DE1617814C - Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Ergocryptin - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Ergocryptin. Ergocryptin gehört zu einer Gruppe von Ergot-Alkaloiden; durch Hydrolyse wird Lysergsäure, Dimethylbrenzt raubensäure, D-Prolin und L-Leucin erhalten, die Moleküle dieser Substanzen sind durch Amidbindun- ;$en verbunden. Ergocryptin wird zweckmäßig als Hypertensives Mittel und bei der Behandlung von ;)eripheren vasculären Störungen verwendet.

In der Literatur sind verschiedene mikrobiologische /erfahren zur Herstellung von Alkaloiden der Ergot-.-jruppe bekannt (niederländische Patentschriften ·') 415 127 und 6 405 662; USA.-Patentschriften i 117 917 und 3 110 651; japanische Patentschrift IQ 250/64), nach welchen Verfahren es jedoch nur möglich ist, Mischungen derartiger Alkaloide zu erhalten.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß •nan bei einem Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Ergocryptin durch submerses aerobes Züchten von Claviceps purpurea in assimilerbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralsalze entialtenden flüssigen Nährmedien bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Werten nur das Ergocryptin-Alkaloid in guten Ausbeuten erhält und daß danach außer den beträchtlichen Vorteilen während der !■xtraktions- und Isolationsverfahren das Alkaloid in loher Reinheit und guten Ausbeuten erhalten wird, -venn man als Claviceps purpurea Claviceps purpurea <\TCC 20019 einsetzt.

Der neue Stamm Claviceps purpurea ATCC 20019 A'urde aus Ergot-Sclerotien isoliert, die von einer itoggenähre gesammelt worden waren; er zeigt folgende norphologischen Eigenschaften:

Mikroskopisches Aussehen

Auf den üblichen festen Kulturmedien zeigt das vlycel Hyphen, die in jungem Zustand lang und dünn ind und wenig auffällige und gut getrennte Septa '.eigen. Beim Älterwerden werden die Hyphen größer; -lie Septa werden sehr auffällig, und die verschiedenen /.eilen, die die Hyphen bilden, quellen. Bei jungen Hyphen beträgt die Zellenlänge etwa 24 bis 30 μ, und ler Durchmesser ist 3 bis 4 μ. Alte Zellen sind 10 bis μ lang und haben einen Durchmesser von 4 bis 5 μ. Manchmal trennen sich die Zellen, die die alten Hyphen bilden, ab und umgeben ihre Endteile, wodurch Arthrosporen entstehen, deren Dimensionen von den der oben beschriebenen Zellen nicht sehr verschieden sind.

Mehr oder weniger schnell und mehr oder weniger häufig, je nach den verwendeten Kulturmedien, bilden sich an der Spitze von zahlreichen Hyphen Conidien, die bei manchen Kulturmedien rundlich und bei anderen deutlich oval sind; die Größe der ersteren ist etwa 5 bis 7 μ (Durchmesser) und die der anderen bis 8 zu 3 bis 5 μ.

Makroskopisches Aussehen

Die makroskopischen Eigenschaften wurden an Streifen der in der Tabelle angegebenen Medien festgestellt, die 8, 16 bzw. 24Tage lang bei 28⁰C bebrütet worden waren.

TS-Medium:

Reichliches Wachstum; samtiges Aussehen und weiße Farbe, die beim Altern violett wird; das Luftmycel ist reichlich. Die Rückseite der Kolonie ist farblos bis violett. Es werden keine löslichen Pigmente gebildet. Reichliche Conidien.

Agarkartoffelglukose:

Diskretes Wachstum, reichliches Luftmycel, weiß, häufig gebündelt wie Coremia. Die Rückseite der Kultur ist fabrlos. Lösliche Pigmente sind nicht vorhanden. Zahlreiche Conidien.

T36-Medium:

Gutes Wachstum mit großen Falten, mäßiges weißliches Luftmycel. Die Rückseite ist farblos; lösliche Pigmente sind nicht vorhanden. Zahlreiche Conidien.

T 31-Medium:

Gefaltet, hell, weißlich, mäßiges Wachstum. Kein Luftmycel vorhanden. Keine löslichen Pigmente vorhanden. Spärliche Conidien.

T25S-Medium:

Spärliches Wachstum, irregulär, in mehr oder weniger domartigen Kolonien. Mäßiges Luftmycel mit samtigem Aussehen und rosa Farbe. Violette Rückseite. Keine löslichen Pigmente vorhanden. Reichliche Conidien.

S. P.-Medium:

Gutes Wachstum, gleichmäßig verteilt, mit samtigem Aussehen und weißlicher Farbe. Rückseite farblos. Keine löslichen Pigmente vorhanden. Keine Conidien vorhanden.

T22-Medium:

Gutes Wachstum, ungleichmäßig, weißlich, mit farbloser Rückseite. Keine löslichen Pigmente und keine Conidien vorhanden.

	TS	Tabelle	T 36	T 31	Kartoffel glukose	S. P.	T 22
Verbindungen	100 g 10 g	T 25 S	200 g	300 g	20 g	300 g	25 g 100 g
vlaisquellflüssigkeit	300 g
Saccharose
ilukose
\sparagin
vlehlhydrolysatc

Tabelle (Fortsetzung)

Verbindungen

TS	T 25 S
0,1g	0,1g
	15g
	125 mg
0,5 g	0,5 g
0,3 g	0,5 g
7 mg	7 mg
6 mg	6 mg
20 g	20 g
ad 11	ad U
	ad pH
	5,2
ad pH
5,2

T 36	T 31
	10 g
	2g
60 mg
10 g
	500 ml
80 mg
0,35 g
0,35 g
4 mg
3 mg
20 g	20 g
ad 11
	ad 11
ad pH
5,2

Kartoffelglukose

S. P.

T 22

Baumwollsamen

Peptone

Hefeextrakt

Zitronensäure

Kartoffelinfusion (¹J...
Häckselinfusion (²) ..

KCl

KH₂PO₄

MgSO₄-7H₂O

FeSO₄-7H₂O

ZnSO₄-7.H₂O

Agar

Destilliertes Wasser ..

Leitungswasser

wässeriger Ammoniak

NaOH.

10 g
10 g

500 ml

20 g
ad 11

0,5 g
0,5 g
7 mg
6 mg
20 g
1000 ml

0,5 g 0,3 g

20 g 1000 ml

5,5

(¹) 200 g Kartoffeln werden 45 Minuten lang in 500 ml Leitungswasser gekocht. Das Ganze wird durch Gaze filtriert, und das (infundierte) Filtrat wird auf das Volumen gebracht.

(²) 200 g Kornhäcksel (Spelzen) werden 45 Minuten lang in 5 1 Leitungswasser gekocht, dann filtriert und auf das Volumen gebracht.

Der erfindungsgemäß zum Einsatz kommende Mikroorganismus wird insbesondere in einem flüssigen Kulturmedium unter aeroben Bedingungen in Submerskultur bei einer Temperatur von 20 bis 30⁰C, vorzugsweise 24° C, während eines Zeitraumes von 8 bis 16 Tagen gezüchtet. Der pH-Wert kann je nach, den verwendeten Fermentationsmedien von. 4 bis 6,5 schwanken. Als Ausgangsstoff für Kohlenstoff kann Glukose, Saccharose, Mannit, Sorbit, Glyzerin, Zitronensäure und Bernsteinsäure verwendet werden. Der Ausgangsstoff für Stickstoff kann Ammoniak, Asparagin, Pepton, Kaseinhydrolisate und Ammoniumsalze, wie Sulfat und Chlorid und andere Substanzen, wie sie gewöhnlich verwendet werden, sein. Als Mineralsalze werden zweckmäßig für die Herstellung des Alkaloids je nach dem verwendeten Medium verschiedene Salze verwendet, und es können Chloride, Phosphate, Sulfate und Magnesium, Eisen, Zink, Mangan und Kalium verwendet werden.

Der Stamm Claviceps purpurea ATCC 20019 kann durch Gefriertrocknung gelagert werden, wobei als Suspendiermittel eine Flüssigkeit verwendet wird, die aus drei Teilen einer 60%igen Saccharoselösung und zwei Teilen Milch besteht. Außerdem kann er auf T36-Medium weiter übertragen werden. Die Fermentierung kann im Erlenmeyerkolben und in Laboratoriums- oder industriellen Fermentern verschiedener Kapazität durchgeführt werden.

Die Menge des in der \Nährbrühe vorhandenen Alkaloids kann qualitativ durch Papierchromatographie bestimmt werden in Vergleich mit einem Ergocryptinstandard und quantitativ durch spektrophotometrische Verfahren.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung:

Beispiel 1

In einem 10-1-Fermenter werden 61 TG-Medium durch 30 Minuten langes Erhitzen auf 12O⁰C sterilisiert. Dieses Medium hat die folgende Zusammensetzung:

Glukose 100 g

Zitronensäure 10 g

Hefeextrakt 0,1g

KH₂PO₄ 0,5 g

MgSO₄-7H_aO 0,3g

FeSO₄-7H₂O 7 mg

ZnSO₄ · 7H₂O 6 mg

Destilliertes Wasser auf 1000 ml

pH 5,2 , mit

Ammoniak

Hierauf wird mit 50 ml einer Suspension von Conidien und Mycel, erhalten durch Suspendieren von fünf Kulturen des Stammes Claviceps purpurea ATCC 20019 in einem Probierrohr in T36-Medium, in Wasser beimpft.

Die Kultur wird 4 Tage lang bei 24⁰C gezüchtet, wobei mit einem Mischstrom von 41 pro Minute belüftet und mit einer rotierenden Schütteleinrichtung mit sechs Blättern bei einer Geschwindigkeit von 300 UpM geschüttelt wurde. Die so erhaltenen Kulturen dienen zur Animpfung mit einem Verhältnis von 10°/₀ von 6 1 T 25-Medium, das in einem anderen 10-1-Fermenter hergestellt und fermentiert worden war. Dieser wird dann bei 24⁰C mit einer Belüftung entsprechend einer Luftzufuhr von 61 pro Minute und mit einem Schüttelrührwerk, das mit sechs Rührblättern versehen ist, bei einer Drehzahl von 350 UpM, · gehalten. Nach lOtägiger Züchtung enthält die Kultur

llOOy/mlErgocryptin. . .

Außerdem wurde an Stelle des T 25-Mediums das Medium 668 verwendet, welches folgende Zusammensetzung hat:

5 6

Saccharose 60 g Nach 14tägiger Züchtung enthält die Kultur

Glyzerin '.... 60 ml 1500 y/ml Ergocryptin. .

Glukose 80 g · _ . . , .

Hefeextrakt. ...0,1g . . Beispiel

Zitronensäure 15 g 5 Es wird wie im Beispiel 1 gearbeitet, wobei jedoch

KCl , 0,125 g von fünf Kulturen auf S. F.-Medium in Probierrohren

KH₂PO₄... 0,5 g ausgegangen wurde.

MgSO₄ · 7H₂O 0,5 g Es werden 1300 y/ml Ergocryptin erhalten.

FeSO₄-7H₂O ,. 7 mg

ZnSO₄ -7H₂O 6 mg io Beispiel 3

Destilliertes H₂O auf 1000 ml

pH 5,2 mit Es wird wie im Beispiel 1 beschrieben gearbeitet,

Ammoniak wobei jedoch von fünf Kulturen auf T 22-Medium in

Sterilisierung 20 Minuten Probierrohren ausgegangen wurde.

lang bei 10O⁰C 15 Es werden 1250 y/ml Ergocryptin erhalten.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Ergocryptin durch submerses aerobes Züchten von Claviceps purpurea in assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralsalze enthaltenden flüssigen Nährmedien bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Werten, d a d u r ch gekennzeichnet, daß man als Claviceps purpurea Claviceps purpurea ATCC 20019 einsetzt.