DE2308059B2 - Verfahren zur biosynthetischen Herstellung von Griseofulvin - Google Patents

Description

Es sind bereits zahlreiche Verfahren zur Biosynthese von Griseofulvin mittels verschiedener Arten des Genus Penicillium, wie z. B. mittels der P.patulum-, P.griseofulvum- und P.urticae-Stämme bekannt (USA.-Patentschriften 3 095 360, 3 069 329 und 3 069 328).

Bei diesen bekannten Verfahren werden Kulturmedien verwendet, deren Zusammensetzung hinsichtlich der Stickstoff-, Kohlenstoff- und anderer Komponenten-Quellen je nach den metabolischen Eigenheiten der Art oder des verwendeten Stammes variiert wird. Die physikalisch-chemischen Züchtungsbedingungen (Temperatur, Belüftung, Rührvorgang, Dauer usw.) sind bei den bekannten Verfahren sowohl den Stämmen als auch den verwendeten Medien spezifisch.

Die bekannten Verfahren (USA.-Patentschriften 3 095 360, 3 069 329 und 3 069 328), bei weichen Stämme von P.griseofulvum und P.urticae verwendet werden, weisen den Nachteil auf, daß geringe Aktivitäten (Antibioticum-Konzentration) erreicht werden.

Bei den bekannten Verfahren gemäß den obengenannten USA.-Patentschriften werden zum Animpfen (Inokulation) des Mediums zur Gewinnung der Vorkultur (des vegetativen Inokulums) in agar-agarhaltigen Kulturmedien erzeugte Sporensuspensionen verwendet. Diese Verfahren weisen insbesondere den Machteil auf, daß das Biosynthese-Potential mit der Zeit unbeständig wird und daß eine ständige Laboratoriumsverarbeitung der Kulturen notwendig ist.

Bei einigen der bekannten Verfahren (USA.-Patentschriften 3 069 329, 3 069 328), bei weichen Penicillium patulum-Stämme angewendet werden, werden als An- 5<> reger Methylgruppendonatoren verwendet, und die Kohlenstoffquelle wird kontinuierlich während des Biosyntheseprozesses zugeführt, womit Nachteile hinsichtlich zusätzlicher Ausgaben für die zur kontinuierlichen Zugabe erforderten Stoffe und Anlagekosten verbunden sind.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird nunmehr ein Verfahren zur biosynthetischen Herstellung von Griseofulvin durch Züchten von Penicillium griseofulvum oder Penicillium urticae in einem Kulturmedium vorgeschlagen, daß dadurch gekennzeichnet ist, daß das Kulturmedium aus 5 bis 15 g/l Maiskeimen, 5 bis 8 g/l Maisextrakt, 100 bis 140 g/l Laktose, 7 bis 15 g/l Glukose, 10 bis 14 g/l Calciumcarbonat, 1 bis 2 g/l Kaliumchlorid, 6 bis 10 g/l Monokaliurnphosphat, 0,05 bis O₁I g/t Magnesiumsulfat, I bis 2 g/l Harnstoff und 2 bis 10 g/l hydriertem Sonnenblumenöl (Sonit) besteht.

Die Erfindung wird an dem folgenden Awsfuhrungsbeispiel erlSutert, bei welchem als Stamm Penicillium urticae verwendet wurde: a) Vorbereitung des sporentragenden Impfmaterials

Entschälte, mit Wasser durchtränkte und sterilisierte Hirse- oder Reiskörner wurden mit einer Sporensuspension angeimpft, die aus einer durch Zuchtwahl gewonnenen und vorgeprüften Reinkultur m.t hohem Potential vorbereitet wurde.

Die Bebrütung wurde bis zur vollkommenen Sporenbildung geführt, die Kultur dann unter Vakuum eetrocknlt und I bis 2 Jahre bei +4' C aufbewahrt, wobei die Überlebensfähigkeit der Sporen und da. Biosynthesepotential während dieser Zeit gute Werte zeigte.

b) Vorbereitung des I. vegetative* Inokulums I eines Mediums folgender Zusammensetzung wurden zubereitet:

g/

g, g,

Maisextrakt (50",,)

Natriumacetat

Monokaliumphosphat

Kaliumchlorid υ,.

Magnesiumsulfat Ο,ί

EisendD-sulfat 0,(

Glukose (100°„ig berechnet) 28

Hydriertes Sonnenblumenöl (Sonit) 1

pH-Wert 5,95 bis 6,0
Nach Sterilisieren wurde mit sporentragendem M-. terial angeimpft und bei 27 bis 28 C unter Rühr;··. mit einer Belüftungsmenge von I I Luft/l/Minute, b> einem Überdruck von 0,3 bis 0,5 atm während 25 h Stunden gezüchtet, wobei unter optimalen Un, füllungsbedingungen eine Biomasse von 20 bis 30' gekennzeichnet durch den IL bis III. Grad metactm matischer Korpuskeln, erhalten wurde.

c) Vorbereitung des II. vegetativen Inokulums I eines Mediums folgender Zusammensetzung wurden zubereitet:

Sojabohnenschrot

Calciumcarbonat ο

Monokaliumphosphat 4

Glukose (100%ig berechnet) 20

Laktose 20

Natriumchlorid 3

Ammoniumsulfat 2

g/l g/l g/l g/l g/l g/I g/l

Ammoniumsulfat

Magnesiumsulfat 0,01 g/l

Hydriertes Sonnenblumenöl (Sonit) 1 g/l pH-Wert 5,95 bis 6,0

Nach Sterilisieren wurde mit 5 bis 10% Vol/Vol des I. vegetativen Inokulums angeimpft und 18 bis 25 Stunden unter den beim I. vegetativen Inokulum angewandten Bedingungen gezüchtet.

d) Die eigentliche Biosynthese Tonnen des Mediums folgender Zusammensetzung wurden zubereitet:

Maiskeim 5 bis 15 g/l

Maisextrakt 5 bis 8 g/l

Laktose 100 bis 140 g/l

Glukose 7 bis 15 g/l

Calciumcarbonat 10 bis 14 g/l

Kaliumchlorid 1 bis 2 g/l

J 2

Monokaliumpho&phat 6 bis IO g/l Magnesiumsulfat 0,05 bis 0,1 g/l Harnstorr I bis 2 g/l Hydriertes Sonnenblumenöl

(Sonit) 2 bis 10 g/l

pH-Wert 5,8 bis 7,5

In ein 15 bis 20 Tonnen-Gefäß wurden 6 Tonnen Wasser eingeführt, das Maiskeimmehl und der Maisextrakt zugegeben, und 15 bis 60 Minuten bei 100 C »o gekocht. In ein anderes gleiches Gefäß wurden in 6 Tonnen Wasser die Laktose und die Glukose bei 55 bis 65 C gelöst, dann über den thermisch behandelten Maiskeimmehl und -extrakt gegeben. In einem zur Zubereitung der Salze bestimmten 500-1-Gefäß wurden »5 das Monokaliumphosphat, das Kaliumchlorid, das Magnesiumsulfat und der Harnstoff gelöst und dann die erhaltene Lösung den anderen Komponenten zugegeben. In einem 5-Tonnen-Gefäß wurde die CaI-ciumcarbonataufsvhlämmung vorbereiiet, die dann auch über die anderen Komponenten gegeben wurde. Das für die Mischungsformel berechnete Volumen wurde mit Wasser aufgefüllt, der pH-Wert mit 10 bis I5%iger Natriumhydrjxidlösung auf 5.7 bis 6,3 gestellt und das hydrierte Sonnenblumenöl als Antischaummittel zugesetzt.

Das so zubereitete Medium wurde zur Sterilisation nach einem kontinuierlichen Verfahren geführt. Die Sterilisation wurde bei 120 bis 125 C durchgeführt. Um den Abbau der Zucker zu vermeiden, können diese separat bei einer niedrigeren Temperatur (115 bis I20^cC) sterilisiert werden, aber nur, nachdem 059

das ganze Sterilisationssystem mit Wasser geregelt wurde. Man muß beachten, daß die Sterilisationsdauer für einen Ansatz (30 t) 4 bis 5 Stunden nicht überschreitet. Sowohl die Verlängerung der Sterilisationsdauer als auch die Erhöhung der Sterilisationstemperatur führt zu einer teilweisen Degradation der anwesenden Stoffe, insbesondere des Zuckers, der bei Temperaturen über 120 C karamelisiert, was sich negativ auswirkt.

Nach Überimpfen mildem II. vegetativen Snokulum im Verhältnis von 5 bis I0"_o VoI/VoI wurde der Biosyntheseprozeß mit folgenden Parametern durchgeführt:

Temperatur: 26 bis 30 C.

Belüftung: während der ersten 12 Stunden zwischen 0,8 und 1,2 I Luft/l/Minute, nach !2 Stunden und bis zum Ende

der Fermentation zwischen 1,2 und 2 I Luft/l/Minute.

pH-Wert:

der natürliche pH-Wert, der zwischen 5,8 und 7,0 lieg'

Der Fermentationsvorgang dauerte 300 bis 350 Stunden und eine Aktivität von 12000 Gamma/ml wurde erzielt.

Das erfindungsgemäße Verfahren weist den Vorteil auf, daß man Ausbeuten von 12000 Gamma/ml erreicht und daß der Reinigungsvorgang unter bequemen Bedingungen verläuft, da keine Zwischenprodukte der Biosynthese gebildet werden.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur biosynthetischen Herstellung von Griseofulvin durch Züchten von Penicillium griseofulvum oder Penicillium urticae in einem Kulturmedium, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium aus S bis 15 g/l Maiskeimen. S bis 8 g/l Maisextrakt, 100 bis 140 g/l Laktose, 7 bis 15 g/l Glukose, 10 bis 14 g/l Calciumcarbonat. to

   1 bis 2 g/l Kaliumchlorid, 6 bis i0 g/I Monokaliumphosphat, 0,05 bis 0,1 g/l Magnesiumsulfat, I bis

   2 g/l Harnstoff und 2 bis 10 g/l hydriertem Sonnenblumenöl (Sonit) besteht.

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