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Verfahren zur Gewinnung von wasserlöslichen Vitaminen der B-Gruppe
Gegenstand des Patentes 607 5122 ist ein Verfahren zur Gewinnung von
wasserlöslichen Vitaminen der B-Gruppe. Das Verfahren besteht darin, daß man die
genannten Vitamine aus ihren Lösungen adsorbiert und aus dem Adsorbat mit Aminen,
insbesondere mit cyclischen, tertiären Aminen eluiert.
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Bei der weiteren Bearbeitung des Erfindungsgegenstandes wurde nun
gefunden, daß man bei der Verarbeitung Vitamin B 2-haltiger Lösungen in vorteilhafter
Weise vor der nach dem Verfahren des Patentes 607 512
vorzunehmenden Adsorption
eine an sich bekannte Fällung mit Aceton einschaltet, die Fällung in Wasser löst
und aus der klar zentrifugierten Lösung nach dem Verfahren des Patentes
607 Sie die Vitamine in an sich üblicher Weise adsorbiert und aus dem Adsorbat
mit Aminen eluiert.' Zum Eluieren kann auch Ammoniaklösung Verwendung finden. Die
so erhältlichen Vitamin B 2-haltigen Eluate kann man weiterreinigen und ihren Vitamingehalt
anreichern, wenn man sie nach dem Einengen durch Behandeln mit wasserlöslichen organischen
Lösungsmitteln und durch Zusatz von Metallsalzen in saurer Lösung von Begleitstoffen
in an sich üblicher Weise befreit, aus der neutralen oder schwach alkalischen Lösung
die Vitamine mit Metallsalzen in bekannter Weise ausfällt, die Fällung in üblicher
Weise, z. B. mit Schwefelwasserstoff, zerlegt und den Metallniederschlag abscheidet.
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Die so erhältlichen Lösungen zeichnen sich durch eine leuchtend gelbe
Farbe mit ausgeprägter Fluoreszenz im Grünen aus. Diese neuen Farbstofflösungen
sind außerordentlich lichtempfindlich und werden bereits bei längerer Belichtung
mit sichtbarem Licht verändert. Dabei wurde die überraschende Tatsache festgestellt,
daß gleichzeitig mit der Lichtveränderung der Farbstoffe eine Zerstörung des wasserlöslichen
Vitamins B 2 -
stattfindet. Es ist dabei nicht erwiesen, ob das Vitamin wegen
seines eigenen Farbstoffcharakters oder infolge photochemischer Sensibilisierung
durch die begleitenden Farbstoffe lichtempfindlich ist. Im Hinblick auf die Lichtempfindlichkeit
des Vitamins ist es zweckmäßig, unter völligem Lichtabschluß zu arbeiten.
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Zu einem farbigen Präparat mit hoher Vitaminwirkung kann man gelangen,
wenn man die obenerwähnte, nach Zerlegung der
Metallsalzfällung
anfallende Lösung, gegebenenfalls nach vorherigem Einengen, mit in Wasser schwerlöslichen
Alkoholen, wivButylalkohol, Ämylalkohol >und Cyclohexanol ex@. trahiert und das
Extraktionsmittel entfernt.
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Die den wirksamen Stoff enthaltenen Lt sungen haben gelbe Farbe und
zeigen bef@_ neutraler Reaktion eine ausgesprochene Fluoreszenz im Grünen. Die Lösungen
zeigen hinsichtlich ihrer Fluoreszenz amphoteren Charakter. Bei deutlich alkalischer
und stark saurer Reaktion verschwindet die Fluoreszenz reversibel, die gelbe Färbung
bleibt jedoch erhalten.
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Die Farbstärke geht in allen bisher untersuchten Fällen parallel mit
dem biologischen Wirkungsgrad. Lösungen, die Farbe und Fluoreszenz irreversibel
verloren haben, erwiesen sich im Tierversuch immer wieder als wirkungslos, sofern
es sich nicht um eine z. B. durch ein Reduktionsmittel verursachte reversible Entfärbung
handelt. Dementsprechend haben sich als Ausgangsstoffe für die Wirkungsstoffe des
Vitamins B -- solche Stoffe des Tier- und Pflanzenreiches geeignet erwiesen, die
durch einen Gehalt gelber, grün fluoreszierender wasserlöslicher Farbstoffe gekennzeichnet
sind. Von tierischen Organen sind z. B. reich an Vitamin B z und ari solchen Farbstoffen
Leber, Herz und Niere. Beim Huhn enthalten die Beinmuskeln mehr Vitamin B:2 als
die Brustmuskulatur. Unterschiede im B --Gehalt der -Milch verschiedener Herkunft
finden sich im Gehalt an Farbstoff, der in die Molke übergeht, wieder. Die biologische
Auswertung von Frauenmilch und-Kuhmilch ergab z. B. für das Verhältnis des B --Gehaltes
den Wert i : 2. Dasselbe Verhältnis wurde kolorimetrisch für die aus den entsprechenden
Molken durch Adsorption an Fullererde und Elution gewonnenen Farbstofflösungen gefunden-.
Im Hühnerei findet sich Vitamin B 2 zu einem beträchtlichen Teil im Eiklar, das
nahezu farblos erscheint. Im frischen Eiklar und im Eieralbumin, die sich als Ausgangsmaterial
für das' vorliegende Verfahren besonders bewährt haben, wurde die Anwesenheit wasserlöslicher,
gelber, grün fluoreszierender Farbstoffe festgestellt. Ein hochwirksames Farbstoffpräparatkonnte
daraus durch das oben gekennzeichnete Verfahren isoliert werden. Im Pflanzenreich
-sind verschiedene grüne Blätter, insbesondere Spinat, als Quelle des Vitamins B:2
bekannt. Nach unseren Feststellungen finden sich auch im Spinat gelbe, grün fluoreszierende
Farbstoffe. Dasselbe trifft für das bekannteste B:2-Material; die Hefe, zu. Die
aus Hefe durch Adsorption an Fullererde und Elution erhältlichen gereinigten Farbstofflösungen
haben sich als sehr vitaminreich erwiesen. Charakteristisch für die neuen Farbstoffe
ist ihr Verhalten gegenüber Reduktions- und Oxydationsmitteln, insbesondere die
folgende _#ydrosulf@t-Bromreaktion. Die wässerige, ;3ei@be, grün fluoreszierende
Lösung wird mit .etvas 2 n-Natriumcarbonatlösung versetzt, .it=öbei die Fluoreszenz
verschwindet, aber die Farbe erhalten bleibt. Fügt man einige Tropfen verdünnte
Natriumhydrosulfitlösung zu, so erfolgt Entfärbung. Säuert man nun mit 2 n-Schwefelsäure
an und gibt tropfenweise Bromwasser zu, so kehrt die gelbe Farbe, nach Abstumpfen
mit Natriumacetat auch die grüne Fluoreszenz zurück. Die Leukofarbstoffe lassen
sich auch durch Methylenblau dehydrieren.
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Von Interesse für die Fraktionierung nahe verwandter Farbstoffe der
hier beschriebenen Gruppe ist die chromatographische Adsorptionsanalyse: Wird die
aus Herz, Hefe, Eieralbumin u. a. gewonnene Farbstofflösung mit Salzsäure angesäuert
und durch eine Säule von Talkum, Kieselgur, aktiver Kieselsäure, Aluminiumoxyd u.
dgl. filtriert, so werden gewisse Farbstoffe dabei in Form von Zonen festgehalten,
andere gelangen beim Nachwaschen mit dem Lösungsmittel ins Filtrat. Indem man die
einzelnen Farbzonen des Chrömatogramms mechanisch trennt und mit verdünntem Ammoniak
oder Aminen in der für Fullererde beschriebenen Weise eluiert, wird eine weitere
Differenzierung der Farbstoffe erzielt.
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Die wirksamen Substanzen lassen sich aus ihren neutralen oder schwach
alkalischen Lösungen in Form schwerlöslicher Metallsalze, z. B. der Silbersalze,
abscheiden.
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Die einzelnen Operationen erfolgen unter möglichstem Lichtausschluß
beispielsweise wie folgt. Beispiel i i kg käufliches Eieralbumin wird in 3 bis 41
destilliertem Wasser unter zweistündigem Turbinieren gelöst und danach zentrifugiert.
Nach Abschäumen wird die Flüssigkeit vom Ungelösten abgegossen und mit dem gleichen
Volumen Methylalkohol unter Rühren versetzt. Die so entstandene Albuminfällung wird
nach einigem Stehen abgesaugt, mit dem gleichen Volumen Methylalkohol angerührt
und nach mehrstündigem Stehen wiederum abgesaugt. Die vereinigten grün fluoreszierenden
Filtrate werden auf die Hälfte ihres Volumens im Vakuum eingeengt und das Konzentrat
zentrifugiert.
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Zu je 450 ccm der Lösung werden 37 ccm konzentrierte Salzsäure zugesetzt
(diese saure Lösung darf nicht unnötig lange stehen) und mit 7 g Fullererde eine
Stunde lang gerührt. Nach dem-Zentrifugieren wird die Fullererde
so
lange mit destilliertem Wasser gewaschen, bis sie frei von Salzsäure ist. Das Adsorbat
wird zwecks Elution i1/2 Stunden mit einer Mischung von 16o ccm destilliertem Wasser,
40 ccin Alkohol und 40 ccm Pyridin gerührt,. zentrifugiert und die Lösung im Vakuum
auf' 8 bis -io ccm eingeengt. Aus der dunkelbraunen Lösung wird durch Zusatz von
Methylalkohol kolloidal gelöste Fullererde ausgeflockt und durch Filtrieren entfernt.
Das Filtrat wird danach im Vakuum eingeengt und mit Aceton zur Ausfällung der Begleitstoffe
versetzt. Diese Acetonfällung muß nach dem Einengen der erhaltenen Lösung gegebenenfalls
nochmäls wiederholt werden, so lange bis nichts mehr gefällt wird. Die grüngelb
gefärbte, stark fluoreszierende Lösung wird vom Aceton im Vakuum befreit und, gegebenenfalls
unter Wasserzusatz, auf ein Volumen von 25 bis 30 ccm (bezogen auf i kg Albumin)
gebracht. Diese Lösung wird mit einigen Tropfen Eisessig versetzt und so lange finit
Äther ausgeschüttelt, bis keine gefärbten Substanzen mehr in den Äther gehen. Die
wässerige Lösung wird mit dem gleichen Volumen 2n-Salpetersäure versetzt und mit
5 °/oiger Silbernitratlösung gefällt. Dieser im folgenden als Fällung i bezeichnete
Niederschlag wird von der Lösung durch Zentrifugieren getrennt und die Lösung mit
Ammoniak genau neutralisiert. Das dadurch gefällte braunrot gefärbte Silbersalz
(Fällung 2) wird abzentrifugiert, wobei die zentrifugierte Lösung nur schwach gefärbt
sein soll. Die Fällung i wird darauf mit 0,5 n-Salpeter= säure aufgerührt
und zentrifugiert, worauf die Fällung :2 mit der erhaltenen salpetersauren Lösung
durchgerührt wird. Die Fällung 2 geht dabei größtenteils in Lösung. Nach dem Zentrifugieren
wird die stark gefärbte Lösung mit n-Ammoniaklösung neutralisiert und der erhaltene
braunrote Niederschlag abzentrifugiert. Die Lösung bleibt gefärbt. Der Niederschlag
wird dann mit 4, n-Essigsäurelösung durchgerührt, zentrifugiert und die essigsaure
Lösung durch Einleiten von Schwefelwasserstoff gefällt. Der Schwefelwasserstoff
wird darauf im Vakuum entfernt und die Lösung mehrmals mit Amylalkoliol ausgeschüttelt.
Die amylalkoholische Lösung wird im Vakuum auf wenige Kubikzentimeter -eingeengt
und der dabei sich abscheidende Niederschlag durch Zentrifugieren von der Mutterlauge
befreit. Der Niederschlag -neigt starke Vitaminwirkung und liefert beim Umkristallisieren
aus Wasser einen Farbstoff in Form schöner, braungelber Nadeln von gerader Auslöschung,
manchmal zu Drusen vereinigt. Im Mikroschmelzpunktapparat erhitzt, verliert der
Farbstoff bei etwa 315' die Doppelbrechung. Beispiele 1,5 kg fein zerkleinertes
Rinderherz werden in 2 4oo ccm kochendes destilliertes Wasser .eingetragen. Das
Kochen wird unter Rühren 8 Minuten fortgesetzt, die Flüssigkeit abgesaugt, auf 400
ccm im Vakuum eingedampft und mit 8oo ccm Aceton versetzt. Der erhaltene Niederschlag
wird in 45o ccm Wasser gelöst und diese Lösung klar zentrifugiert, darauf mit 37
ccm konzentrierter Salzsäure versetzt, wieder zentrifugiert und die erhaltene klare
Lösung eine Stunde mit 25 g Fullererde verrührt. Das Adsorbat wird finit Wasser
gründlich gewaschen und mit einer Lösung von i2o ccm Wasser, 3o ccm Alkohol und
3o ccm Pyridin il/, Stunden eluiert und das Eluat unter Ausschluß von Licht im Vakuum
auf 8 ccm eingeengt. Durch Versetzen mit Methylalkohol und später mit Aceton wird
das Eluat von den Begleitstoffen befreit. Man erhält eine gelbe, grün fluoreszierende
Lösung von hohem Vitamingehalt und einen Niederschlag brauner - Farbstoffe, die
aus Wasser kristallisieren. Beispiel 3 5 kg Bierhefe werden in 21/,l siedendes
Wasser eingetragen und unter Rühren io Minuten gekocht. Zu dem etwas getrübten Zentrifugat
wird verdünnte Schwefelsäure hinzugefügt, bis die Lösung 0,7 normal sauer
ist. Dann wird sie mit 300 g Fullererde 2 Stunden verrührt. Das Adsorptionsmittel
wird abzentrifugiert und so lange auf der Zentrifuge gewaschen, bis das Waschwasser
neutral gegen Lackmuspapier reagiert. Zur Elution wird die Fullererde i Stunde mit
einer Mischung aus 2 1 Wasser, 5oo ccm Methylalkohol und i00: ccm 20 °/oigem Ammoniak
geschüttelt. Nach dem Abschleudern der Fullererde und der Entfernung des Methylalkohols
und des Ammoniaks im Vakuum wird die stark vitaminhaltige Lösung nach den Angaben
des Beispiels i weiter angereichert.