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Verfahren zur Züchtung von Micrococcus lysodeikticus Die Erfindung
bezieht sich auf einen submersen Gärprozeß zur Züchtung von Microcöccus lysodeikticus,
dessen Zellen viele Stoffe enthalten, die sowohl für industrielle als auch für pharmazeutische
Verwendungen geeignet sind. So kann man z. B. aus den Zellen eine sehr aktive Katalase
gewinnen. Die Zellen enthalten auch eine wirksame Polynucleotidase, die in der Lage
ist, Mononncleotide reversibel zu polymerisieren. Außerdem enthalten die Zellen
Nucleinsäuren, wie Ribonucleinsäure, Deoxyribonucleinsäure u. dgl., in größeren
Mengen. Auch wurden in den Zellen Pigmentierungsstoffe gefunden.
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Die Zellen des Micrococcus lysodeikticus wurden schon früher durch
Gärverfahren hergestellt. Diese V°rfahren haben in einem Oberflächenkulturverfahren
bestanden, das für die Herstellung großer Zellmengen jedoch aus vielen, Gründen
unbefriedigend und u11-bequem ist. Besonders ungünstig ist bei dieser Oberflächengärung
die Größe der benötigten Oberfläche und eine damit verbundene Gefahr der Verunreinigung.
Wirtschaftliche Überlegungen, wie Arbeits- und Produktionskosten,, sprechen daher
gegen die Verwendung von Oberflächenverfahren in der Technik.
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Es wurden daher schon viele Versuche gemacht, den Micrococcus lysodeikticus
durch ein submerses Kulturverfahren in einem großen Volumen einer flüssigen Nährlösung
zu züchten. Die entsprechenden Versuche sind nicht erfolgreich gewesen, denn die
Kulturen wurden ausnahmslos mit Hefen oder sporenbildenden Bazillen verunreinigt.
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Es wurde nun ein submerses Gärverfahren für die Vergärung des Micrococcus
lysodeikticus entwickelt, wodurch ein großes Zellvolumen in einfacher Weise erzeugt
werden kann, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Nährmedium, das Kohlehydrate,
proteinartige Stoffe, Wachstumsfaktoren und Mineralsalze enthält, mit dem Organismus
Micrococcus lysodeikticus beimpft, das Nährmedium während der Wachstumsperiode unter
Belüftung durchrührt und dabei den pg Wert während des Wachstums auf etwa 7,0 und
darüber hält.
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Die Zellenausbeute des Micrococcus lyso-deikticus trennt man dann
aus der Nährlösung in üblicher Weise ab.
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Das Wesentliche der Erfindung liegt in der Feststellung, daß die Nährlösung
während der ganzen Wachstumsperiode auf einem pE[-Wert oberhalb von etwa 7,0, vorzugsweise
auf einem pH-Wert im Bereich von 7,5 bis 9,0, gehalten werden muß. Überraschenderweise
werden hierdurch die Verunreinigungen in ihrer Entwicklung gehemmt.
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Durch die folgenden Beispiele soll die Erfindung näher erläutert werden.
Beispiel 1 Der hier verwendete Micrococcus lysodeikticus wurde unter Nr. 4698 von
»American Type Culture Collection« bezogen. Der Organismus wurde auf Schräg-A.gar
bei Raumtemperatur durch etwa einmalige Übertragung in je 7 oder 8 Tagen gezüchtet.
Der Agar für die Züchtung der Kultur hatte die folgende Zusammensetzung: 111/o Hefeextrakt
(Anheuser-Busch), 211/o, Dextrose, 0,5molares saures Kaliumphosphat (8,7 g je Liter),
111/o Salzlösung der folgenden Zusammensetzung: 4% Magnesiumsulfat-Heptahydrat,
0,2% Natriumchlorid, 0,211/o F-isensulfat-Heptahydrat, 0,16% Man:gansulfat, 211/o
Agar.
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Das pl, dieses Mediums, jedoch ohne den Agar, wurde mit einer Lösung
von Kaliumhydroxyd (1 cm3 50%ige K O H/Liter) annähernd auf 8,0 gebracht. Nach Einstellung
des p. Wertes wurden 2% Agar zu dem Medium gegeben. Das Gemisch wurde zum Sieden
gebracht, in Röhrchen verteilt, diese -mit Watte zugestopft und im Autoklav unter
Druck sterilisiert.
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Das flüssige Medium für das Wachstum wird in Form von drei getrennten
Lösungen wie folgt hergestellt: Lösung A: In einen Rundkolben von 121 Inhalt werden
9,1 1 destilliertes Wasser gegeben sowie
100 cm3 der oben bezeichneten
Salzlösung und 85 g Natriumbicarbonat, so daß die Endmolarität im Medium 0,1molar
ist. Die Oberfläche dieser Flüssigkeit wird mit einem Anti.schaummittel, wie z.
B. einem polymeren Silikon (»Dow Corning Antiform A«), besprüht. Der Kolben wird
mit einem Wattestopfen verschlossen und 1 Stunde bei einem Druck von 1,05 kg/cm2
im Autoklav erhitzt.
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Lösung B: 100 g Hefeextrakt (Anheuser-Busch) und 400 cm3 Wasser werden
in einen 1-1-Kolben -gegeben. Der Kolben wird mit Watte verschlossen und 20 Minuten
lang bei 1,05 kg/cm2 im Autoklav gehalten.
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Lösung C: In einen 50(#-cm3-Kolben werden 200 g Dextrose und 300 cm3
Wasser gegeben. Der Kolben wird dann mit Watte verstopft und 20 Minuten lang bei
einem Druck von 1,05 kg/cm2 im Autoklav erhitzt.
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Die auf Raumtemperatur abgekühlten Lösungen B und C werden unter aseptischen
Bedingungen zu Lösung A hinzugefügt. Der p$ Endwert dieses Gemisches beträgt 8,8.
Die- Lösung wird mit einem Impfstoff, der nach einer der folgenden Methoden hergestellt
werden kann, beimpft: Zubereitung 1: In einen-Kulturkolben, der 1 1 des oben beschriebenen
Agar enthält, werden Micrococcuslysodeikticus-Zellen gebracht. Man läßt den Kolben
48 Stunden bei Raumtemperatur zum Wachsen stehen. Am Ende dieser Zeit bereitet man
einen Impfstoff, indem man die Oberfläche des Kulturmediums im Kolben mit sterilem
destilliertem Wässer abspült. Der Inhalt von zweien dieser Kolben wird als Beimpfung
für die Gär- oder Wachstümsstufe verwendet.
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Zubereitung 2: In einen 250-cm3-Weithals-Erlenmeyer-Kolben werden
40 cm3 einer Lösung, die 17 g einer Natriumbicarbonatlösung und 10 cm3 der Salzlösung
je Liter enthält, gegeben. In einen anderen 250-cm3-Erlenmeyer-Kolben werden 40
cm3 einer Lösung gegeben, die 20 g Hefeextrakt und 40 g Dextrose je Liter enthält.
Die zwei Erlenmeyer-Kolben werden mit Watte zugestopft und bei einem Druck von 1,05
kg/cm2 20 Minuten lang im Autoklav behandelt. Nach dem Abkühlen wird der Inhalt
eines Kolbens unter aseptischen Bedingungen in den anderen Kolben übergeführt. Der
letztere wird mit Zellen von Micrococcus lysodeikticus beimpft. Man schüttelt den
Kolben 48 Stunden lang bei Raumtemperatur und gibt dann den Inhalt unter aseptischen
Bedingungen als Impfstoff für das Gär- oder Wachstumsstadium zu dem Inhalt der 12-1-Kolben.
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Das flüssige Kulturmedium oder die Wachstumslösung dieses Beispiels
wurde mit einem Impfstoff, der gemäß Zubereitung 1 hergestellt wurde, beimpft und
der Ansatz unter Durchleiten von Luft intensiv belüftet. Das Belüftungssystem bestand
aus einem Luftauslaß und einem Luftzuführungsrohr, das durch einen Gummistopfen
in den Kolben reichte. Die zugeführte Luft wurde durch sterile Watte filtriert und
in dem Medium mittels einer Glasfritte verteilt. Ehe man das Kulturmedium hineingab,
wurde das gesamte Belüftungssystem in einem Autoklav sterilisiert. Man setzte das
Belüften und Durchrühren bei Zimmertemperatur für eine Wachstumsperiode von etwa
48 Stünden fort. Die Zellen wurden dann mittels einer Sharples-Zentrifuge gesammelt.
Die Gesamtausbeute an Zellen betrug 3,5 g (Trockengewicht) je Liter Medium.
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Beispiel 2 Als Kulturkolben wurde ein 250-cm3-Erlenmeyer-Kolben verwendet.
Das Medium wurde nach dem unter Präparat II beschriebenen Verfahren hergestellt.
Der Kolben wurde mit Micrococcus lysodeikticus beimpft und auf eine Standard-Schüttelmaschine
gebracht und etwa 48 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach dieser Wachstumsperiode
wurden die Zellen mit einer Sharples-Zentrifuge gesammelt. Die Zellenausbeute betrug
9,0g (Trockengewicht) je Liter des Mediums.
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Beispiel 3 Der Ansatz für diese Versuchsanordnung wurde wie folgt
zusammengestellt: Lösung A 510,0 g Na H C 03 12,0 g Na Cl 12,0 g FeS 04 " 7 H20
240,0 g Mg S O4 ' 7H2 O 10,8 g Mn S 04 45,421 Wasser (12,0 gal) Die Lösung A wurde
in ein Fermentationsgefäß mit Belüftungs- und Rührvorrichtung gebracht. Das Gefäß
samt Inhalt wurde dann 60 Minuten lang durch Erhitzen auf 121,1° C bei einem Druck
von 1,05 kg/cm2 sterilisiert.
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Lösung B 600,0 g Hefeextrakt 5,671 Wasser Diese Lösung wurde in einem
Kolben aus rostfreiem Stahl 60 Minuten lang in einem Autoklav bei 1,05 kg/cm2 sterilisiert.
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Lösung C 1200 g Dextrose 5,6771 Wasser Lösung C wurde ebenfalls in
einem Kolben aus rostfreiem Stahl 60 Minuten lang bei 1,05 k g/cm2 im Autoklav sterilisiert.
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Nachdem die Lösungen auf Raumtemperatur abgekühlt waren, wurden die
Lösungen B und C unter aseptischen Bedingungen zu Lösung A zugefügt. Das PH der
Mischung betrug 8,5.
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Das Nährmedium wurde dann mit wie in Präparat 2 hergestellten Zellen
des Micrococcus lysodeikticus beimpft.
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Die Wachstumslösung wurde gerührt und 48 Stunden lang mit einer Geschwindigkeit
von 49,56 Liter Luft je Minute bei 32,2° C belüftet. Nach Beendigung des Wachstums
wurden die Zellen mittels einer Sharples-Zentrifuge gesammelt. Die Ausbeute betrug
5,0g (Trockengewicht) Zellen je Liter Lösung.
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Beispiel 4 Gemäß dem im Beispiel 2 beschriebenen Verfahren wurde ein
Ansatz ohne Na H C 03 als Puffermedium hergestellt. Nach einer Wachstumsperiode
von 48 Stunden konnte man feststellen, daß der Kolben mit sporenbildenden Stäbchen
verunreinigt war und daß keine Zellen des Micrococcus lysodeikticus gebildet waren.
Dieses Beispiel zeigt einen anderen Vorteil der Erfindung, wonach das Wachstum von
unerwünschten Verunreinigungen in alkalischen' Medien unterdrückt wird.
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Beispiel 5 Um den p$ Bereich für das erfindungsgemäße Verfahren zu
ermitteln, wurden eine Reihe Versuche durchgeführt.
250-cm3-Standard-Schüttelkolben,
die 80 cm3 der im Beispiel 1 beschriebenen Nährlösung, aber ohne Na H C O'3-Zusatz,
enthielten, wurden sterilisiert, nachdem die PH-Werte der Lösungen mit 0,lmolaren
Natriumphosphatlösungen auf die vorbestimmten Werte abgepuffert waren. Die Kolben
wurden dann 20 Minuten lang bei 1,05 kg/cm2 im Autoklav sterilisiert und mit 1 cm3
einer Lösung beimpft, die man durch Abwaschen eines 24 Stunden alten Schräg-Agars
vou Micrococcus lysodeikticus mit 30 cm3 H.0 erhalten hatte. Nach Zeiträumen von
2, 31/z, 51/2 und 24 Stunden wurden aliquote Proben des Wachstumsmediums genommen
und die Ausbeuten bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt
| Tabelle 1 |
| Einfluß des p11-Wertes auf die Ausbeute an |
| Micrococcus lysodeikticus |
| g Zellen (Trockengewicht) |
| p$ je Liter nach |
| 2,0 Std. I 3,5 Std. I 5,5 Std. I 24 Std. |
| 6,7 0,017 0,028 0,077 1,29 |
| 7,2 0,023 0,061 0,088 1,40 |
| 7,3 0,066 0,073 0,110 2,06 |
| 7,4 0,057 0,054 0,034 2,40 |
| 8,0 0,272 0,265 0,333 2,40 |
| 8,8* 0,157 0,200 0,225 2,34 |
| 9,0 0,198 0,109 0,176 2,30 |
| Kontrollversuch, mit Na HCO3 gepuffert. |
Aus den obigen Werten kann man ersehen, daß bei allen Versuchszeiten die Geschwindigkeit
der Zellenproduktion bei einem p,1-Wert von etwa 8,0 auf ein Maximum steigt und
daß die maximale Zellproduktion in einem pH Bereich von etwa 7,4 bis 8,8 erhalten
wird.
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Beispiel 6 In Übereinstimmung mit dem in Beispiel 2 beschriebenen
Verfahren wurde eine Versuchsreihe durchgeführt, um den Einfluß des pH-Wertes auf
die Zellenausbeute des Micrococcus lysodeikticus nach einer Wachstumsperiode von
48 Stunden zu bestimmen. Die Lösungen wurden auf das gewünschte p$ mit 0,1molaren
Natriumphosphatlösungen eingestellt. Die erhaltenen Werte sind in der folgenden
Tabelle zusammengestellt.
| Tabelle 2 |
| Einfluß des PH-Wertes auf die Ausbeute an |
| Micrococcus-lysodeikticus-Zellen |
| (nach einer Wachstumsperiode von 48 Stunden) |
| Ausbeute |
| p$ (g je Liter |
| Trockengewicht) |
| 7,0 4,8 |
| 7,5 4,8 |
| 8,0 4,6 |
| 8,3 4,5 |
| 8,5 5,1 |
| 9,0 4,7 |
| 9.5 4,5 |
| 10,0 1,2 |
| * Kontrollversuch, mit Na H C 03 gepuffert. |
Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß die Zellenausbeute des Micrococcus lysodeikticus
bei einem pg von 10 rapid abfällt- und daß ein Bereich von etwa 7,0 bis 9,5 befriedigend
ist für erhöhte Zellproduktion.
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Es sei erwähnt, daß die oben mitgeteilten genauen Werte für die Ansätze
ohne vom Wesen der Erfindung abzuweichen, variiert werden können. So muß z. B. das
Nährmedium folgende Grundstoffe enthalten: 1. Kohlehydrate, 2. proteinartige Substanzen,
3. Wachstumsfaktoren, 4. Mineralsalze.
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Die folgend genannten Substanzen können an Stelle der oben in den
Beispielen genannten verwendet werden Kohlehydrate Dextrose, Rohrzucker, Maltose,
Melasse, Maissirup Mineralsalze: Lösliche Salze von Magnesium, Natrium, Eisen, Kalium,
Mangan, Schwefel, Phosphor.
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Proteinartige Substanzen, Wachstumsfaktoren Hefeextrakt, Maisquellflüssigkeit,
Autolysierte Hefe, Pepton.
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Wie oben bereits erwähnt, bezieht sich das Wesen der Erfindung darauf,
während des Wachstumsvorganges des Kulturmediums einen p11-Wert über etwa 7,0, vorzugsweise
im Bereich von 7,5 bis 9,0 zu halten. Dies kann durch die Verwendung verschiedener
Pufferlösungen erreicht werden. Neben dem obenerwähnten Natriumbicarbonat kann man
andere Puffer verwenden, z. B. Kaliumbicarbonat, Kaliumphosphat, Natriumphosphat,
Natriumcitrat usw.
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Die Molarität der Pufferlösung kann bis zu 0,2molar betragen, ohne
eine merkliche Wirkung auf das Wachstum des Organismus zu verursachen. Es wurde
ferner festgestellt, daß 0,lmolares Bicarbonat ausreicht, um den p11-Wert 48 bis
72 Stunden lang oberhalb 8,0, zu halten. Die bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung beabsichtigt die Verwendung von 0,lmolarem Natriumbicarbonat als Puffer
für das Wachstumsmedium.