JP2677154B2 - 総ケトン体の測定方法および測定試薬 - Google Patents
総ケトン体の測定方法および測定試薬Info
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Description
定方法に関し、更に詳細には、臨床検査の分野で糖尿病
の診断マーカーとして周知である、体液中、特に血清、
血漿または尿中のアセト酢酸および3−ヒドロキシ酪酸
の総量(以下、総ケトン体という)の測定方法並びにそ
のための測定試薬に関する。本発明は酵素を用い、簡便
で高精度の測定方法並びにそのための測定試薬を提供す
るものである。
レス、運動過多、糖尿病等において糖代謝が障害を受け
ると、代替的に脂質代謝が亢進し脂肪組織から多量の脂
肪酸が遊離する。遊離した脂肪酸は、肝ミトコンドリア
でβ酸化を受け、その結果として体液中のアセト酢酸や
3−ヒドロキシ酪酸量が増加することが知られている。
これらの化合物を測定することは、特に糖尿病の病体把
握に有用であり、臨床的に極めて意義が深いものとされ
ている。(繁田 幸男:ケトン体 日本臨床 40秋季
臨時増刊号 250(1982))これまでのケトン体
測定法としては、(1)ガスクロマトグラフィーによる
もの(Analgt.Biochem,47 235
(1972)を参照、以下GC法と言う)、(2)ニト
ロプルシッドによるアセトン、アセト酢酸の呈色を利用
する半定量法(以下、半定量法と言う)、(3)アセト
酢酸を、p−ニトロフェニルジアゾニウムフルオロボレ
ートのジアゾニウム塩とカップリングさせることにより
呈色させ比色定量する方法。(特開昭55−15004
を参照)またその改良法として、界面活性剤の存在下で
アセト酢酸とp−ニトロフェニルジアゾニウムフルオロ
ボレートとを反応させた後にアルカリ化して安定なアゾ
化合物を生成させ、これを比色定量する方法(特開昭5
9−5959を参照。以下これらを比色法と言う)、
(4)3−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を用いる酵素法
(繁田 幸男:日本臨床38 638(1980)、W
illiamsom D.H.:Biochem.J.
82 90−96(1962)を参照。以下酵素法と言
う)、および(5)3−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素によ
る酵素的サイクリング反応を利用した方法(特開平04
−158779を参照。以下酵素サイクリング法と言
う)、が報告されている。
体液、特に主として糖尿病患者の血清または血漿であ
る。ケトン体はアセト酢酸と3−ヒドロキシ酪酸の総称
であり、通常3−ヒドロキシ酪酸がアセト酢酸に比べて
高濃度を占め、病態時にはさらにその差が開く傾向にあ
る。アセトンは気化しやすく不安定であり、呼気からも
排出されるために一般的にあまり測定されない。
セト酢酸と3−ヒドロキシ酪酸とを合わせたもの」を意
味するものとする。
すると以下のようになる。GC法はアセト酢酸および3
−ヒドロキシ酪酸を化学的にアセトンに転換させこのア
セトンを測定するものである。この方法は検体前処理を
必須とし多数の検体を処理するには問題を有する。
投与などの早急の処置を必要とする場合の指標として意
義がある。しかしながら、この方法は分子中の活性水素
を検出するという原理を用いるため、検体中に夾雑する
活性水素を有する化合物により妨害を受け、さらに活性
水素を持たない3−ヒドロキシ酪酸を測定できないとい
う本質的な欠陥がある。またアセト酢酸で0.5mM、
アセトンで2mM以上になって初めて検出し得る程度の
低感度であり、正常値付近での判定は不可能である。
点で優れているが、測定操作に先立って検体に除タンパ
ク処理又は透析処理を施す必要がある。したがって、多
数の検体を測定対象とする自動分析装置への適用には適
していない。
特に問題はない。しかしながら、アセト酢酸を測定する
場合、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
(還元型NAD)の消費量を測定するため高い吸光度域
において僅かな吸光度減少を測定するという原理上必然
的に測定精度が犠牲となる、という欠点を持っている。
検体前処理も必要としない特長を有し多数の検体を測定
対象とする自動分析装置へ容易に適用しうる測定法であ
る。しかしながら、3−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の補
酵素となりにくいチオニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド(チオNAD)を使用するため、通常では考えら
れない高濃度の3−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を必要と
する。そのため経済的観点からみて実用性に問題があ
る。また、NADのアナログである還元型チオNADの
極大吸収波長が400nm付近であり、その波長で測定
を行うため、溶血、ビリルビン等の影響も受けやすい、
という問題がある。
のケトン体測定法の欠点を解決し、検体中のケトン体を
検体前処理を必要とせずに簡便、迅速にかつ高精度に測
定できる方法、さらに汎用の自動分析装置を用いて測定
できる方法およびそのための試薬を提供することが本発
明の目的である。
び3−ヒドロキシ酪酸の酵素的な測定法は下記の反応を
利用している。
オチド NADH :還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド 本反応に基づく3−HBの測定法は生成するNADHの
紫外線吸収を測定するものであるが検体量を充分に取れ
ば、正常域(59±33μM:日本臨床 40秋季臨時
増刊号 250(1982))においてもほぼ満足のい
く測定精度を示す。しかしながら本反応に基づくAcA
測定については、消費されるNADHを測定することに
よって間接的に決定するため、充分な測定範囲をもつよ
うに設定された高い吸光度域(高濃度NADH域)にお
いて低濃度の検体を測定する場合、僅かな吸光度減少を
測定することになるため測定値の精度が低くなる。(坂
本信夫:綜合臨床40 1359−64(1991)) 我々は3−HBの測定法における利点即ち、低い吸光度
域(低濃度NADH域)において生成するNADHの吸
光度を測定し、定量する場合にほぼ満足のいく測定精度
を示す点に着目し、さらに乳酸脱水素酵素による妨害反
応、測定時における他の共存物質の影響に対する対策、
試薬の安定化等を考慮して鋭意検討を重ねた結果、本発
明を完成させた。
3−HBに変換する場合、NADHが定量的に消費され
ながら反応が完結する。この場合高濃度のAcAを測定
するためには、それに見あうNADHを反応系に添加し
なければならない。しかし充分量のNADHを存在させ
る場合、当然ながら初期吸光度は高い状態にある。この
ような状態において、正常域程度の低濃度の検体を反応
させて得られる僅かな吸光度変化は、初期吸光度(高吸
光度)のノイズに隠されて正確に測定できない。本発明
者等はこの点に着目し、検討を重ねた結果、AcAを3
−HBに変換する反応において、添加する還元型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)の濃度を
0.2mM以下好ましくは0.01〜0.10mM程度
の低濃度とし、さらに酸化型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド(NAD+)を補酵素としてNADHを生
成する別の酵素反応(例えば、イソクエン酸脱水素酵素
(EC1.1.1.41))を共役させることにより、
初期吸光度を低い状態で保ちながらAcAを3−HBに
変換しうることを見出した。即ち、低濃度のNADHを
用い、共役酵素反応でNADHを供給しながら、AcA
を完全に3−HBに変換する。その後過剰量のNADを
添加し、さらに反応pHをアルカリ域にシフトさせるこ
とにより検体中に最初から存在する3−HBとAcAか
ら変換された3−HBとを全てAcAに変換する。この
際、反応に伴って生じるNADHの吸光度を測定するこ
とにより精度良く検体中のAcAを3−HBと共に測定
しうることを見出した。またNADHを生成する酵素反
応を共役させることによりpH7〜7.5程度の弱アル
カリ域においても添加してある還元型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドが変性劣化せず安定に存在し、し
かも乳酸脱水素酵素を共役させることにより従来から問
題とされていた、高乳酸脱水素酵素検体測定時の誤差を
完全に回避しうることに成功した。
2段階の反応を経てから分光光度計で吸光度を測定す
る。第1段反応では検体中のAcAを低濃度に制御した
NADHの存在下において3−HBDの作用により完全
に3−HBに導く。この時消費されるNADHはNAD
Hを生成する別の酵素反応(例えば、イソクエン酸脱水
素酵素(EC1.1.1.41))を共役させることに
より、高濃度のAcAを反応させた場合においても短時
間でNADHは初期レベル(高濃度にはならないレベ
ル)に回復する。またこの第1段反応において、添加し
てある乳酸脱水素酵素の作用により検体中のピルビン酸
が速やかに乳酸に変換され、この時消費されるNADH
は、NADHを生成する別の酵素反応を共役させること
によりAcAを反応させた場合と同様に、短時間でNA
DHは初期レベルに回復する。第2段反応では過剰量の
NADを添加し、反応pHをアルカリ域にシフトさせる
ことにより3−HBからAcAへの反応を開始させる。
これと同時に、第1反応においてNADHを生成した酵
素反応の阻害剤を添加し、さらに乳酸脱水素酵素の周知
の阻害剤を添加することにより副反応を停止させ、検体
中のAcAを3−HBに変換すると共にNADHの生成
反応を正確に導き、生成NADHの量を吸光度増加量と
して捉える。(実施例1,2参照) 前述のように第1段反応におけるNADHの濃度を低濃
度に即ち低い吸光度に制御すると共に、第2段反応にお
いて、AcAの3−HBへの変換におけるNADHの生
成反応に基づく吸光度の増加として総ケトン体濃度を捉
えることができる。この方法により、自動分析装置によ
る高精度な総ケトン体の測定が可能となった。またNA
DHを生成する別の酵素反応の共役により、NADHの
安定化がなされ、さらに乳酸脱水素酵素反応を共役させ
ることにより従来から問題とされていた、高乳酸脱水素
酵素検体測定時の誤差を完全に回避できた。(実施例5
参照) 乳酸脱水素酵素の添加の理由は、検体中のピルビン酸を
乳酸に変換するためである。検体中にピルビン酸が存在
すると、乳酸脱水素酵素による逆反応によって乳酸を生
じる際にNADHがNAD+に変換されてしまうため主
反応で生じたNADHが減少し、測定誤差を生じる。こ
の現象は乳酸脱水素酵素を多く含む検体ほど顕著であ
り、ケトン体測定の障害となる。
と乳酸脱水素酵素により予じめ乳酸に転化しておき、ピ
ルビン酸による障害を除いておく。次いで、第2段階反
応では乳酸がピルビン酸となる逆反応が起らないよう乳
酸脱水素酵素の阻害剤を用いる。
式で表わすことができる。尚、使用試薬については好ま
しい例示である。
び乳酸脱水素酵素)との共役反応に利用可能な酵素は、
例示したイソクエン酸脱水素反応以外に次の酵素を使用
できる。
1.1.49) アルデヒドデヒドロゲナーゼ(EC1.2.1.5)お
よび(EC1.2.1.3) グルコースデヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.47)
および(EC1.1.1.119) 実施に際しては共役反応に用いる上で最も好ましいのは
イソクエン酸脱水素酵素である。
の反応及び吸光度測定を妨害しない基質を用いることが
できる。
ては次のものが使用できる。
的に使用されているキレート剤、例えばEDTA、及び
トランス−1,2−シクロヘキサンジアミン−N,N,
N’,N’−酢酸等がある。
酸、オキサミン酸等がある。
の種類等によって異なるが通常pH7.0〜7.5、好
しくはpH7.3〜7.5で行われる。第2段階反応は
通常pH8.0〜9.0、好しくはpH8.7〜8.9
で行われる。
具体的に説明する。
を本発明の方法により反応させた場合に得られる検量線
を図1(AcA検量線)及び図2(3−HB検量線)に
示した。反応条件は下記の通りである。
これら20μlに対して以下の組成の第1試薬240μ
l、第2試薬60μlを反応させ日立7150型自動分
析装置により主波長340nm、副波長700nmとし
24〜50測光ポイント間において吸光度変化量を測定
した。
ドアデニンジヌクレオチドの生成反応として捉えられ、
低濃度から高濃度にわたって良好な直線性を示した。
ス 実施例1に示した検量線における反応タイムコースを図
3(AcA)及び図4(3−HB)に示した。図におけ
る横軸は日立7150型自動分析装置における測光ポイ
ントを示し、縦軸は主波長340nm、副波長700n
mにおける吸光度を示す。
cAを低濃度に制御したNADHの存在下において3−
HBDの作用により完全に3−HBに導く。この時消費
されるNADHは還元型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドを生成するイソクエン酸脱水素酵素による反応
の共役により、高濃度のAcAを反応させた場合におい
ても短時間でNADHは初期レベルに回復する。第2段
反応では過剰量のNADを添加し、反応pHをアルカリ
域にシフトさせることにより3−HBからAcAへの反
応が進行し、5分間という短時間において反応は完結す
る。
反応ではなんら変化を受けず、第2段反応によりAcA
へ反応が進行し、5分間という短時間において反応は完
結する。
び3−HBを既知量添加し調製した検体を、実施例1の
測定条件において測定し、加えたAcA及び3−HBの
回収率により本測定条件における測定値の正確性を検討
した。結果を表1(AcA)、表2(3−HB)に示
す。
条件における測定値の正確性が示される。
るAcA測定精度を、従来の吸光度減衰における方法と
比較した。測定条件は実施例1に示した通りである。
和化学研究所の血中アセト酢酸測定用“ケトンテストA
「三和」”を能書に従って使用し、日立7150型自動
分析装置により測定を行った。
0、200μMそれぞれ添加したものを検体とし、同一
の検体を10回同時測定し得られる吸光度の変動係数に
より測定精度を比較した。
極めて高精度であることが示される。
の干渉 正常者プール血清に、乳酸脱水素酵素5000IU/l
及びピルビン酸2mM又は乳酸20mMを添加したもの
と、未添加のプール血清を検体として本発明における方
法により測定して得た吸光度の比較を表4に示す。測定
条件は実施例1の通りである。
水素酵素とその基質であるピルビン酸又は乳酸が高濃度
に存在していても、測定吸光度になんら変化は認められ
ず、これらの影響を完全に回避していることが示され
る。
法との相関性により確認した。既存の方法は以下に示す
通りである。
「三和」” 2.3−HB測定試薬(吸光度増加法) 製造発売元:株式会社三和化学研究所 販売名 :血中3−ヒドロキシ酪酸測定用 “ケトンテストB「三和」” 本発明における測定は実施例1記載の条件にて行い、既
存の方法における測定は上記の各試薬を添付能書に従っ
て使用し、日立7150型自動分析装置により測定を行
った。
ストB「三和」”夫々における測定結果の和と本発明に
おける測定値間の相関性を図5に示した。
1に近い。本発明の測定法は従来の方法と相関性が高
く、非常に高い信頼性を有することが示される。
の測定方法は極めて高精度のものであり、自動分析装置
へ容易に適用するものである。すなわち、本発明の方法
により、従来問題であった総ケトン体特にAcAの測定
が簡便化、高精度化し、自動分析装置による信頼性の高
い測定が検体未処理のまま可能となった。
を示すグラフである。
ムコースを示すグラフである。
トB「三和」”夫々における測定結果の和と本発明にお
ける測定値間の相関性を示すグラフである。
Claims (6)
- 【請求項1】(1)検体中のアセト酢酸を3−ヒドロキ
シ酪酸に変換し、 (2)検体中に元から存在する3−ヒドロキシ酪酸と上
記(1)で変換された3−ヒドロキシ酪酸との両方を、
3−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の作用により酸化型ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下で反応さ
せ、 (3)上記(2)の反応によって生じた還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドの量を測定することから
なる総ケトン体の測定方法。 - 【請求項2】 上記(1)の工程における反応を、3−
ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の作用により、還元型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下において行う
ことを特徴とする請求項1記載の方法。 - 【請求項3】 上記(1)の工程において、酸化型ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素としてその
還元型に変換する別の酵素反応を共役させることを特徴
とする請求項2記載の方法。 - 【請求項4】 上記(2)の反応によって生じる還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの量を吸光度と
して測定する請求項1記載の方法。 - 【請求項5】(1)緩衝剤、 (2)3−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素 (3)還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、 (4)酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、 (5)3−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素との共役反応によ
り酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに変換する酵
素、および(6)上記(5)の酵素の基質、 からなる総ケトン体の測定試薬。 - 【請求項6】更に、上記(6)の酵素の阻害剤を含む請
求項5記載の総ケトン体の測定試薬。
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