DE1123436B - Verfahren zur Herstellung neuer Wuchsstoffe - Google Patents

Description

Aus Materialien biologischen Ursprungs, insbesondere Pflanzenmaterial, tierischen Organen und Mikroorganismen, sind bereits eine große Zahl biologisch und physiologisch aktiver Stoffe isoliert worden. Solche Stoffe werden unter anderem zur Beschleunigung des Wachstums von Mikroorganismen, insbesondere Hefen, verwendet. So werden beispielsweise zur Beschleunigung von Wachstums- und Gärungsvorgängen bei technischen Gärungen extrahiertes Sojabohnenmehl (französische Patentschrift 786 564), ungekochte Molke (deutsche Patentschrift 717 997), Hefe- oder Malzextrakte (französische Patentschrift 870 386) zugesetzt. Ferner soll gemäß der deutschen Patentschrift 864 140 aus Bakterien ein Wuchsstoff gewonnen werden, der das Wachstum von Hefe in gleicher Weise wie Vitamin H fördert, aber nicht mit diesem identisch ist.

Es ist auch bereits bekannt, daß man aus Mikroorganismen eisenhaltige Wuchsstoffe gewinnen kann, nämlich Ferrichrom Coprogen und Ferregens Faktor (Bact. Rev., 21, S. 101 [1957]).

Es wurde nun gefunden, daß man aus pflanzlichen Organismen, insbesondere Actinomyceten, und deren Extrakten Wuchsstoffe in reiner bzw. angereicherter Form erhalten kann, die im folgenden Ferrioxamine genannt werden.

Die Ferrioxamine sind Stickstoff- und eisenhaltige organische Verbindungen. Sie besitzen eine braunrote Farbe und sind leicht löslich in Säuren und stark polaren Lösungsmitteln, wie Wasser, Dimethylformamid, Glykol, Äthylenglykolmonomethyläther, sowie in niederen aliphatischen Alkoholen, wie Methanol. Auch in höheren aliphatischen Alkoholen sowie in aromatischen Alkoholen und Phenolen sind sie beschränkt löslich, z. B. in Butanol, Benzylalkohol, Phenol. Die Hydrolysate der Ferrioxamine enthalten ninhydrinpositive Substanzen. In chemischer Hinsicht sind die Ferrioxamine einer Gruppe von Antibiotika, die »Sideramycine« genannt werden, verwandt. Zu den Sideramycinen gehören unter anderem die eisenhaltigen Antibiotika Grisein, Albomycin, die Ferrimycine, das Antibiotikum 1787 (H. Thrum, Naturwiss. 44, S. 561 [1957]) und die Substanzen L. A. 5937 (P. Sen si und M. T. Timbal, Antibiotics & Chemotherapy, 9, S. 160 [1959]).

Das rohe Ferrioxamin, das beispielsweise bei der Fermentation von Streptomyceten erhalten wird, ist gewöhnlich ein Gemisch verschiedener Komponenten. Ferrioxamin B ist das Hauptprodukt der bei der Fermentation von S. pilosus Ettlinger et al. NRRL 2857 (ETH 21748) gebildeten Ferrioxamine. Daneben werden weitere Stoffe, die als Ferrioxamine A, C, Verfahren zur Herstellung neuer Wuchsstoffe

Anmelder: CIBA Aktiengesellschaft, Basel (Schweiz)

Vertreter: Dipl.-Ing. E. Splanemann, Patentanwalt, Hamburg 36, Neuer WaU 10

Beanspruchte Priorität:

Schweiz vom 25. September 1959 (Nr. 78 652, 78 653) und 18. März 1960 (Nr. 3063, 3064)

Dr. Ernst Gäumann, Dr. Vladimir Prelog, Zürich,

Dr. Hans Bickel, Binningen,

und Dr. Ernst Vischer, Basel (Schweiz),

sind als Erfinder genannt worden

D₁, D₂, E und F bezeichnet werden, gebildet. Bei der Craigschen Verteilung des aus dem Kulturfiltrat (2- bis lOtägige Fermentation bei 27⁰C) durch Extraktion mit Phenol—Chloroform (Ig: ImI) erhaltenen Rohproduktes lassen sich fünf Fraktionen gewinnen, deren Extinktion bei 425 μιη in Fig. 1 dargestellt ist. Aus der Hauptfraktion III erhält man bei der Chromatographie an dem Ionenaustauscherharz Dowex 50 WX₂ reines Ferrioxamin B-Hydrochlorid als braunrotes Pulver (Fig. 2, Fraktionen 93 bis 125).

Ferrioxamin B-Hydrochlorid ist löslich in Wasser und stark polaren organischen Lösungsmitteln. Es verhält sich papierchromatographisch und in der multiplen Verteilung als einheitliche Substanz von ähnlicher Polarität wie die Ferrimycine A₁ und A₂, unterscheidet sich jedoch von jenen durch seine

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bedeutend größere Stabilität. In schwach essigsaurer Lösung wandert es bei der Elektrophorese mit nur wenig kleinerer Wanderungsgeschwindigkeit als jene. Für Ferrioxamin B-Hydrochlorid in stark angereicherter Form wurden folgende Eigenschaften gefunden: Mikroanalyse nach 48 Stunden bei 20⁰C/ 0,001 mm: C48,04»A» H 7,41 %, N11,21 %, Cl 5,25%, Fe 7,67%, P0%. Titration: pK*_Mcs (HeIv., 37, S. 1872 [1954]) 9,74; Äquivalentgewicht 704. Absorptionsspektrum in H₂O: X_max 430 πιμ mit E \t> — 39,0. Das Infrarotspektrum in Nuyol zeigt unter anderem Banden bei 3230, 2900, 1640, 1573, 1461, 1377, 1260, 1225, 1185, 1132, 1028 cm-¹, Doppelbande: 989, 975, 935, 810, 750 cm"¹ (s. Fig. 3). Multiple Verteilung, Papierchromatographie und Papierelektrophorese: vgl. Tabelle 1, Fig. 4 und 5.

Bei der Hydrolyse mit verdünnter Salzsäure können unter anderem Bernsteinsäure, l-Amino-5-hydroxylamino-pentan, Cadaverin und Hydroxylamin nachgewiesen werden. Wird Jodwasserstoffsäure für die Hydrolyse verwendet, entsteht kein l-Amino-5-hydroxylamino-pentan und kein Hydroxylamin. Mit 2,4-Dinitrofluorbenzol bildet Ferrioxamin B ein 2,4-Dinitrophenyl-Derivat.

Aus den Nebenfraktionen II, IV und V, die bei der Craigschen Verteilung des rohen Ferrioxamingemisches erhalten werden (vgl. Fig. 1), lassen sich durch Chromatographie an Ionenaustauschern weitere eisenhaltige, reduzierend wirkende Verbindungen mit Antisideramycinwirksamkeit isolieren (s. u.). Gemäß ihrem Verhalten im Papiercbromatogramm (Fig. 4) und am Ionenaustauscher (Fig. 5) bezeichnet man sie als Ferrioxamine A, C, D₁, D₂, E und F.

Die aus den Fraktionen II und IV (vgl. Fig. 1) isolierten Ferrioxamine A bzw. C verhalten sich physikalisch-chemisch sehr ähnlich wie Ferrioxamin B. A erweist sich im Papierchromatogramm und in der multiplen Verteilung um ein geringes polarer als B. Bei C verhält es sich umgekehrt. Diesem Befund entspricht auch die im Vergleich zu B schwach erhöhte Basizität von A sowie seine um wenig größere elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit in schwach essigsaurer Lösung bzw. die im Vergleich zu B kleinere Basizität und elektrische Beweglichkeit von C (Fig. 5). A und C zeigen weiterhin ähnliche IR-Spektren und Löslichkeitseigenschaften wie Ferrioxamin B und konnten wie dieses als Hydrochloride bis anhin nur in amorpher Form erhalten werden.

Ferrioxamin A-Hydrochlorid ist ein braunrotes Pulver, das sich in Wasser, Methanol, Äthanol, Eisessig und Dimethylformamid gut löst. Es ist unlöslich in Äther, Aceton, Essigester und Chloroform. Rf im Lösungssystemi: 0,35, im Lösungssystem V: 0,21 (vgl. Tab. 1). Verteilungskoeffizient im System VI: 0,111 (vgl. Tab. 1). Papierelektrophorese vgl. Fig. 5. Mikroanalyse: C44,21°/₀, H 7,52%,, N 12,63%, Fe 7,95%, Cl 5,93%. Titration: pK*_Mcs 9,89; Äquivalentgewicht 634. UV-Spektrum in Wasser: max. 430 πιμ (E [*_m = 37). IR-Spektrum in Kaliumbromid zeigt unter anderem folgende Banden (s = starke Bande, m = mittlere Bande, w = schwache Bande): 2,92 μ (s), 3,42 μ (m), 6,10 μ (s), 6,32 μ (s), 6,88 μ (m), 7,30 μ (w), 7,92 μ (w), 8,10 μ (w), 8,49 μ (w), 8,98 μ (w), 9,55 μ (w), 10,15 μ (w), 10,67 μ (w) (vgl. Fig. 11).

Ferrioxamin A gibt eine positive Reaktion mit Ninhydrin. Die Eisenbindung im Ferrioxamin A wird aus dem Komplex entfernt, wenn es mit Mineralsäure oder starken Alkalien behandelt wird. Eisenfreies Ferrioxamin A ist farblos. Es kann mit Ferrichlorid in Ferrioxamin A zurückgeführt werden. Es reagiert auch mit anderen Metallionen unter Bildung der entsprechenden Metallkomplexe, beispielsweise des grünlichen Kupferkomplexes. Weitere charakteristische Eigenschaften s. Tabelle 1.

Ferrioxamin C-Hydrochlorid zeigt annähernd gleiche Löslichkeitseigenschaften wie A. Rf im Lösungsmittelsystem I: 0,54, im Lösungsmittelsystem V: 0,37

ίο (vgl. Tab. 1). Papierelektrophorese vgl. Fig. 5, Verteilungskoeffizient im System VI: 0,489 (vgl. Tabelle 1). Mikroanalyse: C 48,33%, H 7,92%, N 10,20%, Cl 5,15%, Fe 6,82%. Titration: pK*_Mcs 8,88; Äquivalentgewicht 762. UV-Spektrum in Wasser:

max. 430 ΐημ (E }*„ = 39). Das IR-Spektrum in Kaliumbromid zeigt unter anderem Banden bei 2,92 μ (s), 3,43 μ (s), 5,85 μ (m), 6,10 μ (s), 6,33 μ (s), 6,87 μ (s), 7,30 μ (m), 7,95 μ (m), 8,23 μ (w), 8,52 μ (m), 9,65 μ (w), 13,23 μ (m) (vgl. Fig. 12).

Ferrioxamin C gibt eine positive Farbreaktion mit Ninhydrin. Die Eisenbindung im Ferrioxamin C wird aus dem Komplex entfernt, wenn es mit Mineralsäure oder starken Alkalien behandelt wird. Eisenfreies Ferrioxamin C ist farblos. Es kann mit Ferrichlorid in Ferrioxamin C zurückgeführt werden. Es reagiert auch mit anderen Metallionen unter Bildung der entsprechenden Metallkomplexe, beispielsweise des grünlichen Kupferkomplexes.

Die aus Fraktion V (vgl. Fig. 1) mittels Chromatographie an Ionenaustauschern isolierten lipophileren Ferrioxamine D₁, D₂ und E, die in den Systemen V und VI größere Rf-Werte als 0,5 und Verteilungskoeffizienten über 1 aufweisen, verhalten sich bei der Elektrophorese und Titration als neutrale Verbindüngen (vgl. Tabelle 1, Fig. 4 und 5). Ferrioxamin D, das bei der Ionenaustauschchromatographie als die am schnellsten wandernde Substanz aus einer einheitlich erscheinenden Bande isoliert wird (vgl. Fig. 8), läßt sich durch einfache Verteilung zwischen Chloroform und Wasser in das lipophilere, aus Methanol— Äther in länglichen Prismen kristallisierende Ferrioxamin D₁ und das nur in sehr geringer Menge anfallende Ferrioxamin D₂ auftrennen. Ferrioxamin D₁ ist gut löslich in Wasser, Methanol, Äthanol, Eisessig, Methylcellosolve und Choroform, schwer löslich in Äther, Aceton, Essigester, Pyridin und Dimethylformamid. Es kristallisiert aus Methanol— Äther in roten Nadeln. F. nach dreimaliger Kristallisation 194 bis 200⁰C. Rf im Lösungsmittelsystem I:

0,73, R₁ im Lösungsmittelsystem V: 0,72 (vg). Tabelle 1). Verteilungskoeffizient im System VI: 1,80 (vgl. Tabelle 1). Elektrophorese vgl. Fig. 5. Mikroanalyse: C 49,31%, H 7,47%, N 12,37%, Cl 0%, Fe 7,66%. Titration: keine sauren oder basischen Funktionen feststellbar. UV-Spsktrum in Wasser: Xmax 430 ηιμ (E }*_m = 44). Das IR-Spektrum in Kaliumbromid zeigt unter anderem Banden bei 2,95 μ (s), 3,06 μ (s), 3,25 μ (w), 3,43 μ (s), 6,08 μ (s), 6,35 μ (s), 6,86 μ (s), 7,30 μ (m), 7,94 μ (m), 8,20 μ (w), 8,49 μ (w), 8,83 μ (w), 9,00 μ (w), 9,65 μ (w), 10,00 μ (w), 10,31 μ (w), 10,67 μ (w), 12,20 μ (w), 13,30 μ (m) (vgl. Fig. 13). Ferrioxamin D₁ gibt keine Farbreaktion mit Ninhydrin. Die Eisenbindung im Ferrioxamin Dj wird aus dem Komplex entfernt, wenn es mit Mineralsäure oder starken Alkalien behandelt wird. Eisenfreifis Ferrioxamin D₁ ist farblos. Es kann mit Ferrichlorid in Ferrioxamin D₁ zurückgeführt werden. Es reagiert auch mit anderen Metallionen unter Bildung der

entsprechenden Metallkomplexe, beispielsweise des grünlichen Kupferkomplexes.

Ferrioxamin D₂: Das IR-Spektrum in Kaliumbromid zeigt unter anderem Banden bei 2,95 μ (s), 3,43 μ(πι), 6,08 μ (s), 6,36 μ (s), 6,90 μ (s), 8,49 μ (w), 8,87 μ (w), 9,65 μ (w), 10,05 μ (w), 10,70 μ (w), 13,22 μ (w) (vgl. Fig. 16). R_t im Lösungsmittelsystem I: 0,64; Rf im Lösungsmittelsystem V: 0,68 (vgl. Tabelle 1). Papierelektrophorese vgl. Fig. 5.

Ferrioxamin E, das ein differenzierteres IR-Spektrum als die übrigen Ferrioxamine besitzt (vgl. Fig. 14), unterscheidet sich von diesen auch durch seine schlechte Löslichkeit in Wasser und Methanol.

Mikroanalyse: C 49,80°/₀, H 7,37°/₀, N 12,48°/₀, Cl 0°/₀, Fe 8,14°/₀. Titration: keine sauren oder basischen Funktionen feststellbar. UV-Spektrum in Wasser: Xmax 430 Γημ (E H= 42). Das IR-Spektrum in Kaliumbromid zeigt unter anderem Banden bei 2,92 μ (s), 3,02 μ (s), 3,45 μ (s), 5,96 μ (s), 6,15 μ (s), 6,36 μ (s), 6,90 μ (s), 7,10 μ (m), 7,15 μ (m), 7,39 μ (m), 7,82 μ (w), 7,98 μ(m), 8,45 μ (w), 8,54 μ (w), 8,85 μ (w), 901 μ (w), 9,20 μ (w), 9,98 μ (m), 10,07 μ (w), 10,23 μ (w), 10,43 μ (w), 10,71 μ (w), 11,87 μ (w), 13,20 μ (m), 13,66 μ (w) (vgl. Fig. 14).

Ferrioxamin E gibt keine Farbreaktion mit Ninhydrin. Die Eisenbindung im Ferrioxamin E wird aus dem Komplex entfernt, wenn es mit Mineralsäure oder starken Alkalien behandelt wird. Eisenfreies Ferrioxamin E ist farblos. Es kann mit Ferrichlorid in Ferrioxamin E zurückgeführt werden. Es reagiert auch mit anderen Metallionen unter Bildung der entsprechenden Metallkomplexe, beispielsweise des grünlichen Kupferkomplexes.

Ferrioxamin F, das gemäß seinem Verhalten bei der Papierchromatographie und bei der Gegenstromverteilung auch zu der lipophilen Gruppe (D₁, D₂, E) gehört, zeigt jedoch im Gegensatz zu D₁, D₂ und E basische Eigenschaften und wird als Hydrochlorid isoliert (vgl. Fig. 4 und 5).

Ferrioxamin F-Hydrochlorid ist gut löslich in Wasser, Methanol, Pyridin, Eisessig, Äthanol, Dimethylformamid; wenig löslich in Chloroform, unlöslich in Essigester, Aceton und Äther. Mikroanalyse: C 50,44%, H 7,29%, N 10,53%, Cl 4,10%, Fe 5,57 %. Rf im Lösungsmittelsystem V: 0,80 (vgl. Tabelle 1). Verteilungskoeffizient im System VI: 3,12 (vgl. Tabelle I). Elektrophorese vgl. Fig. 5. Titration: pKxcs 9,75, Äquivalentgewicht 695. Das IR-Spektrum in Kaliumbromid zeigt unter anderem Banden bei 2,95 μ (s), 3,45 μ (m), 6,10 μ (s), 6,37 μ (s), 6,92 μ (m) 7,40 μ (w), 7,97 μ (w), 8,50 μ (w), 8,88 μ (w), 9,72 μ (w), 10,10 μ (w), 10,70 μ (w), 13,75 μ (w) (vgl. Fig. 15). UV-Spektrum in Wasser: Xmax 430 ηιμ, P 1% _ "Μ

Ferrioxamin F gibt eine positive Reaktion mit Ninhydrin. Die Eisenbindung im Ferrioxamin F wird aus dem Komplex entfernt, wenn es mit Mineralsäure oder starken Alkalien behandelt wird. Eisenfreies Ferrioxamin F ist farblos. Es kann mit Ferrichlorid in Ferrioxamin F zurückgeführt werden. Es reagiert auch mit anderen Metallionen unter Bildung der entsprechenden Metallkomplexe, beispielsweise des grünlichen Kupferkomplexes.

In der nachfolgenden Tabelle 1 sind charakteristische physikalische Daten der bisher isolierten Ferrioxamine vergleichsweise zusammengestellt.

Tabelle

Ferrioxamin	Papierelektro phorese	Papierchro RfI	matographie Rf V	Multiple Verteilung KVI	Extinktion bei 430 Γημ F i%	Titr pKmcs	ation Äquivalent
	a)	b)	c)	d)	n Um	e)	gewicht
A	13,6	0,35	0,21	0,11	37	9,89	634
B	13,0	0,44	0,29	0,23	39	9,74	704
C	12,3	0,54	0,37	0,49	39	8,88	762
D1	3,9	0,73	0,72	1,80	44	(neutral)
D2	3,9	0,64	0,48			(neutral)
E	3,9	0,68	0,59	1,59	42	(neutral)
F	12,5		0,80	3,12	34	9,75	695

a) Zentimeter Laufstrecke in 0,33 η-Essigsäure, nach 4¹/, Stunden bei 220 V. Vergleichsweise wandert Fruktose 3,9 cm.

b) Rf I: Rf -Wert im System I: n-Butanol—Eisessig—Wasser (4: 1:5).

c) Rf V: R_f -Wert im System V: tert.-Butanol—Wasser—gesättigte wäßrige Natriumchloridlösung—0,1 n-Salzsäure (50: 25 : 25 : 1), Papier imprägniert mit Aceton—Wasser— gesättigte wäßrige Natriumchloridlösung (6:3: 1).

d) KVI: Verteilungskoeffizient im System VI: n-Butanol— Benzylalkohol — Wasser — gesättigte wäßrige Natriumchloridlösung—0,1 n-Salzsäure (200 : 100: 300: 60: 3). Verteilung von 10 mg über 34 Stufen von je 3 cm³ organischer und wäßriger Phase bei 23 bis 25⁰C. Auswertung durch Extinktionsmessung (2 cm³ der mit Alkohol auf 10 cm³ verdünnten Fraktionen) bei 425 Γημ.

e) W. Simon et al., HeIv., 37, S. 1872 (1954).

In Tabelle 2 sind vergleichsweise chemische und physikalische Daten für Ferrioxamin B und verwandte Wuchsstoffe sowie einige Sideramycin-Antibiotika (Grisein A, Albomycin und Ferrimycin A) zusammengestellt.

Die Salze der basischen Ferrioxamine A, B, C und F leiten sich von den bekannten anorganischen und organischen Salzen ab, beispielsweise von der Salzsäure, den Schwefelsäuren und Phosphorsäuren, der Essig-, Propion-, Valerian-, Palmitin- oder ölsäure, der Bernsteinsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Mandelsäure, Glutaminsäure oder Pantothensäure. Sie stellen neutrale oder saure Salze dar. Ihre Herstellung erfolgt

Tabelle

Substanz	C	Anal; H	«enwen N	e (0Io) Cl	Fe	Mole kular gewicht	d) PK*MCS	Abso Ä-max	rption E J*m	Nachgewiesene Hydrolysenprodukte	e)
Ferrimycin A1	48,65	7,09	12,95	6,10	4,56	1106 a)	4,18;	228	282	NH3, Bernsteinsäure,
							7,88	319	28,2	1 -Amino-5-hydroxyl-
								425	22,6	amino-pentan,
										o-Aminovalerian-
										säure, Cadaverin,	(0,83)
										krist. Substanz mit
										ληιαχ 227 und 323 ηιμ,
										Prolinund nichtidenti-
										fizierbaren ninhydrin-
										positiven Substanzen
Grisein A2)	43,95	5,65	12,97		5,14	1034 a)		265	108	Methyluracil,
								420	28,9	Glutaminsäure
Albomycin3)					4,16	1270-				Methyluracil, Serin,
						1346")				Ornithin
Ferrioxamin	48,04	7,41	11,21	5,25	7,67	704 a)	9,74	430	39,0	NH3, Bernsteinsäure,
B-hydro-										1 - Amino-5-hydroxyl-
chlorid										aminopentan,
										Cadaverin, o-Amino-	(1,2)
										valeriansäure,
										Hydroxylamin, kein
										Glyzin, Ornithin oder
										Serin
Ferrichrom *)	44,02	5,90	16,55		7,35	725 c)		425	39,4	NH3, Glycin, Ornithin	2,89
FerrichromA4)	44,75	5,80	11,18		5,3	1100 c)		440	33,8	Serin, Glycin, Ornithin	3,01
Coprogen6)	50,96	6,83	10,26		6,61			440	36,6

a) Durch Titration.

b) Gemäß Fe-, SO₁- und NH,-Gehalt.

c) Durch zwei unabhängige Methoden ermittelt.

d) W. Simon, E. Kovats, L. H. Chopard-dit-Jean & E. Heilbronner, HeIv., 37, S. 1872 (1954).

e) Kolorimetrisch nach Csaky") bestimmte »Hydroxylamin-Werte« pro Atom Fe. Die in Klammern angegebenen Werte sind unkorrigiert.

') Patentanmeldung C 21 506 (Case 4287/1 +2/E).

²) F. A. Kuehl et al., J. Amer. Chem. Soc, 73, S. 1770(1951).

³) G. F. Gause, Brit. Med. J., 1955, S. 1177.

«) J. B. Neilands, Bact. Rev., 21, S. 101 (1957).
⁵) C. W. Hesseltine et al., J. Amer. Chem. Soc, 74, S. 1362 (1952).
o) T. Z. Csaky, Acta Chem. Scand., 2, S. 450 (1948).

durch doppelte Umsetzung von Salzen, beispielsweise von Ferrioxamin-sulfat mit pantothensaurem Calcium oder durch Anionenaustausch an einem Ionenaustauscher, beispielsweise von Ferrioxamin-chlorid an einem stark basischen Ionenaustauscher wie IRA-400 in der Sulfatform.

Die Ferrioxamine besitzen wachstumsfördernde Eigenschaften für eine große Zahl von Organismen.

So besitzen sie einen solchen Effekt auf Bacillus subtilis, Micrococcus pyogenes var. aureus, Saccharomyces cerevisiae, Ustilago sphaerogena und Chlamydomonas eugametos. Als Beispiel sind in der Tabelle 3 Ergebnisse von Versuchen mit Ustilago sphaerogena (Brandpilz) und mit Chlamydomonas eugametos (Grünalge) zusammengefaßt, wobei ein angereichertes Präparat von Ferrioxamin B verwendet wurde:

Tabelle

	Relatives Wachstum im Vergleich zu einer unbehandelten Kontrolle Ferrioxamin B-Zusatz ^g/cm3)	10	1 0,1	247 %	0,01
O	100	540%	405%	98%	158%
100%		271%	136%	98%
100%	280%

0,001

Ustilago sphaerogena (24-Stunden-Kultur)..
Chlamydomonas eugametos (4-Tage-Kultur)

Andere Organismen, z. B. Vertreter der Gattung Arthrobacter, wie Arthrobacter terregens und Arthro-Π1

bacter flavescens, entwickeln sich überhaupt nur in Anwesenheit von Ferrioxaminen. In diesen Fällen

besitzen die Ferrioxamine also einen ähnlichen Vitamincharakter, wie es für die Wirksubstanzen Ferrichrom, Terregens Factor und Coprogen gezeigt worden ist (Bact. Rev., 21, S. 101 [1957]).

Eine weitere biologische Eigenschaft der Ferrioxamine besteht darin, daß sie imstande sind, die antibakterielle Wirkung von Antibiotika, die der Gruppe der Sideramycine angehören, gegenüber grampositiven Erregern kompetitiv aufzuheben.

Die Antisideramycinwirkung der Ferrioxamine tritt auf gegenüber den Antibiotika Albomycin, Grisein, A1787, Ferrimycin und A 22765, die alle auch gekreuzte Resistenz mit Grisein aufweisen. Überraschend ist, daß die Ferrioxamine die Wirkung der griseinartigen Sideramycine gegenüber grampositiven Bakterien aufheben, nicht aber gegenüber gramnegativen.

Der Antagonismus zwischen den Ferrioxaminen einerseits und den Sideramycinen, der Antisideramycin-Aktivität genannt wird, kann sowohl »in vitro« als auch »in vivo« nachgewiesen werden. Die antagonisierende Wirkung des Ferrioxamins B gegenüber verschiedenen Antibiotika ist aus der nachfolgenden Tabelle ersichtlich. Als Testorganismen wurden verwendet : Escherichia coli, Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus. Die zu prüfenden Antibiotika wurden im modifizierten Test nach Bonifas, der unten beschrieben ist, gegen Ferrioxamin B (1 mg/ml) geprüft.

	Tabelle	4	Staphylococcus	Esche richia	30
		aureus	coli
Antibiotika	Enthemmung der Testorganismen	kompetitive	01)
	Bacillus			35
Ferrimycin	subtilis	kompetitive	keine
Grisein	kompetitive	kompetitive	keine
(40 000 IE/mg)		kompetitive	keine
Albomycin	kompetitive	kompetitive	η	40
A 1787	kompetitive	keine	keine
A22 7652)	kompetitive	keine	keine
Neomycin	kompetitive	keine	keine
Streptomycin	keine	keine	keine
Streptothricin	keine	keine	0	45
Viomycin	keine
Penicillin	keine
keine

') 0 bedeutet, daß das betreffende Antibiotikum gegen diesen Testorganismus fast keine Wirkung zeigt.

²) Stamm S. aureofaciens Duggar A 22765.

Weitere in der Tabelle nicht aufgeführte, durch Ferrioxamine nicht beeinflußte Antibiotika sind: Acetomycin, Actinomycine C, X, I und Z, Angolamycin, Carbomycin, Chartreusin, Chlortetracyclin, Cycloserin, Cincrubine, Desertomycin, Erythromycin, Exfoliatin, Granaticin, Holomycin, Leucomycin, Megacidin, Methymycin, Narboinycin, Novobiocin, Olcandomycin, Oxytetracyclin, Pikromycin, Rhodomycin, Spiramycine, Streptogramin, Tetriomycine und Thiolutin.

Die Antisideramycinwirkung in vitro der Ferrioxamine eignet sich gut für eine qualitative Erkennung und quantitative Bestimmung dei Ferrioxamine, indem der an und für sich zur Bestimmung von synergistisch wirkenden Substanzen ausgearbeitete Test von Bonifas (V. Bonifas, Experientia, 8, S. 234 [1952]) sinngemäß angewendet werden kann. Dazu werden Testplatten, z. B. Petrischalen, die eine Schicht eines geeigneten Agarnährbodens enthalten, mit Bacillus subtilis Cohn emend. Prazmowski oder Staphylococcus aureus Rosenbach beimpft. Auf die Agarschicht werden Streifen von Filtrierpapier (5 mm breit), z. B. von Whatman-Nr. 1 -Papier, die mit einer Lösung eines Sideramycin-Antibiotikums, z. B. einer Lösung von lOj/ml Ferrimycin in Methanol, getränkt sind, aufgelegt. Senkrecht dazu werden darüber Streifen gleicher Breite gelegt, die mit der auf Ferrioxamin B-Gehalt zu testierenden Lösung getränkt sind. Nach einer 9- bis 15stündigen Bebrütung bei 36° C ist eine Beeinflussung der antibiotischen Wirkung des Ferrimycins leicht zu erkennen: im Hemmhof, welcher sich aus den Streifen mit dem Antibiotikum bildet, entsteht an der Kreuzung der beiden Streifen eine keilförmige Einschnürung, deren Form und Dimensionen unter Standardbedingungen zur quantitativen Bestimmung der Ferrioxamine verwendet werden (vgl. Fig. 10). Wenn eine Lösung sowohl Ferrioxamin als auch Ferrimycin enthält, muß sie 30 Minuten bei neutralem pH auf 60° C erhitzt werden. Dadurch wird die antibiotische Wirkung des Ferrimycins zerstört, während die Ferrioxaminwirkung erhalten bleibt und folglich quantitativ bestimmt werden kann.

Im Antisideromycintest erwies sich B von allen Ferrioxaminen als das wirksamste. Mit Staphylococcus aureus als Testorganismus zeigen die anderen Ferrioxamine bezüglich B folgendende Aktivitäten: A 51%, C 16%, D₁ 8%, D₂ 3%, E 4% und F 30%.

Die bereits genannten Substanzen Ferrichrom, Terregens Faktor und Coprogen gleichen in ihrem Vitamincharakter für Arthrobacter terregens und Arthrobacter flavescens den Ferrioxaminen. Hingegen ist die oben geschilderte, für die Ferrioxamine typische, wachstumsfördernde Wirkung auf Bacillus subtilis, Micrococcus pyogenes, Saccharomyces cerevisiae, Ustilago sphaerogena und Chlamydomonas eugametos für die drei Substanzen Ferrichrom, Terregens Faktor und Coprogen nicht bekannt. Es ist auch nichts über einen antagonistischen Effekt dieser Substanzen auf die antibakterielle Aktivität der Sideramycin-Antibiotika bekannt.

Bei der Papierchromatographie unterscheidet sich Ferrichrom beim direkten Vergleich im System V (vgl. Tab. 1) eindeutig von den Ferrioxaminen B bis F, zeigt in diesem System jedoch einen ähnlichen R_f-Wert wie Ferrioxamin A. Dagegen kann es als neutrale Substanz bei der Papierelektrophorese in 0,33 n-Essigsäure leicht vom stark basischen Ferrioxamin A unterschieden werden. Der Terregensfaktor enthält nur Spuren von Eisen und ist somit von sämtlichen aufgeführten Ferrioxaminen verschieden. Coprogen ist an Hand seiner analytischen Daten gut von den Ferrioxaminen A, B, D und E zu unterscheiden. Das Verhältnis %C zu %N beträgt bei Coprogen 4,97, bei den erwähnten Ferrioxaminen 3,5 bis 4,3. Bei den Ferrioxaminen C und F ist dieser Unterschied nicht so ausgeprägt (%C zu %N = 4,74 bis 4,78). Die Ferrioxamine C und F sind jedoch starke Basen, die als Hydrochloride isoliert werden, während Coprogen gemäß den vorliegenden Daten eine neutrale Substanz darstellt (Journ. Amer. Chem. Soc, 74, S. 1362 [1952]).

Die Ferrioxamine, ihre Derivate und Spaltprodukte sowie Salze dieser Verbindungen werden erhalten, wenn man aus pflanzlichen Organismen oder deren Extrakten die neuen Wuchsstoffe nach an sich

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bekannten Methoden unter Berücksichtigung der oben angegebenen chemischen und physikalischen Daten und unter Anwendung des Antisideramycintestes isoliert und, wenn erwünscht, Salze, Derivate oder Spaltprodukte der neuen Verbindungen herstellt.

Die Ausgangsstoffe für die Gewinnung der Ferrioxamine sind z. B. höhere Pflanzen, wie Dicotyledoneae, z. B. die Gattung Solanaceae, beispielsweise Solanum lycopersicum oder die Gattung UmbeUiferae, beispielsweise Daucus carota L. und Monocotyledoneae, z. B. Commelinaceae, wie Rheoe discolor, ferner Algenkulturen, z. B. von Chlamydomonas eugametos, oder vor allem Kulturen von Mikroorganismen, z. B. von Vertretern der Gattung Streptomyces, von Bakterien, z. B. von B. subtilis oder von Hefen, z. B. von Saccharomyces cerevisiae. Die Antisideramycin wirkung kann man im rohen Extrakt oder Kulturfiltrat an Hand des obenerwähnten Testes erkennen.

Eine besonders bevorzugte Quelle sind Kulturen von Streptomyceten, die an Hand der von Ettlinger et al. (Arch. Mikrobiol., 3, S. 326 [1958]) vorgeschlagenen Merkmale den folgenden Arten zugeordnet werden: Streptomyces griseoflavus (Krainsky) Waksman et Henrici, Streptomyces lavendulae (Waksman et Curtis) Waksman et Henrici, Streptomyces galilaeus Ettlinger et al., Streptomyces pilosus Ettlinger et al., Streptomyces polychromogenes

ίο Hagemann, Penasse et Teilion, Streptomyces viridochromogenes (Krainsky) Waksman et Henrici, Streptomyces aureofaciens Duggar, Streptomyces olivaceus (Waksman) Waksman et Henrici, Streptomyces griseus (Krainsky) Waksman et Henrici, Streptomyces glaucescens Gause et al.

Aus der folgenden Tabelle sind die artbestimmenden Merkmale der Ferrioxamine bildenden Streptomycetenstämme ersichtlich.

	Morphologie der Sporen	Tabelle	5	Morphologie des Luftmycels	Melanoides Pigment
Merkmale Art	Sporen mit kurzen Stacheln	Farbe des Luftmycels	Sporenketten mit offenen regelmäßi gen Spiralen, oft mehr als sechs Windungen	fehlt
S. griseoflavus (Krainsky) Waksman et Henrici	Sporen mit feinen zerbrechlichen Haaren	Aschgrau	Sporenketten mit offenen regelmäßi gen Spiralen, meist mehr als sechs Windungen	vor handen
S. pilosus Ettlinger et al.	Sporen mit kurzen Stacheln	Aschgrau	Sporenketten mit offenen regelmäßi gen Spiralen, oft mehr als sechs Windungen	vor handen
S. viridochromogenes (Krainsky) Waksman et Henrici	glatt	Hellblau	Sporenketten monopodial verzweigt, gerade oder gewellt	fehlt
S. olivaceus (Waksman) Waksman et Henrici	glatt	Aschgrau	Sporenketten monopodial verzweigt, mit unregelmäßigen offenen Spiralen	fehlt
S. aureofaciens Duggar	glatt	Aschgrau	Sporenketten monopodial verzweigt, lange gerade Hauptachse, offene regelmäßige Spiralen, meist mehr als sechs Windungen	vor handen
S. galilaeus Ettlinger et al.	glatt	Aschgrau	Sporenketten mit offenen, unregel mäßigen Spiralen an den Enden langer gerader Stücke	vor handen
S. lavendulae- (Waksman et Curtis) Waksman et Henrici	glatt	Blaßkarmin zimtbraun	Sporenketten gerade oder gewellt	fehlt
S. polychromogenes Hagemann et al.	glatt	Blaßkarmin zimtbraun	Sporenketten gewellt, sympodial ver zweigte Büschel ohne Spiralen	fehlt
S. griseus Waksman et Henrici	Gelblich- grünlich grau

Zur Gewinnung größerer Mengen von Ferrioxaminen werden vorteilhaft Kulturen der genannten Mikroorganismen verwendet. Besonders bewährt haben sich in dieser Beziehung die obenerwähnten Streptomycesstämme, die sich leicht in größerem Maßstab züchten lassen. Die vorliegende Erfindung ist aber nicht auf die Verwendung der Vertreter der genannten Arten beschränkt, sondern betrifft auch die Verwendung von ferrioxaminbildenden Stämmen anderer Arten und insbesondere von Varianten aller dieser Organismen, wie sie z. B. durch Selektionierung oder Mutation, insbesondere von Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoffsenfölen gewonnen werden.

Zur Gewinnung der Ferrioxamine in größerem Maßstab wird z. B. ein die Eigenschaften der oben angeführten Streptomyceten aufweisender Stamm,

ζ. Β. in wäßriger, Kohlenhydrate, stickstoffhaltige Verbindungen sowie anorganische Salze enthaltender Nährlösung aerob gezüchtet, bis diese eine wesentliche Ferrioxaminwirkung zeigt, und die Ferrioxamine hierauf isoliert. Man kann aber auch Pflanzen, wie Grünalgen, oder Bakterien, wie B. subtilis, züchten und daraus Ferrioxamine in reiner bzw. angereicherter Form isolieren. Für die Züchtung der genannten Mikroorganismen kommen als assimilierbare Kohlenhydrate z. B. Glukose, Saccharose, Laktose, Mannit, Stärke sowie Glycerin in Frage. Als stickstoffhaltige Nährstoffe und gegebenenfalls wachstumsfördernde Stoffe seien genannt: Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte, wie Pepton oder Trypton, ferner Flcischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais und Weizen, von Destillationsrückständen der Alkoholherstellung, von Hefe, Samen, insbesondere der Raps- und Sojapflanze, der Baumwollpflanze usw., aber auch Ammoniumsalze und Nitrate. Von anderen anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Eisen, Zink und Mangan enthalten.

Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich beispielsweise bei Streptomyceten eine solche zwischen 18 und 4O⁰C. Eine wesentliche Ferrioxaminwirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach 2 bis 10 Tagen. Zur Kultur gibt man 0,1 °/o Ferrichlorid zu und trennt das Mycel vom Kulturfiltrat ab, wonach die Hauptmenge der Ferrioxamine im Kulturfiltrat gefunden wird. Es bleiben aber trotzdem namhafte Mengen davon am Mycel adsorbiert. Es ist daher vorteilhaft, letzteres gut auszuwaschen. Dazu eignen sich beispielsweise Wasser und/oder wäßrige organische Lösungsmittel, wie Alkohole, z. B. wäßriges Methanol.

In ähnlicher Weise kann man auch Bakterien, z. B. B. subtilis, züchten und das Kulturfiltrat als Quelle für die Isolierung der Ferrioxamine verwenden.

Für die Isolierung der Ferrioxamine aus den genannten Materialien, insbesondere den Kulturfiltraten von Pilz- oder Bakterienzüchtungen, kann man nach an sich bekannten Methoden vorgehen und z. B. eine der nachfolgend angegebenen Arbeitsweisen oder Kombinationen davon verwenden.

1. Man kann Adsorptionsmittel verwenden, z. B. Aktivkohlen, wie Norit, aktivierte Erden, wie Frankonit, Fullererde oder Floridin, oder Harzadsorber, wie Asmit. Die Elution der Adsorbate erfolgt zweckmäßig mit Gemischen von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln mit Wasser, z. B. mit Wasser-Methanol-, Wasser-Pyridin-, verdünnte Essigsäure-Methanol- oder Wasser-Methanol-Eisessig-Butanol-Gemischen. Als besonders vorteilhaft für die Elution eines Frankonit- oder Noritadsorbates hat sich das Gemisch von Wasser (4 Volumteile) und Pyridin (1 Volumteil) erwiesen.

2. Eine zweite Methode zur Abtrennung der Ferrioxamine besteht darin, daß man sie an Kationenaustauschern adsorbiert, wobei besonders Säuregruppen enthaltende Harze, wie Dowex 50, geeignet sind. Letzteres kann sowohl in der Säureform als auch in der Natriumform verwendet werden, doch hat sich auch ein Gemisch dieser beiden Formen bewährt. Die Elution geschieht zweckmäßig mit sauren Agentien,

z. ß. mit m;tiianolischer Salzsäure oder sauren Pufferlösung:n.

3. Weiter können die Ferrioxamine einer wäßrigen Lösung mittels organischer Lösungsmittel entzogen werden. Für diese Extraktionsv;rfahren haben sich höhere organische Alkohole, z. B. Benzylalkohol oder Isopropylalkohol, besonders bewährt. Zweckmäßigerweise wird dabei der wäßrigen Phase ein anorganisches Salz, z.B. Ammoniumsulfat oder Natriumchlorid, zugesetzt. Aus den erhaltenen organischen Extrakten können die Ferrioxamine entweder durch Abdampfen des Lösungsmittels oder durch Ausfällung mittels eines geeigneten organischen Lösungsmittels, z. B. Äther, Petroläther oder Äthylacetat, in angereicherter Form erhalten werden.

4. Eine Anreicherung der Ferrioxamine wird auch dadurch erreicht, daß man konzentrierte, wäßrige oder alkoholisch-wäßrige Lösungen des Salzes mit einem Überschuß von organischen, mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, wie Aceton, Dioxan usw., versetzt, wobei die Salze in fester Form ausgefällt werden.

5. Eine weitere Methode der Anreicherung der Ferrioxamine besteht darin, daß man sie zwischen einer wäßrigen Lösung und einer Lösung von Phenol in Chloroform verteilt, wobei sowohl das ph der wäßrigen Lösung als auch der Phenolgehalt der Chloroformlösung variiert werden. Versteht man unter dem Verteilungskoeffizienten von Ferrioxaminen das Verhältnis von Konzentration in der organischen Phase zur Konzentration in der wäßrigen, so ergibt sich, daß der Verteilungskoeffizient mit steigendem Phenolgehalt der organischen Phase zunimmt und mit sinkendem Ph der wäßrigen Phase abnimmt. Da es somit möglich ist, jeden beliebigen Verteilungskoeffizienten von Ferrioxaminen in diesem System einzustellen, kann man durch Kombination von wenigen Verteilungsoperationen einen Großteil inaktiver Verunreinigungen abtrennen.

6. Eine andere Methode zur Anreicherung und/oder Auftrennung der Ferrioxamine stellt die Chromatographie dar, wie Adsorptionschromatographie an verschiedenen Materialien, z. B. an Norit, Aluminiumoxyd, Magnesiumsilikaten, Silicagel, Calciumsulfat, sowie Verteilungschromatographie mit Cellulose, Stärke, Silicagel, Celite u. dgl. als Trägersubstanzen, oder aber Chromatographie an Ionenaustauscherharzen, z. B. an Dowex 50, Amberlite IRC-50 u. dgl.

7. Weiter können die Ferrioxamine durch Gegenstromverteilung nach Craig zwischen zwei nicht mischbaren Lösungsmittelphasen angereichert werden. Folgende Lösungsmittelsysteme haben sich dabei besonders bewährt:

a) Benzylalkohol — 20% ige wäßrige Lösung von Ammoniumsulfat;

b) n-Butanol (100 Volumteile) — Benzylalkohol (200 Volumteile) — 1 n-Salzsäure (6 Volumteile) — Wasser (300 Volumteile) — wäßrige, bei 19°C gesättigte Natriumchloridlösung (60 Volumteile).

8. Schließlich eignet sich die präparative Elektrophorese an einer Säule mit Trägermaterial gut zur Reinigung, Anreicherung und Auftrennung von Ferrioxaminpräparat. Diese wird als Hochspannungselektrophorese bei 500 bis 4000 Volt durchgeführt.

Eine weitere Verbesserung besteht darin, daß man dieses Verfahren nach dem sogenannten Gegenstromprinzip durchführt. Dabei werden die als Kationen vorliegenden Ferrioxamine A, B, C und F auf der

Trägersäule örtlich festgehalten, indem man ihre durch das elektrische Feld hervorgerufene Bewegung mittels einer in entgegengesetzter Richtung verlaufenden Strömung des Elektrolyts genau kompensiert. Dadurch wird erreicht, daß Stoffe mit anderer elektrischer Beweglichkeit die Trägersäule an den beiden Elektrodenenden verlassen.

Die einzelnen Ferrioxamine werden als reine und einheitliche Substanzen in Form eines amorphen Pulvers oder als Kristalle erhalten. Für ihre Gewinnung haben sich folgende Methoden als besonders geeignet erwiesen:

Lyophylisation einer wäßrigen oder alkoholischen Lösung.

Fällen aus einer wäßrigen, alkoholischen oder phenolischen Lösung mit lipophilen organischen Lösungsmitteln, die mit dem das Ferrioxamin enthaltenden Lösungsmittel mischbar sind; besonders geeignet für diese Fällung sind niedere Alkylketone, wie Aceton, Methyläthylketon, Äther wie Diäthyläther, Diisobutyläther, und Kohlenwasserstoffe wie Pentan, Hexan, Petroläther.

Kristallisation aus geeigneten Lösungsmittelgemischen wie Alkohol — Äther, z. B. Methanol

— Diäthyläther, oder Mischungen von Wasser und organischen Lösungsmitteln, die mindestens teilweise mit Wasser mischbar sind, z. B. Wasser

— Aceton, Wasser — Eisessig usw.

Die Ferrioxamine, ihre Derivate und die Salze dieser Verbindungen können als Wuchsstoffe für verschiedene Organismen verwendet werden, und zwar entweder allein oder in Form von speziellen Präparaten. Sie besitzen ferner ausgeprägte antianämische Eigenschaften, beispielsweise bei Entblutungsanämie und Eisenmangelanämie, und können dementsprechend als Heilmittel in Form von Präparaten verwendet werden.

Die Präparate enthalten die Ferrioxamine, ihre Salze oder Derivate zusammen mit einem geeigneten Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi, Polyalkylenglykole, Vaseline oder Cholesterin. Solche Präparate können in fester Form, z. B. als Pulver, oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netzoder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.

Fig. 1 zeigt eine Gegenstromverteilung von rohem Ferrioxamin über 80 Stufen mit je 100 cm³ organischer und 100 cm³ wäßriger Phase im System n-Butanol—Benzylalkohol—gesättigte wäßrige Kochsalzlösung—n-Salzsäure (100:200:300:60:6). -•-•—Extinktion bei 425 ηιμ. HJ-Antisideramycinaktivität in Millimeter (abgeänderter Bonifas-Test);

Fig. 2 zeigt im Chromatogramm von Fraktion III von Fig. 1 an Dowex 50-WX₂ mit Ammoniumacetatpuffer als Elutionsmittel;

Fig. 3 zeigt das IR-Spektrum von Ferrioxamin B in Nujol;

Fig. 4 zeigt im Papierchromatogramm der Ferrioxamine im System tert.-Butanol—Wasser—gesättigte wäßrige Natriumchloridlösung—0,1 n-Salzsäure (50:

25:25:1), Papier imprägniert mit Aceton—Wasser— gesättigte wäßrige Natriumchloridlösung (6:3:1);

Fig. 5 zeigt Papierelektrophorese der Ferrioxamine, Zentimeter Laufstrecke in 0,33 η-Essigsäure nach 4V₂ Stunden bei 220 V;

Fig. 6 zeigt im Chromatogramm von Fraktion II von Fig. 1 an Dowex 50-WX₂ mit Ammoniumacetat als Pufferlösung. -·-·—Extinktion bei 425 πιμ;

Fig. 7 zeigt ein Chromatogramm von Fraktion IV ίο von Fig. 1 an Dowex 50-WX₂ mit Ammoniumacetatpuffer als Elutionsmittel. -·-·—Extinktion bei 425 ΐημ;

Fig. 8 zeigt ein Chromatogramm der Fraktionen 2 bis 5, das bei der Chromatographie von Fraktion V von Fig. 1 an Dowex 50-WX₂ mit Ammoniumacetatpuffer als Elutionsmittel in beiden Fällen erhalten wird. -■-·—Extinktion bei 425 ΐημ;

Fig. 9 zeigt ein Chromatogramm der Fraktionen 48 bis 55, das bei der Chromatographie von Fraktion V von Fig. 1 an Dowex 50-WX₂ mit Ammoniumacetatpuffer als Elutionsmittel in beiden Fällen erhalten wird. -·-·—Extinktion bei 425 ηιμ;

Fig. 10 zeigt den Antagonismus zwischen Ferrioxaminen und Ferrimycin im abgeänderten Bonifas-Test. Die schraffierten Flächen zeigen die Hemmung des Wachstums des Testorganismus;

Fig. 11 zeigt das IR-Spektrum von Ferrioxamin A in Kaliumbromid;

Fig. 12 zeigt das IR-Spektrum von Ferrioxamin C in Kaliumbromid;

Fig. 13 zeigt das IR-Spektrum von Ferrioxamin D₁ in Kaliumbromid;

Fig. 14 zeigt das IR-Spektrum von Ferrioxamin E in Kaliumbromid;

Fig. 15 zeigt das IR-Spektrum von Ferrioxamin F ³^ in Kaliumbromid;

Fig. 16 zeigt das IR-Spektrum von Ferrioxamin D₂ in Kaliumbromid.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, ohne daß damit eine Einschränkung des Erfindungsgegenstandes beabsichtigt ist. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

Beispiel 1

Die Züchtung des Streptomyces pilosus, Stamm NRRL 2857, wird nach dem Submersverfahren durchgeführt. Man verwendet eine Nährlösung, die je Liter Leitungswasser 20 g Sojamehl und 20 g Mannit enthält. Die Nährlösung wird in den Impfkolben oder in den Fermentern 20 bis 30 Minuten bei 1 atü sterilisiert. Die sterilisierte Nährlösung zeigt ein Ph von 7,2 bis 7,6. Die Beimpfung erfolgt mit bis zu 20 °/₀ einer teilweise sporulierenden vegetativen Kultur des genannten Organismus. Man inkubiert unter gutem Schütteln oder Rühren bei 24 bis 30°, wobei die Kulturen in Fermentern mit etwa 2 Volumen Luft je Volumen Lösung je Minute belüftet werden. Nach 48 bis 240 Stunden Bebrütung hat die Kulturlösung den höchsten Gehalt an Ferrioxamins B erreicht. Man unterbricht die Kultur, gibt 0,1 % Ferrichlorid zu, trennt das Mycel sowie andere feste Bestandteile von der die Hauptmenge des Ferrioxamin B enthaltenden Lösung mittels Filtration oder Zentrifugation ab, wobei gegebenenfalls der Kulturlösung vor der Filtration etwa 1 °/₀ eines Filterhilfsmittels, z. B. Hyflo Supercel, zugesetzt wird. Die Filterrückstände wäscht man mit Wasser oder wäßrigem Methanol und vereinigt die Waschflüssigkeiten mit dem Kultur-

filtrat. Das gewonnene Kulturfiltrat wird unter stetem Rühren mit 2°/₀ Tonerde, z.B. Frankonit, versetzt. Nach gründlicher Durchmischung filtriert man ab und wiederholt mit dem erhaltenen Filtrat den Absorptionsvorgang ein- bis zweimal. Die Filterrückstände werden vereinigt und mehrmals mit Wasser und wäßrigem Methanol gewaschen. Anschließend werden die Filterrückstände zwei- bis dreimal mit einem Pyridin-Wasser-Gemisch (1:4) eluiert. Das durch Filtration geklärte Eluat wird am Vakuum eingeengt. Die erhaltenen Konzentrate können entweder direkt weiterverarbeitet werden (s. Beispiel 3), oder man kann daraus mittels Gefriertrocknung ein Gemisch der Ferrioxamine in roher Form isolieren.

Verwendet man an Stelle der oben angegebenen Nährlösung solche, die je Liter Leitungswasser die folgenden Nährstoffe enthalten, so erhält man nach analoger Züchtung und Aufarbeitung Kulturfiltrate von ähnlich hohem Gehalt an Ferrioxamin B.

a) Saccharose 20 g

Natriumeitrat 0,9 g

Ammoniumacetat 3 g

sek. Kaliumphosphat 3 g

Magnesiumsulfat 0,8 g

Kupfersulfat 0,01 mg

Manganchlorid 0,07 mg

Ferricitrat 20 mg

b) Rohglukose 10 g

Sojamehl 10 g

Cornsteep liquor 20 g

Kochsalz 5 g

Natriumnitrat Ig

Kalk 10 g

c) Raps-Extraktionschrot 20 g

Rohglukose 10 g

sek. Kaliumphosphat 0,2 g

Kalk 10 g

d) Flachsmehl 40 g

Rohglukose 10 g

sek. Kaliumphosphat 0,2 g

Kalk 10 g

An Stelle des angegebenen Stammes der Art Streptomyces pilosus können die folgenden Stämme verwendet werden (unter den angegebenen Stamm-Nummern werden die Stämme im Institut für spezielle Botanik, Eidgenössische Technische Hochschule, Zürich, aufbewahrt). Nach analoger Züchtung und Aufarbeitung erhält man Kulturfiltrate von ähnlich hohem Ferrioxamingehalt.

Stamm Nr.	Streptomyces-Art	S. olivaceus
7 346	S. olivaceus
7 437	S.aureofaciens Duggar
22 083	S. aureofaciens
22 765	S.galilaeus Ettlinger et al.
18 822	S.lavendulae (Waksman et Curtis)
14 677	Waksman et Henrici
	S. lavendulae
21510	S. polychromogenes Hagemann et al.
21837	S. polychromogenes
23 217	S. polychromogenes
23 310	S. griseus Waksman et Henrici
10 112	S. griseus
13 495	S. griseus
7 419

Beispiel 2

Stamm Nr.	Streptomyces-Art
9 578	S.griseoflavus (Krainsky) Waksman et
	Henrici
15311	S.griseoflavus
11 686	S. pilosus Ettlinger et al.
23 258	S. pilosus
23 305	S. pilosus
17 635	S. viridochromogenes (Krainsky)
	Waksman et Henrici
18 055	S. viridochromogenes
6 445	S. olivaceus (Waksman) Waksmann et
	Henrici

Der Stamm A 23 978 der Art Streptomyces aureofaciens (Institut für spezielle Botanik, Eidgenössische Technische Hochschule, Zürich) wird submers gezüchtet auf einer Nährlösung, die je Liter Leitungswasser 20 g Malzextrakt, 20 g Distillers solubles enthält. Die Züchtung und Aufarbeitung erfolgt gleich wie im Beispiel 1, wobei Kulturfiltrate mit ähnlich hohem Ferrioxamingehalt erhalten werden.

3°

Beispiel 3

60 1 Kultur werden in der im Beispiel 1 dargestellten Weise hergestellt und aufgearbeitet. Das gewonnene Pyridin-Wasser-Eluat (etwa 6 1) wird im Vakuum auf 31 eingeengt. In diesem Konzentrat werden 870 g Ammonsulfat gelöst. Die Lösung wird durch Filtration oder Zentrifugation, gegebenenfalls unter Zugabe von 1 °/o Hyflo Supercel, geklärt. Durch drei- bis viermaliges Ausschütteln mit Benzylalkohol oder Isopropylalkohol werden die Ferrioxamine in das organische Lösungsmittel übergeführt. Die organischen Phasen werden vereinigt und mit Hilfe von Natriumsulfat getrocknet. Man gibt einen Überschuß von Äther oder Äthylacetat zu und filtriert die ausgefällten Ferrioxamine ab. Der Zusatz von Filterhilfsmittel, z. B. Hyflo Supercel, vor der Ausfällung erleichtert die Gewinnung des Niederschlages. Aus diesem können die Ferrioxamine mit Methanol oder Wasser ausgewaschen werden. Diese Eluate werden eingedampft oder lyophilisiert, und man erhält so die Ferrioxamine in angereicherter Form.

Beispiel 4

Einem gemäß Beispiel 1 oder 2 erhaltenen Kulturfiltrat werden je Liter 20 g Kochsalz zugefügt. Die klare Lösung wird dreimal mit V₁₀ Volumen Chloroform-Phenol-Gemisch (1 Volumteil Chloroform, 1 Gewichtsteil Phenol) ausgezogen. Die organischen Phasen werden vereinigt, unter Zusatz von Hyflo Supercel filtriert und mit einem Überschuß an Äther versetzt. Durch mehrmaliges Ausschütteln mit wenig Wasser werden die Ferrioxamine in die wäßrigen Anteile übergeführt. Die erhaltenen wäßrigen Phasen werden vereinigt und zur vollständigen Entfernung des Phenols zweimal mit Äther ausgeschüttelt. Durch Gefriertrocknung gewinnt man ein orange bis braunrotes Präparat von Ferrioxaminen, das durch Papierchromatographie zerlegt werden kann.

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Beispiel 5

201 Kulturlösung werden unter Rühren mit 400 g Hyflo Supercel und 200 ml einer 10%igen wäßrigen Ferrisulfatlösung versetzt und filtriert. Das Filtrat extrahiert man nach Zugabe von 3,6 kg Kochsalz in einem Gegenstromextraktor mit 21 Phenol-Chloroform (1 g: 1 ml), trocknet den Extrakt über Natriumsulfat und läßt ihn innerhalb 1 Stunde in eine gut gerührte Suspension von 20 g Hyflo Supercel in 2 1 Äther und 101 Petroläther einlaufen. Nach dem Filtrieren des pulverigen Gemenges aus Filterhilfsmittel und Niederschlag und Auswaschen mit etwa 21 Äther wird fünfmal mit je 600 cm³ Methanol eluiert. Die vereinigten Eluate liefern beim schonenden Eindampfen 10 g rohes Ferrioxamin in Form eines braunroten Pulvers.

Beispiel 6

4 g rohes Ferrioxamin werden im System n-Butanol— Benzylalkohol—Wasser—gesättigte wäßrige Natriumchloridlösung—1 n-Salzsäure (100 : 200 : 300 : 60 : 6) über 80 Stufen zu je 100 cm³ organischer und 100 cm³ wäßriger Phase verteilt. Die Auswertung der Verteilung erfolgt durch biologische Testierung und durch Extinktionsmessung bei 425 m: Jeder vierten Einheit entnimmt man 2 cm³ oberer und unterer Phase und vermischt diese mit 32 cm³ Methanol, wobei eine homogene Lösung erhalten wird, deren Konzentration für beide Testierungen geeignet ist (vgl. Fig. 1). Die gemäß dieser Auswertung in vier Gruppen zusammengefaßten Verteilungsfraktionen enthalten, wie sich papierchromatographisch zeigen läßt, neben dem Hauptprodukt Ferrioxamin B (in Verteilungsfraktion III) weitere antisideramycinwirksame, rotgefärbte Verbindungen, die als Ferrioxamine A, C, D₁, D₂, E und F bezeichnet werden.

40

45

Die Verteilungsfraktion III schüttelt man mit 31 Petroläther. Die tiefrotgefärbte wäßrige Phase wird mit Chloroform gewaschen, mit Kochsalz bis zu einer Konzentration von lO°/o versetzt und mit Phenol— Chloroform (1 g: 1 ml) erschöpfend extrahiert. Den Phenol-Choroform-Extrakt wäscht man mehrmals mit 10°/₀ Natriumchlorid enthaltender 0,01 n-Salzsäure, filtriert durch eine kleine Säule von 20 g Celite und fällt die Inhaltsstoffe durch Zugabe von 25 g Hyflo Supercel, 500 cm³ Äther und 11 Petroläther unter Rühren bei 0°. Das pulverige Gemenge aus Filterhilfsmittel und Niederschlag wird gut mit Äther gewaschen und hierauf mit wenig Methanol eluiert. Aus dem Methanoleluat erhält man beim schonenden Eindampfen 982 mg rohes Ferrioxamin B in Form eines braunroten Pulvers.

Die Verteilungsfraktionen II, IV und V werden auf gleiche Weise aufgearbeitet.

Fraktion Nr.	Verteilungs- fraktion	Hauptsächlichstes Ferrioxamin
6 bis 18 19 bis 32 33 bis 62 63 bis 80	II III IV V	A B C D1, D2, E und F

sehenen und mit Cellulosepulver gefüllten, vertikalen Glassäule von 1,5 m Höhe und 2,6 cm Durchmesser der Zonenelektrophorese nach J. Porath (Biochim. et Biophys. Acta, 22, S. 151 [1956]) unterworfen. Als Elektrolytlösung dient 7₃n-Essigsäure. Man löst die Substanz in 20 cm³ Wasser und trägt die tiefrotgefärbte Lösung am oberen Anodenende auf die Säule auf. Die orangerotgefärbte, etwa 10 cm hohe Ferrioxaminzone wandert bei einer Spannung von 1600 Volt und einer Stromstärke von 30 mA mit einer Geschwindigkeit von 3,9 cm/Stunde gegen die Kathode am unteren Säulenende. Um die Trennwirkung der Säule zu erhöhen, wird diese elektrische Wanderung durch eine entgegengesetzt gerichtete Elektrolytströmung kompensiert, wodurch der wegen seiner Eigenfarbe gut erkennbare Wirkstoff in der Säule örtlich festgehalten wird. Begleitstoffe, die eine größere bzw. kleinere elektrische Wanderungsgeschwindigkeit als der Wirkstoff haben, werden dabei in den Kathodenbzw. Anodenraum abgetrieben und aus der Säule entfernt. Nach 5 bis 6 Tagen hat der Wirkstoff unter diesen Bedingungen eine Flüssigkeitssäule von 4 bis 5 m Länge durchwandert. Nun bricht man die Elektrophorese ab und eluiert die Säule mit 7₃n-Essigsäure, wobei Fraktionen von je 15 cm³ aufgefangen werden. Diese werden einzeln untersucht. Die stark rotgefärbten, biologisch aktiven Fraktionen werden vereinigt. Man setzt 10°/₀ Natriumchlorid zu und extrahiert erschöpfend mit einem Gemisch von Phenol— Chloroform (1 Gewichtsteil, 1 Volumteil). Die vereinigten Extrakte werden mit V100 "-Salzsäure, die 10% Natriumchlorid enthält, mehrere Male gewaschen und darauf durch Celite nitriert. Zum tiefrotgefärbten wasserfreien Filtrat gibt man Filterhilfsmittel (Hyflo Supercel) und versetzt unter Rühren mit dem fünffachen Volumen Äther—Petroläther (1:1), wobei der Wirkstoff auf das Filterhilfsmittel ausgefällt wird. Dieses wird abfiltriert und mit viel Äther gewaschen. Darauf eluiert man die aktive Substanz mit wenig Methanol und dampft die rote Lösung im Vakuum bei 20° zur Trockne ein. Man erhält so ein im Vergleich zum Ausgangsmaterial zweimal angereichertes Präparat des Ferrioxamins B. Es stellt ein rotes amorphes Pulver dar, das in Wasser, Methanol, Butanol, Benzylalkohol, Phenol, Dimethylformamid und Essigsäure löslich ist und Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff und Eisen enthält. Es zeigt im übrigen folgende Eigenschaften: pK (66 °/₀ wäßrige Methylcellosolve) = 9,54; Äquivalentgewicht = 645; Ultraviolett-Absorptionsmaximum bei 430mμ (log EU = 1,51); Infrarotspektrum siehe Fig. 3.

Bei der Hydrolyse eines solchen Präparates in 6n-Salzsäure (6 Stunden bei 110°) erhält man ein Gemisch, das fünf ninhydrinpositive Substanzen enthält. Diese zeigen bei der Papierchromatographie folgende Rf-Werte:

Beispiel 7

1 g eines gemäß Beispiel 6 erhaltenen Präparates von Ferrioxamin B wird in einer mit Kühlmantel ver-

65

	Lösungsmittelgemisch	n-Butanol—Eis
Substanz Nr.		essig—Wasser (4:1:1)
	Phenol—H2 O (8: 2)	0,37
1	0,68	0,34
2	0,40	0,10
3	0,35	0,05
4	0,30	0,04
5	0,20

Beispiel 8

865 mg rohes Ferrioxamin B aus der Verteilungsfraktion III (vgl. Beispiel 6) werden an einer Säule (66 cm ■ 7,14 cm²) von Dowex 50-WX₂ (100/200 mesh) bei 15 bis 17^L chromatographiert. D^r Ionenaustauscher wird vorher nach Vorschrift von Hi rs et al. (J. Biol. Chem., 219, S. 623 [1956]) gereinigt, in der Ammoniumform durch Sedimentation auf die Säule gebracht und mit 0,2 m Ammoniumacetatpuffer von Ph 4,60 während 48 Stunden bei einer Durchlaufgeschwindigkeit von 200 ml/Stunde äquilibriert. Die in 9 cm³ der genannten Pufferlösung auf die Säule aufgetragene Substanz entwickelt man mit 0,2m p_H4,6-Puffer während 72 Stunden (100 ml/Stunde). Hierauf wird das Elutionsmittel unter Verwendung eines 1-1-Mischgefäßes mit 2 m Ammoniumacetatpuffer von Ph 4,7 kontinuierlich aufkonzentriert (Gradient Elution) und das Eluat kurz vor Austritt der ersten gefärbten Zone in Fraktionen zu 40 cm³ aufgefangen. Die gemäß Extinktionsmessung bei 425 ΐημ (vgl. Fig. 2) zusammengefaßten Fraktionen extrahiert man in der bereits beschriebenen Weise unter Verwendung von Phenol—Chloroform, Äther— Petroläther—Hyflo Supercel und Methanol.

Fraktion	Menge mg	Substanz
13 bis 18 93 bis 125 185 bis 197	62 544 36	nicht identifiziert Ferrioxamin B-Hydrochlorid nicht identifiziert

Ferrioxamin B ist löslich in Wasser, Methanol, Alkohol, Phenol, Dimethylformamid und Eisessig, schlecht löslich in Butanol und praktisch unlöslich in Chloroform, Aceton, Äther und Essigester. Mikroanalyse nach 48 Stunden bei 20°/0,001 mm:

C 48,04°/₀, H 7,41%, N ll,21°/₀, Cl 5,25°/₀, P 0%, S 0%, Fe 7,67%· Titration: pK_Mcs = 9,74, Äquivalentgewicht 704. Absorption (H₂O): X_ma.x 430 ηιμ, E \*_m = 39,0. TR-Spektren vgl. Fig. 3. R_f-Wert im System I: 0,44, im System V: 0,29 (vgl. Tabelle 1), Verteilungskoefrizient im System VI: 0,228 (vgl. Tabelle 1).

Ferrioxamin B gibt eine positive Reaktion mit Ninhydrin. Es läßt sich leicht mit Ferrichlorid-Kaliumferricyanid-Reagens (J. M. Barton et al., Nature, 170, S. 249 [1952]) oxydieren. Anderseits kann es mit Natriumdithionit unter Entfärbung reduziert werden. Die dabei erhaltenen farblosen Lösungen gewinnen beim Stehen an der Luft rasch ihre ursprüngliche Rotfärbung zurück. Das im Ferrioxamin B gebundene Eisen wird dem Komplex bei der Einwirkung von Mineralsäuren, starken Alkalien oder 8-Oxychinolin entzogen.

Eisenfreies Ferrioxamin B (Desferrioxamin B) ist

ao farblos. Es kann mit Ferrichlorid in Ferrioxamin zurückverwandelt werden. Auch mit anderen Metallionen reagiert Desferrioxamin B unter Bildung der entsprechenden Metallkomplexe, beispielsweise des grünlichgefärbten Kupferdesferrioxamins.

Beispiel 9

20 mg eines gemäß Beispiel 8 erhaltenen Präparates von Ferrioxamin B werden in 3 cm³ 1,2 n-Salzsäure gelöst und 5 Minuten lang im kochenden Wasserbad erwärmt. Die anfänglich rotbraune Lösung wird dabei fast farblos. Sie wird im Vakuum zur Trockne eingedampft. Man löst hierauf den Rückstand in 0,2 cm³ Wasser und verwendet für die folgende papierchromatographische Untersuchung je 0,01 cm³ dieser Lösung. Als Fließmittel dient ein Gemisch von 7 Volumteilen n-Butanol und 3 Volumteilen 6 η-Salzsäure. Es konnten die folgenden Substanzen identifiziert werden:

Substanz	Rf	a	b	C	d
Cadaverin Fe++	0,12 0,17 0,25 0,34 0,68 0,84 0,93	Blaßgelb Gelb	Grauviolett Grauviolett Bläulich	Tiefrot Tiefrot Blaßrot Rot	—
1 -Amino-5-hydroxyl- aminopentan Hydroxylamin Unbekannte Substanz ... Fe+++ Unbekannte Substanz ...	Violettrot

In der Tabelle bedeutet a auf dem Papier erkennbare Eigenfarbe der Substanzen, b Farbreaktion mit Ninhydrin, c Farbreaktion mit Triphenyltetrazoliumchlorid + Natronlauge, d Farbreaktion mit dem Reagens nach Czaki. (Alle Reagenzien gemäß »Handbuch der Papierchromatographie« von I. M. Hais und K. Macek, Verlag Gustav Fischer, Jena, 1958.)

Wird bei der Hydrolyse an Stelle von Salzsäure 57%ige Jodwasserstoffsäure (4 Stunden, 110°) verwendet, so fehlen im Papierchromatogramm Hydroxylamin, l-Amino-5-hydroxylaminopentan und Fe+ ++. Dafür ist mehr Cadaverin vorhanden.

Eine zweite Portion Ferrioxamin B wird mit 1,2 η-Salzsäure, wie oben beschrieben, hydrolysiert. Das Hydrolysengemisch wird anschließend mit Äther extrahiert. Man trocknet den Extrakt mit Natriumsulfat und dampft ihn ein. Aus dem Rückstand kann Bernsteinsäure in kristalliner Form erhalten werden.

Beispiel 10

Zu einer Lösung von 450 mg eines gemäß Beispiel 8 erhaltenen Ferrioxamin B-Präparates und 450 mg Natriumhydrogencarbonat in Wasser gibt man eine Lösung von 450 mg 2,4-Dinitrofluorbenzol in 26 cm³

Äthanol. Nach 4stündigem Stehen bei Zimmertemperatur wird der Alkohol im Vakuum abgetrieben. Das überschüssige Reagens wird durch Ausschütteln mit Äther entfernt. Das tiefrotbraune Dinitrophenylferrioxamin B läßt sich nun leicht mit n-Butanol ausschütteln (Ferrioxamin B selbst bleibt unter denselben Bedingungen in der wäßrigen Phase). Der mit Wasser gewaschene und dann getrocknete Butanol-Auszug wird im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird mit Aceton ausgezogen und die Acetonlösung von einem unlöslichen braunen Rückstand (114 mg) abfiltriert. Aus der auf etwa 5 cm³ eingeengten Acetonlösung läßt sich das Dinitrophenyl-ferrioxamin B als amorphes orangerotes Pulver ausfällen. Ausbeute 338 mg.

Bei der Papierelektrophorese in verdünnter Essigsäure wandert das Dinitrophenylderivat bei 1000 Volt in 2 Stunden 5,5 cm weit, während Ferrioxamin B unter den gleichen Bedingungen 18,5 cm wandert.

Beispiel 11

Zur Isolierung der Ferrioxamine A, C, D₁, D₂, E und F werden die bei der Gegenstromverteilung von Roh-Ferrioxamin anfallenden Verteilungsfraktionen II, IV und V (vgl. Beispiel 6) an Dowex 50-WX₂ (200/400 mesh) mit Ammoniumacetatpuffer als EIutionsmittel chromatographiert. Das Harz reinigt man vorerst nach Vorschrift von Hirs et al. (C. H. W. Hirs, S. Moore, W. H. Stein, J. Biol. Chem., 219, S. 623 [1956]). Es wird in der Ammoniumform durch Sedimentation auf die Säule gebracht und vorgängig der Substanzauftragung während etwa 70 Stunden mit der zur Elution verwendeten Pufferlösung bei einer Durchlaufgeschwindigkeit von 20 ml/cm²/Std. äquilibriert. Die Substanzen trägt man je nach Löslichkeit in 1- bis 10°/oiger Lösung auf die Säule auf und entwickelt die Chromatogramme bei 23 bis 25° und bei einer Durchlaufgeschwindigkeit von 5 bis 15 ml/cm²/Std. mit Ammoniumacetatpuffer von ph 4,5 in steigender Konzentration (Gradient-Elution). Die Bewertung der Chromatogramme erfolgt durch Extinktionsmessung der Eluatfraktionen (30 bis 40 cm³) bei 425 πιμ. Die entsprechend zusammengefaßten Eluatfraktionen werden nach Zusatz von 10% Kochsalz mit Phenol—Chloroform (1 g: 1 cm³) erschöpfend extrahiert. Die tiefrotgefärbten Extrakte wäscht man ausgiebig mit 10°/o Natriumchlorid enthaltender 0,01 η-Salzsäure, filtriert durch eine Schicht von Celite und fällt die Inhaltsstoffe aus den klären FiI-traten durch Zusatz von Äther und Petroläther auf Hyflo Supercel. Das Gemisch von Substanz und Trägerstoff wird zur Entfernung von Phenol mit Äther gewaschen und hierauf mit wenig Methanol eluiert. Aus den Methanoleluaten erhält man die Ferrioxamine beim schonenden Eindampfen in Form braunroter hygroskopischer Pulver, die für die Analyse während 50 Stunden bei 25°/0,03 mm über Phosphorpentoxyd getrocknet werden.

5 g Fraktion II (vgl. Beispiel 6)werden an einer Dowex-WX₂-Säule von 90 cm · 22cm² nach dem oben beschriebenen Verfahren chromatographiert (Fig. 3). Pufferlösung bei Beginn: 0,1m Ammoniumacetat pn 4,5. Durchlauf geschwindigkeit: HOml/Std. Volumen der Eluatfraktionen: 35 bis 40cm³. Umstellung auf Gradientelution mit Mischkammer von 41 und 1,75m Ammoniumacetatpuffer von ph 4,70 bei Fraktion Nr. 90.

Fraktion Nr.

283 bis 300
301 bis 325

326 bis 352

353 bis 385

xo 416 bis 445

Gewicht
mg

302
488

393
452
415

Inhaltsstoffe

Ferrioxamin A-hydrochlorid Ferrioxamin B + A-hydrochlorid

I nicht näher

I charakterisierte Stoffe

Ferrioxamin A-hydrochlorid ist ein braunrotes Pulver, das sich in Wasser, Methanol, Äthanol, Eisessig und Dimethylformamid gut löst. Es ist unlöslich in

Äther, Aceton, Essigester und Chloroform. Ri im Lösungssystemi: 0,35, im Lösungssystem V: 0,24 (vgl. Tabelle 1). Verteilungskoeffizient im System VI:

0,111 (vgl. Tabelle 1). Papierelektrophorese vgl. Fig. 5.

Mikroanalyse: C 44,21%, H 7,52%, N 12,63%,

ao Fe 7,95%, Cl 5,93%. Titration: pK_MCs 9,89, Äquivalentgewicht 634. UV-Spektrum in Wasser: ληαχ 430 πιμ, (E il = 37). Das IR-Spektrum in Kaliumbromid zeigt unter anderem folgende Banden (s = starke Bande, m = mittlere Bande, w = schwache Bande): 2,92μ (s\ 3,42μ (m), 6,10μ (s), 6,32μ (s), 6,88 μ (m), 7,30 μ (w), 7,92 μ (w), 8,10 μ (w), 8,49 μ (w), 8,98 μ (w), 9,55 μ (w), 10,15 μ (w), 10,67 μ (w) (vgl. Fig. 11).

Ferrioxamin A gibt eine positive Reaktion mit Ninhydrin. Die Eisenbindung im Ferrioxamin A wird aus dem Komplex entfernt, wenn es mit Mineralsäure oder starken Alkalien behandelt wird. Eisenfreies Ferrioxamin A ist farblos. Es kann mit Ferrichlorid in Ferrioxamin A zurückgeführt werden. Es reagiert auch mit anderen Metallionen unter Bildung der entsprechenden Metallkomplexe, beispielsweise des grünlichen Kupferkomplexes.

Beispiel 12

5 g Fraktion IV (vgl. Beispiel 6) chromatographiert man an einer Dowex 50-WX₂-Säule nach dem im Beispiel 11 beschriebenen Verfahren (vgl. Fig. 7). Pufferlösung bei Beginn: 0,1m Ammoniumacetat Ph 4,5. Durchlauf geschwindigkeit: 110 ml/Stunde.

Volumen der Eluatfraktionen: 35 bis 40 cm³. Umstellung auf Gradientelution mit Im Ammoniumacetat von Ph 4,6 bei Fraktion 720, mit 2m Ammoniumacetat von pn 4,7 bei Fraktion 963:

50	Fraktion	Nr.	Gewicht	Inhaltsstoffe
			mg
	34 bis	46	135	I nicht näher charakterisierte
55	54 bis	68	226	j Stoffe
	218 bis	284	—	gelb grün fluoreszierende Sub
				stanz nicht isoliert
	780 bis	830	430	Ferrioxamin B-hydrochlorid
	860 bis	900	194	Ferrioxamin C-hydrochlorid
60	1034 bis	1080	360	nicht näher charakterisierte
				Substanz

Ferrioxamin C zeigt annähernd gleiche Löslichkeitseigenschaften wie A. Rf im Lösungsmittelsystem I: 0,54, im Lösungsmittelsystem V: 0,37 (vgl. Tabelle 1). Papierelektrophorese vg). Fig. 5, Verteilungskoeffizient im System VI: 0,489 (vgl. Tabelle 1).

Mikroanalyse: C 48,33%, H 7,92%, N 10,20%, Cl 5,15%, Fe 6,82%. Titration: pK_Mcs 8,88; Äquivalentgewicht 762. UV-Spektrum in Wasser: Imax 430 ηιμ (E }*„ = 39). Das IR-Spektrum in Kaliumbromid zeigt unter anderem Banden bei 2,92 μ (s), 3,43 μ (s), 5,85 μ (m), 6,10 μ (s), 6,33 μ (s), 6,87 μ (s), 7,30 μ (m), 7,95 μ (m), 8,23 μ (w), 8,52 μ (m), 9,65 μ (w), 13,23 μ (m) (vgl. Fig. 12).

Ferrioxamin C gibt eine positive Farbreaktion mit Ninhydrin. Die Eisenbindung im Ferrioxamin C wird aus dem Komplex entfernt, wenn es mit Mineralsäure oder starken Alkalien behandelt wird. Eisenfreies Ferrioxamin C ist farblos. Es kann mit Ferrichlorid in Ferrioxamin C zurückgeführt werden. Es reagiert auch mit anderen Metallionen unter Bildung der entsprechenden Metallkomplexe, beispielsweise des grünlichen Kupferkomplexes.

Beispiel 13

148 g Fraktion V (vgl. Beispiel 6) werden vorerst auf einer Säule von 150 cm-79 cm² vorfraktioniert. Das Chromatogramm entwickelt man bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 2 bis 3 l/Stunde während je 24 Stunden mit 0,1m, 0,2m, 0,6m und während 100 Stunden mit 1,8m Ammoniumacetatpuffer von Ph 4,7. Es werden Fraktionen von 5 1 aufgefangen. Die zusammengefaßten Fraktionen 2 bis 5 enthalten vorwiegend Ferrioxamine D₁, D₂ und E (44 g), 48 bis 55 hauptsächlich Ferrioxamin F (8,4 g).

Rechromatographie von Fraktionen 2 bis 5

5 g der Fraktionen 2 bis 5 chromatographiert man unter den gleichen Bedingungen wie Fraktion II, jedoch ohne Gradientelution (vgl. Fig. 8).

Fraktion Nr.

48 bis 56
66 bis 80

Gewicht
mg

980
989

Inhaltsstoffe

Ferrioxamin D₁ und D₂
Ferrioxamin E

Das aus Fraktion 48 bis 56 mit Phenol—Chloroform isolierte Gemisch von D₁ und D₂ (980 mg) wird in 100 cm³ Wasser gelöst, mit Kochsalz gesättigt und zweimal mit dem gleichen Volumen Chloroform extrahiert. Der Chloroformextrakt hinterläßt nach dem Trocknen über Natriumsulfat beim Eindampfen 697 mg Ferrioxamin D₁. Die wäßrige Phase wird ausgiebig mit Chloroform gewaschen und hierauf mit Phenol—Chloroform extrahiert. Beim Aufarbeiten des Extraktes in üblicher Weise erhält man 95 mg Ferrioxamin D₂. Ferrioxamin D₁ ist gut löslich in Wasser, Methanol, Äthanol, Eisessig, Methylcellosolve und Chloroform, schwer löslich in Äther, Aceton, Essigester, Pyridin und Dimethylformamid. Es kristallisiert aus Methanol—Äther in roten Nadeln. F. nach dreimaliger Kristallisation 194 bis 200°. Rf im Lösungsmittelsystem I: 0,73, Rf im Lösungsmittelsystem V: 0,88 (vgl. Tabelle 1). Verteilungskoeffizient im System VI: 1,80 (vgl. Tabelle 1). Elektrophorese vgl. Fig. 5.

Mikroanalyse: C 49,31%, H 7,47%, N 12,37%, Cl0%, Fe 7,66%· Titration: keine sauren oder basischen Funktionen feststellbar. UV-Spektrum in Wasser:

Imax 430 Πΐμ (E [I = 44).

Das IR-Spektrum in Kaliumbromid zeigt unter anderem Banden bei 2,95 μ (s), 3,06 μ (s), 3,25 μ (w), 3,43 μ (s), 6,08 μ (s), 6,86 μ (s), 7,30 μ (m), 7,94 μ (m), 8,20 μ (w), 8,49 μ (w), 8,83 μ (w), 9,00 μ (w), 9,65 μ(ν/\ 10,00 μ (w), 10,31 μ (w), 10,67 μ (w), 12,20 μ (w), 13,30 μ (m) (vgl. Fig. 13). Ferrioxamin D₁ gibt keine Farbreaktion mit Ninhydrin. Die Eisenbindung im Ferrioxamin D₁ wird aus dem Komplex entfernt, wenn es mit Mineralsäure oder starken Alkalien behandelt wird. Eisenfreies Ferrioxamin D₁ ist farblos. Es kann mit Ferrichlorid in Ferrioxamin D₁ zurückgeführt werden. Es reagiert auch mit anderen Metallionen unter Bildung der entsprechenden Metallkomplexe,

ίο beispielsweise des grünlichen Kupferkomplexes.

Ferrioxamin D₂: Das IR-Spektrum in Kaliumbromid zeigt unter anderem Banden bei 2,95 μ (s), 3,43 μ (m), 6,08 μ (s), 6,36 μ (s), 6,90 μ (s), 8,49 μ (w), 8,87μ(νν), 9,65μ(ιν), 10,05 μ(w), 10,70 μ(w), 13,22 μ(ν) (vgl. Fig. 16).

Rf im Lösungsmittelsystem I: 0,64; Rf im Lösungsmittelsystem V: 0,68 (vgl. Tabelle 1). Papierelektrophorese vgl. Fig. 5.
Ferrioxamin E: Das aus Fraktion 66 bis 80 erhaltene

ao Ferrioxamin E (898 mg) ist in Eisessig löslich, in den meisten Lösungsmitteln, insbesondere auch in Wasser und Methanol schwer- bis unlöslich. Durch zweimaliges Umlösen aus viel Wasser—Aceton erhält man ein mikrokristallines Pulver.

R₁-Werte im System I: 0,68, im System V: 0,59. Papierelektrophorese vgl. Fig. 5. Verteilungskoeffizient im System VI: 1,59 (vgl. Tabelle 1).

Mikroanalyse: C 49,80%, H 7,37%, N 12,48%, Cl0%, Fe 8,14%. Titration: keine sauren oder basischen Funktionen feststellbar. UV-Spektrum in Wasser: X_max 430 ΐημ (E }?„ = 42).

Das IR-Spektrum in Kaliumbromid zeigt unter anderem Banden bei 2,92μ(8), 3,02μ(5), 3,45μ(s), 5,96 μφ, 6,15μ(5), 6,36μ(8), 6,90μ(₅), 7,10μ(ΐη), 7,15μ(πι), 7,39μ(ηΐ), 7,82μ^), 7,98μ(ΐη), 8,45 μ(ιν), 8,54 μ(ιν), 8,85μΜ, 9,01 μ(w), 9,20 μ(ιν), 9,98μ(ΐη), 10,07 μ (W), 10,23 μ (w), 10,43 μ (w), 10,71 μ (w), 11,87μ(νν), 13,20 μ(πι), 13,66μ(νν) (vgl. Fig. 14). Ferrioxamin E gibt keine Farbreaktion mit Ninhydrin.

Die Eisenbindung im Ferrioxamin E wird aus dem Komplex entfernt, wenn es mit Mineralsäure oder starken Alkalien behandelt wird. Eisenfreies Ferrioxamin E ist farblos. Es kann mit Ferrichlorid in Ferrioxamin E zurückgeführt werden. Es reagiert auch mit anderen Metallionen unter Bildung der entsprechenden Metallkomplexe, beispielsweise des grünlichen Kupferkomplexes.

Rechromatographie der Fraktionen 48 bis 55

5 g von Fraktionen 48 bis 55 werden unter den gleichen Bedingungen wie Fraktionen 2 bis 5 (s. o.) rechromatographiert. Pufferlösung bei Beginn: 0,5 m Ammoniumacetat ph 4,7. Umstellung auf Gradientelution mit Mischkammer von 41 und Zufluß von 2 m Ammoniumacetatpuffer von ph 4,7 bei Fraktion 663 (vgl. Fig. 9). Die Fraktionen 821 bis 880 enthalten 1,12 g Material, das vorwiegend aus Ferrioxamin F besteht. Zur Weiterreinigung wird dieses Material im System n-Butanol—Wasser einer Craigschen Gegenstromverteilung über 20 Stufen (10/10 mJ) unterworfen. Die Inhalte der Elemente extrahiert man anschließend mit je 80 ml Petroläther, verwirft die Petrolätherphasen und lyophilisiert die wäßrigen Raffinate. Mit dem aus den Elementen 1 bis 4 gewonnenen Material (570 mg) wird die Verteilung wiederholt (30 Stufen). Aus Element 5 erhält man 64 mg papierchromatographisch einheitliches Ferrioxamin F-hydrochlorid in Form eines braunroten Pulvers. Ferrioxamin F-hydrochlorid

209 508/299

ist gut löslich in Wasser, Methanol, Pyridin, Eisessig, Äthanol, Dimethylformamid, wenig löslich in Chloroform, unlöslich in Essigester, Aceton und Äther.

Mikroanalyse: C 50,44%, H 7,29%, N 10,53%, Cl 4,10%, Fe 5,57%. R₁ im Lösungsmittelsystem V: 0,80 (vgl. Tabelle 1). Verteilungskoeffizient im System VI: 3,12 (vgl. Tabelle 1). Elektrophorese vgl. Fig. 5. Titration: pKjncs 9,75, Äquivalentgewicht 695.

Das IR-Spektrum in Kaliumbromid zeigt unter anderem Banden bei 2,95 μφ, 3,45 μ (m), 6,19 μ(5), 6,37μ(5), 6,92μ(πι), 7,40μ(», 7,97μ^), 8,50μΜ, 8,88μ(W), 9,72μ(W), ΙΟ,ΙΟμ(νν), 10,70μ^), 13,75μ^) (vgl. Fig. 15).

UV-Spektrum in Wasser: X_max 430 ΐημ (E \*_m = 34). Ferrioxamin F gibt eine positive Reaktion mit Ninhydrin. Die Eisenbindung im Ferrioxamin F wird aus dem Komplex entfernt, wenn es mit Mineralsäure oder starken Alkalien behandelt wird. Eisenfreies Ferrioxamin F ist farblos. Es kann mit Ferrichlorid in Ferrioxamin F zurückgeführt werden. Es reagiert auch mit anderen Metallionen unter Bildung der entsprechenden Metallkomplexe, beispielsweise des grünlichen Kupferkomplexes.

Beispiel 14

100 g frische Bäckerhefe wird in 1 1 Methanol aufgeschwemmt und 30 Minuten kräftig gerührt. Die Aufschwemmung filtriert man und engt die methanolische Lösung am Vakuum auf 200 cm³ ein. Zu diesem Konzentrat werden 200 cm³ Wasser zugesetzt und die Lösung durch Filtration oder Zentrifugation geklärt. Die geklärte Lösung wird dreimal mit einem Chloroform-Phenol-Gemisch (1 Volumteil Chloroform, 1 Gewichtsteil Phenol) ausgezogen. Die vereinigten organischen Phasen versetzt man mit wenig Filterhilfsmittel (Hyflo Supercel) und gibt zu dieser Aufschwemmung unter stetem Rühren einen Überschuß an Äther zu. Das ausgefallene Roh-Ferrioxamin wird zusammen mit dem Filterhilfsmittel abgetrennt, mit Äther gewaschen und getrocknet. Aus dem Filterhilfsmittel werden die Ferrioxamine mit Methanol eluiert. Die methanolische Lösung wird am Vakuum schonend eingedampft, wobei die Ferrioxamine in Form eines aktiven rotbraunen Harzes erhalten werden, das sich mittels Papierchromatographie reinigen läßt.

Zu Präparaten mit ähnlich hohem Gehalt an Ferrioxaminen gelangt man, wenn man an Stelle der Bäckerhefe einen käuflichen Hefeextrakt, abgepreßte Brauereihefe oder frische Hefekulturen wie beschrieben aufarbeitet.

Beispie) 15

Die Grünalge Chlamydomonas eugametos wird submers auf einer Nährlösung folgender Zusammensetzung bei 24° gezüchtet:

Magnesiumsulfat 2,5 g

K₂HPO₄ 1,25 g

Harnstoff 1,05 g

Leitungswasser 1000 ml

Spurenelementlösung 10 ml

Spurenelementlösungsgehalt je 1000 ml:

CaCl₂ 8,35 g

H₃BO₃ 11,42 g

FeSO₄-7 H₂O 4,98 g

ZnSO₄ · 7 H₂O 8,82 g

MnCl₂-4 H₂O 1,44 g

H₂MoO₄ 0,71g

CuSO₄ · 5 H₂O 1,57 g

Co(NO₃)₂6H₂O 0,49 g

Komplexon III 3g

Die Nährlösung wird in den Kulturgefäßen 20 bis 30 Minuten bei 1 atü sterilisiert. Die Beimpfung erfolgt mit bis zu 20% einer Submerskultur. Die

ίο Kulturen werden in den 4-1-Schüttelgefäßen stetig mit V₄ Volumen Luft je Volumen Lösung pro Minute belüftet. Nach einer 4- bis 12tägigen Kultur unter ständiger Belichtung werden die kräftiggrünen Kulturen aufgearbeitet. Die Kulturen werden unfiltriert mit 2% Tonerde, z. B. Frankonit, versetzt und kräftig durchmischt. Die Aufschwemmung wird unter Zusatz von Filterhilfsmittel filtriert und die Lösung erneut mit 2% Tonerde versetzt, ausgerührt und abfiltriert. Die vereinigten Filterrückstände werden mit Wasser und Methanol ausgewaschen und anschließend mit einem Pyridin-Wasser-Gemisch (1:4) eluiert. Das azeotrope Gemisch wird am Vakuum eingeengt und die Ferrioxamine aus den Konzentraten durch Gefriertrocknung isoliert. Die rotbraunen Präparate können in der oben angegebenen Weise weiter angereichert werden.

Beispiel 16

Junge, etwa 50 cm hohe Tomatenpflanzen werden in einer Saftpresse zu Preßsaft verarbeitet. 11 Preßsaft wird durch dreimaliges Extrahieren mit Äthylacetat vom Chlorophyll befreit. Zur braunen wäßrigen Phase gibt man 290 g Ammonsulfat zu, filtriert die erhaltene Lösung und extrahiert sie anschließend dreimal mit Benzylalkohol. Die vereinigten organischen Phasen werden durch Zugabe von Natriumsulfat getrocknet und mit einem Überschuß an Äthylacetat versetzt. Der entstandene Niederschlag wird mit Äther gewaschen und anschließend in wenig Wasser aufgenommen. Mittels Gefriertrocknung erhält man schließlich ein wirksames Ferrioxaminpräparat, das sich, wie in den vorangehenden Beispielen gezeigt, aufarbeiten läßt.

Zu Präparaten ähnlicher Aktivität gelangt man, wenn an Stelle von Tomatenpflanzen Blätter von Rheoe discolor verwendet werden.

Beispiel 17

Die Züchtung von Bacillus subtilis wird nach dem Submersverfahren durchgeführt. Man verwendet eine Nährlösung, die je Liter Leitungswasser 10 g Rohglukose, 5 g Pepton, 3 g Fleischextrakt, 5 g Kochsalz und 10 g Kalk enthält. Man inkubiert die Kulturen bei 33 bis 37° unter Belüftung und unter stetem Schütteln oder Rühren. Nach 48 bis 96 Stunden Bebrütung werden die Kulturen unfiltriert mit 2% Tonerde (Frankonit) versetzt, kräftig gerührt und anschließend durch Filtration oder Zentrifugation geklärt. Das Sediment wird mit Methanol gewaschen und anschließend mit einem Pyridin-Wasser-Gemisch (1:4) eluiert. Das Eluat enthält die Hauptmenge der Ferrioxamine, die, wie oben beschrieben, isoliert werden.

Claims (7)

PATENTANSPRÜCHE:

1. Verfahren zur Herstellung eisenhaltiger Wuchsstoffe aus pflanzlichem Material, dadurch

zeichnet, daß man aus Mikroorganismen oder deren Extrakten die Ferrioxamine, ihre Derivate und Spaltprodukte sowie Salze dieser Verbindungen nach an sich bekannten Methoden unter Berücksichtigung der chemischen und physikalischen Eigenschaften dieser Verbindungen und unter Anwendung des Antisideramycin-Testes isoliert und, wenn erwünscht, Salze, Derivate oder Spaltprodukte der Ferrioxamine herstellt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man aus Kulturen von Algen, Hefen, Bazillen oder Streptomyceten die Ferrioxamine A, B, C, D₁, D₂, E, F oder eine Mischung einzelner Komponenten mittels Adsorption, Extraktion, Fällung, Kristallisation, Lyophilisation, Verteilung zwischen Lösungsmitteln, Chromatographie und/ oder Elektrophorese isoliert, indem man die Anwesenheit der Ferrioxamine im Ausgangsmaterial und bei den einzelnen Aufarbeitungsoperationen mittels des Antisideramycintestes prüft.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsmaterial Kulturen von Streptomyces griseoflavus

(Krainsky) Waksman et Henrici A 9578 oder Streptomyces pilosus NRRL 2857 verwendet.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Ferrioxamine an dem Ionenaustauscher Dowex 50-WX₂ adsorbiert und mit Ammoniumacetatpuffer vom pn 4,5 bis 4,6 in einer Molarität von 0,2 bis 2,0 eluiert werden.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Ferrioxamine mit Lösungen von Phenol in Chloroform extrahiert werden.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ferrioxamine zwischen zwei nicht mischbaren Lösungsmittelphasen verteilt.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ferrioxamine mittels Hochspannungselektrophorese nach dem Gegenstromprinzip anreichert.

In Betracht gezogene Druckschriften:
Deutsche Patentschriften Nr. 717 997, 864 140;
französische Patentschriften Nr. 786 564, 870 386.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

© 209 508/299 1.