden, sofern der verwendete Mikroorganismus zur Assimilation dieser Kohlenstoffquellen befähigt ist. Beispiele für Stickstoffquellen sind organische

Stickstoff

und anorganische /verbindungen, sowie natürliche organische Substanzen, wie Peptone Maisquellwasser und Hefeextrakt. Ferner _j

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kanu das Nährmedium mit Phosphaten, wie KaliumdihydrogenphosjDhat und Dikaliumhydrogenphosphat und Metallsalzen, wie Magnesiumsulfat, versetzt werden.

Die Züchtungsbedingungen v/erden je nach dem verwendeten Mikroorganismus ausgewählt. Nach beendeter Züchtung werden die Zellen beispielsweise durch Zentrifugation von der Gärmaische abgetrennt.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen RNS-Hydrolyseverfahrens v/erden die Zellen in einem wäßrigen Medium in einer Konzentration von 10 bis 40 mg/ml, vorzugsweise etwa 20 mg/ml, bezogen auf das Trockengewicht der Zellen, suspendiert. Die Suspension wird mit RNS, einem Chelatbildner und einer bestimmten Menge

Phosphationen versetzt. . -

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete RNS wird nach üblichen Verfahren gewonnen und stammt im allgemeinen aus Mikroorganismen. Zur Hydrolyse wird sie in einer Menge von 1 bis 40 mg/ml, vorzugsweise 10 bis 20 mg/ml verwendet.

Im erfindungsgemäßen Verfahren können übliche Chelatbildner für , Metallionen verwendet werden; vgl. Mantani a.a.O. Vorzugsweise werden Äthylendiamintetraessigsäure, Cyclohexandiamintetraessigsäure und Hydroxyäthylendiamintriessigsäure verwendet. Die Chelatbildner werden in einer Konzentration von 5 "bis 30 millimolar, vorzugsweise 10 bis 30 millimolar eingesetzt.

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Wie bereits erwähnt, wird im erfindungsgemäßen Verfahren das Verhältnis von Nucleosid-2^f,3^f-cyclophosphaten zu Nucleosid-3¹, 5f-cyclophosphaten durch die Konzentration der Phosphationen im Reaktionsmedium beeinflußt.

Beispielsweise wird Escherichia coli ATCC 10798 in 50 ml eines 30 mg/ml Glucose, 6 mg/ml Hefeextrakt, 8,5 mg/ml Kaliumdihydrogenphosphat, 11 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat und 0,25 mg/ml Magnesiumsulfat enthaltenden Puffers vom pH-Wert 6,8 16 Stunden bei 38°C in einem 3 Liter fassenden Srlenmeyer-Kolben gezüchtet. Nach beendeter Züchtung werden die Zellen durch Zentrifugieren von der Gärmaische abgetrennt, inschließend werden 2,5 g (Trockengewicht) dieser Zellen in jeweils 100 ml "asser, 0,10 m, 0,15 i, 0,16 a, 0,17 m und 0,3 m Phosphatpuffer vom pK-Uert 7,5 suspendiert. Die Suspensionen werden mit 0,5 g P-NS und 292 mg Äthylendiamintetraessigsäure versetzt und 48 Stunden bei 40 C zur Umsetzung gebracht. Anschließend wird die Menge der gebildeten Nucleosid-2', 3' -cyclophosphate" und der I-Iucleosid-3', 5' cyclophosphate bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.

Tabelle I

Phosphationen- Bildung von Nucleosid- Bildung von Nucleosidkonzentration, m 2¹ ,S'-cyclo.phosphaten, 3¹,5 '-cyclophosphaten, mg/ml rng/ml

0 2 Spuren

0,10 2 Spuren

0,15 . 1,7 0,25

0,16 0,96 - 0,77

0,17 Spuren . 1,2

O,3 Spuren 1,2

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Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß die RNS in Abwesenheit von Phosphationen selektiv zu Nucleosid-2¹,3'-cyclophosphaten hydrolysiert wird. Bei steigender Phosphationenkonzentration nimmt die Bildung von Nucleosid-2¹,3'-cyclophosphaten

5" ab, während die Menge der gebildeten Nucleosid-3¹,5'-cyclophosphaten zunimmt. Bei- einer Phosphationenkonzentration von 0,17 m oder mehr wird die RNS praktisch selektiv zu Nucleosid-3¹,5'-cyclophosphaten hydrolysiert.-

Man erhält also nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bei Phosphationenkonzentrationen im Reaktionsmedium von 0 bis 15 m Reaktionsprodukte, die hauptsächlich aus Nucleosid-2'^'-cyclophosphaten bestehen, während' bei Phosphationenkonzentrationen von 0,17 m und höher die Reaktionsprodukte hauptsächlich aus Nucleosid-3',5'-cyclophosphaten bestehen.

Bei einer Konzentration von 0,15 m bis 0,17 ι werden praktisch gleichviel 2',3'- und 3',5'-Cyclophosphate gebildet.

Als Quelle für Phosphationen können verschiedene Phosphate verwendet werden, die Phosphationen an das wäßrige Medium abgeben. Besonders, geeignete Phosphatquellen sind in den folgenden Beispielen aufgeführt.

Im allgemeinen wird die Reaktion zwischen RNS, den Mikroorganismenzellen, dem Chelatbildner und den Phosphationen 1 bis 96 Stunden, vorzugsweise 24 bis 48 Stunden, bei Temperaturen von 35 bis 45°C, vorzugsweise 38 bis 42°C, durchgeführt. Während der Umsetzung wird der pH-Wert im Bereich von 4 bis 9 gehalten.

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Falls die selektive Bildung von Nucleosid-2¹,3'-cyclophosphaten erwünscht ist, wird der pH-Wert vorzugsweise bei etwa 5 gehalten, während bei der selektiven Bildung von Nucleosid-3¹,5'-cyclophosphaten der pH-Wert vorzugsweise im Bereich von 8 gehalten wird.

Geeignete wäßrige Reaktionsmedien sind verschiedene Pufferlösungen, wie Acetatpuffer und Phosphatpuffer. Im Hinblick auf die Einstellung des pH-Wertes ist die Verwendung von Phosphatpuffern bevorzugt.

Nach beendeter Umsetzung v/erden die Reaktionsprodukte isoliert und nach üblichen Verfahren gereinigt. Beispielsweise v/erden die Zellen aus dem Reaktionsgemisch durch Abfiltrieren entfernt. Das zellfreie Filtrat wird der Adsorption an Aktivkohle oder einem synthetischen Adsorptionsmittel unterworfen und anschließend mit alkalischem, wäßrigem Methanol oder einem Gemisch aus Aceton und Wasser eluiert. Das Eluat wird eingeengt und an einem Ionenaustauscherharz, beispielsweise Dowex 1x2 (Cl~-Form) (stark basisches Anionenaustauscherharz der Firma The Dov/ Chemical Co.), adsorbiert. Anschließend wird mit einer neutralen Salzlösung, beispielsweise einer wäßrigen Ammoniumhydrogencarbonatlösung eluiert. Durch Gefriertrocknung oder Kristallisation erhält man aus dem Eluat ein Gemisch aus Nucleosid-2',3^r-cyclophosphaten, das 2«,3'-c-AMP, 2',3'-C-GMP, 2',3'-C-UMP und 2',3'-C-CMP enthält oder ein Gemisch aus Nucleosid-3',5'-cyclophosphaten, das 3',5'-C-AMP, 3',5'-C-GMP, 3',5'-C-UMP und 3',5'-C-CKP enthält.

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Wenn als Reaktionsprodukt ein Gemisch aus Nucleosid-2¹,3'-• cyclophosphaten und Nucleosid-3',5'-cyclophosphaten erhalten wird, kann dieses leicht in die einzelnen Nucleosid-cyclophosphate aufgetrennt v/erden. Beispielsweise werden die Zellen vom Reaktionsgemisch abfiltriert. Sodann wird das Filtrat mit einer Säure, wie Salzsäure oder Phosphorsäure, auf einen ρΗ-ΐ/ert von 3,5 Ms 4,0 eingestellt. Mach dem Einengen des Filtrates fallen die Kucleosid~3' ,5'--cyclophosphate aus. Nach dem Abtrennen der Nucleosid-3¹,5'-cyclophosphate durch Filtrieren werden die 2',3'-Cyclophosphate aus dem Filtrat erhalten. Die als Feststoff erhaltenen Nucleosid-3',5'-cyclophosphate können anschließend in einem schwach alkalischen Lösungsmittel vom pH-Wert mindestens 7,5 gelöst v/erden. Die auf diese V/eise erhaltenen 2^f,3'- oder 3',5'-Cyclophosphate können auf die vorstehend beschriebene ^T.veise gereinigt werden.

Die erhaltenen 2',3.'~ oder 3',5'-Cyclophosphate lassen sich leicht nach bekannten Verfahren in "die einzelnen Komponenten auftrennen. Beispielsweise wird ein Gemisch aus 2',3'- oder 3'^'-Cyclophosphaten auf eine mit einem Anionenaustauscherharz, . wie Dowex 1x2 (Cl~-Form) beschickte Säule gegeben. Die Elution wird stufenweise unter Verwendung von 0,1 bis 1,0 m Lösungen neutraler Salze, wie Ammoniumhydrogencarbonat, durchgeführt.

Durch wiederholte Säulenchromatographie lassen sich die 2',3'~ oder 3',5'-Cyclophosphate in die einzelnen Komponenten auftrennen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

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" Beispiel 1

Escherichia coli ATCC 10798 wird in 500 ml eines 30 mg/ml Glucose, 6 mg/ml Hefeextrakt, 8,5 mg/ml Kaliumdihydrogenphosphat, 11 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat und 0,25 mg/ml I-Tagnesiumsulfat enthaltenden Puffers vom pH-V/ert 6,8 16 Stunden bei 38° C in einem 3 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben gezüchtet. Anschließend werden die Zellen durch Abzentrifugieren von der Gännaische abgetrennt.

Sodann v/erden 4 g (in sämtlichen Beispielen beziehen sich die Gewichtsangaben der Zellen auf das Trockengev/icht) Zellen in 200 ml Wasser suspendiert. Die Suspension v;ird mit 3 g RIJS und 876 mg Äthylendiamintetraessigsäure versetzt. Das Geraisch v.-.ird 48 Stunden bei 40°C umgesetzt. Nach der Umsetzung haben sich im Reaktionsgemisch 14 mg/ml eines Gemische« aus Iiucleosiä-2¹,3¹-cyclophosphaten gebildet.

Die Zellen werden vom Reaktionsgemische abfiltriert und das PiI-trat wird über eine mit Dowex 1x2 (Cl'-Fonn) beschickte Säule gegeben. Die Elution wird mit einer wäßrigen Ammoniuinhydroge-ncarbonatlösung durchgeführt. Das Eluat wird eingeengt und gefriergetrocknet. Man erhält 1,8 g eines pulverförmiger! Gemisches aus Nucleosid-2¹^'-cyclophosphaten von 90prozentiger Reinheit, das 2',3'-c-AMP, 2^f,3^f-c-GMP, 2^f,3'-P-UMP und 2 ^f, 3'-C-CMP enthält.

Beispiel 2

2,5 g der gemäß Beispiel 1 erhaltenen Zellen von Escherichia coli ATCC 10798 werden in 100 ml Wasser suspendiert. Die Suspen-_j

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sion wird mit. 1 g RNS und 519 mg Cyclohexandiamintetraessigsäure versetzt. Das Gemisch wird sodann 48 Stunden bei 4O⁰C umgesetzt. Nach "beendeter Reaktion erhält man 6*2 mg/ml eines Gemisches aus Nucleosid-2',3'-cyclophosphaten im Reaktionsmedium.

■ Bei -spiel 3

Escherichia coli ATCC 10798 wird in 500 ml eines 30 mg/ml Glucose, 50 mg/ml Maisquellwasser, 8,5 mg/ml Kaliumdihydrogenphosphat, 11 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat und 0,25 mg/ml I-Iagnesiumsulfat enthaltenden Nährmediums vom pH-V,^Tert 6,5 16 Stunden "bei 38 C in einem 3 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben gezüchtet. Anschließend werden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt.

Sodann werden 2 g der Zellen in 100 ml ^T.vasser suspendiert. Die Suspension wird mit 1,5g RNS und 500 mg Hydroxyäthylendiemintiriessigsäure versetzt. Nach beendeter Reaktion erhält man im Reaktionsmedium ein Gemisch aus 9,7 mg/ml e.ines Gemisches aus Nucleosid-2^f,3'~cyclophosphaten.

Beispiel4

4,4 g der gemäß Beispiel 3 erhaltenen Zellen von Escherichia coli ATCC 10798 werden in 200 ml 0,33 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 suspendiert. Die Suspension wird mit 2 g RNS und 876 mg Äthyl endiamintetraessigsäure versetzt.- Sodann wird das Gemisch 48 Stunden bei 40⁰C umgesetzt. Man erhält im Reaktionsgemisch 7,2 mg/ml eines Gemisches aus Nucleosid-3¹,5^f-cyclophosphaten.

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T Anschließend werden die Zellen abfiltriert. Das Filtrat wird an einem Kunstharz adsorbiert. Die Elution wird mit 50prozentigem Aceton durchgeführt, und das erhaltene Eluat wird eingeengt. Die eingeengte Lösung wird an Dowex 1x2 (Cl"-Form adsor-

5' biert. Die Elutioii wird mit einer Calciumchlorid-Salzsäure-Pufferlösung durchgeführt. Sodann wird das Eluat eingeengt und gefriergetrocknet. Man erhält 0,6 g eines pulverförmigen Gemisches aus i;ucleosid-3^f jS'-c.yclpphosphaten von 86prozentiger Feinheit.

Beispiel 5

Aerobacter aerogenes, IAH 1133, ATCC 8329 wird in 500 ml eines 10 mg/ml GlUCOSe₅ 10 mg/ml Maisquellwasser, 8,5 mg/ml Kaliumdihydrogenphosphat, 11 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat und 0,25 mg/ml Magnesiumsulfat enthaltenden Nährmediums vom pH-'.v'ert 6,8 0 Stunden bei 28°C in einem 3 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben gezüchtet. Nach der Züchtung v/erden die Zellen abzentrifugiert.

7,5 g der so erhaltenen Zellen werden in 300 ml 0,05 m Acetatpuffer vom pH-^TiVert 5,5 suspendiert. Die Suspension wird mit 3 g RUS und 1752 mg Ethylendiamintetraessigsäure versetzt. Das Gemisch wird sodann 24 Stunden bei 40°C umgesetzt. Nach beendeter Reaktion erhält man im Reaktionsgemisch 5,6.mg/ml eines Gemisches aus Nucleosid-2¹,3^f-cyclophosphaten.

Die Zellen werden aus dem Reaktionsgemisch abfiltriert, und das Filtrat wird an einem Kunstharz adsorbiert. Die Elution wird mit einem Gemisch aus Aceton und Ammoniaklösung durchgeführt. Das ,

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Eluat wird eingeengt und anschließend mit Wasser verdünnt. Die verdjinnte Lösung wird über eine mit Dowex 1x2 (Cl""-Form) beschickte Säule gegeben. Die Elution wird mit einer wäßrigen Ammoniurahydrogencarbonatiösung durchgeführt. Das Eluat wird eingeengt und gefriergetrocknet. Man erhält 0,7 g eines pulverförmigen Gemisches aus Nucleosid-2',3'-cyclophosphaten von 85prozentiger Reinheit.

Beispiel 6

Aerobacter aerogenes ATCC 8329 wird in 500 ml eines 10 mg/ml Glucose,. 6 mg/ml Hefeextrakt, 8,5 mg/ml Kaliumdihydrogenphosphat, 11 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat und 0,25 mg/ml Magnesiumsulfat enthaltenden Nährmediums vom pH-Vi^Terf6,8 8 Stunden bei 38°C in einem 3 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben gezüchtet. Anschließend v/erden die Zellen abzentrifugiert.

2,5 g der so erhaltenen Zellen werden in 100 ml 0,40 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 suspendiert. Die Suspension wird mit 800 mg RNS und 584 mg Athylendiamintetraessigsäure versetzt. Das Gemisch wird 36 Stunden bei 40⁰C umgesetzt. Nach beendeter Reaktion erhält man 4,3 mg/ml eines Gemisches aus Nucleosid-3¹,5'-cyclophosphaten. .

Das Reaktionsgemisch wird anschließend gemäß Beispiel 4 aufgearbeitet. Man erhält 133 mg eines pulverförmigen Gemisches aus 3^f ,5'-Cyclophosphaten von 83prozentiger Reinheit.

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· Beispiel 7

Salmonella typhosa ATCC 9992 wird in 500 ml eines Nährmediums der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 116 Stunden bei 28°C in einem 3 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben gezüchtet. Ar schließend werden die Zellen abzentrifugiert.

1,8 g der so erhaltenen Zellen werden in 100 ml 0,05 m Phosphatpuffer vom pH-V7ert 6,8 suspendiert. Die Suspension wird mit 1 f RNS und 438 mg Athylendiamintetraessigsäure versetzt. Das Gemisch wird 15 Stunden bei 40⁰C umgesetzt. Es bilden sich 6,3 mg/ml eines Gemisches aus Nucleosid-2¹,3^f-cyclophosphaten.

Sodann wird das Reaktionsgemisch gemäß Beispiel 5 aufgearbeitet. Man erhält 170 mg eines pulverförmigen Gemisches aus 2',3^!-Cyc^_ phosphaten von 82prozentiger Reinheit.

Beispiel 8

2 g der gemäß Beispiel 7 erhaltenen Zellen von Salmonella typhosa werden in 100 ml 0,36 m Phosphatpuffer vom"pH-Wert 8,0 suspendiert. Die Suspension wird mit 1,5 g MS und 730 mg Athylendiamintetraessigsäure versetzt. Das Gemisch wird 44 Stunden bei 43⁰C umgesetzt. Man erhält 9,1 mg/ml eines Gemisches aus Hucleosid-3¹,5'-cyclophosphaten.

Beispie 19 Pseudomonas aeruginosa ATCC 15246 wird gemäß-Beispiel 1 gezüchtet. Nach dem Züchten werden die Zellen'abzentrifugiert. 2,3 g der so erhaltenen Zellen v/erden in 100 ml 0,05 m Acetatpuffer vom pH-V/ert 5,0 suspendiert. Die Suspension wird mit 1,5 g RNS _j

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Ί und 584 mg Äthylendiamintetraessigsäure versetzt. Das Gemisch wird 43 Stunden bei 38⁰C umgesetzt. Man erhält 9 mg/ml eines Gemisches aus Nucleosid-2¹,3'-cyclophosphaten.

' Das Reaktionsgemisch wird gemäß Beispiel 5 aufgearbeitet. Man erhält 144 mg eines pulverförmigen Gemisches aus Nucleosid-2¹,3'-cyclophosphaten von 78prozentiger Reinheit..

Beispiel 10 Man verfährt wie in Beispiel 4, verwendet aber Pseudomonas aeruginosa ATCC 15246 anstelle von Escherichia coli ATCC 10798. Man erhält 371 ug/n;l eines Gordisches eus rcucD.eosid-3¹,5^r-cyclophofiphaten.

B e i s ρ i e 1 11 Hansenula anomala ATCC 20144 v/ird in 500 ml eines 40 mg/ml Glucose, 5 rag/ml Pepton, 2 mg/ml Keieextrnkt, 2 .^g/rnl Kaliumdihydro- . genphosphat, 2 mg/ml Dikaliumhydrogenphoüphat, 1 mg/ml Kagnesiumsulfat und 20 mg/ml Malzextrakt entho].tc-nden Kährmediums vom pH-^ert 6,5 28 Stunden bei 28°C in einem 3 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben gezüchtet. Nach beendeter Züchtung werden die Zellen abzentrifugiert. Sodann werden 2,5 g der Zellen in 100 ml 0,33 m Phosphatpuffer vom pK-v/er't 8,0 suspendiert. Die Suspension wird mit 1 g RNS und 500 mg Hydroxyäthylendiamintriessigsäure versetzt und 72 Stunden bei 40⁰C umgesetzt. Nach beendeter Reaktion erhält man 3,6 mg/ml eines Gemisches aus Nucleosid-3^f,5'-cyclophosphaten. Sodann wird das Reaktionsgemisch gemäß Beispiel 4 aufgearbeitet. Man erhält 47 rag eines pulverförmigen Gemisches aus Nucleosid-3¹,5'-cyclophosphaten von 76prozentiger Reinheit. ,

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■ Beispiel 12

Kloeckera apiculata ATCC 18212 wird gemäß Beispiel 11 gezüchtet, mit der Ausnahme, daß die Züchtungsdauer 32 Stunden beträgt'. Anschließend werden die Zellen abzentrifugiert. Sodann werden 3g der erhaltenen Zellen.in 100 ml 0,33 m Phosphatpuffer vom pH-V.^rert 8,0 suspendiert. Die Suspension wird mit 1 g RNS und 692 mg Cyclohexandiamintetraessigsäure versetzt. Das Gemisch wird 72 Stunden bei 40°C umgesetzt. Nach beendeter Umsetzung erhält man 3,5 mg/ml eines Gemisches aus Nucleosid-3¹,5'-cyclophosphaten. Das Reaktionsgemisch wird gemäß Beispiel 4 aufgearbeitet. Man erhält 42 mg eines pulverförmigen Gemisches aus 3^fj5'-Cyclophosphaten von 74prozentiger Reinheit.

Beispiel 13 2,5 g gemäß Beispiel 11 erhaltene Zellen von Torulopsis sphaerica ATCC 8549 werden in 100 ml 0,33 m Phosphatpuffer vom pH-»^rert 8,0 suspendiert. Die Suspension wird mit 1 g RNS und 438 mg Ethylendiamintetraessigsäure versetzt. Sodann wird das Gemisch 48 Stunden bei 40°C umgesetzt. Nach beendeter Reaktion erhält man 523 ug/ml eines Gemisches aus Nucleosid-3',5^T-cyclophosphaten.

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Claims

Patentansprüche

(hy Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Ribonucleins'äüre zu Nucleosid-2', 3'-cyclophosphaten und Nucleosid-3',5'-cyclophosphaten, dadurch, gekennzeichnet, daß man Ribonucleinsäure mit intakten Zellen von Ribonuclease-Aktivität aufweisenden Mikroorganismen in wäßrigem Medium in Gegenwart eines Chelatbildners umsetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung zusätzlich in Gegenwart von Phosphationen durchführt .

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Iiucleosid-2¹, j5'-cyclophosphate und l·Iucleosid-35¹,5'-cyclophosphate aus dem wäßrigen Medium abtrennt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen der Gattungen Escherichia, Salmonella, Aerobacter, Pseudomonas, Hansenula, Kloeckera oder Torulopsis verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen der Species Escherichia colij Aerobacter

25' aerogenes, Salmonella typhosa, Pseudomonas aeruginosa, Hansenula anomala, Kloeckera apiculata oder Torulppsis sphaerica verwendet. .

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6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Escherichia coli ATCC 10798, Aerobacter aerogenes ATCC 8329, Salmonella typhosa ATCC 9992, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15246, Hansenula anomala ATCC 20144, Kloeckera apiculata ATCC 18212 oder Torulopsis sphaerica ATCC 8549 verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mar als Chelatbildner Athylendiarnintetraessigsäure, Cyclohexandiamir.

tetraessigsäure oder Hydroxyäthylendiamintriessigsäure verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hydrolyse bei einer Phosphationenkonzentration bis zu 0,15 ra durchführt und dadurch selektiv zu Nucleosid-2¹,3^f-cyclophosphaten gelangt.

9. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Phosphationenkonzentration von 0,15 m bis 0,17 m einstellt und dabei zu einem Gemisch aus etwa gleichen Mengen Nucleosid-2',3^f-cyclophosphaten und Kucleosid-3',5'-cyclophosphaten gelangt.

10. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Phosphationenkonzentration auf mindestens 0,17 m einstellt und dabei selektiv zu Nucleosid-3',5'-cyclophosphaten gelangt.

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J 11-, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß . man 1 bis 40 mg/ml Ribonucleinsäure mit 10 bis 40 mg/ml intakten Mikroorganismenzellen umsetzt.

⁵ 12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Konzentration des Chelätbildners im Medium auf 5 bis 30 milliraolar einstellt.

13. - Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man 10 den pH-Vfert des Mediums auf etwa 5 einstellt.

14. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert, des Mediums auf etwa 8 einstellt.

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