DE2237940B2 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure - Google Patents
Verfahren zur quantitativen Bestimmung von HarnsäureInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen
photometrischen Bcstim-.iung von Harnsäure,
welches vollenzymalisch durchgeführt werden kann, wobei die Ergebnisse im nahe* UV-Bereich eines
Photometers abgelesen werden.
Es sind bisher grundsätzlich zwei Methoden zur Harnsäurebestimmung bekannt geworden.
Im einen Fall wird Harnsäure durch Phosphor-WoIframsäurc
oxidiert und das bei der Reaktion entstandene Phosphor-Wolfram-Blau kolorimetrisch gemessen. Bei
diesem Verfahren können naturgemäß andere reduzic1
rende Stoffe, wie z. B. Medikamente oder reduzierende Metaboliten stören.
Im zweiten Fall (Harnsäurebestimmung nach Praetorius)
wird Harnsäure mittels Uricase zu Allantoin abgebaut, wobei die Absorptionsabnahme der Harnsäure im
Bereich von 293 πιμ ein Maß für deren Konzentration
darstellt. Dieses Verfahren ist, wie die meisten Enzymreaktionen recht spezifisch, jedoch stört die Eigenabsorption
des Proteinanteils des Enzyms ebenso, wie andere in der Probe enthaltende Eiweißstoffe, so daß
falsche Ergebnisse auftreten können.
Um den genannten Nachteilen zu entgehen, ist vorgeschlagen worden, das bei der enzymatischen Umsetzung
der Harnsäure mittels Uricase entstehende Wasserstoffperoxid kolorimetrisch zu bestimmen
(Bernt und Lorentz; Anal. Biochem. 1969). Die Bestimmung
beruht auf der Oxidation von O-Dianisidin mittels Peroxidase zu einem Farbstoff.
Obwohl hierbei die Extinktion im günstigen sichtbaren Bereich des Spektrums gemessen werden kann,
besitzt das Verfahren Nachteile, die es für die Praxis ungeeignet machen. Zum einen wird die Verwendung von
Dianisidin heute wegen der Gefahr cancerogener Wirkung vermieden und zum anderen wird auch dieses Verfahren
durch Proteine gestört, so daß sich eine Enteiweißung vor der Bestimmung nicht vermeiden läßt.
Weiterhin ist ein Verfahren bekannt gewoi Jen (DE-OS
21 49 675), in dem Methanol durch das enzymatisch
ι» gebildete Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Katalase zu Formaldehyd oxidiert wird, der dann in Gegenwart
eines Ammoniumsalzes nach der Hantzsch'schen Reaktion mit Acetylaceton zu 3,5-Diacetyl-l,4-dihydrolutidin
umgesetzt wird. Die der Harn-
Ii säure-Konzentration proportionale Konzentration des
gelben Farbstoffs kann bei 410 ιημ kolorimetrisch bestimmt
werden. Das Verfahren stellt zwar sine Verbesserung vorbekannter Bestimmungsmethoden dar, ist
jedoch im Hinblick auf die Einhaltung bestimmter
_'ii Reaktionsparameter umständlich. So ist z. B. ein auf
37°C thermostatisiertes Bad erforderlich, in dem zur
Entwicklung des Lutidinfarbstoffs mindestens 30 Minuten, praktisch jedoch über eine Stunde, inkubiert werden
muß. Außerdem erfolgt der letzte Schritt nicht
r> enzymatisch und kann deshalb durch reduzierende oder oxidierende Bestandteile der Probe, welche mit dem
empfindlichen Formaldehyd reagieren, gestört werden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen
Harnsäurenachweis zu entwickeln, der vollenzymatisch
in durchgeführt werden kann und der in kurzer Zeit, ohne
umständliche Inkubation ein von Störsubstanzen unbeeinflußtes quantitatives Ergebnis liefert.
Diese Aufgabe wird ausgehend von einem Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure, in
>". welchem man auf eine Harnsäure enthaltende Probe Uricase und Katalase in Gegenwart von Äthanol unter
Luftzutritt einwirken läßt, dadurch gelöst, daß man den
entstandenen Acetaldehyd unter Einwirkung von Alkoholdehydrogenase
mit NADH zu Äthanol rückreduziert
Wi und die Abnahme der NADH-Konzentralion durch
spektrophotometrische Bestimmung mißt, wobei das Verfahren bei einem pH von 6,8 — 7,1 durchgeführt wird
und dem Reaktionsgemisch so viel Äthanol zugegeben wird, daß dessen Konzentration die Grenzen von 0,3 bis
i'i 0,7 Vol.% nicht überschreitet.
Erfindungsgemäß wird also das bei der Allantoin-Rcaktion in der Harnsäure freiwerdende Wasserstoffperoxid
in gegenwart von Katalase mit Äthanol umgesetzt. Der dabei gebildete Acclaldehyd wird von
">» NADH in Anwesenheit von Alkoholdehydrogenase zu
Äthanol rückreduziert, wobei die Abnahme der NADH-Konzentration, die spektrophotometrisch in dem
günstigen Bereich von 340 bzw. 366 Γημ gemessen werden
kann, dem Harnsäuregchalt der Probe proportional
v» ist.
Es handelt sich hier zwar um an sich bekannte Einzelschritte, die jedoch bisher nicht kombiniert wurden, weil
angenommen werden mußte, daß sich die Reaktionen gegenseitig stören. Zur besseren Übersicht wird der
Wt Reaktionsweg im folgenden schematisch aufgezeichnet.
Λ: Harnsäure + 2 II,O + O,
Uriciisc Allantoin f H2O- f- CO,
H: H2O, + Äthanol -
Kiihiliise
Acetaldehyd + 2 11,0
C: Acetaldehyd t- NAI)II ΙΑ I kohol dc hydrogen:! se
► Äthanol ι Ν Λ I)
Es ist bekannt, daß die drei Schritte bei verschiedenen
pH-Optima ablaufen: A: pH 9,3; B: pH 7,0; C: pH 6,5. Besonders kritisch ist das relativ alkalische pH-Optimum
der Uricasereaktion (A) im Hinblick auf die bekanntermaßen stark pH-abhängige Gleichgewichtseinstellung
der Reaktion C:
Es ist ferner bekannt, daß die Reaktion C durch in der Probe vorhandenes Äthanol gestört wird. Weiterhin
weiß man, daß Katalase kein ausschließlich peroxidatisch wirkendes Enzym ist, sondern, vor allem bei geringen
Alkoholkonzentrationen, aus Wasserstoffperoxid vorwiegend direkt Sauerstoff freimacht, der als solcher
nicht in der Lage ist, mit Äthanol zu reagieren.
Da nun einerseits die Reaktion B für einen quantitativen Umsatz des Wasserstoffperoxids eine hohe
Alkoholkonzentration erfordert, wohingegen gerade Äthanol auf den Ablauf der Reaktion C inhibierend
wirkt (vgl. Methoden der enzymatischen Analyse von H. U. Bergmeyer. 1962, Seite 292), ist es als überraschend
anzusehen, daß kritische Bedingungen gefunden werden konnten, die es ermöglichen, die V:rfahrensschritte
B und C zu kombinieren, ohne den quantitativen Ablauf der Gesamtreaktion wesentlich zu beeinflussen.
Durch zusätzliche Kombination der Schritte B und C mit dem Verfahrensschritt A werden die Verhältnisse
naturgemäß noch unübersichtlicher.
Bei Einhaltung der obengenannten Bedingungen lassen sich überraschenderweise die Verfahren A, B und
C kombinieren; man erhält ausgezeichnet korrelierende Ergebnisse und die Reaktion wird weder durch Eiweiß
noch durch Fremdstoffe nennenswert gestört. Da entstandener Acetaldehyd auch bei Raumtemperatur sofort
von NADH reduziert und so aus dem Gleichgewicht entfernt wird, ist die Reaktion auch gegen reduzierende
Störsubstanzen relativ unempfindlich.
Das Verfahren wird vorzugsweise bei pH 7 durchgeführt. Die optimale Alkoholkonzentraiion liegt bei 0.5
Vol.%.
Als Puffet hat sich besonders ein Phosphat-Puffer,
bestehend aus 3.522 g Kaliumdihydrogenphosphat und 7,268 g Dinatriumhydrogenphosphat. gelöst in 1000 ml
Wasser bewährt. Er puffert bei pH 7.0.
Obwohl der Verfahrensschritt C im Falle üblicher
Acetaldehydbestimmungcn normalerweise nur nach Enlciweißtng der Probe durchgeführt wird, hat es sich
unerwartet gezeigt, daß sich beim erfindungsgemäßen Verfahren ein Entciweißungsschriit erübrigt (vgl. auch
Γ ig. II).
Die Extinktion von NADH wird im nahen UV bei 340 b/.w. 360 Γημ gemessen.
Das erfhdungsgcmäße Verfahren kann bei Raumtemperatur
durchgeführt werden, wobei eine Thcrmostatisicrung entfallen kann. Das Analysenergebnis liegt
bereits nach ca. 20 Minuten vor.
Gegenüber der einfachen Harnsäure-Bestimmung nach Praetorius muß das erhaltene Ergebnis /.war mit
einem zusätzlichen Korreklurfaktor versehen werden. Da es sich aber um eine sich konstant ergebende
mittlere Differenz handelt, wird die Genauigkeit kaum beeinträchtigt.
Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfah
rcns erfordert nur sehr kleine Probemengcti (0.1 ml
Serum), so daß auch Bestimmungen im Kapillarplasma möglich sind.
In l·' i g. I ist eine Lichkurve dargestellt, die mit einer
wäßrigen Harnsiiurclösu g erstellt wurde.
In Fig. Il ist eine Eichkurvc dargestellt, die mittels
eines .Standardserums mit einem Sollgchiilt von
5,9 mg% Harnsäure ermittelt wurde.
Aus den F i g. I und Il ist die Linearität der Beziehung
Extinktion-Harnsäurekonzentration ersichtlich.
In den Tabellen 1 und 2 sind die aus menschlichem Serum erhaltenen Harnsäurewerte nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren mit den durch Absorptionsmessung nach Praetorius erhaltenen Werten verglichen.
Im folgenden Beispiel soll die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens näher erläutert werden.
Beispiel
a. Reagenzien und Reagenzlösungen
a. Reagenzien und Reagenzlösungen
r. 1. Phosphat-Puffer:
3,522 g Kaliumdihydrogenphcsphat und 7,268 g Dinatrium-hydrogenphosphat-dihydi at werden
in 1000 ml bidestilliertem Wasser gelöst.
2. NADH-Lösung:
-•ü 25 mg NADH werden in 10 m( einer einprozentigen
Natriumbicarbonatlösung gelöst. Die Lösung ist ca. 10 Tage haltbar.
3. Äthanol (absolut)
4. Alkohol-Dehydrogenase (Boehringer-Mannheim):
-'■> Kristallsuspension in 3,2 M Ammoniumsulfatlösung, pH ca. 6.Sp.Aktivität 200 U/mg (25°C)
5. Katalase (Boehringer Mannheim):
Lösung in 30% Glycerin/!0°/i> Athanol.Sp.Aktivitat
260 000 U/ml (25°C)
i" 6. Uricase (Boehringer-Mannheim):
i" 6. Uricase (Boehringer-Mannheim):
Lösung in 50% Glycerin pH 10,2 5OmM Glycin;
0,13 M Natriumcarbonat. Sp.Aktivität 4.5 U/mg (25°C)
7. Harnsäure-Standardlösung (5 mg/100 ml):
ι") 5 mg Harnsäure werden mit 0.1 n-Natronlauge
gelöst und auf 100 ml aufgefüllt.
8. Harnsäurc-Standardserum (5,9 mg/100 ml):
F.S wurde ein Standardscrum der Firma Nyeganrd (Seronorm®) eingesetzt.
b. Durchführung der Harnsäurc-Bestinimung
In eine l-cm-Kiivcttc werden nacheinander 2,0 ml
Phosphaipurfcr (I). 0,!5mI NADH-Lösung (2). 0.01 ml
Äthanol. 0.01 ml Alkohol-dehydrogenase. 0,005 ml Katalase
und schließlich 0.1 m! der Probe pipetticrt.
Es wird nach jedem Pipcttiercn kurz gemischt und der erste Extinktionswert (E\) bei 366 ιτιμ 10 Minuten
nach Zugabe der Frobe abgelesen. Unmittelbar nach dem Ablesen von Ei werden 10 μΙ Uricase cinpipettier..
Nach weiteren 10 Minuten wird der zweite Extinktionswcrt
(E>) bei derselben Wellenlänge abgelesen. Der
Leerwert (L) wird >Tegcn Wasser bestimmt.
Der Harnsäiircgchalt wird wie folgt bcrecnnet:
Λ E χ 131 mg"/n Ihimsiiure
Der Fakl'ir 131 wurde empirisch bestimmt (vgl. Tabelle
2).
Vergleichs versuche
1. Ls wurden je 10 Proben desselben Serums parallel nach dein crfinciungsgcmiiUcn Verfahren und nach dem
Verfahren mich Praetorius bestimmt.
Tabelle I | 22 37 | mit unter· _'» | 940 | 6 | 366 ηιμ) | Ergebnisse der | Ergebnisse der | (mg 0O) | |
5 | Harnsäurebestimmung von 10 Proben | schiedlichem Harnsäuregehalt wurden parallel nach | grafischen Aus | Berechnung mit dem | Xi | ||||
A: nach Praelorius (1-cm-K.üvette, 293 πιμ) | dem erfindungsgemäßen Verfahren und nach dem Vcr- | b 7 8 9 10 | wertling nach < | em Faktor 131 nach | 3.9 | ||||
B: nach dem erfindungsgemäßen Verfahren | Tabellc 2 | erfindungs- | dem crfindtiiigs- | 5.2 | |||||
Probe | 5.3 5.3 5.3 5.2 5.2 | gemiißen Verfahren gemäßen Verfahren | 5.2 | ||||||
1 2 J | (1-cm-Kiivettc | 5,1 5,0 5.2 5.2 5.0 | (mg "Zn) | 5.9 | |||||
mg % | fahren nach Praetorius bestimmt. In der Tabelle 2 sind | 3.4 | 6.2 | ||||||
A 5,3 5,2 5,4 | 4 5 | prozcntualc Fehlerbreite der /ti beobachtenden Ab | 4.1 | 6.7 | |||||
B 5,0 5.2 5,1 | weichungen von 12.6— 14.06% ergab. Daraus errechne | 5.5 | 5.9 | ||||||
5,5 5.2 | te sich der faktor 131 (mittlerer Kehler 13%). | 5.5 | 4.3 | ||||||
5.1 5.3 | Die Berechnung der linearen Regression ergab da | 6.2 | 7,6 | ||||||
Aus der Tabelle I läßt sich für das erfindungsgemäße | nach einen Koeffizienten von 1 =0.99. | 6.5 | 5.2 | ||||||
berechnen, während sich aus dem Verfahren nach | 7.0 | 4.9 | |||||||
Praetorius ein Koeffizient von 1,86% ergibt | Harnsäurebestimmung im mcnschlischen Serum | 6.2 | 7.7 | ||||||
2. 32 verschiedene menschliche Seren | Ergebnisse der | 4.5 | 9.1 | ||||||
Bestimmung nach | 8.0 | 5.2 | |||||||
Praelorius | 5.5 | 7.0 | |||||||
5.0 | 9.2 | ||||||||
8.1 | 6.6 | ||||||||
(mg %) | 9.5 | 10.0 | |||||||
3.0 | 5.5 | 6.2 | |||||||
4.3 | 7.3 | 5.5 | |||||||
5.8 | 9.6 | 5.9 | |||||||
5.3 | 6.9 | 6.7 | |||||||
6,2 | 10.4 | 7.5 | |||||||
6.6 | 6.5 | 4.5 | |||||||
7.1 | 5.8 | 6.4 | |||||||
6.2 | 6.2 | 3.5 | |||||||
4.3 | 7.0 | 3,7 | |||||||
7.9 | 8.0 | 6,0 | |||||||
5.3 | 4.7 | 3.1 | |||||||
4.6 | 6.8 | 4.2 | |||||||
7.9 | 3.7 | 4,3 | |||||||
9.3 | 3.8 | Hierzu 1 Blatt Zeichnungen | |||||||
5.7 | 6.2 | ||||||||
7.5 | 3.3 | ||||||||
9.5 | 4.4 | ||||||||
7.0 | 4.5 | ||||||||
11.0 | |||||||||
6.2 | |||||||||
5.7 | |||||||||
6.2 | |||||||||
6.6 | |||||||||
7.5 | |||||||||
4.7 | |||||||||
6.6 | |||||||||
3.4 | |||||||||
3.8 | |||||||||
6.8 | |||||||||
2.9 | |||||||||
4.1 | |||||||||
4.3 |
Claims (4)
1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure, in welchem man auf eine Harnsäure enthaltende
Probe Uricase und Katalase in Gegenwart von Äthanol unter Luftzutritt einwirken läßt, d a durch
gekennzeichnet, daß man den entstandenen Acetaldehyd unter Einwirkung von
Alkoholdehydrogenase mit NADH zu Äthanol rückreduziert und die Abnahme der NADH-Kcnzentration
durch spektrophotometrische Bestimmung mißt, wobei das Verfahren bei einem pH von 6,8—7,1
durchgeführt wird und dem Reaktionsgemisch so viel Äthanol zugegeben wird, daß dessen Konzentration
die Grenzen von 0,3—0,7 Vol.°/o nicht überschreitet.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren bei einem pH von 7,0
durchgeführt wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Äthanol-Konzentration 0,5 Vol.% beträgt.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ohne Thermostatisierung bei Raumtemperatur
durchgeführt wird.
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