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Erzeugung von Chlortetracyclin und Cobalaminen auf biologischem Wege
Die Erfindung betrifft die Herstellung sowohl von Chlortetracyclin als auch von
Cobalaminen durch Fermentation von Nährböden mit Streptomyces aureofaciens.
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Künstliche und natürliche Mutanten von S. aureofaciens ergeben Veränderungen
in der Ausbeute sowohl von Chlortetracyclin als auch den Cobalarninen. Durch Auswahl
von mutierenden Stämmen, welche hohe Ausbeuten ergeben, ist es möglich, die Erzeugung
von Chlortetracyclin und Cobalaminen zu erhöhen. Es wurde jedoch unerwarteterweise
gefunden, daB bekannte übliche Medien, welche Kohlehydrate, organische Stickstoffquellen
und andere Bestandteile umfassen,, keine wesentlich hohen Ausbeuten mit diesen Stämmen
erzeugen. Es scheint, daß das Medium selbst die Erzeugung von Chlortetracyclin und
Cobalaminen beschränkte, ohne Rücksicht darauf, welcher Stamm von S. aureofaciens
verwendet wurde.
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Gegenstand der Erfindung ist die Schaffung eines neuen und verbesserten
Mediums, wodurch das Erzeugungspotential von Stämmen, welche durch Mutation und
andere Auswahlprozesse aus dem
Mutterorganismus erhalten werden,
veiwertet wird. Diese ergeben eine höhere Ausbeute, und demgemäß werden die Erzeugungskosten
dieser außerordentlich wichtigen Arzneimittel merklich vermindert.
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Alle Stämme, welche durch Mutation und andere natürliche und künstliche
Auswahlprozesse von dem Stammorganismus S. aureofaciens erhalten werden, werden
in Übereinstimmung mit den Grundsätzen des internationalen botanischen Kongresses
als S. aureofaciens klassifiziert. Bestimmte dieser Stämme erzeugen viel höhere
Ausbeuten an Chlortetracyclin als der Mutterstamm. Weiterhin wurde gefunden, daß
die Stämme von S. aureofaciens, weiche die größeren Chlortetracyclinmengen zu ergeben
vermögen, auf Variationen in dem Medium ansprechen, gegen welche die Mutterstämme
nicht empfindlich sind. Manche Stämme sprechen günstiger auf ein solches Medium
an als. andere.
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Erfindungsgemäß werden für die Erzeugung von Chlortetracyclin und
Cobalaminen zur Züchtung von S. aureofaciens Nährböden verwendet, die neben den
üblichen Bestandteilen Zusätze von Verbindungen aufweisen, die Chloridionen in Mengen
von o,15 bis 2,5 Gewichtsteilen und Kobaltionen in Mengen von Spuren bis 0,o1 Gewichtsteilen
liefern.
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Der Zusatz von Spurenelementen, auch von Kobalt, ist für biologische
Zwecke an sich bekannt. Die Bestandteile eines im Rahmen der vorliegenden Erfindung
typischen Nährmediums sind die folgenden:
| Teile |
| Wasser . .. . . .. .. .. .. .. .. .. . 500,0
bis 1500,o |
| organische Stickstoffquelle .... 20,o - 40,0 |
| Calciumcarbonat, fein gemahlen 4,5 - 15,0 |
| Kohlehydrat ................. 20,o - 40,0 |
| Ammoniumionen ............. 0,5 - 2,5 |
| Chloridionen .. .. .. .. ......... 0,15 - 2,5 |
| Magnesium .................. o,1 - 0,5 |
| Eisen ........................ Spur bis 0103 |
| Mangan .. .. .. ............... - - 0,04 |
| Zink ......................... - - 0,04 |
| Kobalt ...................... - - 0,o1 |
Da die Mengen an metallischen Spurenelementen Magnesium, Eisen, Mangan, Zink und
Kobalt, welche in dem erfindungsgemäßen Nährmedium erforderlich sind, sehr gering
sind und eine Variation in der Konzentration nicht besonders kritisch ist, so ist
es vorzuziehen, besser diese Elemente in der erforderlichen Menge zuzugeben als
zu analysieren und sich teilweise auf die in den anderen Bestandteilen als Verunreinigungen
vorhandenen Mengen zu verlassen.
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Da die Ionen aus den löblichen Salzen in dem Medium in dissoziiertem
Zustand vorhanden sind, so können ihre Elemente oder Radikale in verschiedenen Salzkombinationen
zugesetzt werden, um dasselbe Medium zu ergeben. Demgemäß ist die Konzentration
als Gehalt an metallischen Bestandteilen definiert. Die Metallionen können als Salze,
Säuren oder Basen zugesetzt werden. Beispielsweise können die metallischen. Spurenelemente
als Sulfate oder Chloride oder andere lösliche Salze zugesetzt werden. In ähnlicher
Weise kann eine bestimmte Menge des erforderlichen Chloridions t.ls Ammoniumchlorid
oder Calciumchlorid usw. zugesetzt werden. Es ist zweckmäßig, einen Teil der Kationen
als Sulfatsalze vorliegen zu haben, da das Sulfation bei der Regelung des pH-Wertes
nützlich ist und für die Salze ein unschädliches Anion liefert. Die gewünschten
Kationen können auch als Carbonate, Salze mit organischen Säuren,, z. B. Zitronensäure
oder Milchsäure, zugefügt werden.
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Unter »Spur« ist die kleinste natürlich auftretende Menge gemeint,
welche normalerweise als Verunreinigung in anderen Bestandteilen eingeführt wird.
Es ist weder erwünscht noch wirtschaftlich möglich, eine vollständige Abwesenheit
derartiger Bestandteile zu sichern.
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Die Spurenelemente, wie Eisen, Mangan, Kobalt und Zink, sind für maximales
Wachstum erforderlich, jedoch sind die Mengen so gering, daß Nährstoffe, wie Maisquellwasser,
hinreichend davon für ein wirksames Wachstum enthalten, obwohl festgestellt wurde,
daß Zusätze, wie oben angegeben, die Angemessenheit sichern und eine konsequentere
Erzeugung an hohe Ausbeuten liefernden Fermentationen gestatten.
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Zur Erzielung bester Ergebnisse sollte ein solches Medium mit
0,33 bis 1 Volumen Luft pro Volumen Lösung je Minute gelüftet und mit einer
Eingangsleistung des Schaufelrades des Rührwerks von etwa 0,3 bis 2 PS je
454,61 gerührt werden. Die Belüftung und das Rühren sind gegenseitig abgestimmt,
so daß eine höhere Rührgeschwindigkeit miteiner niedrigeren Belüftungsgeschwindigkeit
benutzt werden kann, und umgekehrt. Bei den. größeren Tanks ergibt eine Zufuhr von
weniger PS je 45461 Fassungsvermögen normalerweise denselben Grad des Rührens.
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Ein steriles Specköl mit oder ohne Octadekanol oder ein Silikonölan@ti:schaumöl
oder andere Schauminhibitoren können zur* Regelung des Schäumens des Mediums in
dem Fermentationstank verwendet werden.
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Der pH-Wert soll während der Fermentation zwischen etwa 5 und 8 bleiben.
Es wurde gefunden, daß die besten Ergebnisse in dem Bereich von etwa 6,2 bis 6,6
gemessen nach der Sterilisation des Mediums und knapp vor dessen Beimpfung, erhalten
-,verden. Gewöhnlich hat das Medium, wie es hergestellt wird, einen derartigen pH-Wert,
so daß eine Einstellung nicht notwendig ist.
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S. aureofaciens wächst auf dem Medium in den Temperaturgrenzen von
etwa 2o bis 35°. Bessere Ergebnisse werden in einem Bereich von etwa 25 bis 30°
erhalten. Der Mittelpunkt dieses. Bereichs, nämlich 27 bis 28°, ist der bevorzugte
Temperaturbereich, der normalerweise bei der Produktion verwendet wird.
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Etwas Ausbeute kann erhalten werden, wenn man. eine so geringe Zeit,
wie 24 Stunden, fermentiert, besonders, wenn viel Impfstoff verwendet wird. Das
maximale Wachstum tritt gewöhnlich zwischen etwa 6o und 72 Stunden auf, und dieser
Bereich wird für die wirtschaftlichste Erzeugung
bevorzugt. Ein
Tank kann jedoch auch eine so lange Zeit, wie i4o Stunden, fermentiert werden, ohne
dal3 ein unangemessenes Absinken in der Wirksamkeit auftritt. Zur Erzielung der
Höchstproduktion würde eine so lange Zeit unangemessene Kosten hinreichend großer
Tanks zum Arbeiten erfordern. Es kann jedoch aus verschiedenen Gründen beim Arbeiten
im Betrieb zweckmäßig werden, einen Tank während dieser oder einer noch längeren
Zeit arbeiten zu lassen, bevor die Gewinnung von Chlortetracyclin und Cobalaminen
vörgenommen wird.
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Das folgende Beispiel soll die Erfindung näher erläutern, ohne sie
zu beschränken. Aus Gründen der Zweckmäßigkeit sind die Konzentrationen, in Gramm
je Liter ausgedrückt, als das exakte verwendete Gewicht anzugeben; das letztere
kann für irgendeine Größe eines Fermentationstanks von den hier angegebenen bevorzugten
Konzentrationswerten berechnet werden.
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Beispiel Für die Verwendung in einem go goo 1 fassenden Gärkessel
wurde eine ursprüngliche Beschickung hergestellt, welche gogo 1 Wasser enthielt,
zu dem eine hinreichende Menge der Bestandteile zugefügt wurde, so daß nach der
Verdünnupg auf 9o goo 1 die folgenden Konzentrationen vorhanden waren: Maisquellwasser,
wie es für die Penicillinherstellung verwendet wird,
| 5o%. Feststoffe ......... ...... 30,0 g/1 |
| Calciumcarbonat, USP XIII, hell 9,o - |
| Saccharose ... .. ................. 30,0 - |
| Ammoniumsulfat ................ 3,3 - |
| Ammoniumchlorid .............. i,0 - |
| Mg cl2'6 H2 O . . . . . . . . . . . . . . . .
. 2,0 - |
| Fe SO, -:2 H20 .. .. .. .. .. .. .. .. . o,o4i
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| M"SOa - 4H20 .. .. .. .. .. .. . . .. . 0,05 - |
| ZnS04 - 7 H20 .. .. .. .. .. .. .. .. . o,io - |
| C0 C12 - 6H2 O . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0,005- |
Die Stoffe wurden in der angegebenen Reihenfolge unter Rühren zugefügt. Das Konzentrat
wurde durch 40 Minuten langes Erhitzen auf 12o° sterilisiert und aseptisch in den
Gärkessel übergeführt, welcher vorher mit strömendem Dampf sterilisiert worden war.
Das Konzentrat wurde in dem Gärkessel belüftet, gerührt und gekühlt und dann aus
dem städtischen Leitungsnetz so viel sterilisiertes Wasser zugefügt, so daß auf
die oben angegebenen Konzentrationen verdünnt und der Gärkessel auf go goo 1 aufgefüllt
wurde. Die Temperatur des verdünnten Mediums wurde auf 27° eingestellt. Ein Antischaummittel,
das aus i 0/e Octadekanol .enthaltendem Specköl bestand, wurde zu einem Speisungstank
zugefügt, so daß es, falls notwendig, steril zugegeben werden konnte. Ursprünglich
wurde i g/1 zugesetzt, und weiteres Antischaummittel wurde zugefügt, wenn es notwendig
war, das Schäumen im Verlaufe der Fermentation zu steuern. Insgesamt wurden 3 g/1
im Verlauf der Fermentation verwendet. Das Medium in dem Fermentationsta_nk wurde
mit 4 Volumprozent aus einem Impftank geimpft, der einen 25stündigen, eine hohe
Ausbeute liefernden Stamm S. aureofaciens enthielt. Der beimpfte Tank wurde mit
einer Geschwindigkeit von 0,4 Volumen Luft je Volumen Maische je Minute belüftet,
wobei die Luft nahe dem Boden des Fermentationstanks durch eine Reihe von Belüftungsdüsen
eingeleitet wurde, so daß sich eine geringe Bläschengröße ergab. Der Inhalt des
Ferrpentationstanks wurde durch ein Schaufelrad gerührt, das mit einem go-PS-Motor
angetrieben wurde, der bei seiner Nennleistung arbeitete. Die Belüftung und das
Rühren wurden 62 Stunden durchgeführt. Nach Beendigung wurde die Maische geerntet,
und man stellte fest, daß sie 25oo Mikrogramm je ccm Chlortetracyclin und 742 Mikrogramm
je Liter Vitamin B" enthielt.