DE3408502C2

DE3408502C2 - Verfahren zur Schnellanalyse von mehreren in einem flüssigen System vorhandenen Bestandteilen

Info

Publication number: DE3408502C2
Application number: DE3408502A
Authority: DE
Inventors: Nobuhiko Tokio/Tokyo Arakawa; Kenichi Ageo Saitama Numazawa; Minoru Ohashi; Osamu Kawagoe Saitama Oka; Yoshio Saitama Utugi
Original assignee: Oriental Yeast Co Ltd
Current assignee: Oriental Yeast Co Ltd
Priority date: 1983-03-08
Filing date: 1984-03-08
Publication date: 1986-11-13
Also published as: DE3408502A1; US4725539A; JPS59163555A; JPH0366614B2

Abstract

Ein neues Verfahren zur Schnellanalyse von mehreren nebeneinander vorliegenden Substanzen in Gegenwart von biologischen Katalysatoren wird beschrieben. Das Verfahren wird mit Hilfe folgender Verfahrensschritte durchgeführt: Einfüllen der zu analysierenden Flüssigkeit und einer pH-Pufferlösung in eine Reaktionszelle, die gegenüber dem Zutritt von Außenluft abgedichtet ist, aufeinanderfolgende Zugabe von mehreren Enzymen, welche die Aufnahme und Reaktion von gelöstem Sauerstoff induzieren, wobei die in dem flüssigen System vorliegenden mehreren Bestandteile nacheinander stufenweise selektiv oxidiert werden, automatische Messung des gelösten Sauerstoffes und Aufzeichnung des Oxidationsverfahrens mit Hilfe eines Sensors, wobei eine stufenweise abfallende Kurve für den gelösten Sauerstoff erhalten wird, quantitative Bestimmung jedes der Bestandteile durch die jeweilige Art des zugesetzten Enzyms und die Reihenfolge ihrer Zugabe, und quantitative Bestimmung jedes Bestandteils aufgrund der Verminderung der Menge des gelösten Sauerstoffes. In typischer Weise wird die Oxidation der Substanzen unter Anwendung von zwei, drei oder auch mehr Stufen durchgeführt. Die Reaktionszelle zur Durchführung des Verfahrens ist mit einem Sensor für gelösten Sauerstoff versehen, der an einer Seitenwand angeordnet ist und der obere Teil der Zelle ist mit Hilfe eines Stopfens, durch den sich eine feine Bohrung erstreckt, die zur Zuführung von Pufferlösung, Probe und Enzymen dient, ...

Description

Cn* = —- x 0,107 (xmol/ml)

«I«

C₁MP = ~^-l·- -~ x 0,107 (umol/ml)
du

C„,R = i^i^A'- χ 0,107 (xmol/ml)

du

worin das Symbol rf„ die Aufzeichnungsbreite (mm) für das Ausgangssignal für mit Luft gesättigtes Wasser ist und die Symbole C_Mx, Γ|_Μρ und Ch_vr die Konzentrationen (umol/ml) von Hx, IMP und HxR bedeuten. 55

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Schnellanalyse von mehreren Bestandteilen und insbesondere ein Verfahren zur bio-elektrochemischen Analyse von biologischen Substanzen oder Nahrungsmittelsubstanzcn, wie Aminosäuren, Nukleinsäuren, Sacchariden, Lipiden oder dergleichen, welche in ein und demselben flüssigen System vorhanden sind.

Als eine typische konventionelle Methode zur analytischen Trennung von Aminosäuren, Nucleinsäuren, Sacchariden, Lipoiden, Vitaminen oder dergleichen, wurde bisher die chromatographische Methode angewendet. Diese übliche Methode ist jedoch mit Nachteilen behaftet, die darin bestehen, daß eine lange Zeit crlordcrlich ist, um die einzelnen Bestandteile voneinander tu trennen und daß zahlreiche Reagcnticn benötigt weiden und zur Durchführung der Analyse große Geschicklichkeit erforderlich ist. Ein weiterer Nachteil der üblichen Methode besteht darin, daß die zur Durchführung des Analyseverlahrcns erforderliche Vorrichtung komplizierten Aufbau hat und ihre Herstellung entsprechend teuer ist.

In den letzten Jahren wurde ein verbessertes Verfahren vorgeschlagen, welches die rasche und selektive Bestimmung nur eines spezifischen Bestandteils unter zahlreichen weiteren in einfacher Weise mit Hilfe eines elektrochemischen Sensors, wie einer Sauerstoffelcktrode oder WasserstofTperoxidelektrode, mit biologischen Katalysatoren, wie Enzymen, bzw. einer biologischen Zelle oder dergleichen ermöglicht (Koteikakoso, Immobilized Enzymes (1977), herausgegeben von Ichiro Chibata und veröffentlicht von Kodansha Scientific Co., Ltd.). Es wurde jedoch festgestellt, daß dieses verbesserte Verfahren nicht die gleichzeitige Analyse von mehreren Bestandteilen ermöglicht

Dies gilt auch fur die aus Cammann, Das Arbeiten mit ionenselektiven Elektroden, 1977, Seiten 98 bis 106 bekanntgewordene Analysenmethode, die sich der Potentiometric, also der Messung eines durch die Konzentration eines Ions in der Lösung bedingten Potentials an der Berührungsfläche der Probe und Elektrode bedient,

Soweit dort über mit der Amperometrie zusammenhängende Arbeiten referiert wird, erfolgt in einem Durchfluß-verfahren auch jeweils nur die Bestimmung einer einzigen Komponente mittels eines immobilisierten Enzyms, wie es weiter oben schon dargelegt ist. Wollte man in Anwendung dieser Methodik mehrere, gleichzeitig vorhandene Substanzen analysieren, würde dies eine der Zahl der zu prüfenden Substanzen entsprechende Anzahl von Enzymreaktoren mit nachgeschalteten Meßzellen mit jeweilig wechselnden bzw. optimierten Temperaturen in dem Durchflußsystem erfordern. Dies mach den praktischen Einsatz unmöglich.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die vorstehend erläuterten Nachteile zu beseitigen und ein Verfahren zur Verfugung zu stellen, welches die Analyse von mehreren gleichzeitig in einem flüssigen System vorliegenden Bestandteilen rasch und in einfacher Weise ermöglicht.

(iegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Schnellanalyse von mehreren in einem flüssigen System vorhandenen Bestandteilen, das -!urch folgende Verfahrensschritte gekennzeichnet ist:
Einfüllen der zu analysierenden Flüssigkeit und einer pH-Pufferlösung in eine Reaktionszelle, die gegenüber dem Zutritt von Außenluft abgedichtet ist,

aufeinanderfolgende Zugabe von mehreren biologischen Katalysatoren, weiche in Form einer Enzymverteilung vorliegen sowie die Aufnahme und Reaktion von gelöstem Sauerstoff induzieren, wobei die in dem flüssigen System vorliegenden mehreren Bestandteile nacheinander stufenweise selektiv oxidiert werden,
automatische Messung des gelösten Sauerstoffs und Aufzeichnung des Oxidationsverfahrens mit Hilfe nur eines Sensors, der aufgelösten Sauerstoff anspricht (DO-Sensor), wobei eine stufenweise abfallende Kurve für den gelösten Sauerstoff erhalten wird,

qualitative Bestimmung jedes der Bestandteile durch die Art des zugesetzten biologischen Katalysators und die Reihenfolge der Zugabe der biologischen Katalysatoren und

quantitative absatzweise Bestimmung jedes Bestandteils aufgrund der Verminderung der Menge des gelösten Sauerstoffs.

Um zu gewährleisten, daß das erfindungsgemäße Verfahren in zufriedenstellender Weise durchgeführt werden kann, ist es notwendig, eine Vorrichtung vorzusehen, welche die kontinuierliche Messung von gelöstem Sauerstoff und die Aufzeichnung des erhaltenen Meßwertes ermöglicht. Als Sensor, der für diese Vorrichtung erforderlich ist, können übliche aufgelösten Sauerstoff ansprechende Sensoren (DO-Sensoren) angewindet werden, wie eine polarographische Membran-überzogene Sauerstoffelektrode, eine sogenannte Clark-Elektrode, cir; Elektrode für gelösten Sauerstoff vom Typ einer galvanischen Zelle, eine Sauerstoflelektrode auf

Basis des SauerstofTdruckausgleichs, die kürzlich von Conrsry entwickelt wurde, oder ähnliche Sensoren.

Es ist darüber hinaus notwendig, daß eine Reaktionszeit vorgesehen wird, in der nur ein Sensor für gelösten

f SaucrstofTangeordnet oder befestigt ist, mit dessen Hilfe jede Änderung der Konzentration an gelöstem Sauer-

f stoll in der Reaktionsflüssigkeit exakt gemessen werden kann, ohne daß Sauerstoff von außen zutreten kann, und

in die Rcagcntien, Katalysatoren und andere Materialien, wie sie zur Kontrolle der Reaktion erforderlich sind, zugeführt werden können.

Andere Gegenstände, Merkmale und Vorteile der Erfindung sind aus der nachstehenden Beschreibung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen deutlicher ersichtlich.
Nachstehend sollen die beigefügten Zeichnungen kurz beschrieben werden.

I"ig. I ist eine scheicatische Schnittdarstellung einer Reaktionszelle zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens; l-ig. 2 zeigt eine stufenweise abfallende Kurve für den gelösten Sauerstoff, die während der Analyse von Xanthin ;X) und Hypoxartthin (Hx) ausgebildet wird;

j I' i g. 3 zeigt die Kurve, welche den Zusammenhang zwischen dem Verhältnis von Xanthin- und Hypoxanthin-

Konzentration und dem Verhältnis der Verminderung Id₁Zd₂) des Ausgangssjsoms wiedergibt, die bei drroxtda-

ϊ' tivcn Reaktion in zwei Stufen mit Hilfe von Xanthinoxidase und Uricase erhalten wird, und

Fig. 4 ist eine stufenweise abfallende Kurve für den gelösten Sauerstoff während einer oxidativen Reaktion,

die aus drei Stufen besteht, während dsr Analyse einer Mischflüssigkeit, die Inosinsäure, Jnosin und Hypoxan-

£ thin enthalt.

Fig. 5 ist eine graphische Darstellung, welche eine stufenweise abfallende Kurve von gelöstem Sauerstoff

»_}.; während der oxidativen Reaktion einer Probe gemäß Beispiel 3 zeigt.

i' Fig. 6 ist eine graphische Darstellung, welche die Beziehung zwischen der Abnahme von gelöstem Sauerstoff

iü (DO) und der Injektion einer Probe gemäß Beispiel 3 zeigt und die zur Kalibrierung der Bestimmung von Ethyl-

V; alkohol und Glutaminsäure geeignet ist.

·.■ Fig. 7 ist eine graphische Darstellung, welche die stufenweis abfallende Kurve von gelöstem Sauerstoff während der oxidativen Reaktion bei einer Probe gemäß 3eispiel 4 zeigt.

Fig. 8 ist eine graphische Darstellung, welche die Beziehung zwischen der Abnahme an gelöstem Sauerstoff ^: und der Injektion einer Probe gemäß Beispiel 4 zeigt und die zur Kalibrierung der Bestimmung von Glucose und

Glutaminsäure geeignet ist.

Fig. 9 ist eine graphische Darstellung, welche eine stufenweise abfallende Kurve von gelöstem SiiucrsiolT während der oxidativen Reaktion bei einer Probe gemäß Beispiel 5 zeigt.

Fig. 10 ist eine graphische Darstellung, welche die Beziehung zwischen der Abnahme von gelöstem Sauerstoff und der Injektion einer Probe gemäß Beispiel 5 zeigt und die zur Kalibrierung der Bestimmung von Inosinsäure und Glutaminsäure geeignet ist. -

Fig. 11 ist eine graphische Darstellung, welche die stufenweise abfallende Kurve von gelöstem Sauersloll' ,>>'

während der oxidativen Reaktion einer Probe gemäß Beispiel 6 zeigt. ^;■:,;

Fig. 12 ist eine graphische Darstellung, welche die stufenweise abfallende Kurve von gelöstem SuucrstolV Ti

während der oxidativen Reaktion einer Probe gemäß Beispiel 7 zeigt. ;';

to Fig. 13 ist eine graphische Darstellung, welche die stufenweise abfallende Kurve von gelöstem SauerstolT ''·

während der oxidativen Reaktion einer Probe von Beispiel 8 zeigt. ·

Fig. 14 ist eine graphische Darstellung, welche die Beziehung zwischen der Abnahme des gelösten Sauer- '

Stoffs und der Injektion einer Probe gemäß Beispiel 8 zeigt und die zur Kalibrierung der Bestimmung von Ascorbinsäure und Glucose geeignet ist. , Zum besseren Verständnis der Erfindung werden nachstehend bevorzugte Ausführungsformcn im Zusum- \ menhang mit den beigefügten Zeichnungen erläutert. I Fig. 1 veranschaulicht schematisch ein Beispiel für eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemä- I Ben Verfahrens. Diese Vorrichtung umfaßt eine Reaktionszelle 1 mit einem Fassungsvermögen von etwa 2 ml mil einem Sensor 2 für gelösten Sauerstoff {nachstehend einfach s.'s DG-Senscr bezeichnet), der fest an einer ₅ Seitenwand dieser Reaktionszelle 1 angebracht ist. Der obere Teil der Reaktionszelle 1 ist luftdicht mit einem Stopfen 4 verschlossen, durch den sich eine feine Bohrung 3 erstreckt, so daß der Zutritt von Luftsaucrstoll' von außen in die Reaktionszelle 1 verhindert wird. Ein gewünschtes Volumen eines Mittels zum Regeln der Reaktion kann daher durch diese feine Bohrung 3 mit Hilfe einer Mikroinjektionsspritze oder einer ähnlichen Vorrichtung in die Reaktionszelle 1 eingefüllt werden. Die Reaktionstemperatur wird durch Leiten von Wasser 6 durch den Mantel 5 geregelt und bei konstanter Temperatur gehalten und die Reaktionsfiüssigkeit wird mit Hilfe eines Magnetrührers 7 gut gemischt und gerührt. Die Erfindung ist selbstverständlich nicht auf die Anwendung der beschriebenen spezifischen Reaktionsvorrichtung beschränkt und es ist ersichtlich, daß diese Vorrichtung in jeder beliebigen geeigneten Weise verändert oder modifiziert we .Jen karn. :■,

Als biologischer Katalysator für das erfindungsgemäße Verfahren eignen sich Hydrolasen, wie Invcrtasu, Amylase oder dergleichen, und Oxidasen, wie Glucoseoxidase (nachstehend als GOD bezeichnet) oder dergleichen für die Analyse von Sacchariden. Proteasen, Peptidasen und Aminosäureoxidasen sind zur Analyse von j' Proteinen und Aminosäuren geeignet und Cholesterinesterase und Cholesterinoxidase zur Analyse von Cholc- ';' sterin verwendbar. Außerdem eignen sich Nukleotidase, Nukleosidphosphorylase, Xanthinoxidasc oder dergleichen zur Bestimmung von Nukleinsäuren bzw. verwandten Substanzen, beispielsweise Inosinsäurc, die durch Zersetzung von Adenosintriphosphat gebildet wird.

Es ist festzuhalten, daß eine Dehydrogenase, bei der keine Sauerstoffaufnahmereaktion eintritt, beispielsweise Milehsäuredehydmgenase. Alknholdehydrogenase oder dergleichen, zur analytischen Bestimmung von . Milchsäure, Alkohol oder dergleichen in Gegenwart eines Coenzyms und einer Hilfssubstanz, wie Phenazinmethasulfat oder dergleichen, die als Wasserstoffübertragungsmtttel dienen, anwendbar ist. In einigen Fällen kann die biologische Zelle für die oben genannten Zwecke anwendbar sein.

Verfahren zur Analyse von mehreren nebeneinander vorliegenden Bestandteilen mit höchster Wirksamkeit nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können in verschiedenerweise durchgeführt werden. Als vorbereiten- ;'■'

de Stufe vor der Durchführung des Analyseverfahrens ist es empfehlenswert, daß die Reaktions-Charaktcristika, ΐ

die einer einzigen Substanz unter diesen Bestandteilen zukommen, vorher unter Bezugnahme auf eine Standardprobe geprüft werden, vorausgesetzt, daß die Existenz dieser Substanz bekannt ist. So werden beispielsweise die Bedingungen, unter denen eine gewünschte Oxidationsreaktion rasch abläuft, im Vergleich mit der Neigung der Sauerstoffaufnahmekurve bestätigt, während die Menge des Enzyms, der pH-Wert der Rcak- ,

tionslösung, die Zusammensetzung der Pufferlösung, die Temperatur und andere Parameter variiert werden. !.■

Die qualitative Analyse kann durchgeführt werden, indem festgestellt wird, welche Oxidase und welcher '

zugehörige Biokatalysator unter den nacheinander für verschiedene Substanzen, deren Vorliegen erwartet wird, .·

zugesetzten für öas Eintreten eines Sauerstoff-Verbrauches verantwortlich ist, wobei während dieser Bestimmung gleichzeitig beobachtet wird, ob die Kurve für die SauerstoiTaufnahme weiter abfallt oder nicht. ί Da das Ausmaß der Verminderung des Ausgangssignals, welches durch Messung an zwei verschiedenen Zeit- | werten erhalten wird, der Konzentration einer Substanz entspricht, welche auf die Funktion des zugesetzten |. Katalysators anspricht, wobei einer dieser Zeitwerte sich vor der Zugabe dieses Katalysators und der andere sich f an der Stelle befindet, an der die Sauerstofläufnahmereaktion (aufgrund der Reduktion von gelöstem SauerstolT) j ihr Ende erreicht, können sowohl die quantitative, als auch die qualitative Analyse gleichzeitig durchgeführt 1 werden. ?l Es ist festzuhalten, daß das Ausmaß der Verminderung des Ausgangssignals in den Wert des gelösten Sauer- f stoffes umgerechnet werden kann, indem die Sauerstofflöslichkeit bei der Meßtemperatur mit Hilfe einer J: Tabelle festgestellt wird (beispielsweise nach dem Abschnitt »gelöster Sauerstoff« in »Prüfmethode für Indu- | striewasser (JIS K 0101)« und »Prüfmethode für Abwasser (JIS K 0102)«, nachdem eine bestimmte, mit Luft |r gesättigte Pufferlösung in die Reaktionszelle eingefüllt worden ist und das Ausgangssignal des Sensors gemcs- 6 sen wurde. Somit kann die Menge des Sauerstoffverbrauches, bezogen auf die Einheitsmenge einer Standard- JJ probe, erhalten werden, indem die bekannte Konzentration der Standardprobe mitdem Wert der Verminderung § des gelösten Sauerstoffes verglichen wird. Es ist daher möglich, die Konzentration der Substanz unmittelbar aus P. der Menge des verbrauchten Sauerstoffes zu errechnen, ohne daß eine Standardlösung angewendet werden f-

Is ist /u bemerken, cSuU Substanzen, für die keine Verminderung der Konzentration an gelöstem Sauerstoff l'csl/uslcllcn ist, beispielsweise Saccharose, nicht der Einwirkung von Glucoscoxidasc unterliegt, wenn nicht eine vorhergehende Reaktion durchgeführt wird. Es wird daher eine solche vorhergehende Reaktion ausgewählt, in der Invertase, die eine I lydrolasc darstellt, die Saccharose in die reaktive Verbindung Glucose umwandelt, welche dann oxidiert werden kann.

Danach wird die Lösung des Reaktionsgemisches aus Glucose und Saccharose mit Enzymen gemäß der Reihenfolge Glucoseoxidase -► Invertase versetzt, wobei eine stufenweise abfallende Kurve des gelösten Sauerstoffes erhallen wird, die zwei Stufen aufweist.

Die Konzentration an Glucose kann daher aus dem Abfall über die erste Stufe hinweg erhallen werden, während die Konzentration an Saccharose «us dem Abfall über die zweite Stufe erhalten wird. Die vorstehend beschriebene vorhergehende Reaktion kann unter Anwendung von zwei Stufen oder drei Stufen oder auch von mehr Stufen entsprechend dem Erfordernis durchgeführt werden, wobei Hydrolase, Transferenzym (Transferase) oder dergleichen angewendet wird.

!■ür die vorhergehende Reaktion kann darüber hinaus eine Vielzahl von Oxidasen angewendet werden. Durch eine geeignete Kombination der vorstehend beschriebenen Reaktionen wird daher ermöglicht, zahlreiche Sub- is stanzen qualitativ und quantitativ zu bestimmen.

Die Erfindung wird nachstehend ausführlicher anhand einiger Beispiele beschrieben.

Beispiel I

Analyse einer Mischlösung aus Hypoxanthin (nachstehend als Hx bezeichnet) und Xanthin (nachstehend auch als X bezeichnet)

1. Grundlegene Reaktionen für die Analyse

25 O O

[I]

XO

' N N H₂O + O₂ H₂O₂ ^U H H

Hx X

(Hypoxanthin) (Xanthin)

[III] " °

XO . HN Y \ _n UO

-<i

O ' ♦ NO

M₂O + O₂ H₂O₂ ^U H H 2H₂O + O₂ H₂O₂ +CO₂ ^H H

(Harnsäure) (Allantoin)

In den vorstehenden Reaktionen bedeutet das Symbol XO Xanthinoxidase und das Symbol UO Uricase.

2. Angewendete Vorrichtung und Materialien

(1) DO-Sensor:

Clark-Elektrode mit einer Platinkathode mit einem Durchmesser von 3 mm, überzogen mit einem FEP*- F-IIm einer Dicke von 0,025 mm (1/1000 Inch) (Produkt der Oriental Electric Co., Ltd.). V/enn der Sensor in Betrieb ist, wird Gleichstrom von 0,7 Volt angelegt.

(2) Aufzeichnungsvorrichtung:

Hergestellt von Shimazu Manufacturing Co., Ltd. Die Vorrichtung hat eine vollständige Skala entsprechcnd 100 mV und ist fur den Betrieb bei einer Aufzeichnungsgeschwindigkeit von 1 cm/min bestimmt.

(3) Reaktionszeit:

Fassungsvermögen 2000 al, wird bei konstanter Temperatur von 37°C gehalten.

*) ( Pcrfluorcthylenpropylen-Copolymer)

(4) Enzym:

XO wurde in einer Menge von 0,4 I. E./ml in Form einer 3,2 m Ammoniumsulfatsuspension angewendet (hergestellt von Boehringer AG, Mannheim). Außerdem wurde UO in einer Menge von 0,41 I. l^;../ml in Form einer 50 niM Borsäure-Pufferlösung eingesetzt (hergestellt von Oriental Yeast Co., Ltd.)

(5) Pufferlösung:

Hergestellt in Form einer 1/15 m Phosphatpufferlösung (pH 7,6), die mit Luft bei einer Temperatur von ίο 37°C gesättigt war (P. B. S.). Sie hatte eine Konzentration an gelöstem Sauerstoff von 0,214 uMol/ml (bei

einer Temperatur von 37°C).

(6) Zu prüfende Flüssigkeit:

Hx: lOuMol (l,36mg)/ml

X: 10_:xMol(l,52mg)/ml Hx, X: Mischlösung aus beiden Substanzen

3. Verfahren (vgl. Fig. 2 und 3) 20

Ein Volumen von beträchtlich mehr als 2000 ul der Phosphatpufferlösung (P. B. S.) wurde in die in F i g. 1 veranschaulichte Reaktionszelle eingefüllt und die Zelle mit einem Stopfen verschlossen. Die Lösung wurde bis zu einer solchen Höhe eingefüllt, daß ein Teil der Lösung bis zu dem unteren Ende der feinen Bohrung 3 hochstieg. Dann wurde die zu prüfende, X und Hx enthaltende Flüssigkeit (ein Volumen von 5 μΙ bzw. 10 μ|) in eine Mikroinjektionsspritze gefüllt und unter Rühren durch die feine Bohrung 3 in die Reaktionszelle eingespritzt. Danach wurde XO in einer Menge von 20 ·Δ in die Reaktionszelle eingespritzt und alsdann nachdem durch Beobachtung des Ausgangssignals des DO-Sensors, bezeichnet mit Bezugszeichen d\ in Fig. 2 bestätigt worden war, daß die Verminderung des Ausgangssignals des Sensors ein Ende erreichte, wurde UO in einer Menge von 20 μΙ sofort ί zugesetzt, wobei eine aus zwei Stufen bestehende, stufenweise abfallende Kurve für den gelösten Sauerstoff

erhalten wurde, wie sie in Fig. 2 dargestellt ist.

Fig. 3 veranschaulicht schematisch den Zusammenhang zwischen der Zusammensetzung einer Einheit der Flüssigkeit zu der Mischlösung und dem Verhältnis des Abfalls, d\ld₂. Wie aus der Zeichnung ersichtlich ist, besteht eine lineare Abhängigkeit des Abfalls-Verhältnisses ά\Ιά, von dem Mischungsverhältnis der Bestandteile in der Mischlösung, da die charakteristische Kurve sich linear durch zwei Punkte erstreckt, wobei einer dicser Punkte dem Wert d\ld₂ = 1, erhalten mit 100% X, und der andere dem Wert </,/</> = 2, erhalten mit 100% 1 Ix entspricht.

Bei der Prüfung des Zusammenhangs zwischen der Verminderung des Werts an gelöstem Sauerstoff und der Konzentration des Substrats wurde gefunden, daß das Volumen an Sauerstoff O2, angegeben in Mol, das durch die Zugabe von UO adsorbiert wurde, dem gleichen Wert der Konzentration des Substrats im Hinblick auf X oder auf Hx entsprach.

Tabelle 1 Zusammenhang zwischen der Konzentration an X und Hx und dem Volumen des verbrauchten Sauerstoffes O₂ Zusammensetzung des zu analysierenden Volumen des

Substrats in -iMoUrni absorbierten

Substanz Konzentralion C während Sauerstoffes °²

. „ ... in Mol/ml der Reaktion

X 0,05 0,054

Hx 0,25 0,028

Die molare Konzentration von (Hx + X) ist daher aus dem Wert A der Mischlösung aus X und Hx erhältlich und ihr Volumenverhältnis ist darüber hinaus unter Bezugnahme auf Fi g. 3 erhältlich. Im Ergebnis kann die Konzentration jeder der Substanzen bestimmt werden. Jede der vorstehenden Substanzen ist ein Stoffwechsel-Zwischenprodukt, das im Körper von Säugetieren und Menschen nach der Zersetzung von Adenosintri phosphat in Form von Harnsäure ausgeschieden wird. Die Aufstellung einer Methode zur Trennung und quantitativen Bestimmung dieser Substanzen liefert daher einen wichtigen Beitrag für die biochemische Industrie, Nahrungsmittelindustrie und verwandte Industrien. Wie gut bekannt ist, kann mit Hilfe der bisher üblichen Methoden, einschließlich der chromatographischen Methode und der üblichen enzymatischen Methode (die normalerweise durch optische Erfassung und Bestimmung durchgeführt wird) ihre fraktionierte quantitative Bestinrtnung nur mit großen Schwierigkeiten bewerkstelligt werden. Wie aus F ig. 2 klar ersichtlich ist, wird es jedoch mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglicht, jede dieser Substanzen mit hoher Genauigkeit innerhalb kurzer Dauer von weniger als 5 Minuten quantitativ zu-bestimmen, ohne daß eine Standardflüssigkeit erforderlich ist.

Baispiel 2

Quantitative Bestimmung der durch Zersetzung von Adenosintriphosphat erhaltenen Substanzen.

In diesem Beispiel wird die fraktionierte quantitative Bestimmung von Inosinsäure (nachstehend als IMP bezeichnet), Inosin (nachstehend als HxR bezeichnet) und Hypoxanthin (nachstehend als Hx 'iezoiclinet) 5 beschrieben.

I. Grundlcgcne Reaktionen für die Analyse OO ₁₀

N AN

-* Hx

20

1 M

O₂' Ti₃O₂

>UA (2)

H₂O₂ O₂ Ti₁O₂ ^2S

darin bedeuten die Bezugszeichen

AP Alkaliphosphatase, 30

;;; NP Nuclcosidphosphorylase,

% UA. Harnsäure,

ι Rib Ribose, und

-;'■ Pi anorganisches Phosphat.

35 2. Angewendete Vorrichtung und Materialien

1I) DO-Sensor

(2) Aulzeichnungsvorrichtung (Recorder)

(3) Reaktionszeit -to

In diesem Beispiel werden die gleichen Vorrichtungen (1) bis (3) wie in Beispiel 1 unter den gleichen Betriebsbedingungen eingesetzt.

(4) Enzym 45

AP wurde in Form einer 3,2 m Ammoniumsulfat-Suspension zubereitet und in einer Menge von 65 I. E./ml

(bei einer Temperatur von 37° C) angewendet.
NP wurde in Form einer 3,2 m Ammoniumsulfat-Suspension gebracht und in einer Rate von 20 I. E./ml (bei

einer Temperatur von 25° C) angewendet. 50

XO wurde in Form einer 3,2 m Ammoniumsulfat-Suspension zubereitet und in einer Menge von 0,4 I. E./ml

angewendet.

Jedes der vorstehend genannten Enzyme wurde in Form eines Produkts der Boehringer Mannheim AG eingesetzt. 55

(5) Pufferlösung

Als Flüssigkeit A wurde eine 1/15 m Glycin-NaOH-Pufferlösung mit einem pH von 10,5 hergestellt. Außerdem wurden 2 ;J einerO,! m ZnCl_rL6sung und 2 μΐ einerO,l m MgCl_rLösung in2 ml der vorstehend genann- 60 (cn Flüssigkeit A gegeben.

Als Flüssigkeit B wurde eine 1/15 m Phosphatpufferlösung in gleicherweise wie in dem vorhergehenden Beispiel hergestellt,

(6) Zu prüfende Flüssigkeit 65

liin Volumen von 4 _:J einer Mischlösung (10 μΜοΙ/ml), die IMP, HxR und Hx in Form eines Gemisches gleicher Volumteile enthielt, wurde zur Durchführung dieses Versuches verwendet.

3. Verfahrensschritte (vgL Fig. 4)

Das Verfahren kann unter Einhaltung verschiedener Verfahrensschritte durchgeführt werden. Anhand des nachstehenden Fließschemas wird eine typische einfache Verfahrensweise beschrieben, die unter Anwendung einer möglichst geringen Menge an Enzym durchgeführt wird.

zu prüfende Flüssigkeit 4 μΐ Flüssigkeit A 19 al

AP l'yl

I

I Einspritzen des Gemisches in die Reaktionszelle I

I

I Halten bei einer Temperatur von 37° C während etwa 3 Minuten (pH 10,5) I

J

I Einfüllen von Phosphatpufferlösung (Flüssigkeit B) in die Reaktionszelle (pH 7,6) I

γ

I Einspritzen von 20 μΐ XO (Messung von d_t) |

j Einspritzen von 8 uJ NP (Messung von A)}

j Eingießen von 4 ·Α der zu prüfenden Flüssigkeit (Messung von d₃)\

4. Errechnung der Konzentration |

M C₁₁,= -S- χ 0,107 (μΜοΙ/ml) (3) I

C_|Mp = iS ll χ 0,107 (uMol/ml) (4) I

l

C_IUR = iS—Sl χ 0,107 (uMol/ml) (5)

Darin bedeuten das Symbol d₀ die Aufzeichnungsbreite (mm), die dem Ausgangssignal für mit Luft gesättigtes Wasser entspricht, und die Symbole Cn,, C_IMP und C_UxR die entsprechenden Konzentrationen (μΜοΙ/ml) von Hx, IMP und HxR.

Das Prinzip, nach dem die Konzentration jeder der Substanzen durch die vorstehend angegebenen Berechnungen erhalten werden kann, ist für den Fachmann auf diesem Gebiet aufgrund der Reaktionsformel (2) leicht

verständlich. Im Hinbück auf die Tatsache, daß jede der Substanzen Sauerstoff O₂ in einer Menge von 2 Mol pro 1 MoI der ersteren absorbiert, wurde ein Koeffizient von 0,214/2 = 0,107 für die Berechnungen angewendet. Da IMP und HxR in Gegenwart von XO Sauerstoff nicht absorbieren, ist ersichtlich, daß C_(U mit Hilfe von Gleichung (3) erhalten werden kann. Danach kann aufgrund der Reaktion entsprechend dem Wert d₇ C_imv , _IUK| erhalten werden, weil Hx durch Zugabe von XO beseitigt worden ist. Daraus ergibt sich, daß (d, + d₂) der MoI-

SO zahl aller Substanzen entspricht. Was die d₃ entsprechende Reaktion betrifft, ist die anfänglich zugesetzte Substanz verschwunden und da der pH neutral ist, kann AP seine Aktivität nicht ausüben. Daher können alle Substanzen mit Ausnahme von IMP nachgewiesen werden. Die Konzentration von IMP kann daher mit Hilfe von Gleichung (4) aus der Differenz zwischen (d_t + d₂) und </, erhalten werden. Für die Berechnung von C,_[xR ist somit keine spezielle Beschreibung erforderlich.

Beispiel 3

Quantitative Bestimmung von Glucose und Ethylalkohol in ihrer Mischlösung 1) Reaktionsprinzip für die Analyse

>D-Glucose + H₂O + O, >D-Gluconat + H₂O₂ (5)

Ethanol + O₂ Acetaldehyd + H₂O (f>)

GOD: Glucoseoxidase ALOD: Alkoholoxidase

2) Verwendete Vorrichtungen und Materialien

(1) DO-Sensor

(2) Aufzeichnungsvorrichtung (Recorder)

(3) Reaktionszeit

Es wurden die gleichen Vorrichtungen (1) und (2) wie in den vorhergehenden Beispielen eingesetzt. Die Vorrichtung (3) hatte jedoch ein Zellvolumen von 1080 al.

(4) Enzym

GOD wurde in Form eines weißen gefriergetrockneten Produkts eingesetzt, das durch Extraktion und Reinigung aus Aspergillus nigerTyp II erhalten worden war (hergestellt von SIGMA Corporation). Das Enzym hatte eine Aktivität von 33 Einheiten (U)/mg in mit Luft gesättigter Lösung. Die verwendete Enzymlösung wurde durch Auflösen von 5 mg des pulverförmigen Enzyms in 1 ml 0,1 m Phosphatpufferlösung hergestellt. Die so erhaltene Enzymlösung hatte eine Aktivität von 175 U/ml.

ALOD wurde in Form eines gelben gefriergetrockneten Produkts, das aus einem Mikroorganismus erhalten worden war (Produkt der TOYO JOZO Co., Ltd.), eingesetzt und hatte eine Aktivität von 12 U/mg. Die vtrwendete Enzymlösung wurde durch Auflösen von 35 mg des pulverformigen Enzyms in 1 ml 0,1 m Phosphatpuflerlösung hergestellt Diese Lösung hatte eine Aktivität von 420 U/ml (12 x 35).

(5) Grundmedium für die Bestimmung

Dieses wurde in Form einer 0,1 m Phosphatpuflerlösung (pH 7,6), mit Luft gesättigt bei einer Temperatur von 37°C eingesetzt

(6) Zu prüfende Flüssigkeit A. Herstellung der Glucoselösung

Eine 2,5 mM Glucoselösung wurde durch Lösen von 450 mg wasserfreier Glucose (Reagenzgrad, Produkt der Kokusan Chemicals Co., Ltd.) in destilliertem Wasser und Auffüllen auf 100 ml hergestellt.

B. Herstellung der Lösung von Ethanol (ElOH)

Eine 19 mM Ethylalkohollösung wurde hergestellt, indem 290 al Ethylalkohol (Reagenzgrad, Alkoholgehalt 99,5%, Dichte 0,79, Produkt der Kokusan Chemicals Co., Ltd.) auf 250 ml verdünnt wurden.

C. Herstellung der Mischlösung

JcI ml der Lösungen A und B wurden auf 10 ml aufgefüllt und dann miteinander vermischt. Die beiden Komponenten in der so gebildeten Mischlösung hatten daher folgende Konzentrationen:

Glucose: 25 mM x 1/10 = 2,5 mM

IUOH: 19 mM X 1/10 = 1,9 mM

3) Verfahren

(1) Eine BOD-Flasche (Belüftungsflasche) mit einem Fassungsvermögen von 100 ml, die mit dem Grundmedium oder 0,1 m PhosphatpufTerlösung beschickt war, wurde in einen bei 37° C gehaltenen Thermostaten so gestellt und Luft wurde 5 bis 10 Minuten mit Hilfe einer Luftpumpe in die Flasche eingeleitet, um das Grundmedium mit Sauerstoff zu sättigen.

(2) Bei einer konstanten Temperatur von 37°C gehaltenes Wasser wurde durch den Mantel 6 der in Fig. 1 gezeigten Reaktionszelle geleitet, um die Temperatur der Reaktionszelle konstant zu halten. Dann wurde der Stopfen 4 entfernt und das Grundmedium in einer Menge (etwa 1,2 ml) in die Reaktionszelle eingespritzt, die ausreichte, daß die Flüssigkeitsoberfläche des Grundmediums den unteren Teil der feinen Bohrung 3 erreichte. Dann wurde der Stopfen 4 sorgfältig eingefügt, so daß keine Luftblase in der Reaktionszelle verblieb.

(3) Der Ausgangswert, der sich aus dem DO-Reduktionsstrom des DO-Se nsors (2) ergab, wurde auf dem Registrierstreifen der Aufzeichnungsvorrichtung aufgezeichnet, während der Magnetrührer 7 betrieben wurde. Der Abstand d_u zwischen dem Anzeigepunkt und dem DO-Nullpunkt auf dem Registrierstreifen entsprach der O₂-Konzentration von 0,214 μΜοΙ/ml (oder 214 amolar).

Der DO-Nullpunkt fällt im wesentlichen mit dem elektrischen Nullpunkt der Aufzeichnungsvorrichtung zusammen. Der DO-Nullpunkt kann genau festgestellt werden, indem etwa 100 al einer 0,5 molaren wäßrigen Niitriumsullitlösung zu dem Grundmedium gegeben werden, um die DO-Aufnahme zu vervollständigen. Es ist erwünscht, die Bestätigung von d₀ mit Hilfe von Na₇SO₄ in der Anfangsstufe der Bestimmung und nach Beendigung der Bestimmung vorzunehmen und den Durchschnittswert daraus zu verwenden.

(4) Eine Mikroinjektionsspritze wurde durch die feine Bohrung3 des Stopfens 4 der in Fig. 1 gezeigten Reaklions/ullc eingeführt, um 20 il ALOD in das Grundmedium einzuspritzen.

(5) Die zu prüfende Flüssigkeit, welche die vorher angegebenen Mengen an Glucose und Ethylalkohol enthielt, wurde mit Hilfe einer weiteren Mikroinjektionsspritze in das Grundmedium gegeben, während die DO-Aufzeichnung fortgesetzt wurde. Um eine Eichkurve herzustellen, wurde die zu prüfende Flüssigkeit S₁ in Mengen von 5 μΐ, 10 ;xl und 20 μΐ zugegeben.

(6) Aufgrund der Zugabe von S₁ begann an dem durch S, bezeichneten Punkt in F i g. 5 die Aufzeichnung einer Verminderung des DO. Der Grand dafür war die Sauerstoffaufhahme oder Absorption durch das Grundmedium in der Reaktionszelle, die mit dem Fortschreiten der Oxidationsreaktion verursacht wurde, oder die O₃-AuI-nahme durch die Reaktion von Ethylalkohol entsprechend der vorher beschriebenen Reaktionsformel (6). Diese Oj-verbrauchende Reaktion war in etwa 2 Minuten beendet Die Differenz (</,) zwischen dem vor der Zugabe von S₁ und dem nach der Beendigung der Reaktion bestimmten DO-Wert gibt den Grad der SauerstofTaufna-ime von EtOH in der zu prüfenden Flüssigkeit, die in das Grandmedium eingespritzt worden war, an. Fig. 6 zeigt den Zusammenhang zwischen der Menge oder dem Volumen der zugegebenen zu prüfenden Flüssigkeit und der stufenweisen DO-Verminderung (d_t).

Aus der Tatsache, daß dieser Zusammenhang eine durch den Nullpunkt verlaufende gerade Linie bildet, ist ersichtlich, daß die Konzentration von EtOH aus dem Volumen des absorbierten oder verbrauchten O₂ bestimmt werden kann.

20 25 30

Tabelle 2 Zusammenhang zwischen der EtOH-Konzentration

und dem Volumen des verbrauchten Sauerstoffes

Volumen der	Konzentration	DO-Abfall	absorbiertes
in die Reak	an EtOH	*Ld₁)*	Oi-Volumen
tionszelle	während der
eingespritzten	Reaktion
Prot?
M)	(ymol/I)	(mm)	(ymol/l)
5	8,75	8	8,6
10	17,6	13	13,9
20	35,1	31	33,3

35 40 45

Wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist, beträgt das Molverhältnis von EtOH in der Reaktionszelle zu dem absorbierten Sauerstoff etwa 1:1. Die EtOH-Konzentration kann daher ohne Verwendung der Eichkurve aus dem Volumen des absorbierten Sauerstoffes errechnet werden.

(7) Die GOD-Lösung der vorstehend beschriebenen Zusammensetzung wurde dann in das Grundmedium eingespritzt. Aufgrand der O₂-Aufnahmereaktion durch Glucose gemäß der vorstehenden Retirtionsformcl (5) wurde wieder eine Verminderung des DO verursacht. Die Reaktion war in etwa 4 bis 6 Minuten beendet.

Obwohl die molare Konzentration an absorbiertem Sauerstoff, die aus dem DO-Abfall erhalten wurde, im Vergleich mit der molaren Konzentration der Glucose etwas gering war, konnte die Glucosekonzentration aus einer in Fig. 6 gezeigten Eichkurve erhalten werden.

Die gleichzeitige Bestimmung von EtOH und Glucose benötigte nur kurze Zeit von 6 bis 9 Minuten.

50 55 60

Tabelle 3 Zusammenhang zwischen der Glucosekonzentration

und dem Sauerstoffverbrau<;h

Volumen der	Konzentration	DO-Abfall	absorbiertes
in die Reak-	an Glucose	(</:)	Oj-Volumcn
üonszellc	wahrend der
eingespritzten	Reaktion
Probe
dl)	(_:unol/l)	(mm)	(■unol/1)
5	11,5	10	10,8
10	23,1	15	16,1
20	46,2	34	36,6

65

V Beispiel 4

S: Quantitative Bestimmung von Glucose und Mononairiumglutamat (nachstehend auch MSG bezeichnet) in

: deren Mischlösung

%: 5

:■;. I) Reaktionsprinzip der Analyse

; >D-Glucose + H₂O + O₂ >jS-B-Gluconat + H₂O₂ (5)

·; (Die Reaktion ist die gleiche wie in Beispiel 3)

^ L-GIutamat + O₂ + H₂O * ar-Ketoglutarat + H₂O₂ + NH₃ (7) 15

GLOD: Glutamatoxidase

% 2) Verwendete Vorrichtungen und Materialien 2ü

I (I) DO-Sensor

I (2) Aufzeichnungsvorrichtung (Recorder)

f (3) Rcaklionszelle

I 25

I In diesem Beispiel wurden die gleichen Vorrichtungen (1) bii <3) wie in Beispiel 3 eingesetzt.

(4) Enzym

Die gleiche GOD wie in Beispiel 3 wurde verwendet. Als GLOD wurde ein Produkt der Research Laboratories, Yamasa Shoyu Co., Ltd. verwendet. Dieses war a;is einer wäßrigen Extraktlösung einer Weizenkleiekultur von Strcptomyces sp. X-119-6 in Form eines halbgereinigten Produkts erhalten worden, das eine Aktivität von 100 U/ml hatte.

(5) Grundmedium für die Bestimmung

Das gleiche Grundmedium wie in Beispiel 3, d. h. eine 0,1 m PhosphatpulTerlösung, gesättigt mit Luft 6ei einer Temoeratur von 37° C, wurde verwendet. 40

(ei) Zu prüfende Flüssigkeit A. Herstellung von Glucoselösung 45

Die gleiche Glucoselösung wie in Beispiel 3, die Glucose in einer 2,5 mmolaren Konzentration enthielt, wurde hergestellt.

50 B. Herstellung von Mononatriumglutamat

0,468 g Mononatriumglutamat-monohydrat (HOOCH · (NH₂)CH₂CH₂COONa · H₂O) des Reagenzgrads mit einem Molekulargewicht von 187 (Produkt der Wako Chemicals <Jo., Ltd.) wurde mit Hilfe von 0,1 molarer PhosphatpulTerlösung auf 100 ml aufgefüllt, wobei eine 25 mM-Lösung erhalten wurde. 55

C. Herstellung der Mischlösung (S₂)

Jeweils 1 ml der Lösungen A und B wurden mit 0,1 m Phosphatpufferlösung auf 10 ml aufgefüllt und ver- 60 mischt. Die Konzentration jedes der Bestandteile Glucose und Natriumglutamat in der erhaltenen Mischlösung entsprach 2,5 mM/l.

3) Verfahren (vgl. Fig. 7 und 8) 65

Die in Beispiel 3 beschriebene Verfahrensweise wurde wiederholt. Die Zugabe der Probelösung und der Enzymlösung wurde in folgender Weise durchgerührt: Beschickung der Reaktionszelle mit Grundmedium Einspritzen von 20 μ\ GOD ~,i

Einspritzen der Probelösung Si (i> bis 20 Ά) fc,

Messung von d, i)

Einspritzen von 20 al GLOD Messung von

4) Ergebnisse ■'

's Ϊ

Tabelle 4 /f Zusammenhang zwischen der Konzentration des Substrats (Glucose und Glutamin- ·;

säure) und dem absorbierten SauerstofTvolumen Ϊ

Die aufgefundene Menge fur Glucose und Glutamat, die aus dem Volumen des absorbierten SaucrstolTcs erhalten wurde, war im Vergleich mit dem theoretischen Wert von 2,5 mMol relativ niedrig. Es besteht jedoch 35 ein linearer Zusammenhang zwischen der zugesetzten Menge und </, und <A, wie in F i g. 8 gezeigt ist. Die Konzentration jedes Bestandteils kann daher mit Hilfe der in Fig. 8 gezeigten Eichkurve genau bestimmt werden.

Beispiel 5 Quantitative Bestimmung von Inosinsäure und Glutaminsäure in ihrer Mischlösung

1) Reaktionsprinzip für die Analyse

Volumen der in	Konzentration	I)O-AbHiII	durch die Sauer-	DO-AbIuII	durch die S<<ucr-
die Reaktions	an Glucose und	<rf\|)	stoflabsorption durch GOD	(rf₂)	stofl'absorplion durch GLOD
zelle einge spritzten Probe (Sj)	Glutaminsäure während der Reaktion		(iT.oi/ml)		(umol/ml)
(.1)	(y.mol/ml)	(mm)	11,8	(mm)	8,6
5	11,5	11	18,3	8	19,4
10	23,1	17	43,0	18	37,6
20	46,2	40	35

^UA (2) 5o P Rib-IP O₂ H₂O₂ O₂ H₂O₂

(1 MoI IMP entspricht einer SauerstofTaufnahme von 2 MoI Sauerstoff).

L-Glutamat + O₂ + H₂O _ff-KetogIutarat + H₂O₂ + NH₃ (7)

(I Mol Glutamat entspricht einer SauerstofTaufnahme von 1 Mol Sauerstoff).

2) Verwendete Vorrichtungen und Materialien

(1) DO-Sensor

65 (2) Aufzeichnungsvorrichtung (Recorder) (3) Reaktionszeiie

Es wurden die gleichen Vorrichtungen (1) bis (3) wie in Beispiel 3 angewendet,

(4) Enzym

Al': 700 U/ml in einer Glycin-NaOH-PufTerlösung mil dem pll-Wert 10,5

I·,,: XO (20 U) + NP (20 U)/ml

GLOIJ: 100 U/ml. Dieses wurde unter im wesentlichen gleichen Bedingungen wie in Beispiel 4 angewendet. 5

(5) Grundmedium (Pufferlösung) 0,1-molare PhosphatpufTerlösung mit dem pH-Wert 7,6. 10

(6) Zu prüfende Flüssigkeit A. 5'-Natriuminosinat (IMP-Na-SaIz) (CniH||N₄Na_:O_sP · 7H₂O) 15

Molekulargewicht: 518.

0,13 g IMP-Na-SaIz vom Reagenzgrad (Produkt der Tokyo Kasei Co., Ltd.) wurde in 10 ml 0,1 m Phosphatpufl'urlösung unter Herstellung einer 25 mmolaren Lösung gelöst.

B. Mononatriumglutamat · H₂O (Molekulargewicht 187) Nach der in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrensweise wurde eine 25 mmolare Lösung hergestellt.

C. Herstellung der Mischlösung

I ml der Lösung A und 2 ml der Lösung B wurden vermischt und mit Hilfe einerO.l-molaren PhosphatpufTerlösung auf IO ml aufgefüllt, um eine Mischlösung herzustellen. Die Konzentrationen der Komponenten in der 30 Mi'-xhlösung waren wie folgt:

Glutaminsäure: 25/5 = 5 mmolar IMP: 25/10 = 2,5 mmolar

3) Verfahren (1) Vorreaktion

80 μ| Lösung C (IMP + Glut) und 80 al AP-Enzymlösung wurden in einem Mikro-Reagenzglas mit einem Fas- ac sungsvcrmögen von 2 ml miteinander vermischt und bei einer Temperatur von 37°C 15 Minuten lang umgesetzt, wobei IMP in H,R umgewandelt wurde (S₂-Lösung).

(2) Reaktion zur Bestimmung 45

Die Reaktion wurde nach der folgenden Verfahrensweise durchgeführt. Einfüllen des Grundmediums in die Reaktionszelle

i Einspritzen von 20 al der GLOD-Lösnng in die Reaktionszelle

ι Einspritzen von 5 bis 20 al der Probelösung (S₂) in die Reaktionszelle 55

Aufzeichnung von </, (DO-Abfall durch GLOD)

i Einspritzen der Eo-Lösung in die Reaktionszelle

i 60

Aufzeichnung von d₂ (DO-Abfall durch kombinierte Wirkung zwischen NP und XO) Berechnung der Sauerstoffaufnahme aus </, und A

4) Ergebnisse

Tabelle 5

Zusammenhang zwischen der Konzentration von Inosinsäure und Glutaminsäure als Substrate und dem VoIu-⁵ men des absorbierten Sauerstoffes

	Volumen der in	Glutaminsäure-	DO-Abfall	Oi-Absorption	1MP-Konzen-	DO-Abrall	Oi-	Absorption
	die Reaktions	Konzentration	ä\	durch GOD	tration während	dl	(x	1/2) durch
	zelle einge	während der			der Reaktion		NP	+ XO
10	spritzten Probe	Reaktion
	Kl)	(:>mol/ml)	(mm)		(iunol/ml)	(mm)	(:-t	ιοί/ml)

5 11,5 15 16,1 5,78 11,0 5,5

15 10 23,1 28 30,1 11,5 20,5 10,25

20 40,2 49 49,4 23,1 46 23,0

Die Reaktionszeit für die Bestimmung betrug 3,5 bis 6,5 Minuten und der quantitative Wert für IM P entsprach 20 im wesentlichen dem theoretischen wert.

Beispiel 6 25 Quantitative Bestimmung von Glutaminsäure und Inosinsäure in einer Speisewürze

1) Reaktionsprinzip für die Analyse Es fanden die gleichen Reaktionen wie in Beispiel 5 statt.

2) Verwendete Vorrichtungen und Materialien

Die gleichen Vorrichtungen (1) bis (3) wie in Beispiel 5 wurden verwendet. Auch das verwendete Enzym (4) und Grundmedium war das gleiche wie in Beispiel 5.

(6) Zu prüfende Flüssigkeit

0,5 g einer handelsüblichen pulverförmiger· Würze (Produkt der Ajinomoto Co., Ltd.) wurde in 100 m! Phosphatpufferlösung gelöst, um die zu testende Flüssigkeit herzustellen.

3) Verfahren (1) Vorreaktion

80 al AP-Enzymlösung für die Vorreaktion wurden zu 80 μΐ S,-Lösung in einem Mikroreagenzglas mil 2 ml Fassungsvermögen gegeben und das so gebildete Gemisch wurde 5 Minuten bei 37° C gehalten, um das 1M P in der Probe entsprechend Reaktionsformel (2) in H_xR umzuwandeln (S₂-Lösung).

(2) Reaktion für die Bestimmung

Die folgende Verfahrensweise wurde zur Durchführung der Reaktion angewendet. Einfüllen des Grundmediums in die Reaktionszelle

i Einspritzen der S₂-Lösung (10 μΐ = Vs)

60 Einspritzen von Enzymlösung E₀ (15 al)

I Aufzeichnung von d, (DO-Abfall durch NP + XO)

Einspritzen von GLOD-Lösung (10 ;xl) Aufzeichnung von d₂ (DO-Abfaii durch GLOD) Errechnung (der Oi-Aufnahme aus d_x und d₂)

4) Ergebnisse

Tabelle 6

licslimmung von Inosinsäurc (IMP) und Glutamat (Glut) in einer Würze

fiMp, errechnet aus der SauerslulT-•ibsorplion in der Reaktionszelle

Vers. Vs	DO-AbIaIi	(mm)	Oi-Absorplion in der
Volumen der	*ti,*	126	Keuklions/cllc (;iMol)
eingespritzten		121	durch ti durch OLOU
Probe (S₂)		124
(I'D	(mm)
1 10	4		4,45 140
2 10	4	4,45 134
mittel 10	4	4,45 137
</„ l')2mm.
Anmerkung i:

<(iiui- errechnet aus der SauerstofT-absorption in der Reaktionszellc

mg/1

/Mol

mg/1

(mg/i)

1.16 1,16 1,16

140 134 137

26,1 25,0 25,6

27,3 26,2 26,7

Die Konzentration an IMP(c,_MP) wurde nach der folgenden Gleichung erhalten, unter Bezug auf die Tatsache, daß der Zusammenhang der O₂-Absorption mit dem Anteil an IMP 2 Mol/l Mol IMP beträgt, wie inderReaktionsfbrmel (2) angegeben wird.

<iMi· = (J₁Zd₀ x 0,214/2 (nmol/ml)

= (I_xId_n X 0,107 (μΐηοΙ/ml) = </,/</„ X 107 (uMol)

Anmerkung 2:

Die Glutamatkonzentration (c\;i_ul) wurde nach der folgenden Gleichung aufgrund des Zusammenhangs 1 Mol O71 Mol Glutamat erhalten.

i-ciiui = d,/d₀ X 0,214 (μτηοΐ/ml) /

Anmerkung 3:

Die Konzentration, angegeben als Gewicht/Volumen für jeden Bestandteil wurde errechnet, wobei das Molekulargewicht von IMP als 518 (Heptahydrat) und von Glut als 187 angenommen wurde.

Anmerkung 4:

(¹IMr + ecu,,,, multipliziert mit 216, der Verdünnungsrate bei dem Analyseverfahren, ergibt 0,57 g/100 ml, was» im wesentlichen mit der hergestellten Konzentration übereinstimmt. Außerdem beträgt das Verhältnis von IMP zu IMP + Glut (1,16/26,73) x 100 = 4,3%, was als korrekter Wert angenommen wird. Die zur Analyse erforderliche Zeit betrug etwa 10 Minuten.

Beispiel 7 Quantitative Bestimmung von Glutaminsäure und Glucose in Sojasauce

Sojasauce ist eine traditionelle japanische Speisewürze, deren wesentliche Bestandteile Glutaminsäure und Glucose sind. Es existiert kein geeignetes bekanntes Verfahren, um diese Bestandteile in einfacher Weise und rasch zu bestimmen. Erfindungsgemäß ist es möglich, die Bestimmung dieser Bestandteile in etwa 10 Minuten durchzuführen. Probe: kräftige Sojasauce (Kikoman Shoyu Co., Ltd.)

1. Reaktionsprinzip für die Analyse Ms finden die gleichen Reaktionen wie in Beispiel 4 statt.

2. Verwendete Vorrichtungen und Materialien

Es wurden die gleichen Vorrichtungen (1) bis (3) wie in Beispiel 4 verwendet

Darüber hinaus wurden die gleichen Enzyme (4) und das gleiche Grundmedium (5) wie in Beispiel 4 eingesetzt.

(6) Zu prüfende Probe

Kräftige Sojasauce, die unter der Warenbezeichnung »Kikoman Koikuchi Shoyu« von Kikoman Shoyu Co., Ltd. vertrieben wird, wurde eingesetzt. 5 Zubereitung der Probelösung:

1 ml der Probe wurde zur Herstellung der Probelösung mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt und dazu wurde 0,1 m Phosphatpufferlösung in einer Menge von 10 ml pro 1 ml der Probelösung hinzugefügt Die Lösung wurde somit auf 1 :1000 verdünnt und dann zur Analyse mit Luft bei einer Temperatur von 37°C gesättigL

10 3. Verfahren (vgl. Fig. 12 und Tabelle 7)

Für die Analyse wurde die folgende Verfahrensweise angewendet:

15 Füllen der Reaktionszelle mit lOOOfach verdünnter Sojasauce-Lösung

ι Einspritzen von GLOD (10 ;J)

ί Aufzeichnung der Kurve für den DO-Abfall (Glutaminsäureoxidase)

20 i

Messung von rf,

i Einspritzen von GOD (10 jd) (Glucoseoxidase)

t 25 Aufzeichnung der Kurve für den DO-Abfall

i Messung von rf>

4. Ergebnisse s

Tabelle 7 \ Bestimmung von Glutaminsäure und Glucose in Sojasauce I DO-Abfall (mm) Oj-Absorption Gi-Absorplion Konzentralion |

durch GLOD durch GOD (g/100 ml der Sojasaucc) %

40 80 91 86,0 101,0 1,26 1,76

4, (in LuΓι gesättigtem Wasser) = 199 mm.

Die Berechnung wurde in folgender Weise vorgenommen.

c_c,,_ul: Konzentration der Glutaminsäure in der Sojasauce (g/100 ml) r_Ciu· Konzentration der Glucose in Sojasauce (g/100 ml)

so _ d_t (mm) x0,214 (mM) x 1000(Verdünnungsrate)X 147 (M.G.)

^C<>luI d₀ (mm)

= 80 X 0,214 X 1000 X 147 (mg) _{= )2} ^_{6 /(} = l,26(gGlutaminsäure/100ml)

rf» (mm) x	0,214 (mM) x 1000 x	180	(M	.G	.)
	(/„ (mm)
91	X 0.214 x 1000 X 180	(mg)

₆₅ = = 17,614 (mg/1)

= lJöfgGlucose/IOOml)

16

Beispiel 8 Quantitative Bestimmung von L-Ascorbinsäure (AsA) und Glucose in einer Mischlösung

1) Reaktionsprinzip fur die Analyse

L-Ascnrbinsäure + 1/2 0. ► Dehydroascorbinsäure + H₂O (8) JM)-Glucose + H₂O₂ -^°-—»· jfif-D-Glüconat + H₂O₂

ASOD: Ascorbatoxidase GOD: Glucoseoxidase

2) Verwendete Vorrichtungen und Materialien

In diesem Beispiel wurden die gleichen Vorrichtungen (1) und (2) wie in Beispiel 5 eingesetzt.

(3) Reaktionszelle

Die verwendete Reaktionszelle hatte ein Zellvolumen von 1160 ·Δ und hatte praktisch die gleiche Konstruktion, die in Fig. 1 gezeigt ist.

(4) Enzyme

GOD wurde in Form eines gelben gefriergetrockneten Produkts, das durch Extraktion aus Mikroorganismen und anschließende Reinigung erhalten worden war, eingesetzt (Produkt der Oriental Yeast Co., Ltd.). Es hatte cine Aktivität von 340 U/mg in einer mit O₂ gesättigten Lösung.

GOD-Enzymlösung wurde durch Auflösen von 5 mg des pulverformigen GOD in 1 ml einer 0,1 m Phosphatpuffcrlösung (pH 7,6) hergestellt. Sie hatte eine Aktivität von 1700 U/ml. ASOD (Produkt der Oriental Yeast Vo., Ltd.) wurde in Form eines weißen gefriergetrockneten Produkts eingesetzt, das durch Reinigung des aus Gurken extrahierten Enzyms erhalten worden war. Es hatte eine Aktivität von 168 U/mg.

Die ASOD-Enzymlösung wurde durch Auflösen des pulverformigen ASOD-Enzyms in einer 0,1 m Calciumnli&TphalpulTcrlösung, die 1 mg Albumin pro ml als Stabilisator enthielt, in einer Menge von 1 mg/ml hergestellt. Die Aktivität dieser Lösung betrug 168 U/ml.

(S) Grundmedium für die Bestimmung

0,1 molare PhosphatpufTerlösung (PBS) (pH-Wert 7,6), die mit Luft bei einer Temperatur von 30⁰C gesättigt worden war. wurde verwendet.

(6) Zu prüfende Flüssigkeit A. Herstellung der Ascorbinsäurelösung (AsA)

[-!ine 10 mM Ascorbinsäurelösung wurde durch Auflösen von 176 mg L-Ascorbinsäure (Reagenzgrad, Produkt der Wako Pure Chemical Ind., Ltd.) in 100 ml einer 2%igen ΗΡΟ,-Lösung hergestellt und in einem Kühlschrank aufbewahrt. Die Lösung wurde vor der Anwendung in dem gewünschten Verhältnis verdünnt (HPO₅ ist ein Stabilisator für AsA).

B. Herstellung der Glucoselösung

2.S mM Glucoselösung wurde durch Auflösen von 450 mg wasserfreier Glucose (Produkt der Kokusan Chemicals Co., Ltd.) in destilliertem Wasser und anschließendes Auffüllen auf 100 ml hergestellt.

C. Herstellung der Mischlösung

I ml Lösung A und 0,4 ml Lösung B wurden miteinandervermischt und das so erhaltene Gemisch wurde mit destilliertem Wasser auf 2 ml aufgefüllt. Die Konzentrationen der Bestandteile in der Mischlösung waren daher folgende:

AsA: 1OmM x 1/2 = SmM Glucose: 25 mM x 1/5 - 5 mM

3) Verfahren

(I) liinc 100 ml-Belüflungsllasche (BOD-lFlasche) wurde mit dem Grundmedium oder einer 0,1 m PhosphatpulTcrlösung gelullt und in einen bei 30⁰C gehaltenen Thermostaten gelegt und Luft wurde während 20 Minuten mil I IiIIc einer Luftpumpe in die Flasche eingeleitet.

(2) Bei 30⁰C gehaltenes Wasser wurde durch den Mantel der Reaktionszelle geleitet, so daß die Temperatur der Reaktionszelle konstant bei 30° C gehalten wurde. Dann wurde der Stopfen von der Reaktionszeit entfernt und 2 ml des mit Luft gesättigten Grundmediums in die Reaktionszelle eingespritzt, so daß die Flüssigkeit den unteren Teil der feinen Bohrung erreichte. Dann wurde die Reaktionszelle so mit dem Stopfen verschlossen, daß keine Luftblase in der Reaktionszelle verblieb.

(3) Der Ausgangswert des DO-Reduktionsstroms des DO-Sensors wurde auf einem Meßstreifen der Aufzeichnungsvorrichtung aufgezeichnet, während ein Magnetrührer in der Reaktionszelle rotierte. Der Abstand </_u zwischen dem Anzeigepunkt und dem DO-Nullpunkt entsprach der Sauerstoffkonzentration von 0,235 μΜοΙ/ml (bei 30⁰C).

(4) Eine Mikroinjektionsspritze wurde tief in die feine Bohrung der Reaktionszelie eingeführt und 20 j J ASOD wurden in die Zelle eingespritzt.

(5) Die zu prüfende Flüssigkeit, die Ascorbinsäure und Glucose enthielt, wurde mit Hilfe einer weiteren Injektionsspritze eingespritzt, während die DO-Aufzeichnung fortgesetzt wurde. Um eine Eichkurve zu erhalten, wurde die Flüssigkeit in Mengen von 10 μΐ, 20 μΐ und 30 al eingespritzt

(6) Der DO-Abfall beim Einspritzen jeder Probe wurde aufgezeichnet und ist in Fig. 13 angegeben und mit »Probe« bezeichnet. Dies war auf die Sauerstoffabsorptic a durch das Grundmedium in der Reaktions/.clic zurückzuführen, die mit dem Ablauf der Sauerstoff verbrauchenden Reaktion durch Ascorbinsäure entsprechend Reaktionsformel (1) auftrat Die Reaktion war in etwa 1 Minute beendet. Die erhaltene Differenz d\ der DO vor dem Einspritzen von ASOD und der DO nach Beendigung der Reaktion gibt den Sauerstoffverbrauch durch die zu prüfende Flüssigkeit an.

Fig. 14 ae^t den Zusammenhang zwischen der Eingabe der zu prüfenden Flüssigkeit und dem DO-AbIaII. Tabelle 8 Zusammenhang zwischen der AsA-Konzentration und

dem Volumen des verbrauchten Sauerstoffes

Volumen der	Konzentration	DO-Abfall	Volumer, des
in die Reak	von AsA	Wi)	absorbierten
tionszelle	während der
eingespritzten	Reaktion
Probe
Vs W)	(uMoI/I)	(mm)	(jiMol/1)
ίΟ	43,0	18	21,4
20	86,0	38	45,1
30	129,0	58	68,8

(7) Danach verursachte das Einspritzen von 20 μΙ GOD-Lösung einen erneuten Abfall des OO-Wcrlcs. Die Reaktion war in 4 bis 6 Minuten beendet.

Die vorstehend beschriebene gleichzeitige Bestimmung von AsA und Glucose erforderte nur eine kurze Zeil von 5 bis 7 Minuten.

Tabelle 9 Zusammenhang zwischen der GIucose-Konzentration

und dem Volumen des verbrauchten Sauerstoffes

Volumen der	Konzentration	DO-Abfall	Volumen des
in die Reak	von Glucose	(</\|)	absorbierten
tionszelle	während der		O:
eingespritzten	Reaktion
Probe
Vs (_μΙ)	ΙμΜοΙ/Ι) _%	(mm)	(μΜθΙ/1)
10	43,0	25	29,7
20	86,0	46	54,6
30	129,0	75	89,0

Wie aus Tabellen 8 und 9 ersichtlich ist, beträgt der Wert für die Sauerstoffaufnahme durch AsA und Glucose etwas .veniger als der aus den Rcaktionsl'ormeln (8) und (2) errechnete theorelhische Wert. Wie jedoch in l^;ig. 14 gezeigt ist, tritt für jede der Komponenten ein linearer Zusammenhang zwischen der Sauerstoffaulhahmc und der Konzentration auf, dcrals gerade Linie, die durch den Ursprungswert verläuft, angegeben werden kann. Aus diesem Grund erfolgt die Bestimmung von Ascorbinsäure und Glucose unter Anwendung der in F i g. 14 gezeigten Eichkurve.

Die Merkmale und Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens werden nachstehend nochmals kurz dargclegi.

1I) Die Vorbehandlung der Proben ist leicht durchzuführen, ohne daß Einflüsse durch die Färbung, Trübung, UV-Absorption und andere Eigenschaften der Flüssigkeit geprüft werden müssen.

(2) Die Messungen sind sehr rasch durchzufuhren.

(3) Ausgezeichnet hohe Spezifität ist gewährleistet.

(4) Die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens kann sehr einfach gestaltet werden. 5

(5) Die Messungen können bei niederen Konzentrationen im Bereich von 0,005 bis 0,1 uMol/ml mit ausgezeichnet hoher Empfindlichkeit durchgeführt werden.

(6) Die Menge des verbrauchten Enzyms kann durch Anwendung einer kleinen Reaktionszelle bei einem geringen Wertgehalten werden. Wie in Beispiel 2 beschrieben ist, kann einmal zugesetztes Enzym wiederholt verwendet werden (so kann beispielsweise XO dreimal und MP zweimal verwendet werden). 10

(7) Alle Verfahrensschritte werden bei Raumtemperatur mit hoher Sicherheit durchgeführt und gefährliche Chemikalien sind nicht erforderlich.

Wie aus der vorstehenden Beschreibung leicht ersichtlich ist, bietet das erfindungsgemäße Verfahren zahlreiche Vorteile gegenüber den bisherigen zeitaufwendigen und nur für die Bestimmung einerspezifischen Kom- 15 poncntc geeigneten Arbeitsweisen und ist daher sehr wertvoll für die Analyse von verschiedenen gleichzeitig in einem flüssigen System vorliegenden Substanzen, wie sie vorstehend erwähnt wurden, also z. B. Lipoide, Aminosäuren, zu Nucleinsäuren führende Stoffe, Alkohole, Vitamine und dergleichen, wie sie in Nahrungsmitteln, Getränken und Organismen vorkommen. Ohne Trennung der Komponenten voneinander wird die jeweilige Oxidase zu der Lösung zugesetzt, um die Sauerstoffaufnahme zu feewirken und alsdann mittels des DO-Sensors 20 die Menge der Sauerstoffaufnahme bzw. mit anderen Worten die Verminderung des gelöste Sauerstoffs ermittelt.

Die Erfindung wurde zwar anhand typischer Ausführungsformen und Beispiele beschrieben, sie ist jedoch nicht auf diese beschränkt.

Hierzu 9 Blatt Zeichnungen

Claims

ι ι Patentansprüche:

1. Verfahren zur Schnellanalyse von mehreren in einem flüssigen System vorhandenen Bestandteilen, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:

Einfüllen der zu analysierenden Flüssigkeit und einer pH-Pufferlösung in eine einzelne Reaklionszclle, die gegenüber dem Zutritt von Außenluft abgedichtet ist,

aufeinanderfolgende Zugabe von mehreren biologischen Katalysatoren, welche in Form einer Enzymverteilung vorliegen sowie die Aufnahmereaktion von gelöstem Sauerstoff induzieren, wobei die in dem flüssigen System vorliegenden mehreren Bestandteile nacheinander stufenweise selektiv oxidiert werden, automatische Messung des gelösten Sauerstoffs und Aufzeichnung des Oxidationsverfahrens mit Hilfe nur eines Sensors, der aufgelösten Sauerstoff anspricht (DO-Sensor), wobei eine stufenweise abfallende Kurve für den gelösten Sauerstoff erhalten wird,

qualitative Bestimmung jedes der Bestandteile durch die Art des zugesetzten biologischen Katalysators und die Reihenfolge der Zugabe der biologischen Katalysatoren und quantitative absatzweise Bestimmung jedes Bestandte As aufgrund der Verminderung der Menge des gelösten Sauerstoffs.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Oxidation der Bestandteile in zwei, drei oder mehr Stufen durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in einer Reaktionszelle durchgehen wird, an deren einer Seitenwand ein Sensor für gelösten Sauerstoff befestigt ist und deren oberer Teil luftdicht mit einem Stopfen verschlossen ist, der mit einer feinen Bohrung versehen ist, die zur Zugabe der Pufferlösung, der zu prüfenden Flüssigkeit und der biologischen Katalysatoren dient.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die untersuchende Flüssigkeit eine Mischlösung von Hypoxanthin (Hx) und Xanthin (X) ist, daß die mehreren biologischen Katalysatoren Xanthinoxi- dase (XO) bzw. Uricase (UO) in Form einer Suspension bzw. Lösung sind und zunächst die Xanthinoxidasc (XO) zu der Mischlösung und. nach beendeter chemischer Reaktion der (XO) alsdann die Uricase (UO) zugesetzt werden sowie im Anschluß an die vollständige chemische Reaktion der (UO) die quantitative Berechnung von (Hx) und (X) aufgrund des Verhältnisses von d_xld₂ erfolgt, wobei rf, dem Wert der Verminderung vom gelösten Sauerstotf (DO) durch die Zugabe von (XO) und d₂ dem Wert der Verminderung von (DO) durch die Zugabe von (UO) entsprechen.

5. Verfar 'en nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die untersuchende Flüssigkeil eine Mischlösung von lnosinsäure (IMP) Inosin (HxR) und Hypoxanthin (Hx) ist, daß die mehreren biologischen Katalysatoren alkalische Phosphatase (AP), Xanthinoxidase (XO) und Nucleosid phosphorylase (NP) sind und daß zu der Mischlösung bei einer" pH von etwa 10,5 zunächst (AP) zugesetzt wird, alsdann durch Zugabe einer

Phosphat-Pufferlösung der ph-Wert auf 7,6 gebracht und (XO) als zweites Enzym zugesetzt sowie nach der Bestimmung des Abnahmewerts d·, von (DO) aufgrund der Zugabe von (XO) schließlich als drittes Enzym (NP) zugesetzt und der Abnahmewert d₂ von (DO) aufgrund des Zusatzes von (NP) ermittelt werden, woraufhin noch eine gleiche Volumenmenge der zu untersuchenden Lösung, wie zu Beginn, der Mischlösung zugegeben und der Abnahmewert von (DO) ermittelt und die quantitative Berechnung vea </■., rf, und rf, nach den folgenden Gleichungen erfolgen: