DE2233523A1

DE2233523A1 - Verfahren zur zuechtung von mikroorganismen und danach erhaltenes proteinreiches biologisches material

Info

Publication number: DE2233523A1
Application number: DE2233523A
Authority: DE
Inventors: Charles Montant; Pierre Raynaud
Original assignee: Agence National de Valorisation de la Recherche ANVAR; Azote et Produits Chimiques SA
Current assignee: Azote et Produits Chimiques SA; Bpifrance Financement SA
Priority date: 1971-07-09
Filing date: 1972-07-07
Publication date: 1973-01-25
Also published as: DK133438B; CH550248A; FR2145768A5; DK133438C; GB1396954A; BR7204553D0

Description

500-19.Q12P 7. 7. 1972

1. Agence nationale de valorisation de la recherche 92 - Pa r i s Defense (Prankreich)

2. Azote et Produits Chimiques S,A,, Toulouse (Prankreich)

Verfahren zur Züchtung von iviikroorganismen und danach erhaltenes pro.teinreich.es -biologisches Material

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung, eines probeinreichen Γ ro du kt es durch Züchtung von Mikroorganismen. Das nach diesem Verfahren erhaltene biologische !Material bzv/, die "Moniasse" ist als Zusatz für Tierfutter brauchbar,

Das erfindungsgemäße Verfahren besteht in der Kultur bzw. Züchtung von isolierten Stämmen, die zu der Gesamtheit der im .-Mageninhalt dea Kaninchens lokalisierten und sich bei pH 2 entwickelnden Septomyzeten gehören.

Diene Septomyzeten werden durch Entnahme von Mageninhalt vom Kaninchen mit HLiCe einer Sonde oder direkt nach Öffnen

iiölle

des Magens isoliert,, Ausgehend von dieser Entnahme erfolgt eine punktförmige oder streifenförmige Aussaat auf atandard-G-elosemilieu. Sobald die ersten Pilzkoloniebildiingen in Erscheinung treten, erfolgt eine Rückaussaat zur 'Erzielung einer reinen Kultur. Ks werden dann je'z/eils nur die Stumme behalten, die wich auf einem Milieu bei pH 2 entwickeln.

Die von den Erfindern so isolierten Sepfcomyseten wurden beim Museum d'Histoire Naturelle von Paris unter den folgenden Nummern hinterlegt:

2037: Oidiodendron griseum, 2066: Penlcillium cyelopium, 2067' Penicillium lilacinum, 2068: Fenicillium canesceris,. 2069: Penicillium crustosum.

Die angegebenen Kümmern entsprechen den Mummern der Stämme im Katalog der Kollektion. Diese Stämme v/urden von den .Erfindern mit Oidiodendron LOOl und Penicillium L002 bis L005 bezeichnet.

Das OLdiodendron griseim ist eine Hyphomyzete, die von Robak untersucht wurde. Das Oidiodendron griseum (2037)"-Stainm LOOl - besitzt die folgenden morphologischen Eigenschaften: Die Kulturen auf "Agar-üifko" in aufrechten Rohren aeigen sich in Form eines lockeren J?Li.u'.>is von grauer farbe, i>ie Kolonien oind in ihrem Zentrum gewölbt; diu Hyphen von ?.,bix Durchmesner entwickeln sich an der Oberfläche des festen oubstrntu; in flüssigem Liilieu bilden sie mehr oder wenige)r miteinander verbundene Kissen, Die Hyphen tragen Γαιϋfc-uhcoiiporcm, die auf flUssigom KulturmilLeni auf liitratbasis "Korämion" (coremLe.;) bilden können. Die Ulfb-tixosporen stehen senkrecht nach oben und unterteilen sich dabei; sie sind 40 bis IOC) i\ lang.

209884/1244

Am Ende unterteilen sie sich stets ausgehend vom Ende transversal in einer großen Vielzahl von kurzen Abschnitten, die sich rasch abrunden: Es kommt zur Bildung von Arthrosporen mit einem Durchmesser von 2,6 Ju. ■

Die Ärthrosporen sind stets einzellig und erscheinen in Ketten am Ende der hellgrauen Exosporen. Die Konidien können sich direkt ausgehend von vegetativen Hyphen ohne Bildung von Exosporen bilden, insbesondere auf dem Magensaft von Kaninchen in Gegenwart von 2 fo G-lucose.

Der Stamm L002 (Penicillium aus der Reihe cyclopium WESTL) besitzt folgende morphologische Kennzeichen:

Die Kulturen (auf "Agar-Difko" in aufrechten Rohren) von blaugrüner Par be (Farbe ITr. 359 der Farbskala von KLINSIEK und VALETTE) färben sich in den beiden ersten Kulturtagen; die Oberfläche der Kultur ist feingranulös mit gewölbtem Zentrum; die Kulturen können auf synthetischem I.rilieu braun-organge werden. Die Hyphen können 6 μ Durchmesser erreichen; die Büschel oder Pinsel haben eine Länge von 50 bis 60 μ und sind asymmetrisch angeordnet. Die kugelförmigen oder ellipsoidal geformten Konidien haben einen Durchmesser zwischen 3 und 6 n.

Diese bei pH 2 isolierten Stämme haben den Vorteil sich in sehr saurem Milieu entwickeln zu können. So können sie sich beispielsweise selbst bei einem pH-Wert von 1,7 bis 5 entwickeln. Bei der Kultur in saurem IJedium kann die Sterilisation des Kulturmilieus auf ein Minimum reduziert werden.

Nach einem Merkmal der Erfindung wird die Septomyzete auf einem Hähr-iviedium kultiviert, das zumindest eine Quelle

_BAD OBSGlNAL 209884/12U

für Stickstoff (Stickstoffverbindung) und zumindest ein Kohlehydrat aufweist. Das Nährmilieu enthält ebenfalls mineralische Elemente bzw. Zusätze wie PO.^f", K⁺, Mg⁺⁺ und Oligoelemente (Pe, Zn, Mn). Man kann Vitamine zugeben, aber ihre Anwesenheit ist von geringem Einfluß auf die Kultur.

Der in Gramm Stickstoff pro Liter Kulturmilieu ausgedrückte Gehalt an Nährstickstoff liefernden Verbindungen im Kulturmilieu liegt bei zumindest oder mehr als 1,10 g/l und vorzugsweise zwischen Ί ,16 und 2,34 g/l; unterhalb der unteren Grenze wird kein merklicher Einfluß auf die Entwicklungsgeschwindigkeit des Myzels, beobachtet und oberhalb der oberen Grenze keinerlei deutliche Verbesserung während der Entwicklung des Hyzels festgestellt.

Als Stickstoffquellen sind die in Tabelle 1 angegebenen Substanzen geeignet; Tabelle 1 zeigt die Substanzmengen, die Stickstoffgehalten der Kultur von 1,16 bis 2,34 g Stickstoff pro Liter Kultur entsprechen.

Tabelle 1

	Die Stickstoffgehalten von	6 g/l bzw	S	. 2,54 g/l
Substanz	1,1	entsprechenden	g	Substanzmengen
	2,5	g	5,0 g
Harnstoff	7,4	5 g	14,8 g
Alanin	5,6	S	7,2 g
Arginin	5,5	g	11,1 g .
Asparaginsäure	8,4	S	16,8 g
Kaliumnitrat	5,5		6,6 g
Ammoniumnitrat	5,5		11,0 g
Ammoniumsulfat

209884/12U

BAD ORfGINAL

- Ss ist klar, daß man mehrere unterschiedliche Stickstoffquellen heranziehen kann, unter der Bedingung, daß der: Gesamtgehalt an Stickstoff zumindest bei 1,10 g pro Liter Kulturmilieu liegt.

Von den verschiedenen Stickstoffquellen hat sich Harnstoff als sehr interessant herausgestellt, da er den Stoffwechsel der erfindungsgemäß angewandten Mikroorganismen begünstigt. ■

Hach einem weiteren Merkmal der Erfindung wird das im Kähnnilieu enthaltene Kohlehydrat in einer Dosis zwischen 10 und 30 g pro liter Kulturmilieu angewandt. Die beste Ausbeute wird erhalten, wenn die in Gramm Kohlenstoff pro Liter Kulturmilieu ausgedrückte Kohlehydratkonzentration bei 8 g/l liegt, was Konzentrationen- von 20 g/l Glucose, 20 g/l Ribose, 20 g/l Arabinose, 20 g/l Maltose-monohydrat, 18,9 g/l Saccharose, 18,9 g/l wasserfreier Maltose, 18,9 g/l Lactose, 18 g/l Stärke und 18 g/l Cellulose entspricht. Andfere Kohlehydratquellen wie gemahlene Mais- oder Weizenkörner und Melassen können verwendet werden*

Die Kultur der Septomyzeten erfolgt bei einer Temperatur von 18 bis 25 G₀ Die Produktion von Trockenmaterial ist optimal bei 18 G. Dagegen tritt die Sporenbildung bei 25 G seht zeitig auf.

Nach der Züchtung wird die "Biomasse" durch das ggf. mit Ausgangsmaterialien gemischte Myzel gebildet. Die Biomasse wird vor der Verwendung vorzugsweise getrocknet.

Beispielsweise enthält die durch Kultur von Oidiodendron

209884/124 4 BAD

griseum bei pH 2 mit Harnstoffkonzentrationell von 3 g/l erhaltene Biomasse die folgenden Aminosäuren: Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Prolin, Citrullin, Glykokoll, Alanin, Valin, Cystein, Methionin, Isoleucin, Leucin, Tyrosin, Phenylalanin, ß-Alanin, Ornithin, Lysin, Histidin, Tryptophan, Arginin.

Die Gesamtmenge der am dreisehnten Kulturtage entwickelten Aminosäuren lag bei 38 ^CJ> des gesamten Trockengewichts der Biomasse. Die erhaltene Biomasse kann als Zusatz flir Tierfutter Verwendung finden. Sie ist besonders für Tiere geeignet, die einen einzelnen Magen haben wie Kaninchen und Schwein.

Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden anhand der nachfolgenden Beschreibung mehrerer Beispiele fur die Züchtung und die Anwendung der erhaltenen Produkte besser verständlich werden.

Kulturbeispiele

Beispiel 1

Kultur von Oidiodendron griseum bei pH 2

Der Stamm L001 von Oidiodendron griseum, Robak (Wr. 2037 im Katalog der Kollektion des Museum d'Histoire Naturelle von Paris) wurde auf ein Nährmilieu ausgesät mit:

Wasser " 100 ml Monocalciumphosphat . 0,80 g

Monokaliumphosphat 0,15 g

Magnesiumsulfat: 0,05 g

Mangansulfat 0,002 g

Zinksulfat 0,002 g

Glucose 2 g

209884/1244 ^BAD

Der pH-Wert des Hilieus wurde auf.2 eingestellt und dann wurden nach Sterilisieren mit Eau de Javelle aseptisch 0,25 g Harnstoff hinzugegeben.

Der Stamm wurde bei 24°C unter Ausschluß von Licht in trapezoidalen 3?läschchen (Fläschchen von ^lfJouan"-Typ) kultiviert. Während der Entwicklung des Liyzels bleibt der pH-Wert praktisch konstant und gleich 2.

Das erhaltene Myzel gestattet eine numerische Angabe des V/achstums.

Das nach 7, 11 und 15 Kulturtagen erhaltene im Trockenschrank bis auf G-ewichtskonstanz getrocknete Myzel wog 29 j 7 mg; 147 mg und 125 mg. Das Maximum des Trockengewichts wird mithin um den 11. Tag herum erhalten.

Beispiel 2

Kultur von Oidiodendron £ri_seum bei pH 5,4

Unter Aussaat des Stammes L001 von Oidiodendron griseum, Hobak in das in Beispiel 1 beschriebene Kulturmilieu mit 0,25 g Harnstoff pro 100 ml Wasser wurde die Kultur bei pH 5_}4 durchgeführt; das nach 7, 11 und 15 Kulturtagen unter Lichtabschluß erhaltene auf Gewichtskonstanz getrocknete Myzel wog 19,8; 78,2 und 111 mg.

Beispiel 5

Kultur von Penicilliuni cyclopium bei pH 2

Der Stamm L002 von Penieilliuin cyclopium (I\fr. 2066 im Katalog der Kollektion des IJuseum d'Histoire Naturelle von Paris)

209884/1244

wurde auf ein Nährmilieu mit folgenden Gehalten ausgesät:

Wasser ■ 100 ml

Monocalciumphosphat 0,08 g

Monokaliumphosphat 0,15 g

Magnesiumsulfat 0,05 g

Mangansulfat 0,002 g

Zinksulfat 0,002 g

Glucose 2 g

Kaliumnitrat 0,153 g

Der pH-Wert wurde auf 2 eingestellt.

Der Stamm entwickelte sich bei 24 0; der pH-Wert blieb in der Nähe von 2. Für 100 ml Milieu .erhält man die folgenden Myzel-Trockengewichte (Sporen und Fäden):

	4	3.	Tag	60	mg
	5.	Tag	300	mg
	10.	Tag	515	mg
Beispiel

Der Stamm L002 von Penicillium cyclopium wurde auf ein mit demjenigen von Beispiel 3 identisches Uährmilieu (11 Liter) in einer klassischen Fermentationsvorrichtung mit einem Inhalt von 14 Litern mit Rührer und Sauerstoffzuleitung ausgesät. Der Eührer bzw. die Kulturumwälzung wurde auf 100 Upm eingeregelt und der Sauerstoffdurchsetz auf 0,2 1 pro Liter Milieu und kinute. Nach 88 Stunden Kultur wurde ein Trockengewicht von 6,7 g Myzel pro Liter gewonnen. Der Gehalt an Proteinen im auf Gewichtskonstanz getrockneten rohen Myzel erreicht 25 $.

BAD ORIGINAL 2 0 9 8 8 A / 1 2 A 4

Beispiel 5

Es wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 4 mit einem Sauerstoffdurehsatz von 1,4 Litern pro liter Milieu und Iviinute gearbeitet und nach 96 Stunden ein Trockengewicht von 5,7 g üyzel pro Liter Milieu gewonnen.

Der Gehalt an Proteinen im auf Gewientskonstanz getrockneten rohen Kyzel erreicht ebenfalls 25 Gew_o^.,

Beispiel 6 :

Penicilllum cyclopium wurde in einer Permentationsvorrichtung kultiviert, die durch einen Kunststoffbehälter von 1500 1 Inhalt mit einer Belüftung am Boden zur Sieherstsllung ' einer Bewegung des Inhalts gebildet wurde. Das Kulturmilieu hatte folgende Zusammensetzung:

H₃PO₄ !	1,	4	g/i
MgSO₄, 7H₂O ;	0,	2	g/l
Harnstoff :	0,	5	g/l

20 g/l idelassen mit 60 °/o Saccharose und sein pH war auf 3 eingestellt. .

Wasser, Phosphorsäure und Magnesiumsulfat wurden durch üiinführung von Natriumhypochlorit bis die Prüfung mit ortho-Tolidin die Anwesenheit von etwa 50 ppm restlichem freien Chlor anzeigte, sterilisiert. Lielasse und Harnstoff wurden 1 Stunde lang bei 100⁰G sterilisiert, bevor 3ie in den Behälter gegeben wurden.

Das Kulturmilieu wurde unter Verwendung von Vorkulturen

BAD 2 0 9 0 B A / 1 2 U

besät, die in einer Fermentationsvorrichtung von kleiner Kapazität (TO 1) erhalten worden waren. Die Überführung von einem Behälter in den anderen wurde mit Hilfe einer vorangehend sterilisierten Pumpe bewerkstelligt. Die Temperatur schwankte im Verlaufe der Kultur zwischen 20 und 25°O» Jtfach 3 Tagen wurden 7,5 g/l eines Myzels erhalten, in dem die gesam-ten stickstoffhaltigen Materialien 38 </' des Trockenmaterials ausmachten.

Beispiel 10

Penicillium cyclopium wurde auf einem Milieu kultiviert, das durch eine ilischung von zerkleinertem und angefeuchteten Weizen mit 10 g Harnstoff pro kg Getreide gebildet wurde und einen pH-Wert von 2,3 hatte. Das Iviilieu wurde mit einer Sporensuspension besät.

Der Weizen wurde durch Anfeuchten in heißem Viasser von hoher Temperatur und einstundiges Aufheizen auf 100⁰C sterilisiert. Das Penicillium entwickelt sich an der Oberfläche der Körner in den Zwischenräumen und bildet 3ehr rasch Sporen. Nach Ablauf von 17 Tagen ist der Gehalt an stickstoffhaltigem Material von 16,45 auf 24,80 <?j angestiegen, entsprechend einer Zunahme um 54 '/» und das Trockenmaterial (Getreide + Pilz) nimmt von 25,5 kg auf 17,43 kg ab.

Toxizität

Die chronische Toxizität wurde an Gruppen von 10 Kaninchen überprüft. Dazu wurden den Tieren zwei Monate lang alle 3 Tage 10 g frisches Myzel vom Stamm LOOI von Oidiodendrou durch LIagenaoride verabreicht. Es wurde keinerlei anormales

BAD ORIGINAL, 2 0 3 Ο 8 A / 1 2 h A

Verhalten beobachtet. Die Autopsie der !Tiere nach 2 und 6 LIonaten nach Beginn der Behandlung ergab keinerlei Schädigung. Oas Myzel wird mithin gut vertragen.

nährwert des Myzels - ■

" Bs wurden 3 Versuchsreihen durchgeführtί

1. Versuchsreihe;

2 männliche Kaninchen von 1,8 und 1,9 kg wurden innerhalb von 18 Tagen nacheinander mit unterschiedlicher Nahrung versorgt; die Gewichtslcurve dieser Tiere ist in !ig. 1 dargestellt (die Zeit längs der Abszisse in Tagen; das Körpergewicht längs der Ordinate in kg); die Kurven 1 und 2 stammen von je einem der Tiere.

Während der ersten sieben Tage (Phase 1) wurden die Tiere jeden Tag mit einer eiweißhaltigen Kost mit bezogen auf die vom Stickstoff gelieferte nahrung 18 Sew.yö versorgt, ohne daß die Nahrung rationiert wurde.

Vom 8. bis zum. 11. Tage (Phase 2) erhielten die Tiere täglich ohne Hationierung eine stickstoffreie Kost, die abgesehen von den Proteinen mit derjenigen der Phase 1 identisch war.

Vom 12. bis zum 15. Tage (Phase 3) erhielten die Tiere täglich die stickstoffreie Kost der Phase 2 und zusätzlich 30 g-getrocknetes Myzel von Oidiodendron griseum, das über, ein iiagenröhrehen eingeführt wurde-.

BAD ORIGINAL 20988 4/124V

Vom 16. bis sum 18. Tage (Phase 4) erhielten die Kaninchen täglich ohne Rationierung die stickstoffreie Kost der Phase

Wie man aus den Kurven von Fig. 1 ersieht, t3\it die Steigung der in Abhängigkeit von der Zeit aufgetragenen Gewichtskurve für die Phasen 1 und 3 parallel» Dieses Phänomen macht die Wirksamkeit der Behandlung mit Myzel als Zusatz für Tierfutter anschaulich.

ο Reihe

Ein männliches Kaninchen wurde innerhalb von 14 Tagen folgender nehandlun,/ unterworfen;

a) Vollständiges Fasten während der beiden ersten Tage; und

b) vom 3. bis zum 12. Tag wurde eine Nahrung verabreicht,

bei der der proteinische Stickstoff ausschlielilich durch das liyzel von Penicillium cyclopium geliefert wurde, wobei die tägliche Kation derart gebildet wurde, daß der Gehalt an Proteinen in der Ration 20 Gew.'/ö betrug. Die Ration hatte folgende Zusammensetzung*

Erdnußöl 5g

Mineralsalze 4 g

Vitaminmischung ' 1 g Agar-Agar ' 0,5 g

Gholin 0,5 g

Saccharose 35 g

Stärke 34,5 g

Myzel von Penicillium ra r o· cyclopium " 24,- g

V/asser (vom Kochen) 80 g

BAD ORJGlNAi-

2 0 9 3 8 4 / 1 2 U

■ c) vom 13. Tage an einem vollständigen Fasten aus Mangel an Liyzel.

In Figo 2 sind längs der Ordinate die Gewichtsänderungen des Tieres in Abhängigkeit von der Behandlungsdauer aufgetragen.

3. Reihe

Die Gewichte von 2 Gruppen zu je 3 Kaninchen wurden untersucht. Während der ersten drei Tage erhielten beide Gruppen eine Nahrung mit 15 Gew.^f/> Proteinen, die durch eine Mischung von Hafer, Weizen, Luzerne, Ölkuchen von Erdnuß und Soja und "Nachlauf" (kleiehaltiges Grobinehl) geliefert wurden, wobei die tägliche l.ienge 2g Stickstoff entsprach; anschließend erhielten die beiden Gruppen bis zum 11. Tag eine unterschied- ·, liehe Kost, und zwar

erhielt eine Gruppe (Ve z'gl ei cha gruppe) die gleiche Nahrung -wie in der ersten Behandlungsphase (2 g proteinischen Stickstoff pro Tag); und

die zweite Gruppe nahm Myzel von P. eye 1 ppi um ausschlie(31ich jeder anderen Eiweißquelle auf;*

Fig. 3 zeigt die Änderung des Gewichtes .(in kg) der Vergleiehskaninchen (Kurven T₁, T₀ und T_x) und der behandelten Kaninchen (Kurven Pp P₂ und P-.,) in Abhängigkeit von der Behandlungsdauer in Tagen.

Aus diesem letzten Versuch kann gesohLoaaon werden, daß eine Kation von 0,4 g an vom Myzel von P. £yj^Lj3pJLUui herstammendem proteinisehen Stickstoff pro Tag ebenoo wirksam 1st wie 2 g proteinischer Stickstoff pro Tag, der von der Üblicher-

* Dabei wurde das Myzel absLchtLieh den anderen Nährstoffen derart zugemischt, daß die Tagesration an profceLnischem Stickstoff 0,4 g pro Tag und Tier betrug.

¹BAD ORIGINAL

2 0 9 8 8 A / I 2 4 h

weise zugeführten pflanzlichen Ration herstammt.

Im übrigen konnte im Verlaufe der 3 Versuchsreihen ebenfalls beobachtet werden, daß die Tiere in augenfälliger ,/eise die rayzelreiche Nahrung suchen.

BAD ORIGINAL

Ί 0 Π 8 K h I 1 2 4 k

Claims

Patentansprüche

\yi Verfahren zur Herstellung eines proteinreichen Produktes durch Kultur von Uikroorganismen, dadurch gekennzeichnet , daß man zu der Gesamtheit der aus dem Llage,n des Kaninchens isolierten und sich bei pH 2 entwickelnden Septomyzeten gehörende Stämme kultiviert und die erhaltene Biomasse gewinnt»

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Septomyceten durch Oidiodendron griseum, Penicillium.cyclopium, Penicillium crustosum und Penicillium canescens gebildet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung bei einem pH-\/ert von 1,7 bis 5 vorgenommen

4o Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Septomyzeten auf einem Nährmilieu kultiviert werden, daa zumindest eine Stickstoffquelle in Konzentrationen über 1,10 g/l und vorzugsweise zwischen 1,16 und 2,34 g/l Milieu (gerechnet in g Stickstoff) und zumindest 10 bis 30 g/l. Kohlehydrat enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Kohlehydrat durch Melassen gebildet wird.

b. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß . das Kohlehydrat durch Getreidekörner geliefert v?ird.

BAD ORIOiNAU 884/1244

7° Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung der Septomyzeten bei einer Temperatur von 19 bis 25°C erfolgt.

8. Tiernahrung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an nach einem der Ansprüche 1 bis 7 erhaltener Biomasse zusammen mit einem physiologisch akzeptablen Träger.

BAD ORIGINAL 209884/1244