DE3408502C2 - Verfahren zur Schnellanalyse von mehreren in einem flüssigen System vorhandenen Bestandteilen - Google Patents
Verfahren zur Schnellanalyse von mehreren in einem flüssigen System vorhandenen BestandteilenInfo
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Abstract
Ein neues Verfahren zur Schnellanalyse von mehreren nebeneinander vorliegenden Substanzen in Gegenwart von biologischen Katalysatoren wird beschrieben. Das Verfahren wird mit Hilfe folgender Verfahrensschritte durchgeführt: Einfüllen der zu analysierenden Flüssigkeit und einer pH-Pufferlösung in eine Reaktionszelle, die gegenüber dem Zutritt von Außenluft abgedichtet ist, aufeinanderfolgende Zugabe von mehreren Enzymen, welche die Aufnahme und Reaktion von gelöstem Sauerstoff induzieren, wobei die in dem flüssigen System vorliegenden mehreren Bestandteile nacheinander stufenweise selektiv oxidiert werden, automatische Messung des gelösten Sauerstoffes und Aufzeichnung des Oxidationsverfahrens mit Hilfe eines Sensors, wobei eine stufenweise abfallende Kurve für den gelösten Sauerstoff erhalten wird, quantitative Bestimmung jedes der Bestandteile durch die jeweilige Art des zugesetzten Enzyms und die Reihenfolge ihrer Zugabe, und quantitative Bestimmung jedes Bestandteils aufgrund der Verminderung der Menge des gelösten Sauerstoffes. In typischer Weise wird die Oxidation der Substanzen unter Anwendung von zwei, drei oder auch mehr Stufen durchgeführt. Die Reaktionszelle zur Durchführung des Verfahrens ist mit einem Sensor für gelösten Sauerstoff versehen, der an einer Seitenwand angeordnet ist und der obere Teil der Zelle ist mit Hilfe eines Stopfens, durch den sich eine feine Bohrung erstreckt, die zur Zuführung von Pufferlösung, Probe und Enzymen dient, ...
Description
Cn* = —- x 0,107 (xmol/ml)
«I«
C1MP = ~^-l·- -~ x 0,107 (umol/ml)
du
du
C„,R = i^i^A'- χ 0,107 (xmol/ml)
du
worin das Symbol rf„ die Aufzeichnungsbreite (mm) für das Ausgangssignal für mit Luft gesättigtes Wasser ist
und die Symbole CMx, Γ|Μρ und Chvr die Konzentrationen (umol/ml) von Hx, IMP und HxR bedeuten.
55
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Schnellanalyse von mehreren Bestandteilen und insbesondere ein
Verfahren zur bio-elektrochemischen Analyse von biologischen Substanzen oder Nahrungsmittelsubstanzcn, wie
Aminosäuren, Nukleinsäuren, Sacchariden, Lipiden oder dergleichen, welche in ein und demselben flüssigen
System vorhanden sind.
Als eine typische konventionelle Methode zur analytischen Trennung von Aminosäuren, Nucleinsäuren, Sacchariden,
Lipoiden, Vitaminen oder dergleichen, wurde bisher die chromatographische Methode angewendet.
Diese übliche Methode ist jedoch mit Nachteilen behaftet, die darin bestehen, daß eine lange Zeit crlordcrlich
ist, um die einzelnen Bestandteile voneinander tu trennen und daß zahlreiche Reagcnticn benötigt weiden und
zur Durchführung der Analyse große Geschicklichkeit erforderlich ist. Ein weiterer Nachteil der üblichen
Methode besteht darin, daß die zur Durchführung des Analyseverlahrcns erforderliche Vorrichtung komplizierten
Aufbau hat und ihre Herstellung entsprechend teuer ist.
In den letzten Jahren wurde ein verbessertes Verfahren vorgeschlagen, welches die rasche und selektive
Bestimmung nur eines spezifischen Bestandteils unter zahlreichen weiteren in einfacher Weise mit Hilfe eines
elektrochemischen Sensors, wie einer Sauerstoffelcktrode oder WasserstofTperoxidelektrode, mit biologischen
Katalysatoren, wie Enzymen, bzw. einer biologischen Zelle oder dergleichen ermöglicht (Koteikakoso, Immobilized
Enzymes (1977), herausgegeben von Ichiro Chibata und veröffentlicht von Kodansha Scientific Co., Ltd.).
Es wurde jedoch festgestellt, daß dieses verbesserte Verfahren nicht die gleichzeitige Analyse von mehreren
Bestandteilen ermöglicht
Dies gilt auch fur die aus Cammann, Das Arbeiten mit ionenselektiven Elektroden, 1977, Seiten 98 bis 106
bekanntgewordene Analysenmethode, die sich der Potentiometric, also der Messung eines durch die Konzentration
eines Ions in der Lösung bedingten Potentials an der Berührungsfläche der Probe und Elektrode bedient,
Soweit dort über mit der Amperometrie zusammenhängende Arbeiten referiert wird, erfolgt in einem Durchfluß-verfahren
auch jeweils nur die Bestimmung einer einzigen Komponente mittels eines immobilisierten
Enzyms, wie es weiter oben schon dargelegt ist. Wollte man in Anwendung dieser Methodik mehrere, gleichzeitig
vorhandene Substanzen analysieren, würde dies eine der Zahl der zu prüfenden Substanzen entsprechende
Anzahl von Enzymreaktoren mit nachgeschalteten Meßzellen mit jeweilig wechselnden bzw. optimierten Temperaturen
in dem Durchflußsystem erfordern. Dies mach den praktischen Einsatz unmöglich.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die vorstehend erläuterten Nachteile zu beseitigen und ein
Verfahren zur Verfugung zu stellen, welches die Analyse von mehreren gleichzeitig in einem flüssigen System
vorliegenden Bestandteilen rasch und in einfacher Weise ermöglicht.
(iegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Schnellanalyse von mehreren in einem flüssigen
System vorhandenen Bestandteilen, das -!urch folgende Verfahrensschritte gekennzeichnet ist:
Einfüllen der zu analysierenden Flüssigkeit und einer pH-Pufferlösung in eine Reaktionszelle, die gegenüber dem Zutritt von Außenluft abgedichtet ist,
Einfüllen der zu analysierenden Flüssigkeit und einer pH-Pufferlösung in eine Reaktionszelle, die gegenüber dem Zutritt von Außenluft abgedichtet ist,
aufeinanderfolgende Zugabe von mehreren biologischen Katalysatoren, weiche in Form einer Enzymverteilung
vorliegen sowie die Aufnahme und Reaktion von gelöstem Sauerstoff induzieren, wobei die in dem flüssigen
System vorliegenden mehreren Bestandteile nacheinander stufenweise selektiv oxidiert werden,
automatische Messung des gelösten Sauerstoffs und Aufzeichnung des Oxidationsverfahrens mit Hilfe nur eines Sensors, der aufgelösten Sauerstoff anspricht (DO-Sensor), wobei eine stufenweise abfallende Kurve für den gelösten Sauerstoff erhalten wird,
automatische Messung des gelösten Sauerstoffs und Aufzeichnung des Oxidationsverfahrens mit Hilfe nur eines Sensors, der aufgelösten Sauerstoff anspricht (DO-Sensor), wobei eine stufenweise abfallende Kurve für den gelösten Sauerstoff erhalten wird,
qualitative Bestimmung jedes der Bestandteile durch die Art des zugesetzten biologischen Katalysators und die
Reihenfolge der Zugabe der biologischen Katalysatoren und
quantitative absatzweise Bestimmung jedes Bestandteils aufgrund der Verminderung der Menge des gelösten
Sauerstoffs.
Um zu gewährleisten, daß das erfindungsgemäße Verfahren in zufriedenstellender Weise durchgeführt werden
kann, ist es notwendig, eine Vorrichtung vorzusehen, welche die kontinuierliche Messung von gelöstem
Sauerstoff und die Aufzeichnung des erhaltenen Meßwertes ermöglicht. Als Sensor, der für diese Vorrichtung
erforderlich ist, können übliche aufgelösten Sauerstoff ansprechende Sensoren (DO-Sensoren) angewindet
werden, wie eine polarographische Membran-überzogene Sauerstoffelektrode, eine sogenannte Clark-Elektrode,
cir; Elektrode für gelösten Sauerstoff vom Typ einer galvanischen Zelle, eine Sauerstoflelektrode auf
Basis des SauerstofTdruckausgleichs, die kürzlich von Conrsry entwickelt wurde, oder ähnliche Sensoren.
Es ist darüber hinaus notwendig, daß eine Reaktionszeit vorgesehen wird, in der nur ein Sensor für gelösten
f SaucrstofTangeordnet oder befestigt ist, mit dessen Hilfe jede Änderung der Konzentration an gelöstem Sauer-
f stoll in der Reaktionsflüssigkeit exakt gemessen werden kann, ohne daß Sauerstoff von außen zutreten kann, und
in die Rcagcntien, Katalysatoren und andere Materialien, wie sie zur Kontrolle der Reaktion erforderlich sind,
zugeführt werden können.
Andere Gegenstände, Merkmale und Vorteile der Erfindung sind aus der nachstehenden Beschreibung in Verbindung
mit den beigefügten Zeichnungen deutlicher ersichtlich.
Nachstehend sollen die beigefügten Zeichnungen kurz beschrieben werden.
Nachstehend sollen die beigefügten Zeichnungen kurz beschrieben werden.
I"ig. I ist eine scheicatische Schnittdarstellung einer Reaktionszelle zur Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens; l-ig. 2 zeigt eine stufenweise abfallende Kurve für den gelösten Sauerstoff, die während der Analyse von Xanthin
;X) und Hypoxartthin (Hx) ausgebildet wird;
j I' i g. 3 zeigt die Kurve, welche den Zusammenhang zwischen dem Verhältnis von Xanthin- und Hypoxanthin-
Konzentration und dem Verhältnis der Verminderung Id1Zd2) des Ausgangssjsoms wiedergibt, die bei drroxtda-
ϊ' tivcn Reaktion in zwei Stufen mit Hilfe von Xanthinoxidase und Uricase erhalten wird, und
Fig. 4 ist eine stufenweise abfallende Kurve für den gelösten Sauerstoff während einer oxidativen Reaktion,
die aus drei Stufen besteht, während dsr Analyse einer Mischflüssigkeit, die Inosinsäure, Jnosin und Hypoxan-
£ thin enthalt.
Fig. 5 ist eine graphische Darstellung, welche eine stufenweise abfallende Kurve von gelöstem Sauerstoff
»}.; während der oxidativen Reaktion einer Probe gemäß Beispiel 3 zeigt.
i' Fig. 6 ist eine graphische Darstellung, welche die Beziehung zwischen der Abnahme von gelöstem Sauerstoff
iü (DO) und der Injektion einer Probe gemäß Beispiel 3 zeigt und die zur Kalibrierung der Bestimmung von Ethyl-
V; alkohol und Glutaminsäure geeignet ist.
·.■ Fig. 7 ist eine graphische Darstellung, welche die stufenweis abfallende Kurve von gelöstem Sauerstoff während
der oxidativen Reaktion bei einer Probe gemäß 3eispiel 4 zeigt.
Fig. 8 ist eine graphische Darstellung, welche die Beziehung zwischen der Abnahme an gelöstem Sauerstoff
: und der Injektion einer Probe gemäß Beispiel 4 zeigt und die zur Kalibrierung der Bestimmung von Glucose und
Glutaminsäure geeignet ist.
Fig. 9 ist eine graphische Darstellung, welche eine stufenweise abfallende Kurve von gelöstem SiiucrsiolT
während der oxidativen Reaktion bei einer Probe gemäß Beispiel 5 zeigt.
Fig. 10 ist eine graphische Darstellung, welche die Beziehung zwischen der Abnahme von gelöstem Sauerstoff und der Injektion einer Probe gemäß Beispiel 5 zeigt und die zur Kalibrierung der Bestimmung von Inosinsäure und Glutaminsäure geeignet ist. -
während der oxidativen Reaktion einer Probe gemäß Beispiel 6 zeigt. ;■:,;
während der oxidativen Reaktion einer Probe gemäß Beispiel 7 zeigt. ;';
to Fig. 13 ist eine graphische Darstellung, welche die stufenweise abfallende Kurve von gelöstem SauerstolT ''·
während der oxidativen Reaktion einer Probe von Beispiel 8 zeigt. ·
Stoffs und der Injektion einer Probe gemäß Beispiel 8 zeigt und die zur Kalibrierung der Bestimmung von Ascorbinsäure und Glucose geeignet ist. ,
Zum besseren Verständnis der Erfindung werden nachstehend bevorzugte Ausführungsformcn im Zusum- \
menhang mit den beigefügten Zeichnungen erläutert. I
Fig. 1 veranschaulicht schematisch ein Beispiel für eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemä- I
Ben Verfahrens. Diese Vorrichtung umfaßt eine Reaktionszelle 1 mit einem Fassungsvermögen von etwa 2 ml
mil einem Sensor 2 für gelösten Sauerstoff {nachstehend einfach s.'s DG-Senscr bezeichnet), der fest an einer 5
Seitenwand dieser Reaktionszelle 1 angebracht ist. Der obere Teil der Reaktionszelle 1 ist luftdicht mit einem
Stopfen 4 verschlossen, durch den sich eine feine Bohrung 3 erstreckt, so daß der Zutritt von Luftsaucrstoll' von
außen in die Reaktionszelle 1 verhindert wird. Ein gewünschtes Volumen eines Mittels zum Regeln der Reaktion
kann daher durch diese feine Bohrung 3 mit Hilfe einer Mikroinjektionsspritze oder einer ähnlichen Vorrichtung
in die Reaktionszelle 1 eingefüllt werden. Die Reaktionstemperatur wird durch Leiten von Wasser 6 durch den
Mantel 5 geregelt und bei konstanter Temperatur gehalten und die Reaktionsfiüssigkeit wird mit Hilfe eines
Magnetrührers 7 gut gemischt und gerührt. Die Erfindung ist selbstverständlich nicht auf die Anwendung der
beschriebenen spezifischen Reaktionsvorrichtung beschränkt und es ist ersichtlich, daß diese Vorrichtung in
jeder beliebigen geeigneten Weise verändert oder modifiziert we .Jen karn. :■,
Als biologischer Katalysator für das erfindungsgemäße Verfahren eignen sich Hydrolasen, wie Invcrtasu,
Amylase oder dergleichen, und Oxidasen, wie Glucoseoxidase (nachstehend als GOD bezeichnet) oder dergleichen für die Analyse von Sacchariden. Proteasen, Peptidasen und Aminosäureoxidasen sind zur Analyse von j'
Proteinen und Aminosäuren geeignet und Cholesterinesterase und Cholesterinoxidase zur Analyse von Cholc- ';'
sterin verwendbar. Außerdem eignen sich Nukleotidase, Nukleosidphosphorylase, Xanthinoxidasc oder dergleichen zur Bestimmung von Nukleinsäuren bzw. verwandten Substanzen, beispielsweise Inosinsäurc, die
durch Zersetzung von Adenosintriphosphat gebildet wird.
Es ist festzuhalten, daß eine Dehydrogenase, bei der keine Sauerstoffaufnahmereaktion eintritt, beispielsweise Milehsäuredehydmgenase. Alknholdehydrogenase oder dergleichen, zur analytischen Bestimmung von .
Milchsäure, Alkohol oder dergleichen in Gegenwart eines Coenzyms und einer Hilfssubstanz, wie Phenazinmethasulfat oder dergleichen, die als Wasserstoffübertragungsmtttel dienen, anwendbar ist. In einigen Fällen kann
die biologische Zelle für die oben genannten Zwecke anwendbar sein.
Verfahren zur Analyse von mehreren nebeneinander vorliegenden Bestandteilen mit höchster Wirksamkeit
nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können in verschiedenerweise durchgeführt werden. Als vorbereiten- ;'■'
de Stufe vor der Durchführung des Analyseverfahrens ist es empfehlenswert, daß die Reaktions-Charaktcristika, ΐ
die einer einzigen Substanz unter diesen Bestandteilen zukommen, vorher unter Bezugnahme auf eine
Standardprobe geprüft werden, vorausgesetzt, daß die Existenz dieser Substanz bekannt ist. So werden beispielsweise die Bedingungen, unter denen eine gewünschte Oxidationsreaktion rasch abläuft, im Vergleich mit
der Neigung der Sauerstoffaufnahmekurve bestätigt, während die Menge des Enzyms, der pH-Wert der Rcak- ,
tionslösung, die Zusammensetzung der Pufferlösung, die Temperatur und andere Parameter variiert werden. !.■
zugehörige Biokatalysator unter den nacheinander für verschiedene Substanzen, deren Vorliegen erwartet wird, .·
zugesetzten für öas Eintreten eines Sauerstoff-Verbrauches verantwortlich ist, wobei während dieser Bestimmung gleichzeitig beobachtet wird, ob die Kurve für die SauerstoiTaufnahme weiter abfallt oder nicht. ί
Da das Ausmaß der Verminderung des Ausgangssignals, welches durch Messung an zwei verschiedenen Zeit- |
werten erhalten wird, der Konzentration einer Substanz entspricht, welche auf die Funktion des zugesetzten |.
Katalysators anspricht, wobei einer dieser Zeitwerte sich vor der Zugabe dieses Katalysators und der andere sich f
an der Stelle befindet, an der die Sauerstofläufnahmereaktion (aufgrund der Reduktion von gelöstem SauerstolT) j
ihr Ende erreicht, können sowohl die quantitative, als auch die qualitative Analyse gleichzeitig durchgeführt 1
werden. ?l Es ist festzuhalten, daß das Ausmaß der Verminderung des Ausgangssignals in den Wert des gelösten Sauer- f
stoffes umgerechnet werden kann, indem die Sauerstofflöslichkeit bei der Meßtemperatur mit Hilfe einer J:
Tabelle festgestellt wird (beispielsweise nach dem Abschnitt »gelöster Sauerstoff« in »Prüfmethode für Indu- |
striewasser (JIS K 0101)« und »Prüfmethode für Abwasser (JIS K 0102)«, nachdem eine bestimmte, mit Luft |r
gesättigte Pufferlösung in die Reaktionszelle eingefüllt worden ist und das Ausgangssignal des Sensors gemcs- 6
sen wurde. Somit kann die Menge des Sauerstoffverbrauches, bezogen auf die Einheitsmenge einer Standard- JJ
probe, erhalten werden, indem die bekannte Konzentration der Standardprobe mitdem Wert der Verminderung §
des gelösten Sauerstoffes verglichen wird. Es ist daher möglich, die Konzentration der Substanz unmittelbar aus P.
der Menge des verbrauchten Sauerstoffes zu errechnen, ohne daß eine Standardlösung angewendet werden f-
Is ist /u bemerken, cSuU Substanzen, für die keine Verminderung der Konzentration an gelöstem Sauerstoff
l'csl/uslcllcn ist, beispielsweise Saccharose, nicht der Einwirkung von Glucoscoxidasc unterliegt, wenn nicht
eine vorhergehende Reaktion durchgeführt wird. Es wird daher eine solche vorhergehende Reaktion ausgewählt,
in der Invertase, die eine I lydrolasc darstellt, die Saccharose in die reaktive Verbindung Glucose umwandelt,
welche dann oxidiert werden kann.
Danach wird die Lösung des Reaktionsgemisches aus Glucose und Saccharose mit Enzymen gemäß der Reihenfolge
Glucoseoxidase -► Invertase versetzt, wobei eine stufenweise abfallende Kurve des gelösten Sauerstoffes
erhallen wird, die zwei Stufen aufweist.
Die Konzentration an Glucose kann daher aus dem Abfall über die erste Stufe hinweg erhallen werden, während
die Konzentration an Saccharose «us dem Abfall über die zweite Stufe erhalten wird. Die vorstehend
beschriebene vorhergehende Reaktion kann unter Anwendung von zwei Stufen oder drei Stufen oder auch von
mehr Stufen entsprechend dem Erfordernis durchgeführt werden, wobei Hydrolase, Transferenzym (Transferase)
oder dergleichen angewendet wird.
!■ür die vorhergehende Reaktion kann darüber hinaus eine Vielzahl von Oxidasen angewendet werden. Durch
eine geeignete Kombination der vorstehend beschriebenen Reaktionen wird daher ermöglicht, zahlreiche Sub- is
stanzen qualitativ und quantitativ zu bestimmen.
Die Erfindung wird nachstehend ausführlicher anhand einiger Beispiele beschrieben.
Analyse einer Mischlösung aus Hypoxanthin (nachstehend als Hx bezeichnet) und Xanthin (nachstehend
auch als X bezeichnet)
1. Grundlegene Reaktionen für die Analyse
25 O O
[I]
XO
' N N H2O + O2 H2O2 U H H
Hx X
(Hypoxanthin) (Xanthin)
[III] " °
XO . HN Y \ n
UO
-<i
O ' ♦ NO
M2O + O2 H2O2 U H H 2H2O + O2 H2O2 +CO2 H H
(Harnsäure) (Allantoin)
In den vorstehenden Reaktionen bedeutet das Symbol XO Xanthinoxidase und das Symbol UO Uricase.
2. Angewendete Vorrichtung und Materialien
(1) DO-Sensor:
Clark-Elektrode mit einer Platinkathode mit einem Durchmesser von 3 mm, überzogen mit einem FEP*-
F-IIm einer Dicke von 0,025 mm (1/1000 Inch) (Produkt der Oriental Electric Co., Ltd.). V/enn der Sensor in
Betrieb ist, wird Gleichstrom von 0,7 Volt angelegt.
(2) Aufzeichnungsvorrichtung:
Hergestellt von Shimazu Manufacturing Co., Ltd. Die Vorrichtung hat eine vollständige Skala entsprechcnd
100 mV und ist fur den Betrieb bei einer Aufzeichnungsgeschwindigkeit von 1 cm/min bestimmt.
(3) Reaktionszeit:
Fassungsvermögen 2000 al, wird bei konstanter Temperatur von 37°C gehalten.
*) ( Pcrfluorcthylenpropylen-Copolymer)
(4) Enzym:
XO wurde in einer Menge von 0,4 I. E./ml in Form einer 3,2 m Ammoniumsulfatsuspension angewendet
(hergestellt von Boehringer AG, Mannheim). Außerdem wurde UO in einer Menge von 0,41 I. l;../ml in
Form einer 50 niM Borsäure-Pufferlösung eingesetzt (hergestellt von Oriental Yeast Co., Ltd.)
(5) Pufferlösung:
Hergestellt in Form einer 1/15 m Phosphatpufferlösung (pH 7,6), die mit Luft bei einer Temperatur von
ίο 37°C gesättigt war (P. B. S.). Sie hatte eine Konzentration an gelöstem Sauerstoff von 0,214 uMol/ml (bei
einer Temperatur von 37°C).
(6) Zu prüfende Flüssigkeit:
X: 10:xMol(l,52mg)/ml
Hx, X: Mischlösung aus beiden Substanzen
3. Verfahren (vgl. Fig. 2 und 3)
20
Ein Volumen von beträchtlich mehr als 2000 ul der Phosphatpufferlösung (P. B. S.) wurde in die in F i g. 1 veranschaulichte Reaktionszelle eingefüllt und die Zelle mit einem Stopfen verschlossen. Die Lösung wurde bis zu
einer solchen Höhe eingefüllt, daß ein Teil der Lösung bis zu dem unteren Ende der feinen Bohrung 3 hochstieg.
Dann wurde die zu prüfende, X und Hx enthaltende Flüssigkeit (ein Volumen von 5 μΙ bzw. 10 μ|) in eine Mikroinjektionsspritze gefüllt und unter Rühren durch die feine Bohrung 3 in die Reaktionszelle eingespritzt. Danach
wurde XO in einer Menge von 20 ·Δ in die Reaktionszelle eingespritzt und alsdann nachdem durch Beobachtung
des Ausgangssignals des DO-Sensors, bezeichnet mit Bezugszeichen d\ in Fig. 2 bestätigt worden war, daß die
Verminderung des Ausgangssignals des Sensors ein Ende erreichte, wurde UO in einer Menge von 20 μΙ sofort
ί zugesetzt, wobei eine aus zwei Stufen bestehende, stufenweise abfallende Kurve für den gelösten Sauerstoff
erhalten wurde, wie sie in Fig. 2 dargestellt ist.
Fig. 3 veranschaulicht schematisch den Zusammenhang zwischen der Zusammensetzung einer Einheit der
Flüssigkeit zu der Mischlösung und dem Verhältnis des Abfalls, d\ld2. Wie aus der Zeichnung ersichtlich ist,
besteht eine lineare Abhängigkeit des Abfalls-Verhältnisses ά\Ιά, von dem Mischungsverhältnis der Bestandteile in der Mischlösung, da die charakteristische Kurve sich linear durch zwei Punkte erstreckt, wobei einer dicser Punkte dem Wert d\ld2 = 1, erhalten mit 100% X, und der andere dem Wert </,/</>
= 2, erhalten mit 100% 1 Ix entspricht.
Bei der Prüfung des Zusammenhangs zwischen der Verminderung des Werts an gelöstem Sauerstoff und der
Konzentration des Substrats wurde gefunden, daß das Volumen an Sauerstoff O2, angegeben in Mol, das durch
die Zugabe von UO adsorbiert wurde, dem gleichen Wert der Konzentration des Substrats im Hinblick auf X
oder auf Hx entsprach.
Substrats in -iMoUrni
absorbierten
. „ ... in Mol/ml
der Reaktion
X 0,05 0,054
Hx 0,25 0,028
Die molare Konzentration von (Hx + X) ist daher aus dem Wert A der Mischlösung aus X und Hx erhältlich
und ihr Volumenverhältnis ist darüber hinaus unter Bezugnahme auf Fi g. 3 erhältlich. Im Ergebnis kann die
Konzentration jeder der Substanzen bestimmt werden.
Jede der vorstehenden Substanzen ist ein Stoffwechsel-Zwischenprodukt, das im Körper von Säugetieren und
Menschen nach der Zersetzung von Adenosintri phosphat in Form von Harnsäure ausgeschieden wird. Die Aufstellung einer Methode zur Trennung und quantitativen Bestimmung dieser Substanzen liefert daher einen
wichtigen Beitrag für die biochemische Industrie, Nahrungsmittelindustrie und verwandte Industrien. Wie gut
bekannt ist, kann mit Hilfe der bisher üblichen Methoden, einschließlich der chromatographischen Methode
und der üblichen enzymatischen Methode (die normalerweise durch optische Erfassung und Bestimmung
durchgeführt wird) ihre fraktionierte quantitative Bestinrtnung nur mit großen Schwierigkeiten bewerkstelligt
werden. Wie aus F ig. 2 klar ersichtlich ist, wird es jedoch mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglicht, jede dieser Substanzen mit hoher Genauigkeit innerhalb kurzer Dauer von weniger als 5 Minuten quantitativ zu-bestimmen, ohne daß eine Standardflüssigkeit erforderlich ist.
Baispiel 2
Quantitative Bestimmung der durch Zersetzung von Adenosintriphosphat erhaltenen Substanzen.
In diesem Beispiel wird die fraktionierte quantitative Bestimmung von Inosinsäure (nachstehend als IMP
bezeichnet), Inosin (nachstehend als HxR bezeichnet) und Hypoxanthin (nachstehend als Hx 'iezoiclinet) 5
beschrieben.
I. Grundlcgcne Reaktionen für die Analyse OO 10
N AN
-* Hx
20
1 M
O2' Ti3O2
>UA (2)
H2O2 O2 Ti1O2 2S
darin bedeuten die Bezugszeichen
AP Alkaliphosphatase, 30
;;; NP Nuclcosidphosphorylase,
% UA. Harnsäure,
ι Rib Ribose, und
-;'■ Pi anorganisches Phosphat.
35 2. Angewendete Vorrichtung und Materialien
1I) DO-Sensor
(2) Aulzeichnungsvorrichtung (Recorder)
(3) Reaktionszeit -to
In diesem Beispiel werden die gleichen Vorrichtungen (1) bis (3) wie in Beispiel 1 unter den gleichen Betriebsbedingungen
eingesetzt.
(4) Enzym 45
AP wurde in Form einer 3,2 m Ammoniumsulfat-Suspension zubereitet und in einer Menge von 65 I. E./ml
(bei einer Temperatur von 37° C) angewendet.
NP wurde in Form einer 3,2 m Ammoniumsulfat-Suspension gebracht und in einer Rate von 20 I. E./ml (bei
NP wurde in Form einer 3,2 m Ammoniumsulfat-Suspension gebracht und in einer Rate von 20 I. E./ml (bei
einer Temperatur von 25° C) angewendet. 50
XO wurde in Form einer 3,2 m Ammoniumsulfat-Suspension zubereitet und in einer Menge von 0,4 I. E./ml
angewendet.
Jedes der vorstehend genannten Enzyme wurde in Form eines Produkts der Boehringer Mannheim AG eingesetzt.
55
(5) Pufferlösung
Als Flüssigkeit A wurde eine 1/15 m Glycin-NaOH-Pufferlösung mit einem pH von 10,5 hergestellt. Außerdem
wurden 2 ;J einerO,! m ZnClrL6sung und 2 μΐ einerO,l m MgClrLösung in2 ml der vorstehend genann- 60
(cn Flüssigkeit A gegeben.
Als Flüssigkeit B wurde eine 1/15 m Phosphatpufferlösung in gleicherweise wie in dem vorhergehenden Beispiel
hergestellt,
(6) Zu prüfende Flüssigkeit 65
liin Volumen von 4 :J einer Mischlösung (10 μΜοΙ/ml), die IMP, HxR und Hx in Form eines Gemisches gleicher
Volumteile enthielt, wurde zur Durchführung dieses Versuches verwendet.
3. Verfahrensschritte (vgL Fig. 4)
Das Verfahren kann unter Einhaltung verschiedener Verfahrensschritte durchgeführt werden. Anhand des
nachstehenden Fließschemas wird eine typische einfache Verfahrensweise beschrieben, die unter Anwendung
einer möglichst geringen Menge an Enzym durchgeführt wird.
zu prüfende Flüssigkeit 4 μΐ
Flüssigkeit A 19 al
AP l'yl
I
I
J
γ
j Einspritzen von 8 uJ NP (Messung von A)}
j Eingießen von 4
·Α
der zu prüfenden Flüssigkeit (Messung von
d3)\
4. Errechnung der Konzentration |
M
C11,= -S- χ 0,107 (μΜοΙ/ml) (3) I
C|Mp = iS ll χ 0,107 (uMol/ml) (4) I
l
Darin bedeuten das Symbol d0 die Aufzeichnungsbreite (mm), die dem Ausgangssignal für mit Luft gesättigtes Wasser entspricht, und die Symbole Cn,, CIMP und CUxR die entsprechenden Konzentrationen (μΜοΙ/ml)
von Hx, IMP und HxR.
Das Prinzip, nach dem die Konzentration jeder der Substanzen durch die vorstehend angegebenen Berechnungen erhalten werden kann, ist für den Fachmann auf diesem Gebiet aufgrund der Reaktionsformel (2) leicht
verständlich. Im Hinbück auf die Tatsache, daß jede der Substanzen Sauerstoff O2 in einer Menge von 2 Mol pro
1 MoI der ersteren absorbiert, wurde ein Koeffizient von 0,214/2 = 0,107 für die Berechnungen angewendet. Da
IMP und HxR in Gegenwart von XO Sauerstoff nicht absorbieren, ist ersichtlich, daß C(U mit Hilfe von Gleichung (3) erhalten werden kann. Danach kann aufgrund der Reaktion entsprechend dem Wert d7 Cimv , IUK|
erhalten werden, weil Hx durch Zugabe von XO beseitigt worden ist. Daraus ergibt sich, daß (d, + d2) der MoI-
SO zahl aller Substanzen entspricht. Was die d3 entsprechende Reaktion betrifft, ist die anfänglich zugesetzte Substanz verschwunden und da der pH neutral ist, kann AP seine Aktivität nicht ausüben. Daher können alle Substanzen mit Ausnahme von IMP nachgewiesen werden. Die Konzentration von IMP kann daher mit Hilfe von
Gleichung (4) aus der Differenz zwischen (dt + d2) und </, erhalten werden. Für die Berechnung von C,[xR ist
somit keine spezielle Beschreibung erforderlich.
Quantitative Bestimmung von Glucose und Ethylalkohol in ihrer Mischlösung
1) Reaktionsprinzip für die Analyse
>D-Glucose + H2O + O, >D-Gluconat + H2O2 (5)
GOD: Glucoseoxidase
ALOD: Alkoholoxidase
2) Verwendete Vorrichtungen und Materialien
(1) DO-Sensor
(2) Aufzeichnungsvorrichtung (Recorder)
(3) Reaktionszeit
Es wurden die gleichen Vorrichtungen (1) und (2) wie in den vorhergehenden Beispielen eingesetzt. Die Vorrichtung
(3) hatte jedoch ein Zellvolumen von 1080 al.
(4) Enzym
GOD wurde in Form eines weißen gefriergetrockneten Produkts eingesetzt, das durch Extraktion und Reinigung
aus Aspergillus nigerTyp II erhalten worden war (hergestellt von SIGMA Corporation). Das Enzym hatte
eine Aktivität von 33 Einheiten (U)/mg in mit Luft gesättigter Lösung. Die verwendete Enzymlösung wurde
durch Auflösen von 5 mg des pulverförmigen Enzyms in 1 ml 0,1 m Phosphatpufferlösung hergestellt. Die so
erhaltene Enzymlösung hatte eine Aktivität von 175 U/ml.
ALOD wurde in Form eines gelben gefriergetrockneten Produkts, das aus einem Mikroorganismus erhalten
worden war (Produkt der TOYO JOZO Co., Ltd.), eingesetzt und hatte eine Aktivität von 12 U/mg. Die vtrwendete
Enzymlösung wurde durch Auflösen von 35 mg des pulverformigen Enzyms in 1 ml 0,1 m Phosphatpuflerlösung
hergestellt Diese Lösung hatte eine Aktivität von 420 U/ml (12 x 35).
(5) Grundmedium für die Bestimmung
Dieses wurde in Form einer 0,1 m Phosphatpuflerlösung (pH 7,6), mit Luft gesättigt bei einer Temperatur von
37°C eingesetzt
(6) Zu prüfende Flüssigkeit A. Herstellung der Glucoselösung
Eine 2,5 mM Glucoselösung wurde durch Lösen von 450 mg wasserfreier Glucose (Reagenzgrad, Produkt der
Kokusan Chemicals Co., Ltd.) in destilliertem Wasser und Auffüllen auf 100 ml hergestellt.
B. Herstellung der Lösung von Ethanol (ElOH)
Eine 19 mM Ethylalkohollösung wurde hergestellt, indem 290 al Ethylalkohol (Reagenzgrad, Alkoholgehalt
99,5%, Dichte 0,79, Produkt der Kokusan Chemicals Co., Ltd.) auf 250 ml verdünnt wurden.
C. Herstellung der Mischlösung
JcI ml der Lösungen A und B wurden auf 10 ml aufgefüllt und dann miteinander vermischt. Die beiden Komponenten
in der so gebildeten Mischlösung hatten daher folgende Konzentrationen:
Glucose: 25 mM x 1/10 = 2,5 mM
IUOH: 19 mM X 1/10 = 1,9 mM
3) Verfahren
(1) Eine BOD-Flasche (Belüftungsflasche) mit einem Fassungsvermögen von 100 ml, die mit dem Grundmedium
oder 0,1 m PhosphatpufTerlösung beschickt war, wurde in einen bei 37° C gehaltenen Thermostaten so
gestellt und Luft wurde 5 bis 10 Minuten mit Hilfe einer Luftpumpe in die Flasche eingeleitet, um das Grundmedium
mit Sauerstoff zu sättigen.
(2) Bei einer konstanten Temperatur von 37°C gehaltenes Wasser wurde durch den Mantel 6 der in Fig. 1
gezeigten Reaktionszelle geleitet, um die Temperatur der Reaktionszelle konstant zu halten. Dann wurde der
Stopfen 4 entfernt und das Grundmedium in einer Menge (etwa 1,2 ml) in die Reaktionszelle eingespritzt, die
ausreichte, daß die Flüssigkeitsoberfläche des Grundmediums den unteren Teil der feinen Bohrung 3 erreichte.
Dann wurde der Stopfen 4 sorgfältig eingefügt, so daß keine Luftblase in der Reaktionszelle verblieb.
(3) Der Ausgangswert, der sich aus dem DO-Reduktionsstrom des DO-Se nsors (2) ergab, wurde auf dem Registrierstreifen
der Aufzeichnungsvorrichtung aufgezeichnet, während der Magnetrührer 7 betrieben wurde. Der
Abstand du zwischen dem Anzeigepunkt und dem DO-Nullpunkt auf dem Registrierstreifen entsprach der O2-Konzentration
von 0,214 μΜοΙ/ml (oder 214 amolar).
Der DO-Nullpunkt fällt im wesentlichen mit dem elektrischen Nullpunkt der Aufzeichnungsvorrichtung zusammen.
Der DO-Nullpunkt kann genau festgestellt werden, indem etwa 100 al einer 0,5 molaren wäßrigen
Niitriumsullitlösung zu dem Grundmedium gegeben werden, um die DO-Aufnahme zu vervollständigen. Es ist
erwünscht, die Bestätigung von d0 mit Hilfe von Na7SO4 in der Anfangsstufe der Bestimmung und nach Beendigung
der Bestimmung vorzunehmen und den Durchschnittswert daraus zu verwenden.
(4) Eine Mikroinjektionsspritze wurde durch die feine Bohrung3 des Stopfens 4 der in Fig. 1 gezeigten Reaklions/ullc
eingeführt, um 20 il ALOD in das Grundmedium einzuspritzen.
(5) Die zu prüfende Flüssigkeit, welche die vorher angegebenen Mengen an Glucose und Ethylalkohol enthielt, wurde mit Hilfe einer weiteren Mikroinjektionsspritze in das Grundmedium gegeben, während die DO-Aufzeichnung fortgesetzt wurde. Um eine Eichkurve herzustellen, wurde die zu prüfende Flüssigkeit S1 in Mengen von 5 μΐ, 10 ;xl und 20 μΐ zugegeben.
(6) Aufgrund der Zugabe von S1 begann an dem durch S, bezeichneten Punkt in F i g. 5 die Aufzeichnung einer
Verminderung des DO. Der Grand dafür war die Sauerstoffaufhahme oder Absorption durch das Grundmedium
in der Reaktionszelle, die mit dem Fortschreiten der Oxidationsreaktion verursacht wurde, oder die O3-AuI-nahme durch die Reaktion von Ethylalkohol entsprechend der vorher beschriebenen Reaktionsformel (6). Diese
Oj-verbrauchende Reaktion war in etwa 2 Minuten beendet Die Differenz (</,) zwischen dem vor der Zugabe
von S1 und dem nach der Beendigung der Reaktion bestimmten DO-Wert gibt den Grad der SauerstofTaufna-ime
von EtOH in der zu prüfenden Flüssigkeit, die in das Grandmedium eingespritzt worden war, an. Fig. 6 zeigt
den Zusammenhang zwischen der Menge oder dem Volumen der zugegebenen zu prüfenden Flüssigkeit und
der stufenweisen DO-Verminderung (dt).
Aus der Tatsache, daß dieser Zusammenhang eine durch den Nullpunkt verlaufende gerade Linie bildet, ist
ersichtlich, daß die Konzentration von EtOH aus dem Volumen des absorbierten oder verbrauchten O2
bestimmt werden kann.
20 25 30
und dem Volumen des verbrauchten Sauerstoffes
Volumen der | Konzentration | DO-Abfall | absorbiertes |
in die Reak | an EtOH | Ld1) | Oi-Volumen |
tionszelle | während der | ||
eingespritzten | Reaktion | ||
Prot? | |||
M) | (ymol/I) | (mm) | (ymol/l) |
5 | 8,75 | 8 | 8,6 |
10 | 17,6 | 13 | 13,9 |
20 | 35,1 | 31 | 33,3 |
35 40 45
Wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist, beträgt das Molverhältnis von EtOH in der Reaktionszelle zu dem absorbierten Sauerstoff etwa 1:1. Die EtOH-Konzentration kann daher ohne Verwendung der Eichkurve aus dem Volumen des absorbierten Sauerstoffes errechnet werden.
(7) Die GOD-Lösung der vorstehend beschriebenen Zusammensetzung wurde dann in das Grundmedium
eingespritzt. Aufgrand der O2-Aufnahmereaktion durch Glucose gemäß der vorstehenden Retirtionsformcl (5)
wurde wieder eine Verminderung des DO verursacht. Die Reaktion war in etwa 4 bis 6 Minuten beendet.
Obwohl die molare Konzentration an absorbiertem Sauerstoff, die aus dem DO-Abfall erhalten wurde, im Vergleich mit der molaren Konzentration der Glucose etwas gering war, konnte die Glucosekonzentration aus einer
in Fig. 6 gezeigten Eichkurve erhalten werden.
50 55 60
und dem Sauerstoffverbrau<;h
Volumen der | Konzentration | DO-Abfall | absorbiertes |
in die Reak- | an Glucose | (</:) | Oj-Volumcn |
üonszellc | wahrend der | ||
eingespritzten | Reaktion | ||
Probe | |||
dl) | (:unol/l) | (mm) | (■unol/1) |
5 | 11,5 | 10 | 10,8 |
10 | 23,1 | 15 | 16,1 |
20 | 46,2 | 34 | 36,6 |
65
V Beispiel 4
: deren Mischlösung
%: 5
:■;. I) Reaktionsprinzip der Analyse
; >D-Glucose + H2O + O2 >jS-B-Gluconat + H2O2 (5)
·; (Die Reaktion ist die gleiche wie in Beispiel 3)
^ L-GIutamat + O2 + H2O * ar-Ketoglutarat + H2O2 + NH3 (7) 15
%
2) Verwendete Vorrichtungen und Materialien 2ü
I
(I) DO-Sensor
f (3) Rcaklionszelle
I
25
(4) Enzym
Die gleiche GOD wie in Beispiel 3 wurde verwendet. Als GLOD wurde ein Produkt der Research Laboratories, Yamasa Shoyu Co., Ltd. verwendet. Dieses war a;is einer wäßrigen Extraktlösung einer Weizenkleiekultur
von Strcptomyces sp. X-119-6 in Form eines halbgereinigten Produkts erhalten worden, das eine Aktivität von
100 U/ml hatte.
(5) Grundmedium für die Bestimmung
Das gleiche Grundmedium wie in Beispiel 3, d. h. eine 0,1 m PhosphatpulTerlösung, gesättigt mit Luft 6ei
einer Temoeratur von 37° C, wurde verwendet. 40
(ei) Zu prüfende Flüssigkeit A. Herstellung von Glucoselösung 45
Die gleiche Glucoselösung wie in Beispiel 3, die Glucose in einer 2,5 mmolaren Konzentration enthielt, wurde
hergestellt.
50 B. Herstellung von Mononatriumglutamat
0,468 g Mononatriumglutamat-monohydrat (HOOCH · (NH2)CH2CH2COONa · H2O) des Reagenzgrads mit
einem Molekulargewicht von 187 (Produkt der Wako Chemicals <Jo., Ltd.) wurde mit Hilfe von 0,1 molarer PhosphatpulTerlösung auf 100 ml aufgefüllt, wobei eine 25 mM-Lösung erhalten wurde. 55
Jeweils 1 ml der Lösungen A und B wurden mit 0,1 m Phosphatpufferlösung auf 10 ml aufgefüllt und ver- 60
mischt. Die Konzentration jedes der Bestandteile Glucose und Natriumglutamat in der erhaltenen Mischlösung
entsprach 2,5 mM/l.
3) Verfahren (vgl. Fig. 7 und 8) 65
Einspritzen der Probelösung Si (i>
bis 20 Ά)
fc,
Messung von d,
i)
4) Ergebnisse ■'
's Ϊ
säure) und dem absorbierten SauerstofTvolumen Ϊ
Die aufgefundene Menge fur Glucose und Glutamat, die aus dem Volumen des absorbierten SaucrstolTcs
erhalten wurde, war im Vergleich mit dem theoretischen Wert von 2,5 mMol relativ niedrig. Es besteht jedoch
35 ein linearer Zusammenhang zwischen der zugesetzten Menge und </, und <A, wie in F i g. 8 gezeigt ist. Die Konzentration jedes Bestandteils kann daher mit Hilfe der in Fig. 8 gezeigten Eichkurve genau bestimmt werden.
1) Reaktionsprinzip für die Analyse
Volumen der in | Konzentration | I)O-AbHiII | durch die Sauer- | DO-AbIuII | durch die S<<ucr- |
die Reaktions | an Glucose und | <rf|) | stoflabsorption durch GOD |
(rf2) | stofl'absorplion durch GLOD |
zelle einge spritzten Probe (Sj) |
Glutaminsäure während der Reaktion |
(iT.oi/ml) | (umol/ml) | ||
(.1) | (y.mol/ml) | (mm) | 11,8 | (mm) | 8,6 |
5 | 11,5 | 11 | 18,3 | 8 | 19,4 |
10 | 23,1 | 17 | 43,0 | 18 | 37,6 |
20 | 46,2 | 40 | 35 |
UA (2)
5o P
Rib-IP O2 H2O2 O2 H2O2
(1 MoI IMP entspricht einer SauerstofTaufnahme von 2 MoI Sauerstoff).
(I Mol Glutamat entspricht einer SauerstofTaufnahme von 1 Mol Sauerstoff).
2) Verwendete Vorrichtungen und Materialien
(1) DO-Sensor
65 (2) Aufzeichnungsvorrichtung (Recorder)
(3) Reaktionszeiie
(4) Enzym
I·,,: XO (20 U) + NP (20 U)/ml
(5) Grundmedium (Pufferlösung)
0,1-molare PhosphatpufTerlösung mit dem pH-Wert 7,6. 10
(6) Zu prüfende Flüssigkeit
A. 5'-Natriuminosinat (IMP-Na-SaIz) (CniH||N4Na:OsP · 7H2O) 15
0,13 g IMP-Na-SaIz vom Reagenzgrad (Produkt der Tokyo Kasei Co., Ltd.) wurde in 10 ml 0,1 m Phosphatpufl'urlösung unter Herstellung einer 25 mmolaren Lösung gelöst.
B. Mononatriumglutamat · H2O (Molekulargewicht 187)
Nach der in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrensweise wurde eine 25 mmolare Lösung hergestellt.
I ml der Lösung A und 2 ml der Lösung B wurden vermischt und mit Hilfe einerO.l-molaren PhosphatpufTerlösung auf IO ml aufgefüllt, um eine Mischlösung herzustellen. Die Konzentrationen der Komponenten in der 30
Mi'-xhlösung waren wie folgt:
Glutaminsäure: 25/5 = 5 mmolar
IMP: 25/10 = 2,5 mmolar
3) Verfahren
(1) Vorreaktion
80 μ| Lösung C (IMP + Glut) und 80 al AP-Enzymlösung wurden in einem Mikro-Reagenzglas mit einem Fas- ac
sungsvcrmögen von 2 ml miteinander vermischt und bei einer Temperatur von 37°C 15 Minuten lang umgesetzt, wobei IMP in H,R umgewandelt wurde (S2-Lösung).
(2) Reaktion zur Bestimmung 45
i
Einspritzen von 20 al der GLOD-Lösnng in die Reaktionszelle
ι
Einspritzen von 5 bis 20 al der Probelösung (S2) in die Reaktionszelle 55
i
Einspritzen der Eo-Lösung in die Reaktionszelle
i 60
4) Ergebnisse
Zusammenhang zwischen der Konzentration von Inosinsäure und Glutaminsäure als Substrate und dem VoIu-5 men des absorbierten Sauerstoffes
Volumen der in | Glutaminsäure- | DO-Abfall | Oi-Absorption | 1MP-Konzen- | DO-Abrall | Oi- | Absorption | |
die Reaktions | Konzentration | ä\ | durch GOD | tration während | dl | (x | 1/2) durch | |
zelle einge | während der | der Reaktion | NP | + XO | ||||
10 | spritzten Probe | Reaktion | ||||||
Kl) | (:>mol/ml) | (mm) | (iunol/ml) | (mm) | (:-t | ιοί/ml) |
5 11,5 15 16,1 5,78 11,0 5,5
15 10 23,1 28 30,1 11,5 20,5 10,25
20 40,2 49 49,4 23,1 46 23,0
Die Reaktionszeit für die Bestimmung betrug 3,5 bis 6,5 Minuten und der quantitative Wert für IM P entsprach
20 im wesentlichen dem theoretischen wert.
Beispiel 6
25 Quantitative Bestimmung von Glutaminsäure und Inosinsäure in einer Speisewürze
1) Reaktionsprinzip für die Analyse Es fanden die gleichen Reaktionen wie in Beispiel 5 statt.
2) Verwendete Vorrichtungen und Materialien
Die gleichen Vorrichtungen (1) bis (3) wie in Beispiel 5 wurden verwendet. Auch das verwendete Enzym (4)
und Grundmedium war das gleiche wie in Beispiel 5.
(6) Zu prüfende Flüssigkeit
0,5 g einer handelsüblichen pulverförmiger· Würze (Produkt der Ajinomoto Co., Ltd.) wurde in 100 m! Phosphatpufferlösung gelöst, um die zu testende Flüssigkeit herzustellen.
3) Verfahren
(1) Vorreaktion
80 al AP-Enzymlösung für die Vorreaktion wurden zu 80 μΐ S,-Lösung in einem Mikroreagenzglas mil 2 ml
Fassungsvermögen gegeben und das so gebildete Gemisch wurde 5 Minuten bei 37° C gehalten, um das 1M P in
der Probe entsprechend Reaktionsformel (2) in HxR umzuwandeln (S2-Lösung).
(2) Reaktion für die Bestimmung
i
Einspritzen der S2-Lösung (10 μΐ = Vs)
60 Einspritzen von Enzymlösung E0 (15 al)
I
Aufzeichnung von d, (DO-Abfall durch NP + XO)
4) Ergebnisse
licslimmung von Inosinsäurc (IMP) und Glutamat (Glut) in einer Würze
fiMp, errechnet
aus der SauerslulT-•ibsorplion in der
Reaktionszelle
Vers. Vs | DO-AbIaIi | (mm) | Oi-Absorplion in der |
Volumen der | ti, | 126 | Keuklions/cllc (;iMol) |
eingespritzten | 121 | durch ti durch OLOU | |
Probe (S2) | 124 | ||
(I'D | (mm) | ||
1 10 | 4 | 4,45 140 | |
2 10 | 4 | 4,45 134 | |
mittel 10 | 4 | 4,45 137 | |
</„ l')2mm. | |||
Anmerkung i: | |||
<(iiui- errechnet
aus der SauerstofT-absorption in der
Reaktionszellc
mg/1
/Mol
mg/1
(mg/i)
1.16
1,16
1,16
140
134
137
26,1
25,0
25,6
27,3 26,2 26,7
Die Konzentration an IMP(c,MP) wurde nach der folgenden Gleichung erhalten, unter Bezug auf die Tatsache,
daß der Zusammenhang der O2-Absorption mit dem Anteil an IMP 2 Mol/l Mol IMP beträgt, wie inderReaktionsfbrmel (2) angegeben wird.
<iMi· = (J1Zd0 x 0,214/2 (nmol/ml)
= (IxIdn X 0,107 (μΐηοΙ/ml) = </,/</„ X 107 (uMol)
Anmerkung 2:
Die Glutamatkonzentration (c\;iul) wurde nach der folgenden Gleichung aufgrund des Zusammenhangs 1 Mol
O71 Mol Glutamat erhalten.
i-ciiui = d,/d0 X 0,214 (μτηοΐ/ml)
/
Anmerkung 3:
Die Konzentration, angegeben als Gewicht/Volumen für jeden Bestandteil wurde errechnet, wobei das Molekulargewicht von IMP als 518 (Heptahydrat) und von Glut als 187 angenommen wurde.
Anmerkung 4:
(1IMr + ecu,,,, multipliziert mit 216, der Verdünnungsrate bei dem Analyseverfahren, ergibt 0,57 g/100 ml, was» im
wesentlichen mit der hergestellten Konzentration übereinstimmt. Außerdem beträgt das Verhältnis von IMP zu
IMP + Glut (1,16/26,73) x 100 = 4,3%, was als korrekter Wert angenommen wird. Die zur Analyse erforderliche
Zeit betrug etwa 10 Minuten.
Beispiel 7
Quantitative Bestimmung von Glutaminsäure und Glucose in Sojasauce
Sojasauce ist eine traditionelle japanische Speisewürze, deren wesentliche Bestandteile Glutaminsäure und
Glucose sind. Es existiert kein geeignetes bekanntes Verfahren, um diese Bestandteile in einfacher Weise und
rasch zu bestimmen. Erfindungsgemäß ist es möglich, die Bestimmung dieser Bestandteile in etwa 10 Minuten
durchzuführen.
Probe: kräftige Sojasauce (Kikoman Shoyu Co., Ltd.)
1. Reaktionsprinzip für die Analyse
Ms finden die gleichen Reaktionen wie in Beispiel 4 statt.
2. Verwendete Vorrichtungen und Materialien
Darüber hinaus wurden die gleichen Enzyme (4) und das gleiche Grundmedium (5) wie in Beispiel 4 eingesetzt.
(6) Zu prüfende Probe
Kräftige Sojasauce, die unter der Warenbezeichnung »Kikoman Koikuchi Shoyu« von Kikoman Shoyu Co.,
Ltd. vertrieben wird, wurde eingesetzt.
5 Zubereitung der Probelösung:
1 ml der Probe wurde zur Herstellung der Probelösung mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt und dazu wurde 0,1 m
Phosphatpufferlösung in einer Menge von 10 ml pro 1 ml der Probelösung hinzugefügt Die Lösung wurde somit
auf 1 :1000 verdünnt und dann zur Analyse mit Luft bei einer Temperatur von 37°C gesättigL
10 3. Verfahren (vgl. Fig. 12 und Tabelle 7)
15 Füllen der Reaktionszelle mit lOOOfach verdünnter Sojasauce-Lösung
ι Einspritzen von GLOD (10 ;J)
ί Aufzeichnung der Kurve für den DO-Abfall (Glutaminsäureoxidase)
20 i
i Einspritzen von GOD (10 jd) (Glucoseoxidase)
t 25 Aufzeichnung der Kurve für den DO-Abfall
i Messung von rf>
4. Ergebnisse s
durch GLOD durch GOD (g/100 ml der Sojasaucc) %
40 80 91 86,0 101,0 1,26 1,76
4, (in LuΓι gesättigtem Wasser) = 199 mm.
cc,,ul: Konzentration der Glutaminsäure in der Sojasauce (g/100 ml)
rCiu· Konzentration der Glucose in Sojasauce (g/100 ml)
so _ dt (mm) x0,214 (mM) x 1000(Verdünnungsrate)X 147 (M.G.)
C<>luI d0 (mm)
= 80 X 0,214 X 1000 X 147 (mg) = )2 ^6 /(
= l,26(gGlutaminsäure/100ml)
rf» (mm) x | 0,214 (mM) x 1000 x | 180 | (M | .G | .) |
(/„ (mm) | |||||
91 | X 0.214 x 1000 X 180 | (mg) |
65 = = 17,614 (mg/1)
= lJöfgGlucose/IOOml)
16
Beispiel 8
Quantitative Bestimmung von L-Ascorbinsäure (AsA) und Glucose in einer Mischlösung
1) Reaktionsprinzip fur die Analyse
ASOD: Ascorbatoxidase
GOD: Glucoseoxidase
2) Verwendete Vorrichtungen und Materialien
(3) Reaktionszelle
Die verwendete Reaktionszelle hatte ein Zellvolumen von 1160 ·Δ und hatte praktisch die gleiche Konstruktion, die in Fig. 1 gezeigt ist.
(4) Enzyme
GOD wurde in Form eines gelben gefriergetrockneten Produkts, das durch Extraktion aus Mikroorganismen
und anschließende Reinigung erhalten worden war, eingesetzt (Produkt der Oriental Yeast Co., Ltd.). Es hatte
cine Aktivität von 340 U/mg in einer mit O2 gesättigten Lösung.
GOD-Enzymlösung wurde durch Auflösen von 5 mg des pulverformigen GOD in 1 ml einer 0,1 m Phosphatpuffcrlösung (pH 7,6) hergestellt. Sie hatte eine Aktivität von 1700 U/ml. ASOD (Produkt der Oriental Yeast
Vo., Ltd.) wurde in Form eines weißen gefriergetrockneten Produkts eingesetzt, das durch Reinigung des aus
Gurken extrahierten Enzyms erhalten worden war. Es hatte eine Aktivität von 168 U/mg.
Die ASOD-Enzymlösung wurde durch Auflösen des pulverformigen ASOD-Enzyms in einer 0,1 m Calciumnli&TphalpulTcrlösung, die 1 mg Albumin pro ml als Stabilisator enthielt, in einer Menge von 1 mg/ml hergestellt. Die Aktivität dieser Lösung betrug 168 U/ml.
(S) Grundmedium für die Bestimmung
0,1 molare PhosphatpufTerlösung (PBS) (pH-Wert 7,6), die mit Luft bei einer Temperatur von 300C gesättigt
worden war. wurde verwendet.
(6) Zu prüfende Flüssigkeit A. Herstellung der Ascorbinsäurelösung (AsA)
[-!ine 10 mM Ascorbinsäurelösung wurde durch Auflösen von 176 mg L-Ascorbinsäure (Reagenzgrad, Produkt der Wako Pure Chemical Ind., Ltd.) in 100 ml einer 2%igen ΗΡΟ,-Lösung hergestellt und in einem Kühlschrank aufbewahrt. Die Lösung wurde vor der Anwendung in dem gewünschten Verhältnis verdünnt (HPO5 ist
ein Stabilisator für AsA).
2.S mM Glucoselösung wurde durch Auflösen von 450 mg wasserfreier Glucose (Produkt der Kokusan Chemicals Co., Ltd.) in destilliertem Wasser und anschließendes Auffüllen auf 100 ml hergestellt.
I ml Lösung A und 0,4 ml Lösung B wurden miteinandervermischt und das so erhaltene Gemisch wurde mit
destilliertem Wasser auf 2 ml aufgefüllt.
Die Konzentrationen der Bestandteile in der Mischlösung waren daher folgende:
AsA: 1OmM x 1/2 = SmM
Glucose: 25 mM x 1/5 - 5 mM
3) Verfahren
(I) liinc 100 ml-Belüflungsllasche (BOD-lFlasche) wurde mit dem Grundmedium oder einer 0,1 m PhosphatpulTcrlösung gelullt und in einen bei 300C gehaltenen Thermostaten gelegt und Luft wurde während 20 Minuten mil I IiIIc einer Luftpumpe in die Flasche eingeleitet.
(2) Bei 300C gehaltenes Wasser wurde durch den Mantel der Reaktionszelle geleitet, so daß die Temperatur
der Reaktionszelle konstant bei 30° C gehalten wurde. Dann wurde der Stopfen von der Reaktionszeit entfernt
und 2 ml des mit Luft gesättigten Grundmediums in die Reaktionszelle eingespritzt, so daß die Flüssigkeit den
unteren Teil der feinen Bohrung erreichte. Dann wurde die Reaktionszelle so mit dem Stopfen verschlossen, daß
keine Luftblase in der Reaktionszelle verblieb.
(3) Der Ausgangswert des DO-Reduktionsstroms des DO-Sensors wurde auf einem Meßstreifen der Aufzeichnungsvorrichtung aufgezeichnet, während ein Magnetrührer in der Reaktionszelle rotierte. Der Abstand </u zwischen dem Anzeigepunkt und dem DO-Nullpunkt entsprach der Sauerstoffkonzentration von 0,235 μΜοΙ/ml
(bei 300C).
(4) Eine Mikroinjektionsspritze wurde tief in die feine Bohrung der Reaktionszelie eingeführt und 20 j J ASOD
wurden in die Zelle eingespritzt.
(5) Die zu prüfende Flüssigkeit, die Ascorbinsäure und Glucose enthielt, wurde mit Hilfe einer weiteren Injektionsspritze eingespritzt, während die DO-Aufzeichnung fortgesetzt wurde. Um eine Eichkurve zu erhalten,
wurde die Flüssigkeit in Mengen von 10 μΐ, 20 μΐ und 30 al eingespritzt
(6) Der DO-Abfall beim Einspritzen jeder Probe wurde aufgezeichnet und ist in Fig. 13 angegeben und mit
»Probe« bezeichnet. Dies war auf die Sauerstoffabsorptic a durch das Grundmedium in der Reaktions/.clic zurückzuführen, die mit dem Ablauf der Sauerstoff verbrauchenden Reaktion durch Ascorbinsäure entsprechend
Reaktionsformel (1) auftrat Die Reaktion war in etwa 1 Minute beendet. Die erhaltene Differenz d\ der DO vor
dem Einspritzen von ASOD und der DO nach Beendigung der Reaktion gibt den Sauerstoffverbrauch durch die
zu prüfende Flüssigkeit an.
dem Volumen des verbrauchten Sauerstoffes
Volumen der | Konzentration | DO-Abfall | Volumer, des |
in die Reak | von AsA | Wi) | absorbierten |
tionszelle | während der | ||
eingespritzten | Reaktion | ||
Probe | |||
Vs W) | (uMoI/I) | (mm) | (jiMol/1) |
ίΟ | 43,0 | 18 | 21,4 |
20 | 86,0 | 38 | 45,1 |
30 | 129,0 | 58 | 68,8 |
(7) Danach verursachte das Einspritzen von 20 μΙ GOD-Lösung einen erneuten Abfall des OO-Wcrlcs. Die
Reaktion war in 4 bis 6 Minuten beendet.
Die vorstehend beschriebene gleichzeitige Bestimmung von AsA und Glucose erforderte nur eine kurze Zeil
von 5 bis 7 Minuten.
und dem Volumen des verbrauchten Sauerstoffes
Volumen der | Konzentration | DO-Abfall | Volumen des |
in die Reak | von Glucose | (</|) | absorbierten |
tionszelle | während der | O: | |
eingespritzten | Reaktion | ||
Probe | |||
Vs (μΙ) | ΙμΜοΙ/Ι) % | (mm) | (μΜθΙ/1) |
10 | 43,0 | 25 | 29,7 |
20 | 86,0 | 46 | 54,6 |
30 | 129,0 | 75 | 89,0 |
Wie aus Tabellen 8 und 9 ersichtlich ist, beträgt der Wert für die Sauerstoffaufnahme durch AsA und Glucose
etwas .veniger als der aus den Rcaktionsl'ormeln (8) und (2) errechnete theorelhische Wert. Wie jedoch in l;ig. 14
gezeigt ist, tritt für jede der Komponenten ein linearer Zusammenhang zwischen der Sauerstoffaulhahmc und
der Konzentration auf, dcrals gerade Linie, die durch den Ursprungswert verläuft, angegeben werden kann. Aus
diesem Grund erfolgt die Bestimmung von Ascorbinsäure und Glucose unter Anwendung der in F i g. 14 gezeigten Eichkurve.
Die Merkmale und Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens werden nachstehend nochmals kurz dargclegi.
1I) Die Vorbehandlung der Proben ist leicht durchzuführen, ohne daß Einflüsse durch die Färbung, Trübung,
UV-Absorption und andere Eigenschaften der Flüssigkeit geprüft werden müssen.
(2) Die Messungen sind sehr rasch durchzufuhren.
(3) Ausgezeichnet hohe Spezifität ist gewährleistet.
(4) Die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens kann sehr einfach gestaltet werden. 5
(5) Die Messungen können bei niederen Konzentrationen im Bereich von 0,005 bis 0,1 uMol/ml mit ausgezeichnet
hoher Empfindlichkeit durchgeführt werden.
(6) Die Menge des verbrauchten Enzyms kann durch Anwendung einer kleinen Reaktionszelle bei einem
geringen Wertgehalten werden. Wie in Beispiel 2 beschrieben ist, kann einmal zugesetztes Enzym wiederholt
verwendet werden (so kann beispielsweise XO dreimal und MP zweimal verwendet werden). 10
(7) Alle Verfahrensschritte werden bei Raumtemperatur mit hoher Sicherheit durchgeführt und gefährliche
Chemikalien sind nicht erforderlich.
Wie aus der vorstehenden Beschreibung leicht ersichtlich ist, bietet das erfindungsgemäße Verfahren zahlreiche
Vorteile gegenüber den bisherigen zeitaufwendigen und nur für die Bestimmung einerspezifischen Kom- 15
poncntc geeigneten Arbeitsweisen und ist daher sehr wertvoll für die Analyse von verschiedenen gleichzeitig in
einem flüssigen System vorliegenden Substanzen, wie sie vorstehend erwähnt wurden, also z. B. Lipoide, Aminosäuren,
zu Nucleinsäuren führende Stoffe, Alkohole, Vitamine und dergleichen, wie sie in Nahrungsmitteln,
Getränken und Organismen vorkommen. Ohne Trennung der Komponenten voneinander wird die jeweilige
Oxidase zu der Lösung zugesetzt, um die Sauerstoffaufnahme zu feewirken und alsdann mittels des DO-Sensors 20
die Menge der Sauerstoffaufnahme bzw. mit anderen Worten die Verminderung des gelöste Sauerstoffs ermittelt.
Die Erfindung wurde zwar anhand typischer Ausführungsformen und Beispiele beschrieben, sie ist jedoch
nicht auf diese beschränkt.
Hierzu 9 Blatt Zeichnungen
Claims (5)
1. Verfahren zur Schnellanalyse von mehreren in einem flüssigen System vorhandenen Bestandteilen,
gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:
Einfüllen der zu analysierenden Flüssigkeit und einer pH-Pufferlösung in eine einzelne Reaklionszclle, die
gegenüber dem Zutritt von Außenluft abgedichtet ist,
aufeinanderfolgende Zugabe von mehreren biologischen Katalysatoren, welche in Form einer Enzymverteilung
vorliegen sowie die Aufnahmereaktion von gelöstem Sauerstoff induzieren, wobei die in dem flüssigen
System vorliegenden mehreren Bestandteile nacheinander stufenweise selektiv oxidiert werden,
automatische Messung des gelösten Sauerstoffs und Aufzeichnung des Oxidationsverfahrens mit Hilfe nur
eines Sensors, der aufgelösten Sauerstoff anspricht (DO-Sensor), wobei eine stufenweise abfallende Kurve
für den gelösten Sauerstoff erhalten wird,
qualitative Bestimmung jedes der Bestandteile durch die Art des zugesetzten biologischen Katalysators und
die Reihenfolge der Zugabe der biologischen Katalysatoren und quantitative absatzweise Bestimmung jedes Bestandte As aufgrund der Verminderung der Menge des gelösten
Sauerstoffs.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Oxidation der Bestandteile in zwei, drei
oder mehr Stufen durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in einer Reaktionszelle
durchgehen wird, an deren einer Seitenwand ein Sensor für gelösten Sauerstoff befestigt ist und deren oberer
Teil luftdicht mit einem Stopfen verschlossen ist, der mit einer feinen Bohrung versehen ist, die zur
Zugabe der Pufferlösung, der zu prüfenden Flüssigkeit und der biologischen Katalysatoren dient.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die untersuchende Flüssigkeit eine Mischlösung von Hypoxanthin (Hx) und Xanthin (X) ist, daß die mehreren biologischen Katalysatoren Xanthinoxi-
dase (XO) bzw. Uricase (UO) in Form einer Suspension bzw. Lösung sind und zunächst die Xanthinoxidasc
(XO) zu der Mischlösung und. nach beendeter chemischer Reaktion der (XO) alsdann die Uricase (UO) zugesetzt
werden sowie im Anschluß an die vollständige chemische Reaktion der (UO) die quantitative Berechnung
von (Hx) und (X) aufgrund des Verhältnisses von dxld2 erfolgt, wobei rf, dem Wert der Verminderung
vom gelösten Sauerstotf (DO) durch die Zugabe von (XO) und d2 dem Wert der Verminderung von (DO)
durch die Zugabe von (UO) entsprechen.
5. Verfar 'en nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die untersuchende Flüssigkeil eine Mischlösung von lnosinsäure (IMP) Inosin (HxR) und Hypoxanthin (Hx) ist, daß die mehreren biologischen Katalysatoren
alkalische Phosphatase (AP), Xanthinoxidase (XO) und Nucleosid phosphorylase (NP) sind und daß
zu der Mischlösung bei einer" pH von etwa 10,5 zunächst (AP) zugesetzt wird, alsdann durch Zugabe einer
Phosphat-Pufferlösung der ph-Wert auf 7,6 gebracht und (XO) als zweites Enzym zugesetzt sowie nach der
Bestimmung des Abnahmewerts d·, von (DO) aufgrund der Zugabe von (XO) schließlich als drittes Enzym
(NP) zugesetzt und der Abnahmewert d2 von (DO) aufgrund des Zusatzes von (NP) ermittelt werden, woraufhin
noch eine gleiche Volumenmenge der zu untersuchenden Lösung, wie zu Beginn, der Mischlösung zugegeben
und der Abnahmewert von (DO) ermittelt und die quantitative Berechnung vea </■., rf, und rf, nach den
folgenden Gleichungen erfolgen:
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---|---|---|---|
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---|---|
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ID=12478015
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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---|---|
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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CN107185421B (zh) * | 2017-07-18 | 2023-08-29 | 汇森生物设备镇江有限公司 | 一种用于高粘度料液的精确配液*** |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3879263A (en) * | 1973-09-06 | 1975-04-22 | Du Pont | Method for the determination of amylase |
US4040908A (en) * | 1976-03-12 | 1977-08-09 | Children's Hospital Medical Center | Polarographic analysis of cholesterol and other macromolecular substances |
WO1980000454A1 (en) * | 1978-08-18 | 1980-03-20 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Method of measuring substrate of xanthine oxidase,and composition for the determination |
JPS6031472B2 (ja) * | 1978-12-14 | 1985-07-22 | 協和醗酵工業株式会社 | 酸性ウリカ−ゼ |
JPS55149050A (en) * | 1979-05-08 | 1980-11-20 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | Enzyme electrode |
JPS5697863A (en) * | 1980-01-07 | 1981-08-06 | Hitachi Ltd | Method and apparatus for analyzing amylase |
JPS56164797A (en) * | 1980-05-21 | 1981-12-17 | Toyo Jozo Co Ltd | Improved method of determining components in samples |
JPS5783287A (en) * | 1980-11-14 | 1982-05-25 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Elimination of hydrogen peroxide |
JPS57177699A (en) * | 1981-04-28 | 1982-11-01 | Fuji Electric Co Ltd | Determination of alpha-amylase by means of enzyme electrode method |
JPS5948097A (ja) * | 1982-09-14 | 1984-03-19 | Amano Pharmaceut Co Ltd | ポリアミン及びアセチルポリアミンの分別定量方法 |
IT1179354B (it) * | 1984-03-22 | 1987-09-16 | Miles Italiana | Composizione e dispositivo per la determinazione enzimatica di fosfati inorganici in campioni di fluidi quali urina e sangue |
-
1983
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- 1984-03-08 DE DE3408502A patent/DE3408502C2/de not_active Expired
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Karl Cammann: Das Arbeiten mit ionenselektiven Elektroden, Springer Verlag, 1977, S. 98 - 106 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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US4725539A (en) | 1988-02-16 |
JPS59163555A (ja) | 1984-09-14 |
JPH0366614B2 (de) | 1991-10-18 |
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