DE2512267A1 - Reagenz-komposition fuer die bestimmung von glycerin. - Google Patents
Reagenz-komposition fuer die bestimmung von glycerin.Info
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Description
The Dow Chemical Company OCI ? 9 β 7
2030 Abbott Road ^ *" ^
Midland, Michigan, USA 17,158 B
Patentanwälte
Dipl. Ing. H. Weickmann. Dipl. Phys. Dr. K. Fincke
Dipl. Ing. F. A. Weickmann, Dipl. Chem. B. Huber
8 München 80» Möhlstraße 22
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Reagenz sowie ein Verfahren zur Bestimmung von Glycerin-Konzentrationen
in biologischen Flüssigkeiten.
Die koloidnietriscfti. Bestimmung von Glycerin ινηά von Mono-,
Di- und Triglyceriden (in allgemeinen einfach air; "Tx-iglyceride"
bezeichnet) in biologischen Flüssigkeiten wird in vielen Laboratorien nach unterschiedlichen Methoden durch ce führt* Der Wertderartiger
Beatiiiuinrngen als Hilfe boi der Diagnose von Atherosklerose,
Diabetes rr.ellitus, Nephrose und verschiedenen anderen
Krankheiten ist wohl bekannt (öiehe Henry, Clinical Chemistry,
Hoeber Division, Harper & Row, New York (1964), 864-870). Im
typischen Fall umfassen diese Methoden die Abtrennung der Triglyceride
(sowie der Mono- und Diglyceriae) νου anderen Lipiden,
wie Pbospholipiden, durch Extraktion oder Chromatographie«
Die abgetrennten Triglyceride werden dann unter Bildung von Glycerin hydrolysiert, welches chemisch analysiert wird, und
zwar durch chemische Oxidation zu Formaldehyd und Bestimmung des Formaldehyds oder durch enzymatisch© Beεtimmung. Das enzymatische
Verfahren verwendet die Enzyme Glycerinkinase ("GK"v auch als "Glycerokinaso" bezeichnet), Glycerin»l-phosphatdehydrogenase(G-I-PDH)
in Gegenwart von Adenosin-5-tx'iphcsphat (A1I1P) und oxidiertem Nicotinamid-adenii^-dinucleotid (NAD),
und zwar nach folgendem Schema:
ATP
Glycerin —g-g—^+ί^ * G1ycerin -1-phosphat
Glycerin —g-g—^+ί^ * G1ycerin -1-phosphat
NAD
Glycerin-l-phosphat ^^^KADH "h H y Dihydroxy
G-I-PDH aceton-
X^hosphat
^09839/0945
— r -
Auf die Reduktion von HAD zu KADH kann eine Ultraviolett-Spektroskopie
folgen. Die GIycerinbostimmunp; kann auch durch
Ultraviolett-Analyse durchgeführt werden, wobei man Glyesrindehydrogenase
verwendet, um die Reaktion
Glycerin + NAD ■? MADH + Dihydroxyaeeton
zu katalysieren. Bei dem GK, G-l-PDH~katalysierten Verfahren
wird üblicherweise Hydrazin zum Reaktionξgemisch zugegeben,
welches mit dem Dihydroxyaceton-phosphat reagiert und so die
Reaktion nach rechts verschiebt (siehe z.B. Spinella et al.
J. Lipid Research, 7, s· 167-169 (1966)).
Es sind auch Methoden beschrieben worden, bei welchen
Serumproben mit alkoholischer Base hydrolysiert und die neutralisierten Extrakte kolorimetrisch analysiert werden, indem
man die GK, G-I-PDII-Reaktionen mit der Diaphorase-katalysierten
Reaktion des MDII mit dem Tetrazolium-Farbstoff(INT) koppelt1«"
(Klotzsch et al. Abstract 0C31, Technicon Inter-national Congress
"Advances in Automated Analysis", Technicon Instruments Corp.
Tarrytown, N.T. (1972)). Jedoch erfordern die bislang bekannten hydrolytischen Verfahren■mit alkoholischer Base, daß man die
Verseifung lange Zeit bei erhöhten Temperaturen 1ώ erhitztem
äthanolischem Kairumhydroxid durchführt (z.B* JO Min. bei
55-7O0C)-, siehe Carlson et al. Cliru Chim. Acta 4-, 197-205
(1959). Diese Methoden sind daher als unerwünscht zeitraubend und mühselig betrachtet worden.
Unsere Parallel-Anmeldung (C-17158-A) betrifft ein verbessertes
Verfahren zur Bestimmung von Triglyceriden in biologischen Flüssigkeiten, wie Blutserum. Hierbei werden die Triglyceride
der zu analysierenden biologischen Flüssigkeit in kurzer Zeit und bei mäßigen Temperaturen mit einer Lösung
eines Alkalihydroxids in Methanol zu Glycerin hydrolysiert. Die Hydrolyse-Mischung wird dann vorzugsweise mit einem wasserlöslichen
Magnesiumsalz behandelt, um potentiell störende Substa.H^n,
Phospholipide, zu entfernen, worauf man den erhaltenen
Niederschlag z.B. durch Zentrifugieren entfernt. Das Glycerin wird dann quantitativ bestimmt und stellt ein quantitatives
Maß für die Trigiyceride dar«. Wie bei den bekannten Verfahren
v/erden Glycerin, Mono- und Biglyceride bei der Triglycerid—
Bestimmung mitumfaßt und die Resultate werden als "Triglyceride"
wiedergegeben. 509839/0945
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Reagenz-Komposition für die Bestimmung von Glycerin-Konzentrationen in biologischen
Flüssigkeiten, bestehend aus 0,0009-0,074 molaren Mengen einer Magnesiumionen-Quelle, 5-30 Gew.-Teilen (g-Basis) Adenosin-5-triphosphat,
20-125 Gew.-Teile (g-Basis) oxidiertes Nikotinamid-adenin-dinucleotid,
0,5-5 Gew.-Teile (g-Basis) eines farblosen Tetrazolium-Farbstoffs, der in einer Elektronenträgerkatalysierten
Reaktion mit reduziertem Nikotinamid-adenindinucleotid
ein gefärbtes Reaktionsprodukt bilden kann, 1000-10.000 Teile (internationale Einheiten) Glycerinkinase,
5000-280.000 Teile (internationale Einheiten) Glycerin-1-phosphat-dehydrogenase
und 1600-10.000 Teile (internationale Einheiten) Diaphorase.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Bestimmung von Glycerin, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Glycerinhaltige
Flüssigkeitsprobe mit der obigen Reagenz-Komposition mischt, die erhaltene Mischung 1-20 Min. bei einer Temperatur
von 25-45°C inkubiert und den Glyceringehalt kolorimetrisch bestimmt. Die Erfindung betrifft eine kolorimetrische Schnellbestimmung
von Glycerin und erlaubt daher die schnelle, einfache
Bestimmung von Triglyceriden mit relativ billigen und unkomplizierten Vorrichtungen.
Die erfindungsgemäße Komposition und das Verfahren der
vorliegenden Erfindung eignen sich besonders gut für die Bestimmung von Glycerin in biologischen Flüssigkeits-Hydrolysaten.
Nach diesem verbesserten Verfahren wird Glycerin enzymatisch bestimmt, indem man es mit ATP und Mg in Glycerin-1-phosphat
überführt, letzteres mit oxidiertem Nikotinamid-adenin-dinucleotid (NAD) in Dihydroxyaceton-phosphat umwandelt, wobei
das NAD zur reduzierten Form NADH reduziert wird, worauf die Menge des gebildeten NADH bestimmt wird. Das NADH wird vorzugsweise
bestimmt, indem man es in Gegenwart eines Elektronenträgers mit einem farblosen Tetrazolium-Farbstoff reagieren
läßt, der bei einer solchen Reaktion ein gefärbtes Produkt
bilden kann, worauf man die Menge des erhaltenen gefärbten Tetrazolium-Produkts bestimmt. Die photometrische Bestimmung
kann unter Verwendung eines Kolorimeters oder Photometers durchgeführt werden, das die Lichtabsorption oder Lichtdurchlässigkeit
im sichtbaren Spektrum mißt.
509839/0945
Gemäß vorliegender Erfindung sind alle für die verbesserte
Glycerin-Bestimmung erforderlichen Materialien in einer einzigen Reagenz-Substrat-Komposition formuliert und die Reaktionen
können so praktisch gleichzeitig durchgeführt werden. Zweckmäßig wird die freies Glycerin enthaltende Probe mit der
Reagenz-Substrat-Komposition inkubiert. Die Inkubation wird
eine ausreichende Zeit unter den für die obigen Reaktionen förderlichen Bedingungen durchgeführt, so daß eine kolorimetrisch
meßbare Menge des gefärbten Tetrazolium-Produkts gebildet wird,
worauf man die Menge des Produkts mißt.
Die Roagenz-Substrat-Komposii'ion enthält vorzugsweise
die folgenden Bestandteile in folgenden Mengenverhältnissen:
Für die Phosphorylierung von Glycerin zu Glycerin-1-phosphat:
ATP — 5-30 g
GlycerinkinasG — 1000-10.000 internationale Einheiten
(I.U., bestimmt durch Analyse bei 500C)
MagnesiumquellG, z.B. MgCl2· 6 H5O — 0,0009-0,0?4- Mol.
Für die Umwandlung von Glycerin-1-phosphat in Dihydroxyaceton-phosphat
und NAD in NADH:
G-I-PDH — 5000-280.000 I.U. (bestimmt durch Analyse bei
25°C)
NAD — 20-125 S
Für die Tetrazolium-Farbi'eaktion:
Tetrazolium-Farbstoff (INT) — 0,5-5 S Diaphorase — 1600-10.000 I.U. oder mehr (I.U. bestimmt
durch Analyse bei 250C).
Die oben genannten Bestandteile v/erden zweckmäßig in einem wäßrigen Puffer mit geeignetem pH-Wert (z.B. 6,8-8,9, vorzugs-
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v/eise 7,5-8^75) dispergiort, wobei man die obengenannten Mengen
in etwa 15 1 Puffer verwendet. Die maximale Konzentration von
ATP, GK1 Magnesiumquelle, NAD, INT und Biaphorase scheinen nicht
kritisch zu sein; man kann diese Bestandteile, insbesondere das ■
GK und die Diaphorase in Mengen verwenden, die von der obengenannten
Minimalmenge bis zur Sättigung der endgültigen Mischung
mit der Probe reichen. Jedoch erhält man gute Resultate innerhalb der obengenannten Mengenbereiche.
Ammoniumsulfat, das normalerweise in einigen Enzym-Zubereitungen
vorhanden ist, und Hydrazin sind für die Komposition nicht erforderlich; vielmehr ist die Komposition vorzugsweise
praktisch frei von Ammoniumsulphat und Hydrazin, d.h. sie enthält Ammoniurasulphat- und Hydrazin-Konzentrationen, die
unterhalb der Menge liegen, die einen signifikant meßbaren Effekt auf die Enzym-katalysierten Reaktionen haben, vorzugsweise
kein nachweisbares Hydrazin. Wenn man Ammoniumsulfat-Enzym-Zubsreitxingen
verwendet, so werden sie zweckmäßig durch übliche Methoden dialysiert, um das Ammoniumsulfat zu entfernen,
bevor sie in die Reagenz-Substrat-Komposition eingearbeitet werden« Man kann weitere Bestandteile zusetzen, wie Stabilisierungsmittel,
oberflächenaktive Mittel oder Lyophilsations-Stabiliserungsmittel,
wie Albumin.
Man verwendet 1-10 ml der Reagenz-Substrat-Komposition (vorzugsweise 2-5 ml) pro ml der Hydrolysemischung, die man
durch Behandlung der biologischen Flüssigkeit mit der methanolisch Base erhalten hat. Die erhaltene Mischung wird bei einer !emperatu:
von 25-45°C (vorzugsweise 57°C) inkubiert, bis eine meßbare Farbe
entstanden ist. Die Inkubationszeit beträgt üblicherweise 1-20 Min, Die für eine äquivalente Farbentwicklung erforderliche
Zeit steigt bei abnehmender Temperatur; die Inkubation wird vorzugsweise bei 35-£i-Q°C in 1-12 Min. durchgeführt. In den
meisten Fällen ist die Farbentwicklung nach etwa 3 Hin. bei
37°C praktisch vollständig. Die Reaktionen können nach einer
vorgegebenen Zeitdauer beendet werden, indem man einen Überschuß Säure (s.B. Salzsäure) zusetzt. Die Färbung, Vielehe
etwa 15 Min. nach Säurezusatz stabil bleibt, kann, in einem Kolorimeter oder Spektrophotometer mit Licht einer V/ellen-
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Länge von 4-75-530 Nanometer gemessen werden. Alternativ kann
man die Farbe nach einer vorgegebenen Inkubationsdauer ohne
Abbruch der Inkubation messen, was bei Verwendung einer automatischen
Analysenvorrichtung zweckmäßiger sein dürfte. In solchen Fällen kann die Farbe im allgemeinen nach sehr kurzen
Inkubationszeiten (z.B. 1-3 Min. bei 37°C) bestimmt werden,
da man bei einer präzisen Steuerung gute Resultate auch mit einer Farbentwicklung erhalten kann, die nicht ganz vollständig
ist.
Die Reagenz-Substrat-Komposition kann gewünschtenfalls
als Konzentrat hergestellt und lyophilisiert werden. Die erhaltene lyophilisierte Komposition eignet sich für die Lagerung
und Handhabung bei Raumtemperatur und bei Kälte; vor ihrer Verwendung wird sie mit Puffer rekonstituiert.
In den folgenden Beispielen ist die Erfindung näher er- läutert.
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Beispiel 1
Man stellt eine Reagenz-Substrat-Komposition her, indem man die folgenden Bestandteile in den folgenden Mengenverhältnissen
mischt:
Magnesiumchlorid (Hexah7/drat) 6 g
ATP 18 g
NAD ' 72 g
Rinderalbumin (Stabilisierungsmittel) 16 g
Glycerinkinase-Lösung (1400 internationale Einheiten pro ml) 6 ml
Glycerin-1-phosphat-dehydrogenase
(2.000 I.U. pro ml) 60 ml
Diaphorase 7705 I.ü.
Wässr. 0,10 H 2-Amino-2-methyl-l,3-
propandiol-hydrochlorid-Puffer
(pH 8,1 bei 370G) q.s. ad 15 1
Die Reagenz-Substrat-Korcposition wird in Koloriraeter-Küvetten verteilt, und zwar 1,5 ml pro Küvette.
Die Komposition.wird wie folgt zur Triglycerid-Analyse
verwendet:
0,1 ml menschliches Serum, 0,1 ml einer Triolein-Standardlösung
(200 mg Triolein pro 100 ml) und 0,1 ml destilliertes Wasser gibt man in Küvetten, welche jeweils als "Probe",
"Standard" und "Kontrolle" bezeichnet werden. In jede Küvette gibt man 1,0 ml 0,32 N Natriumhydroxid in Methanol. Die erhaltenen
Hydrolysemischungen werden gut vermischt und 10 Min. im Wärmebad auf 37°C gehalten. Dann vermischt man 1,0 ml
einer wäßrigen 0,15 molaren Magnesiumsulfat-Lösung mit dem Inhalt jeder Küvette und zentrifugiert diese 5 Min. mit der
1150-fachen Schwerkraft (1150 χ g), um den erhaltenen Niederschlag
abzutrennen.
Man gibt 0,5 ml der erhaltenen klaren überstehenden Lösung
aus jeder Küvette zu 1,5 ml der Substrat-Reagenz-Komposition in jedem der drei entsprechend bezeichneten Küvetten (Probe,
■ 509839/Ö945
Standard, Kontrolle). Die Küvetten werden 5 Min. bei 37°C inkubiert,
worauf man die Inkubation durch Zusatz von 0,5 ml O1I N Salzsäure in jeder Küvette stoppt. Die !Farbe jeder
Küvette wird durch Messung der Absorption in einem Kolorimeter mit Licht der Wellenlänge von 500 Nanometer bestimmt. Der Triglyceridgehalt
der Probe wird dann berechnet, indem man die Absorptionsdifferenz zwischen der Probe und der Kontrollküvette
durch die Absorptionsdifferenz zwischen Standard und Kontrollküvette dividiert und den Quotient mit der bekannten
Triglyceridkonzentration der Triolein-Standardlösung
(200 mg pro 100 ml) multipliziert.
Bei v/eiteren Verfahren erhält man gute Resultate, wenn,
man 1 ml 0,1 N Salzsäure aur Beendigung der Inkubation nach 5 Min. verwendet.
Man verwendet die Kompositionen und die im Beispiel 1 beschriebenen
Methoden zur Bestimmung des Triglyceridgehaltes von menschlichem Serum in 105 Serumproben, welche Triglycerid-Konzentrationen
von 50-510 mg pro 100 ml auf v/eisen. Eine getrennte
Probenserie aus identischem Serum wird nach der Methode von Kessler und Lederer, "Automation in Analytical Chemistry",
S. 341-344, Skeggs, Ed., Mediad, New York (1966) analysiert.
Ein statistische Korrelationsstudie der Resultate zeigt eine ausgezeichnete lineare Korrelation zwischen den Methoden,
wobei der Korrelationskoeffizient 0,9902 und die Standard-Abweichung
10,68 ist.
Man verwendet das Reagenz und die Methode zur Bestimmung der Triglycerid-Konzentration in 5 gleichen Teilen desselben
Serums. Fünf gleiche Proben werden täglich an 4 aufeinander-
509839/0945
folgenden Tagen analysiert. Als Mittel von 20 Bestimmungen
findet man 386 mg pro 100 ml mit einer Präzision von + 2,85 %
(95 % Vertrauensgreiize).
509839/09A5
Claims (3)
- - ίο -Patentansprüche/1.) Reagenz-Komposition für die Bestimmung von Glycerin-Konzentrationen in biologischen Flüssigkeiten, bestehend aus 0,0009-0,074 molaren Mengen einer Magnesiumionen-Quelle, 5-30 Gew.-Teilen (g-Basis) Adenosin-5-triphosphat, 20-125 Gew.-Teile (g-Basis) oxidiertes Nikotinamid-adenin-dinucleotid, 0,5-5 Gew.-Teile (g-Basis) eines farblosen Tetrazolium-Farbstoffs, der in einer Elektronenträger-katalysierten Reaktion mit reduziertem Nikotinamid-adenin-dinucleotid ein gefärbtes Reaktionsprodukt bilden kann, 1000-10.000 Teile (internationale Einheiten) Glycerinkinase, 5000-280.000 Teile (internationale Einheiten) Glycerin-1-phosphat-dehydrogenase und 1600-10.000 Teile (internationale Einheiten) Diaphorase.
- 2. Komposition gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet $ daß sie außerdem 15 Vol.-Teile (Liter-Basis),eines wäßrigen Puffers vom pH 6,8-8*9 enthält.
- 3. Verfahren zur Bestimmung von Glycerin, dadurch gekennzeichnet , daß man eine Glycerin-haltige Flüssigkeitsprobe mit der Reagenz-Komposition gemäß Anspruch 1 und 2 mischt, die erhaltene Mischung 1-20 Min. bei einer Temperatur von 25-4-50O inkubiert und den Glyceringehalt kolorimetrisch bestimmt.509339/0945S *■
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