DE2010486A1 - Verfahren zur Herstellung von Proteinen - Google Patents

Description

University of New south Vales, Barker Street, Kensington, New South Wales / Australien

Verfahren zur Herstellung von Proteinen

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Heratellung von Proteinen aus Säften, welche von Blattmaterialien extrahiert oder ausgepreßt werden. Insbesondere betrifft die Erfindung die Steigerung des Proteirtgehaltes in derartigen Säften aufgrund der Wirkung von Microorganismen auf nicht-proteinhaltige Materialien, welche den Säften zugegeben werden.

Der Proteinmangel in der Welt, insbesondere: an billigen tierischen Proteinen für den Verbrauch durch Tiere und Men-

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βchen ist bekannt. Um den Proteinmangel auszugleichen, wurden in neuerer Zeit verschiedene biosynthetische Verfahren entwickelt, wobei Protein durch Bakterienwachstum auf verschiedenen kohlenhaltigen Substratmaterialien, insbesondere auf solchen die relativ billig sind, erzielt wurde. Eine dieser Biosynthesetechniken nützt das Wachstum verschiedener Hefen oder Bakterien auf Kohlenhydratsubstraten aus. Kohlenhydrate sind jedoch eine relativ teuere Form des Kohlenstoffes. Bei den meisten dieser Biosynthesen fallen weiterhin Kosten für die Zugabe von Vitaminen oder anderen Wachstumehilfen an, die notwendig sind, um das erwünschte Zellwachstum zu gewährleisten. Eine andere kürzlich entwickelte Technik für die biologische Synthese von Hahrungsprotein ist die Kultur von Microorganismen auf Petroleumaubstraten. Diese Art von einer Proteinbiosynthese ermöglicht die Verwendung von flüssigen KohlenwasserstoffChargen, welche billiger sind als die Kohlenhydrate.

Ein schwerer Nachteil für eine breitere Durchsetzung der zuletzt genannten Biοsynthesetechnik liegt in der Notwendigkeit, ein Dreiphasensystem zu betreiben, von denen zwei Phasen flüssig sind. Dies bedeutet höhere Energiekosten und einen geringeren Wirkungsgrad der Sauerstoffabsorption. Zusätzlich ist es notwendig, die beiden flüssigen Phasen voneinander zu trennen, damit eine Vergiftungegefahr vermieden wird, welche sich ergibt, wenn das Proteinprodukt mit Spuren von flüssigen Kohlenwasserstoffen verschmutzt wird. Weiterhin ist es schwierig und sehr teuer, während der Biosynthese ausreichend hohe Konzentrationen der erzeugten Zellen zu erzielen. Dieser Nachteil, daß keine wirtschaftlich zufrie-i denstellenden hohen Konzentrationen von Bakterienzellen in den Biosynthesebädern erreicht werden können, führt zu hohen Kosten für die Abtrennung und für die Trocknung.

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Be ist weiterhin bekannt, daß dae natürliche Protein in Grae oder anderem blattförmigem Material durch Quetschen und Auspressen des Saftes und durch Waschen dee fasaigen Rückstandes gewonnen werden kann. Der auegepreßte Saft und die Waschlösungen werden dann erhitzt, bis das lösliche Protein koaguliert. Es wird dann von der Flüssigkeit abgetrennt. Das so gewonnene Protein kann mit einem geeigneten lösungsmittel zur Entfernung von Fetten und ölen gewaschen oder in anderer Weise, z.B. mit Säuren, behandelt werden, um die Lagereigenschaften zu verbessern. Das so gewonnene feste Material wird dann getrocknet, wobei es ein Produkt mit hohem Proteingehalt ergibt. Dieses zuerst von K.W. Pirie beschriebene Verfahren hat verschiedene Nachteile. Die Proteinauebeute iet gering. Ein großer Teil des Grases oder des zugeführten blattförmigen Materials wird nicht verwendet. Der Geschmack des Blattro!materials, welcher häufig von dem zu fütternden Tier nicht geschätzt wird, tritt ebenfalle bei dem Endprodukt wieder auf.

Gemäß der vorliegenden Erfindung zeigte ee sieh nun, daß der natürliche Proteingehalt von Säften, die aus Blattmaterialien extrahiert oder ausgepreßt wurden, duroh das Wachstum von Microorganismen auf diesen Säften in Gegenwart eines Nichtproteinstickstoffes, wie später im einzelnen beschrieben, angereichert werden kann. Die Säfte selbst sind als Medien und/oder als Nahrungsquelle für die Microorganismen geeignet. Die Umsetzung des Nichtproteinstickstoffes im Protein und das daraus entstehende feste proteinhaltige Material ist für Säugetiere nicht giftig. Ea ist dementsprechend als Nahrungszusatz mit hohem Proteingenalt für Tiere und Menschen geeignet·

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Das Verfahren zur Herstellung von Protein gemäß der Erfindung besteht auB folgenden Verfahrenssehritten:

Extrahieren oder Auspressen von Saft aus nichttoxischen Gräsern oder anderem Blattmaterial.

Zugabe eines nicht-proteinhaltigen Stickstoffspendermaterials, wie später im einzelnen beschrieben, zu dem Saft.

Züchtung von nicht giftigen MicroOrganismen auf dem Saft unter Bedingungen, bei denen der Microorganisraue Proteine synthetisiert, wobei der Microorganismus zu einem Wachstum in Gegenwart eines Proteines ohne Zerstörung dieses Proteines geeignet sein muß.

Unter "Blattmaterial¹¹ sollen nicht giftige Zellulosematerialien pflanzlichen Ursprungs verstanden sein, welche wenigstens AOf w/w Wasser (entsprechend dem in Abschnitt 22.8, Seite 358 der "Official Methode of Analysis of the Association of Official Agricultural Chemists, Editor W. Horwitz, 8th Edition, Washington D.C." beschriebenen Verfahren) und wenigstens 2# w/w Protein, berechnet auf der wasserfreien Basis, enthalten und im speziellen:

Gräser von Weideland und Wiesen; Blätter von Pflanzen einschließlich Büschen, Stauden, Sträuchern, Gemüsen und Bäumen; Halme und Stiele; Blumen; Getreide; Hülsen, äenalen, Schoten und Schalen und Abfällen von Gemüsen. Bevorzugte Blattmaterialien sind legunen, wie Luzerne, roter Klee, weißer Klee, Sudaxgräser, Sisalblätter, Phalarisgras (eine Art von amerikanischen und europäischen Gräsern mit breiten Blättern und dichtem Blütenkranz, auch Kanarisgras oder Ribbon-

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gras), Zuckerrohrblätterj Karottengrtinzeugj rote Beetegrünzeug und Mischungen derselben·

Die Säfte werden hergestellt, indem die Blattmaterialien nach üblichem Verfahren ausgepreßt werden, d.h. in Pressen zusammengepreßt werden. Dem Preßverfahren kann eine Zerkleinerung vorangehen. Z. B. können die Blattmaterialien eingeweicht, geschlitzt, geschnitten, geechnetzelt oder gedroschen * werden, damit sie ihren Saft leichter freigeben. Unter dem ~ Ausdruck "Extrahieren" soll die Extraktion mittels eines Lösungsmittels, z.B. eines organischen Lösungsmittels, verstanden sein. Es wird jedoch bevorzugt, wenn man die Säfte in wässriger Form erhält· Insbesondere bei Pflanzenmaterl-

■ *

alien, die relativ wenig Wasser haben, z.B. 40jt w/w, kann die Extraktion des Proteins erleichtert werden, wenn das Pflanzenmaterial zerkleinert und anschließend in Wasser eingeweicht und gequollen wird.

Die Herstellung der Säfte für das Verfahren gemäß der Erfindung braucht nicht Teil des Produktionsverfahrens sein. Die Säfte können in getrennten Verfahren vorgefertigt werden. |

Gemäß einer weniger bevorzugten Ausftihrungsform des Verfah- : rene können Nebenprodukte anderer Verfahren, z.B. Taeim Eindosen und Behandeln von Gemüsen, Verwendung finden, aus denen geeignete Abfallsäfte erzielt werden. Gemäß einer weiteren Aueführungsform des Verfahrens kann ein Hichtprotein« stickstoff, wie anschließend noch näher bezeichnet, einem Nebenproduktsaft zugegeben werden einschließlich Abfallsäften aus dem Eindosen und Behandeln von Gemüsen. Auf dem Saft läßt man einen nicht giftigen Microorganismue unter Bedingungen wachsen, bei welchen der Microorganiemue-Protein erzeugt. Die Mlcroorganiemen können dabei in Gegenwart Proteines wachsen, ohne daß sie diese»

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Venn der Saft als Nebenprodukt in einen anderen Verfahren anfällt, kann er eine relativ geringe Konzentration en Festkörpern una PrVi.eingehalt haben· So Bind beispielsweise in der Konservenindustrie als Nebenprodukt anfallende Abfallsäfte geeignet, die nur O,O1# w/v Protein enthalten. Gemäß der Erfindung wird jedoch die Verwendung von Extrakten bevorzugt, die einen so hohen wie möglich Ausgangsproteingehalt durch Auspressen, z.B. einen Proteingehalt von 1 bis 5# w/v besitzen, da ein hoher Proteingehalt die Kosten für die weitere Behandlung vermindert.

Die Säfte können in dem Verfahren gemäß der Erfindung in verschiedener Weise benützt werden»

Hach dem Auspressen wird die Zeiletoff pulpe und der das Pflan«enprotein enthaltende Saft voneinander getrennt. Anschließend wird

I) der Saft selbst und/oder

II) die Zellulosepulpe als Fährmedium verwendet.

a) Das in dem Saft enthaltene Protein wird z.B. wie unter 1) beschrieben, koaguliert, von der restlichen flüssigkeit getrennt und dann wird die einen reduzierten Proteingehalt aufweisende Reatflüssigkeit als Wachstumsmedium verwendet. Dieses Verfahren wird für die Kultivierung von proteoIytisehen Bakterien bevorzugt. Die beiden Formen des so erhaltenen Proteins, nämlich koaguliertes Pflanzenprotein und Microbenprotein, können dann i) gemiecht werden oder ii) getrennt verwendet werden.

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b) Der erzielte Saft selbst, z.B. wie oben beschrieben unter i), kann aufgearbeitet werden, indem das in ihm enthaltene Pflanzenprotein koaguliert wird. Der Microorganisms kann dann in der Reetflüesigkeit (mit vermindertem Protein) in Gegenwart des koagulierten Proteine gezüchtet werden. Dieses Verfahren wird für die Kultivierung von Hefen bevorzugt.

c) Die Zellulosepulpe und der Saft können beisammen gelassen I werden. Die Mischung kann dann ale Medium für den Anwuchs verwendet werden. Die eich ergebende Mischung kann von bestimmten Lebewesen , insbesondere von Wiederkäuern, verdaut werden. Sie hat den zusätzlichen Vorteil, daß der Nährwert des ZelluloeematerialB verwendet wird und daß eine verbesserte Ausnutzung des Proteine und der Kohlenstoffquellen erreicht wird, welches sonst nicht extrahierbar in der Zelluloeepulpe zurückbleibt.

Techniken und Mittel für das Auspressen und Abtrennen dee Saftes von dem Blattmaterial, z.B. Filterpreeeen, Dekantieren oder Zentrifugieren, sind bekannt. Jede der bekannten j Techniken ist anwendbar. Das Zentrifugieren wird für hoch- ^; gradige Proteinzusätze bevorzugt. Ee können auch nehr ale einer der angegebenen Verfahrensechritte zum Auepreeeen dee Blattmaterials wahlweise mit Rücklauf eines Teiles des ausgepreßten Saftes oder friechem Saft verwendet werden.

Viele für das Verfahren gemäß der Erfindung geeignete Pflanzen enthalten ausreichende kohlenstoffhaltige und mineralische Nährstoffe, um die verwendeten Microorganiemen zu halten, z.B. Zucker, lipoide, Fettsäuren und anorganische Salze, z.B. Kalziumsalze , Hagneeiumsalze , Kaliumphoephate und

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Spurenelemente. Es können jedoch in Abhängigkeit von der Art dee Mediums,den Microorganismen und der erwünschten Geschwindigkeit der Proteinverdoppelung noch weitere Nährstoffe zugegeben v/erden. Diese Nährstoffe und die Anforderungen der verschiedenen Organismen in bezug auf dieselben sind in der Technik bekannt.

Die Säfte müssen, wie bereite festgestellt! für lebewesen in den Konzentrationen, in welchen sie im Endprosukt, das verfüttert werden soll, enthalten sind, ungiftig sein. Für die überwiegende Mehrzahl der Extrakte aus Pflanzenmaterialien ist dieses Erfordernis kein Problem. In dieser Hinsicht werden natürliche Substrate bevorzugt gegenüber den Kohlenwasserstoffen, da sie nicht mit der stark akuten und langwirkenden Vergiftungsgefahr belastet sind, die den letzteren auch in Spuren anhaftet.

Das Verfahren gemäß der Erfindung kann mit einem beachtenswerten breiten Spektrum von Microorganiemen durchgeführt werden. Säfte von Blattnaterialien sind tatsächlich ein bemerkenewert anpassungsfähiges Medium für die Züchtung von Microorganismen, wie dies nur für wenig andere Substrate gültig ist. Dementsprechend ist die Wahl der Microorganis-■en nicht eng begrenzt kritisch. Ob eine spezielle Hefe, ein Bakterium oder ein Pilz geeignet ist, ist eine Angelegenheit einer einfachen Routineuntersuchung.

Es werden, wie oben angegeben, Teetsubstrate -η üblicher Weise hergestellt, wie dies in der angegebenen Veröffentlichung beschrieben ist. Jeder nicht giftige Microorganisms, welcher sich in 48 stunden auf irgendeinem der angegebenen Substrate verdoppeln kann, ist für die Kultivierung auf den ■ Säften gemäß der Erfindung geeignet.

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Teatsubstrat I Pleischinfusion, vie von V.B.D. Skerman, "A Guide to the

Identification of the Genera of Bacteria", 2nd. ed. Seite 242

Testsubstrat II Glukose, Hefeextrakt wie von Skennan . ■ '"

Tryptonphosphatbrühe beschrieben Seite 251 bakterielle Zellen- ^: ,

suspension; Agär ^M Seite 256 .

Testsubstrat III ■ Karotten oder Kartof-

felstöpsel Medium »- Seite 257

Testsubstrat IV . * Weiringa's Pektatgel " . Seite 258 |

Medium

Wie bereite bemerkt, sind bem dem'Verfahren gemäß der Erfindung giftige MicroOrganismen und pathogene selbstverständlich ausgeschlossen. Für die überwiegende Mehrzahl der bekannten MioroOrganismen ist es jedoch bekannt, ob sie pathogene sind, d.h. ob sie oder ihre toten Zellen giftig sind. Pur eine kleine Anzahl von Mieroorganismen, insbesondere für Bakterien, sind jedoch die in der üteratur aufgeführten Daten für die Toxizität unzureichend inebeeondere für die strengen Kriterien der Toxiaität für Menachen· In

BAO

diesen relativ seltenen Fällen können giftige Microorganismen auf der Basis eines einfachen Routinetestes eliminiert werden. Ein Microorganism*« wird als nicht giftig betrachtet, wenn eine gemischte Population von gesunden Versuchstieren, nämlich 3 Kücken und 6 Ratten, wenigstens zwei Wochen lang Hit einer normalen Diät gefüttert werden, die wenigstens 8ji der Trockensubstanz in Form von toten Zellen enthält, die ▼on dem Microorganisinus erzeugt werden und wenn dann keine toxischen Phänomene und keine Sterblichkeit (LD 50) auftritt, die größer ist als diejenige, die mit einer ähnlichen Kontrollpopulatlon von gesunden Testlebewesen beobachtet werden kann, bei denen die Proteinnahrung durch Kasein ersetzt ist.

Arten von für das Verfahren geeigneten Microorgani einen sind nicht-giftige Hefen, Bakterien, Pilze und Protozoen. Geeignete Hefen sind zum Beispiel Bremascus. Endomvees. Schizosaccharomyces. Monosporella« Nematoapora. Coccidlascus. Hpomycea. Endomyoopsis, Saccharomycea. Pichia. Hansenula. Schwannlomyce8, Debaronyees, Sac charomycold es. Henaenioapora. Nadaonia« Saccharoinycopais. Sporobolomyces. Bullera. TilletiopsiSt Itersonia, Cryptococcus,(ausgenommen jedoch c. neoforman8), Torulopsis. Pityrosporum. Brettanomyces. Candida» Kloeckera, Trigonopaia, Rhodotorula« Torula und Mischungen derselben.

Geeignete Bakterien sind z.B. die folgenden Arten und Stanme, welche in Übereinstimmung mit der Nomenklatur von Bergey¹s Manual of Determinative Bacteriology, 6. Ausgabe, beschrieben sind und von denen selbstverständlich alle pathogenen Stämme ausgeschlossen sind: Pseudomonas. Methanomonaa« Acetobacter _t Vibrio (lediglich Erdbodenbewohner), Cellvlbrio. Cellfacicula, Spirillumi Azotobacter. Rhlzoblum, lactobacilluB, Escherlchla. Aerobacter, Erwin!a» Bacterium.

BAD L

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Cellunonaa. Sarcina, Saccharobacterium« Me thanobacterium, BacilluB subtilis. Bacillus pumilus. Bacillus coagulans _t Bacillus lentis. Bacillus megatherium. Bacillus cereus. Bacillus brevia. Bacillus stearothermophilus« Bacillus thermo di as tat 1 cue - (bei 65⁰C - 5⁰C), Bacillus robustua. Bacillus thermocellulolyticuB - (bei 65⁰C - 5⁰C), Bacillus thermoliquifaciena - (bei 6O⁰C * 5⁰C), Bacillus viridulus. Clostridium cellulyticura - (bei 60⁰C + 5⁰C), Mycobacterium phlei. Thermophi lic streptomyces - (bei 55 - 60⁰C + 5⁰C), Micro- I monoapora - (bei 55 - 6O⁰C + 5°C), Sphaerotilua, Caryophanon, Cytophaga. Aectangium. Sarangium. Polyanglum. Syrangiiun, Melettangiui:i, Fodangium, Chrondromyces, Anglococcua, Sparocytophaga. Splrochaeta und Mischungen derselben. Diese Organismen können einzeln, in Gruppen oder in metablotischer Reihenfolge gezüchtet werden.

Die optimale Wacheturastemperatur let Im allgemeinen die umgebungstemperatur, wenn nicht anders angegeben.

Das Wachstum erfolgt unter aerob!sehen Bedingungen, mit Ausnahme im Falle von Clostridium. Geeignete Pilse sind: g Aerasialea. Myxomycetee. Chytridiomycetes. Hyphochytrediomycetea. Oomycetea. Plaamodiopharoaycites. Zygomvcetea. Trichomycetest Euascomycetidae. Plectomycetes. Diacomycetes. Laboulbeniomycetesv Basldlomycetes und Mischungen derselben. Gans besonders geeignet sind: Rhizopus spp.. AspergiHue spp». Aapergillus oryeae. Pusariuo. FenielIlium bpp.. Heurospora und Geotichlum.

Geeignete Protozoen sind; Dlplodlnium. Eudiplodinium. Entodium species, Holotrlcha. Oatracodinua species und Mischungen derselben.

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Insbesondere geeignete Organismen für Zwecke der vorliegenden Erfindung eind: Rhizopus species, welcher von Brotechimmel abgetrennt wurde, Rhizopus oligosporua. Aspergillus niger, Aspergillus oryzae _t Asperglllua versicolor. Neurospora speciest Neurospora sitophllia. Streptomyces species, welcher aus Kompost gewonnen wurde, Candida utilis yar, major, Candida tropical!β. Candida pulcherrima. Candida lipolytica. Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces ellipsoidus. Saccharomycea carlsbergensis. Saccharomyces fragllis. Hansenula anominala. Geotrichium candidum. Bacillus eubtilis, Bacillus megatherium. Bacillus stearothermophiIuβ. Aerobacter species aerogenls, Escherichia specie8 coil, Pseudomonaa species.

Die am meisten bevorzugten Organismen sind: Candida utilis, Saccharomyces cerevisiae, Aspe rgl Hub orygae. Rhigopus species z.B. von Brotschimmel abgetrennt, Bacillus subtilis. Bacillus stearothermophilus und Escherichia species coil.

Das optimale Nährmedium ist von einem Microorganismen zum anderen verschieden. Der rohe extrahierte Saft, welcher nicht vervollständigt ist, ist nicht notwendigerweise das optimale Medium. Auch ist dies für ein schnelles Wachstum optimale Medium nicht notwendigerweise das wirtschaftlich optimalste, da zusätzliche Nährstoffe die Produktionskosten erhöhen· Es 1st ein weiter Rau« für die Erzielung eines wirtschaftlichen Optimums. Die Hährmedien r· über einen weiten, nicht kritischen Konzentrationebereich wirksam. So können die erforderlichen Mengen von beetimmten Mineralnährstoffen zu dem Hährmedium zugegeben werden, um ein gutes Wachstum der Kicroorganismen und eine maximale Selektivität ereielen. In des wässrigen Wachetumemedium können Kalium,

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Natriumeisen, Magnesium, Kalzium, Hangan, Phosphor und andere Nährstoffe enthalten sein. Diese Materialien können in Form ihrer Salze,und vorzugsweise ihrer wasserlöslichen SaI-. ze,zugeführt werden· So kann beispielsweise das Kalium als Kaliumchlorid, Phosphat, Sulfat, Zitrat, Acetat und Nitrat zugeführt werden. Bisen und Phosphor kann in Form der Sulfate bzw. Phosphate, z.B. Eisensulfat oder Eisenphosphat zugegeben werden. Im allgemeinen wird der Phosphor überwiegend in Form von Ammoniumphosphaten zugeführt. Wenn entweder Ammoniumphosphat oder ammoniumsaueres Phosphat verwendet wird, kann es als zusammengefaßte Quelle sowohl für Stickstoff als auch für Phosphor (Phosphation) für das Wachstum der Micro Organismenzellen dienen. Es wird bevorzugt, daß anorganische Verbindungen dem wässrigen Substrat in Mengen zugegeben werden, die ausreichend sind, um in dem extrahierten Saft die folgenden lonenkonzentrationen in Gewichtsprozenten zu liefern:

K⁺ 0,3 bis 0,15

Mg²⁺ 0,001 bis 0,05

Na⁺ 0,02 bis 0,06

⁵" 0,1 bis 0,5

₄ SO₄ ²" 0,05 bis 0,15

Das Nährmedium kann ebenfalls Spurenmengen von Ionen anderer metallischer Elemente, z.B. von Kalzium, Kupfer, Eisen, Kobalt oder Mangan enthalten, welche dem wässrigen Substrat als Salze, z.B. als Chlorid oder Sulfate zugegeben werden.

Ein geeignetes Nährmedium für Hefen und Schimmel, z.B. Aapergillua niger enthält in dem extrahierten Saft die folgenden Nährstoffe und Zugaben:

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Gramn

DianuBoniumpho sphat 2 Kaliumchlorid ¹»2 Magnesiumsulfat 7HpO 0,6 Zinksulfat 0,18 Mangansulfat 1HgO · 0,05 Bisensulfat 7 H₂O 0,07 Leitungswasser 200 Hefeextrakt 0,025 Extrakt zur Auffüllung auf 1000 ecm. Ein typisches Nährmedium für das Wachstum von Bakterien,

B.B. Bacillus thermophilus, enthält die folgenden Bestandteile:

Gramm

Ammoniumsulfat . 1 Magnesiumsulfat 0,15 Elsensulfat 7H₂O 0,005 Mangansulfat 1H₂O 0,002 Monokaliumpho sphat 1,8 Dinatriumpho s phat 2,8 Kalziumchlorid 0,1

tfatriumearbonat 0,1

Extrakt zur Auffüllung auf 1000 ecm.

Für andere Bakterien hat ein geeignetes Nährmedium die Zusammensetzung ;

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Gramm

Monofcaliumphosphat 7 Magnesiumsulfat, 7HgO 0,2 Natriumchlorid 0,1 Ammoniurachlorid 2,5 Leitungewasser(Spurenelemente) 100 ecm Extrakt zur Auffüllung auf 1000 ecm.

Ein anderes geeignete« Nährmedium für das Wachsttun τοη Bakterien hat die Zusammensetzungt

HH₄Cl 0,5 g

IaCl 4 g

MgSO₄ 0,5 g

Na₂HPO₄ 0,5 g

KH₂PO₄ 0,5 g

Extrakt zur Auffüllung auf 1000 ecm.·

Unter einem Nichtproteinstickstoff - der Ausdruck wird in der vorliegenden Beschreibung auch ale FPN abgekürzt - soll irgendeine stickstoffhaltige Verbindung, ausgenommen elernentarer Stickstoff und Protein, verstanden sein. Besonder* geeignete und bevorzugte Formen von NPN sind die anorganischen oder organischen Stickstoffverbindungen* und zwar Amaonluahydroxyd oder Salze desselben, z.B. citronensäuree Ammon, schwefelsaures Ammon, phosphorsaures Amaon, Aaooniumsäurephosphat, Ammoniumsalpeter, salpetriksauree Anaoniua und Harnstoff. Andere Formen von NPN sind Biuret (Amid der Allophansäure), Triuret (Cyanursäure}« Tetrauret und höhere Kondensationeprodukte von Harnstoff, Ammelin, Ammelid, Cyanursäure, Dicyandiamid und Aminosäuren. Unter den Ausdruck ⁴¹NPR¹¹ sollen auch Hefeextrakt und die ein niedrige«

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Molekulargewicht auivM senden Peptide fallen, wie sie durch saure Hydrolyse oder Enr.ymverdauung von Protein erzeugt werden.

Die Konzentration des NPN, ausgedrückt in Prozent w/v Stickstoff in der klaren Extraktlösung ist nicht eng begrenzt kritisch. Sie reicht von 0,01 bis yfa w/v, wobei der Bereich von 0,02 bis 1j6 w/v bevorzugt wird.

Das Verfahren gemäß der Erfindung ist hinsichtlich der Um- seteung von NPN in Protein beachtlich wirksam. So reicht die Verdoppelungszeit der microbiologischen Organismen von 20 Minuten bis zu 24 Stunden. Die Verdoppelungezeit der bevorssugt angewendeten Organismen liegt zwischen 20 Minuten und 3 Stunden und derjenigen am meist bevorzugt angewendeten Organismen von 20 Minuten bis 1 1/2 Stunden.

Gemäß dem Verfahren der Erfindung kann folgender Proteingehalt erhielt werden:

^ Aue Hefen von 30 bis 70$ w/w

aus Bakterien von 30 bis 75$ w/w aue Pilzen von 30 bis 60$ w/w aus Protozoen von 20 bis 60$ w/w.

Dae Verfahren kann anaerob!sch oder aeroblech Je nach der Art der verwendeten Microorganisnen durchgeführt werden. Pur die meieten Microorganismen ist der Sauerstoffbedarf bekannt· Im allgemeinen wird eine aerobische Arbeitsweise bei dem Verfahren gemäß der Erfindung bevorzugt.

Dem Kulturmedium kann Sauerstoff in irgendeiner Form züge-

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geben werden, in der dieeer von den eingeimpften Microorganiemen leicht aufgenommen werden kann. Es können auch Sauerstoff enthaltende Verbindungen verwendet werden, solange als sie das Zellwaehatum der Microorganiemen und die Nahrungsumsetzung zu den Microorganismenzellen nicht nachteilig beeinflussen· üblicherweise wird jedoch der Sauerstoff in Form eines sauerstoffhaltigen Gases, z.B. Luft, zugeführt· Das Gas soll von 19 bis 22 Gew.-^ Sauerstoff enthalten. Obgleich g die Verwendung von Luft bevorzugt wird, kann auch mit Sauerstoff angereicherte Luft, die mehr als 22 Gew.-jl Sauerstoff enthält, Verwendung finden. Der Sauerstoffgehalt ist nicht eng begrenzt kritisch. Er kann über weite Bereiche schwanken· Konzentrationen von 0,1 bis 250 Micromol von 0« je Liter des Fermentierungssaftes sind geeignet· Der Bereich von 1 bis 10 Micromol O₂ je Liter wird bevorzugt.

Das Verfahren gemäß der Erfindung ist hinsichtlich einer microbiologischen Einwanderung, d.h. einem Eindringen von giftigen oder unerwünschten Microben in das Medium, relativ unempfindlich. Hinsichtlich thermophilen Microorganismen ist dies weitgehend auf deren heftiges Wachstum «urtickau- f führen. Bei den meisten anderen Microorganiemen kann ein Eindringen vermindert werden, indem die WachstuBsbtdingungen so ausgewählt werden, daß sie weitgehend der erwünschten Species angepaßt sind. Die Techniken einer selektiven Kultivierung sind bekannt.

Die verechiedeneh Gattungen von Microorganiemen sind In allgemeinen nach Belieben mischbar. Die Kultivierung von Mischungen, wird tatsächlich bevorzugt. So ergab sich gemäß der Erfindung, daß die folgenden Arten gleichseitig gezüchtet werden können: S.oerevisiae und B. subtil!st B.

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und B. Bubtilia: insbesondere geeignet sind gemischte Medien, welche Candida utilia und Saccharonycea cerevialae enthalten.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrene gemäß der Erfindung wird die Nahrung, auf welcher die MicroOrganismen wachsen, von ihren natürlichen Ifahrungequellen hergeleitet, selbstverständlich in Form des Saftes, der dann von dem Blattmaterial gewonnen wird.

Die für das Verfahren geeigneten Temperaturen liegen in einem weiten Bereich von 20 bis 65⁰C. Temperaturen im Bereich von 40 bis 55⁰C sind bevorzugt, da die Gefahr einer microbiologischen Einwanderung, insbesondere das Eindringen von Pathogenen,in diesem Bereich vermindert ist. Temperaturen über 50⁰C sind ebenfalls bevorzugt, da die Reaktionswärme bei diesen Temperaturen im allgemeinen durch normales Kühlwasser ohne Anwendung einer künstlichen Kühlung abgeführt werden kann· Sementsprechend sind die bevorzugten Microorganismen thermophi1 und für diese bevorzugten Temperaturbereiche geeignet.

Sie in dt« Verfahren erzielbare endgültig· Konzentration an Protein la Medium kann ebenfalls über einen weiten Bereich schwanken, z.B. von 0,3 bis hinauf siyjg^ij/v· Venn das Verfahren ohargenweise durchgeführt wird/der ursprünglich· Proteingehalt des pflanzlichen Ausgangeproduktes in dem Saft nach und nach sich steigern, beispielswei·· in der Größenordnung von 0,01 bis. 5ji w/w zu einer Endkonzentration in der Größenordnung von 0,3 bis 7£ w/w_f wobei diese Steigerung auf die Mieroorganismen zurückzuführen ist. Wenn das Verfahren kontinuierlich durchgeführt wird, dann liegen dl· ge-

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eigneten Proteinkonzentrationen im Bereich von 0,3 bia w/w, wobei zwischen 1/10 und 3/4 dieses Proteins von den Micro Organismen et armen kann.

Besondere geeignete pH-Bereiche sind von 3 1/2 bis 8. Für Hefen wird ein Bereich von 4 bis 6, für Bakterien von

5 bis 8, für Pilze von 3 bis 5 1/2 und für Protozoen von

6 bis 8 bevorzugt. Da Ammoniak und Ammoniumionen verbraucht und Säuren gebildet werden, neigt der pH-Wert zur Abnahme. Dementsprechend ist es im allgemeinen zweckmäßig, den pH-Wert durch Zugabe einer Base, vorzugsweise Ammoniak oder anderem genügend basischem NPN zu steuern. Es wird dann Ammoniak oder diese NPIT-Base wahrend des Verfahrens bei der . Proteinbildung verbraucht, so daß eine weitere Neutralieierung erforderlich ist.

Wenn Mischungen von Microorganismen verwendet werden, dann müssen die Temperatur- und pH-Bereiche,innerhalb welcher sie lebensfähig sind, sich mindestens überlappen. Vorzugsweise sollen sich die optimalen Umweltbedingungen, Temperatur, pH, Art und Konzentration der Nährstoffe in einem weiteren Bereich überlappen. ^

Das in dem Verfahren gebildete Protein kann von dem Medium durch übliche Mittel abgetrennt werden. Diese Techniken sind an sich bekannt r/z.B. Dekantieren, Filtrieren, Zentrifugieren, wahlweise gefolgt durch eine weitere Reinigung, z.B. Waschen, Extrahieren von unerwünschten Materialien mit^Wasser oder !lösungsmitteln und 'Trocknen, z.B. Sprühtrocknen,""-.-■ angewendet werden kann. Wenn erwünscht, können andere Materialien, z.B. ausgleichende Nährstoffe, Aminosäuren, z.B. Methionin, Lipoide, Kohlenhydrate, Vitamine und Mineralien

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den Proteinen während oder nach dem Aufarteitungeverfahren zugemischt werden.

Das Verfahren gemäß der Erfindung hat gegenüber den bekannten Verfahren wesentliche Vorteile. Das Rohmaterial ist außergewöhnlich billig und leicht verfügbar. Im Regelfall ist* ea in den meisten Gegenden, in denen eine Zuaatzemährng für Tiere benötigt wird, also in den Ackerbau betreibenden Gegenden, im Überfluß vorhanden. Dies ist für einige der industriell wenig entwickelten länder besonders vorteilhaft.

Sin weiterer Vorteil des Verfahrens gemäß der Erfindung liegt darin, daß daa Ausgangamaterial bereite Protein enthält. Im Vergleich mit den bekannten Verfahren, bei denen Blattmaterialien extrahiert werden und bei denen Protein aua diesem Extrakt unmittelbar ohne weitere Fermentierung gewonnen wird, liefert das Verfahren gemäß der Erfindung beachtliche wirtschaftliche Vorteile bei dem Aufarbeitungeverfahren, da das Verhältnis von Abfalliquor und Abfallzellulose, welche entfernt werden müssen, zu der Menge an erzieltem Protein gewaltig vermindert wird.

Ein Hauptvorteil des Verfahrene gemäß der Erfindung gegenüber einer auf Kohlenwasserstoffen gegründeten Herstellung von proteinhaltigen Hahrungszusätzen iat derjenige, daß vollständig die Gefahren, welche beim Arbeiten mit Mischungen von Kohlenwasserstoffen und Luft auftreten können, vermieden werden. Manche der bekannten Verfahren arbeiten in der Vähe oder sogar im Bereich einer Explosionsgefahr. Weiterhin werden die lachteile dee Arbeiten« mit zwei flüssigen Phasen, nänllch der Kohlenwasserstoff- und der wässrigen Phase vermieten. Dementsprechend werden auch -'ι- komplexen Probleme

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des Massen- und Wärmeüberganges länge der Grenzschicht vermieden. Letzteres ist ein gut bekanntes Hauptproblem bei Fermentationsverfahren, wobei die Nährstoffe, z.B. Stickstoff, Sauerstoff, Phosphat, Kalium und. Spurenmineralien . durch diese Grenzschicht hindurchtransportiert werden müssen.

Ein weiterer Vorteil liegt in der hohen Umsetzungsgeschwindigkeit (Verdopplungsgeschwindigkeit) bei dem Verfahren ge- ^ maß der Erfindung. Weitere andere Vorteile liegen in der hohen Konzentration an Protein - bis hinauf> zu 10$ w/v des Mediums; der Widerstandsfähigkeit der Medien gegen eine microbiologische Einwanderung} der hohe Stickstoffgehalt ini/Hefen und Bakterien. Aufgrund der biologisch erwünschten Balance von Aminosäuren erfordern die für die meisten Zwecke erzeugten Proteine wenig oder keine Zugabe von teueren Aminosäuren, z.B. Schwefel enthaltenden Aminosäuren. Weiterhin ist vorteilhaft die erhebliche Größe der Zellen der bevorzugten Hicroorganismen und die ausgezeichneten Zellausbeuten je Gewichtseinheit Substrat sowie eine geringe Neigung zum Schäumen. |

Die nachfolgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung, durch welche jedoch letztere nicht beschränkt wird. Sämtliche Verhältnisse sind in Gewichtsprozenten angegeben, wenn nichts anderes ausdrücklich erwähnt ist.

Beispiel 1

Eine Probe luzerne wurde gesammelt und der Feuchtigkeitsgehalt bestimmt. Eine Menge, welche 100 Gramm'feuchtigkeitsfreiem Festmaterial entspricht, wurde in einem Mischer be-

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handelt· Der Saft wurde extrahiert. Das verbleibende faserige Material wurde mit Wasser gewaschen, daraufhin wurde der verbleibende Saft extrahiert. Die Säfte wurden 4 Minuten auf 75⁰C erwärmt. Auf diese Weise· wurde das natürliche Protein koaguliert. Dem Saft wurden 0,7 Gramm Ammoniak zugegeben; durch das Medium wurde Luft geblasen. Das Medium wurde mit einem ausgewählten Hefestamm geimpft und man läßt es 20 Stunden fermentieren. Anschließend wurde das Medium zentrifugiert und das Trockenmaterial unter Vakuum getrocknet. Das Gesamtgewicht des getrockneten Materials betrug 23 g. Es enthielt 15,6 g Protein.

Beispiel 2

Eine Probe von weißen Kleepflanzen - Stengel und Blüten wurde geschnitten. Der Feuchtigkeitsgehalt wurde bestimmt. Der Klee wurde über Nacht (18 Stunden) in einem Kühlraum bei -3,9°C gelagert. Ein Teil wurde in kurze Längen geschnitten und in einem handbetriebenen Fleischwolf mit einer Lochgröße von 1/8" zerkleinert. Das so behandelte zerkleinerte Material wurde in einem gewirkten Nylonsack 3 Minuten bei 29,4 at gepreßt. Folgende Ileßergebnisse wurden erzielt:

Kleeprobe: 1508 g Gesamtgewicht

4,98Ji Protein 84,0 Feuchtigkeitsgehalt

Saft: 1171 g Gesamtgewicht

4,56$ Protein 90,6# Feuchtigkeitsgehalt

faeerlger Rückstand: 329 g Gesamtgewicht

6,47$ Protein

Feuchtigkeitsgehalt

«57 . 009851/1249

- 23 -

Sin Teil des Saftes (1000 g) wurde zur Herstellung τοη Protein verwendet. Das Verfahren bestand dabei darin, dafi das Protein durch Erwärmung koaguliert wurde· Man läßt Hefe auf dem filtrierten Saft wachsen. Der Saft wurde auf 73⁰C durch direkte Danpfelnblasung erwärmt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und alt 400 cea einer verdünnten Säurelusung (pH 2,0) gewaschen. Bas Filtrat und die Waschlösungen wurden ▼ereinigt· Der pH-Wert wurde auf 5»0 eingestellt. Sie zue

mengefaßten Liquora enthielten 0,69 g NPN. Ben Säften wurde ein Impfmaterial zugegeben, das, wie weiter unten beschrieben« hergestellt wurde· Weiterhin, wurden 2 g Aamoniumphosphat (äquivalent zu 0,424 g N₂» ^was «inen Gesamtwert von 1,12 g NPN ergibt ) und 0*5 g eines Hefeextraktes/^fe JjSsung wurde mit Leitungswasser auf 2 Liter aufgegossen. Die Feraenta-

OS '

tion wurde in einem FermentationsgefäB, wie/von Moss und Bush (Biotechn. und Bioeng.IX, 585 - 602, (1967) besehrieben wurde, durchgeführt.

Das Gefäß bestand aus einem Pyrexrohr mit einer Lunge von 18" und einem Durchmesser von 6", welches an jedem Stirnende mittels einer rostfreien Stahlplatte mit 11" Durchmesser g und 1/4" Stärke verschlossen war. Die obere Platte trug ein Gehäuse für eine Rührerwelle, besaß Durchlässe für die Keßelektroden und für ROhren zwecks Zugabe von Säure, Alkali oder anderen flüssigkeiten, während die untere Platte die. Eingangs- und AusgangsSffnung&i für Kühlschlangen usw. besaß. Der pH-Wert wurde mittels einer eingesetzten Elektrode gemessen. Er wurde kontinuierlich im Bereich von 4,8 bis 5,0 gehalten. Die Temperatur wurde auf 30° -0,5° eingestellt. Durch den Boden der Termentiereinrlchtung wurde Luft mit einer Geschwindigkeit von 500 ecm je Minute geblasen. Die Rührergeschwindigkeit wurde «wischen 180 und 420 Umdrehungen " -;'

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je Minute eingestellt, um die Konzentration an gelöstem Sauerstoff auf 15 Micromol je Liter zu halten. Der Rührer testend aus einer Turbine mit 2 1/2* Durchmesser und achtHtihrerblättern überhalb und unterhalb der Rührerscheibe.

Mach Beendigung des Wachstums wurde die Hefesuspension durch die. Bodenplatte abgezogen und zentrifugiert. Fach Abtrennung der Hefe und anderem suspendierten Material wurde der überstehende Liquor entfernt. Die Stickstoffbalance zeigte, daß er 0,11 g Stickstoff (Gesamt H₂) τοη den 0,424 g V₂* *e3-^cne" als HTH zugegeben worden war, enthielt. Wenigstens 0,32 g wurden in Protein umgesetzt. Die Hefe wurde in 300 ecm Leitungswasser wieder suspendiert und zentrifugiert. Das τοη der Fermentation gewonnene Peatmaterial wurde dem aus dem Saft koagullerten Material zugegeben. Das so erzielte Mischprodukt wurde bei 70⁰C in einem Takuumtrogtockner getrocknet. Sine Analyse des Produktes ergab:

88,8 g Gesamtgewicht Protein,

nach Korrektur auf eine lOjCige Peuchtigkeltsbasis. Die Korrektur auf eine 10£lge Peuchtigkeitebasis 1st zur Erleichterung des Vergleiches üblich. Sie wird abgeleitet von^atsäehlichen Feuchtigkeitsgehalt' in dem Trockenprodukt (im allgemeinen ziemlich nahe an 1OjC). Die zur Erzielung der 1OJf erforderliche zuzugebende oder abzuziehende Wassermenge wird erre-chnet. Das Verhältnis des Proteingehaltes, welches sich au· dieser Behandlung ergibt, wird bestimmt.

Venn man auf 1171 g Saft rechnet, beträgt die Ausbeute 104,2 g-Gesamtgewicht. Eine Aminoeäur·analyse wurde durchgeführt. Hler und während der gesamten Beispiele wurden dl·

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BAD

- 25 -

Ergebniese der Aminosäureanalyse in Gramm per 16 g Protein N ausgedrückt» und zwar in Übereinstimmung mit der üblichen Terminologie, wie sie von Block und Weiss, "Aminoacid -Handbook"Seite 9, Publishers Charles C.Thronas, Springfield, Illinois, 1956 Ed. benutzt wurde, folgende Ergebnisse wurden erzielts Methionin 2,0, S-Säuren 1,3» leucin 5,1, Isoleucin 6,2, lysjin 6,4, Tyrosin 3,8, Valin 5,6, Tryptophan 1,5, Phenylalanin 4,9. '

Impfmaterial.

Eine Anzahl von Hefen wurden aus der Xultursammlung der Universität von New South Wales übernommen. Folgende Hefen wurden ausgewählt:

Candida albicans« Candida parapsilosis, Candida sp.« Hanse nula anomala, Rhodotorula glutinis. Rhodotorula mucilaginosa.

Saccharomyces fragilis, Saccharomxces oarlsbergenis. Saccha romyces oerevisiae, Saccharomyces cerevisiae Hefeschaum, Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoidea, Schizoaaccharo myces octosporust Sporobolomyces salmonicolar, Torulopsis sp.. i

Torulopsis glabratum.

Jede Hefe wurde in üblicher Weise auf einem Agargehänge gezüchtet und in 50 ecm einer lösung aus 2$ Glukose kultiviert, welche Nährsalze und Hefeextrakte enthielt. 50 ecm der Kultur von jeder Hefe wurden zusammengefügt, gemischt und gerührt. 10 ecm der Mischkultur wurden 50 ecm Saft zugefügt, welcher etwas zugegebenes Ammoniumphosphat und Hefeextrakte enthielt. Wenn das Wachstum auf dem Saft beendet war, vnirden 10 ecm entnommen und weiteren 50 ecm eines Grassaftes zugegeben_#Man läßt dann das Wachstum weiter fort-

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schreiten. Yon der zweiten Stufe der Saftfermentation wurden 20 oca entnommen und dem Permentationegefäß zugegeben.

Beispiel 3

Eine Probe von Lolch (Roggen-grae) wurde geschnitten. Eine Analyse ergab folgende Ergebniaa:"

Feuchtigkeitsgehalt 79»OJt

Protein 5,73*

Ein Teil der probe wurde entommen und in kurze Abschnitte zerhackt und in einem handbetriebenen Fleischwolf mit einer lochscheibe von 1/8" Lochdurchmesser zerkleinert. 97,8 g des zerkleinerten Grases wurden in ein !Festrohr mit einem Innendurchmesser von 3,25 cm eingebracht. Dieser Probe wurden 0,02 g Hefeextrakt, 20 ecm Leitungswasser und 0,2 g Ammoniumsulfat zugegeben. Der pH-Wert wurde mit Schwefelsäure auf 4,7 eingestellt.

Aus den beiden Hefen wurde ein Impfmaterial hergestellt und gemischt. Die Herstellung erfolgte in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 beschrieben, mit wenigstens zwei Verfahrensstufen, die auf dem Saft aus dem Lolch kultiviert wurden. Die verwendeten'Hefen waren Saccharomycee cerevisiae und Candida utilis.

1 ecm der Suspension aus der letzten Stufe der Herstellung des Impfmaterials wurden dem Gras zugegeben. Das Testrohr wurde in eine Rotationseinrichtung eingebracht, die sich mit 40 U/min drehte. Das Rohr war dabei im Winkel von 40° zu der Horizontalen geneigt.

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Bach Beendigung dee Wachatuea betrag die proteinkonzentration in des liquor 4,7Jt- Baa Material vurde entfernt und in einem Vakuuesehüsseltroekner bei 70 C getrocknet« Sine Analyse des Produktes ergab folgende Ergebnisse:

Geaastgevicht 18,8 g

Protein 33,8 5t

nach Korrektur auf eine lOJtige Feuchtigkeit abaaia.

Die Aainoaäureanalyse (g/16g Protein H) var folgendes -lysin 4,4» Tryptophan 1,8, Phenylalanin 4,3, Methionin 1,25, Leucin 7,1, Isoleucin 5,0, Talin 6,0«

Beispiel 4 Eine Probe Iiolch (Boggengraa - Tje graas) wirde ge-

sanmelt und analysiert. Ein Teil wirde entnoaaen und in kurze längen zerhackt und durch einen handbetriebenen

Fleischwolf getrieben, dessen üocngrSSe 1/8" betrug« Der

laolcn wurde in einen Kylonaack gefüllt und drei Minuten |

bei 29,4 at gepreßt. !Folgende Heßergebnisse «urden erzielt:

lolchprobe: 272,0 g

79,o?. Peuohtigkeit 5,743t Protein Safts 146,9g

90,6Jt Feuchtigkeit 4,93j5?rotain Eückstands . 125,1 g

61,45t Jaiwshtigkeit Protein

₄₅₅₇ * 009851/1249 BADORlGiMAL

Bin Teil dee Saftes (118,0 g) wurde cur Herstellung von Protein verwendet. Bei diesem Verfahren wurde dae Protein durch Bmttraning koaguliert· Han läßt Bodenorganismen auf (ten ge Besten Material» d.h. dae Xbagulat, welohee mit der klaren RUeketandfIUeeigkeit in demeelben Gefäß eusamaenge-Xaeeen wirft« wacheen. Dieser ausgewählte Teil von Saft eueammen mit dta Koagulat wurde in eine 500 ecm konische FIasohe gegeben. Die Flasche wurde teilweis· in ein Wasserbad von 95⁹O gestellt» so daß die Temperatur «loh auf 72⁰O erhöht. Man h*lt sit bei dieser temperatur 4 Minuten lang nnA kühlt dann durch tellwelses Eintauchen in Leitungswasser Tim 25⁰O. Der Flasche wurden 0,2 g Harnstoff und 0,1g Hefeextrakt augegeben. Der pH-Vert wurde mit Schwefelsäure ent 6»β eingestellt. Bas Volumen wurde auf 200 ecm gebracht, wobst eine vorher in dl« Flasche eingebrachte Oradu-i«marke verwendet wurde. Das konische Gefäß wurde in eine Rtittelmaeohlne in einem heißen Raum mit einer Temperatur von 3O⁰C gebracht. Der Saft wurde mit Bodenbakterien geimpft, welche nach dem weiter unten beschriebenen Verfahren (siehe"Impfmaterial") hergestellt wurde.

laoh Beendigung des Wachstums wurde das suspendierte Material in ein sentrlfugiertes Rohr eingebracht. Das suspendierte Material setzte eich am.Boden ab. Der überstehende liquor wurde entfernt. Das abgesetzte Material wurde wieder In 100 com verdünnter ßohwefelsäurelöeung mit einem pH von 2,0 suspendiert. Die Suspension wurde nochnu. mtrifugiert. Das gewonnene Material wurde bei 70⁰O in einem Vakuumtrockner getrocknet. Eine Analyee des Produktee auf einer 10J*igen feuohtigkeitsbaeis ergabt

9,22 g Gesamtgewicht 62,3Ji Protein.

BAD ORIGINAL *

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Die in g/16 g Proteinetickatoff ausgedrückte AalnotÄurβanalye β war folgendes Iyein 4,9_t Tryptophan 1,8, Penylalanin 4,5» Methionin 1,3* leucin 8,5, Isoleucin 5,0, Valin 6,1.

Impfmaterial

Eine Erdbodenprobe, welche etwa 5 g wog, wurde von derselben Stelle entnommen, aus welcher der Lolch (Roggengras) gesam- λ melt worden war. Die Probe wurde in einem Proherohr nit 15 com Leitungswasser aufgefüllt, die Hisohung wurde geschüttelt. Man läßt den Soden absetzen, anschließend gibt man etwa 10 ecm zu 50 ocm einer Lösung su, welche 25t Glukose, Nährsalze und Hefeextrakte enthielt. Nach Beendigung des Wachstums wurden 10 ecm der gemischten Kultur zu 50 eon des Roggengrassaftes zugegeben, welcher etwas zugegebenes Ammoniumphosphat und Hefeextrakt enthielt· Nach Beendigung des Wachstums auf dem Grassaft wurden 10 ocm zu weiteren 50 ecm Grassaft übergebracht« Man läßt das Wachstum weiter fortschreiten. Bei der zweiten Stufe der Gras saft fermenta tion wurden 2 ecm entnommen und dem Inhalt des konischen Gefäßes zugegeben. f

Beispiel 5

Eine Probe Phalarisgras wurde gesammelt. Ein Teil wurde in kurze Längen zerschnitten und in einer mit hoher Geschwindigkeit umlaufenden Mühle unter Verwendung von mit Schneidkanten versehenen Messern zerkleinert. Das zerkleinerte Grae wurde in einen gewirkten Nylonsack eingefüllt und bei 29,4 at drei Minuten gepreßt. Man erhält folgende Meßergebnisse:

BAD ORIGINAL 009851/1249

201048&

Jhalarieprobe: 1697 g Gesamtgewicht

82,5jC Feuchtigkeit

4,789t Protein flefti 1027 g Gesamtgewioht

93,75* Feuchtigkeit

4,16Ji Protein

60,53* extraktion Rückstand! · 666 g Gesamtgewicht

65,7 g feuchtigkeit

5,72 g Protein·

Bin Sell des Saftes (880 g) wurde mur Herstellung von Protein verwendet. Der Saft wurde auf 73⁰O durch unmittelbare Dampfeinblasung erwärmt. Die Flüssigkeit wurde von dem koagulieren Material durch Filtration abgetrennt und mit 300 oom einer verdünnten Sohwefeleäurelösung mit einem pH-Wert von 2,0 gewaschen. Dae PiItrat und die Waschlösungen wurden vereinigt. Der pH-Wert wurde auf 4,5 eingestellt. Weiterhin wurden 2 g immoniumphoephat und mAA 0,5 g Hefeextrakt zugegeben. Bs wurde eine Lösung bis auf 1,6 Liter mit Leitungswasser aufgefüllt. Be wurde ein Impfmaterial "^⁰¹* Aapergillua nlger. verwendet. Das Impfmaterial wurde getrennt über Bwei Verfahrensschritte hergestellt und dem Medium zugegeben.. Man läßt die Organismen unter den in Beispiel 2 angegebenen Bedingungen wachsen. Hach Beendigung des Wachstums wurde die Suspension durch die Bodenplatte abgezogen und zentrifugiert. Der Organismus und das andere abgesetzte Material setzte sich am Boden der Zentrifuge ab. Der überstehende Liquor wurde entfernt. Das abgesetzte Material wurde in 300 ecm Leitungswasser wieder suspendiert

λ j. j μ. -λ. « j und. aus der. Koagulation/ „ und zentrifugiert. Das aus der Pemientation/gewonnenfe Material wurde vereinigt, eo daß man ein Mischprodukt er-

4557 009851/1249 BADORiGiNAL

hält· Daa Produkt wurde bei 7ö*C in einem Takuuatrookner getrocknet. Auf feuohtigkeitefreier Baaia ergab eine Analyee dee Produktes: , .

49»9β g Geeaiitgewioht 56»49C Protein

«enn auf 1027 g Saft berechnet, beträgt die Auebeute 58,33 g.

Die A*inoeäureanalyee war folgendet I|rein 5,0, tryptophan '

1,3, Phenylalanin 4,2, Methionin 0,9, I*uoin 8,3, Ieoleuoin 4,9» Talin TfO*

BeiBPiel 6

Se wurden Proben von Bambueblättsi^ g@@@aaelt* Die Butter

wurden in Plaatikaäcken bei Hauiiteefcei^ or fünf Sage lang

abgelagert* Man entnimmt einen fell, βohneidet ihn in kurse liängen und gibt 285 g Leitungewaeeer au· Die Hiaohung wurde

in einem handbetriebenen Pleiechwolf alt einem loohduroh-

meeeer von 1/8·* eerkleinert. Die cerklelnerten Blatter wur- j den in einen gewirkten Myloneaok eingefüllt und drei Minu-ten bei 29,4 at gepreßt» Man erhält die folgenden Mefiergebnlaaei

Probeι 118 g Blätter

285 g leitungewaeeer • 7,55ji Protein in den Blättern

. j 55,6jC Peuchtigkeit in den

Blättern·

Sin Tell dee Saftee (200 <0 wurde eur Herstellung τοη Protein rerwendet· Der Saft wurd>; in eine konlaohe 500 ecu Plaaohe

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*^70t BAD

eingefüllt lind auf 72⁰C erhitzt, indem die P la β ehe teilweise in ein auf 95⁰C gehaltenes Wasserbad eingetaucht wurde. Zu dem liquor wurden 0,1 g Hefeextrakt zugefügt. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von Schwefelsäure auf 4,7 eingestellt« Weiterhin wurden 50 ecm Leitungswasser zugegeben. Die lösung wurde mit einer Mischung von Saccharomyces cerevisiae und Candida utilis geimpft. Die Hefen, welche von Agargehängen hergestellt wurden, wurden in einer Glukoselösung, welche Additive enthielt, kultiviert, und zwar über zwei Stufen auf einem Saftextrakt von den Bambusblättern. Die Fermentation wurde in einer konischen Flasche durchgeführt, in welch· einem auf konstanter Temperet durch Schütteln bewegt wurde.

einem auf konstanter Temperatur von 3O⁰C gehaltenen Raum

Nach Beendigung des Wachstums wurde die konische Flasche an einem Vakuumgefriertrockner angeschlossen und die Feuchtigkeit entfernt. Das gewonnene Pestmaterial wurde analysiert, wobei man die folgenden Ergebnisse auf einer feuchtigkeitsfreien Basis erhält:

47,67 g feuchtigkeitefreiee Gewicht 21₁2?6 Protein.

Beispiel 7

Eine Probe von weißen Kleeblättern, Stengeln und Blüten wurde geschnitten. Eine Analyse des Klees ergabt

Feuchtigkeit 82, 3j£

Protein 5,36#.

Ee wurde eine Portion entnommen und in kurze Längen zer-

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schnitten und in eine Mühle eingebracht, welche mit echnell umlaufenden Hessern betrieben wurde,und dabei geschnitten· Das zerkleinerte Gras wurde in einen gewirkten Hylonsack eingefüllt und drei Minuten hei 29,4 at gepreßt. Man erzielt die folgenden Meßergehnisse:

Saft: 826 g Gesamtgewicht

90,2# feuchtigkeit

4,81$ Protein

Rückstand: 354 g Gesamtgewicht

64,0# Feuchtigkeit

6,66$ Protein.

Ein Teil des Saftes (150 g) wurde zur Herstellung von Protein verwendet. Dieser Saft wurde in eine konische 500 ecm Flasche eingefüllt, welche auf 74⁰G durch teilweises Eintauchen in ein auf 95⁰C gehaltenes Wasserbad erwärmt wurde. Der Saft wurde fünf Minuten auf dieser Temperatur gehalten und dann durch teilweises Eintauchen in ein Leitungswasserbad bei Zimmertemperatur gekühlt. Das Pflanzenprotein wurde koaguliert und in dem Medium belassen. Diesem Material wur- | den 2 g Biuret und 0,5 g Hefeextrakt zugegeben. Die Lösung wurde mit Leitungswasser auf 300 ecm aufgefüllt. Der pH-Wert wurde auf 6,8 eingestellt. Diesem Material wurde ein Impfmaterial von B. stearothermopMlua zugegeben, welches in üblicher Weise hergestellt war, und zwar in wenigstens zwei Verfahrensstufen, indem man es auf dem Saft wachsen läßt. Das Gefäß und sein Inhalt wurden in einen verschlossenen Schüttler eingebracht, welcher thermostatisch auf 54⁰C eingeregelt war. Nach Beendigung des Wachstums wurde die Suspension aus der konischen Flasche entfernt und zentrifugiert.. · Lie Organismen und das andere suspendierte Material, welches

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eioh an den Boden der zentrifugierten Behälter abgesetzt hat, und der überstehende Liquor wurden entfernt. Das Material wurde in 50 ecm einer verdünnten Säurelösung mit einem pH-Wert von 2,0 wieder suspendiert. Die Materialien wurden nochmals zentrifugiert und nochmals mit 50 ecm Leitungswasser gewaschen, dessen pH-Wert auf 6,0 eingestellt war. Das Produkt wurde bei 72⁰C in einem Vakuumschüs seitrockne r getrocknet. Eine Analyse des Produktes ergab folgende Ergebnisse:

17,21 g Gesamtgewicht 42,OjC Protein auf einer 1Obigen Feuchtigkeitsbasis·

Wenn man auf 826 g Saft berechnet, beträgt die Ausbeute 94,76 g Gewicht.

Bs wurde eine Aminosäureanalyse durchgeführt, die die folgenden Ergebnisse hatte: Lysin 5,7, Tryptophan 2,2, Phenylalanin 4,4, Methionin 1,7, Leucin 8,1, Isoleucin 5,9, Valin 6,9.

Beispiel 8

Proben von verschiedenen Materialien wurden gesammelt. In der nachfolgenden Aufstellung 1 ist die Art des Materials zusammen mit den gewonnenen Ergebnissen zusammengestellt. Mit Ausnahme der Bambusblätter wurde ein Teil jeden Materials entnommen, in kurze Längen zerschnitten und in einem handbetriebenen Pleichwolf mit einer Lochgröße von 1/8" zerkleinert. Bei den Bambusblättern wurden 250 ecm Leitungswasser auf je 100 g zerkleinerte Blätter zugegeben, bevor die Mi-

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βchung in den Fleischwolf gefüllt wurde. In einem einzigen Fall wurde der Abfall-Liquor von einer Gemtisekonservenfabrik (Tomaten) vor dem Einbringen in die konische Flasche nicht behandelt· Das zerkleinerte Material wurde in einen gewi-rkten Nylonsack gefüllt und drei Minuten bei 29,4 at gepreßt.

Der Saft von jeder Probe wurde getrennt behandelt. 200 com Saft wurden in eine konische 500 ecm Flasche eingefüllt und auf eine Temperatur im Bereich von 70 bis 75⁰C durch teilweises Eintauchen in ein auf 95⁰C gehaltenes Wasserbad erhitzt. Der Saft wurde drei bis fünf Minuten lang auf dieser Temperatur gehalten. Das ausgefallene Material wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde auf den erforderliehen pH-Wert eingestellt. Vo dies besonders erwähnt ist, wurde ein Stickstoffspender zugegeben. Es wurden jedoch keine Nährealze oder Hefeextrakt zugegeben. Die Proteinkonzentrationen wurden mittels des Folin-Verfahrens gemessen. Es wurden Kicroorganismen A zugegeben, welche aus einer Mischung von Sacchromycea cerevisiae und Candida utills bestand. Der MicroOrganismus B bestand aus Erdbodenorganis- | men, wie sie bereits in Beispiel 3 beschrieben wurden. Der pH-Wert wurde auf die erforderliche Höhe eingestellt. Die Flüssigkeit wurde geimpft. Die Fermentationen wurden in einer konischen 500 ecm Flasche durchgeführt, welche in einer rotierenden Rütteleinrichtung geschüttelt wurden. Nach Beendigung des Wachstums wurde die endgültige Suspension hinsichtlich des suspendierten Materials und des Proteins analysiert.

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Rohmaterial	%w/v Protein	Verwendete	Verdoppelungs-	1 Stunde	Temp.	°C pH	NPN zugegeben	Konzentra tion % w/v im Medium	0,1	Protein in	B
	indem ver fütterten 8aft	Microorga- nfffTMtft	geechwindigkeft der Organiomen in Stunden	1 Stande			Art	0,1	0,1	der fertigen Charge (% w/v)im Medium
	0,057		ecws	1 Stande	35	6,8	Ammelin	9 0,1	0.2	0,461
Roter Klee	0.057	B	Il	1 Stande	35	W 6.8	Triuret	Dicyandiamid 0,1	0,2	0,402
H Il	0,057	B	•I	!Stande	35	6,8	Biuret	0,1	0,701
ti II*	0,057	B	Il		35	6,8	Calcium dicyan diamid	0,1	0,382
It »I	0,057	B:	•1		35	6,8	(NH4)2CO4	0,1 0,1	0.713
ο GemUseabfall *° Ltqoor (Tozna- JJJtenabfall -ä. Liquor)	0.055	Β:	2.0		30	5,0	Harnstoff	—	0,400
-» Roter Klee	0,059	λ	2.0		30	5,0	Harnstoff	0,330
*** Il M «0	0,037	A	1,9		30	5,0	KNO. S	0,375	•
Phalari·	0,037	C. mm·	2,0		30	5,0	NH4Cl NH4NO3	0,330
Weißer Klee	0,035 0,036	C. Utili·	2,4 2,1	30 30	5,0 4,8	Nil	0,340 0, 375	201C
Bambus Steal -	0,036	C Utili« S Cerevisiae	2.2	30	4,8	0,280	)486
Steal	S Cerevisiae .

-■·	%w/v Protein	Verwendete	Verdoppelungs-	Temp. C	pH	NPN zugegeben	Konzentra tion % w/v Im Medium	Protein in	ΓΟ O
	In dem ver fütterten Saft	Microorga nismen	geschwindigkelt der Organismen In Stunden			Art	0,2	der fertigen Charge (% w/v)im Medium	O
Rohmaterial	0,037	C. UtIlU	1,9	30	5,0	NH Gas 3 .	0,1	0,352	CD
	0,037	C. UUUs		30	4,8	Harnstoff	0,i	0,300
Weißer Klee	0,057	A		30	5,0	Cyanursäure	0,1 .	0,407
AUbB	0,057	A		30	5,0	Ammelin	0,1	0,502
o Roter Klee	0,057	A		30	5,0	Trluret	0,1	0,407
S - «	0,057	A		30	5,0	Dicyandiamid	0,1	0,616
	0,057	A		30	5,0	Biuret	0.1	0,352
- « H	0,057	A	'·'	30	5,0	Calcium Cyanamld	0,1	0,697
""* H M	0,057	B		35	6,8	" Cyanursäure	0,2	0,386
	0,033	Bhyzopus epp.	4	32	4,5	Ammoniak	0,2	0,391
M H	0,033	Asper- glllu· epp.	10	30	4,5	Ammoniak		0,369
Pnalaria				■ · .
tt

Rohmaterial %w/v Protein Verwendete in dem ver— Mlcroorgaftttterten Saft nlsmen

Verdoppelung·- Temp. C pH geschwindigkeit der Organismen in Stunden

NPN zugegeben

Art

Konzentration % w/t im Medium

Protein la

der fertigen Charge

(% w/v)lm Medium

Phalarii

H Il

Il

it ■ n

Il

0,033	- Aapergillua	10	•	10
	orytae
0,033	• Aaperglllu·	9	-
	nlger	-
0,033	Aapergillu·
	veriloolor	9,5
0,033	Neuroepora
0,033	Neuroepora	1,85
	•Itophllu·	2.1
0,033	Streptomyoea
	•pp.	2.0
0,033	Utilli major
0,033	Utilla	2,1
	troplcalla
0,033	Utilla	2.3
	pulcherrlma
0,033	Utilia	-
	llpolytlca
0,033 '	Saccharomycea
	fragulla
0,033	Geotrlchlum
	candldum

30 30 30

30 30

30

30

30 30 30

30

4, 5 A τη mn nt

ak

Ammoniak Ammoniak

Ammoniak Ammoniak

4,6 Ammoniak

Ammoniak Ammoniak

Ammoniak
Ammoniak
Ammoniak

4,5 Ammoniak

0,1 0,2 0.2

0,2 0,2

.0,2

0.2 0,2

0,2

0,2

.0,2

0,2

0,375 0,366 0,361

0,337 0,330

0,354

0,341 0,341

0,332 0,375 0,344

0,329

ro σ

OO

cn

	-	%w/v Protein	Verwendete	Verdoppelung·-	Temp.	-	NPN zugegeben	Konzentra tion % w/t	Protein la	I a
	Rohmaterial	in dem ver fütterten Saft	Mikroorga nismen	geschwindigkeit der Organismen		°C pH	Art	Im Medium	der fertigen Charge (% w/v)lm Medium
				Instand—				0.2
		0,033	B. subtitle	0,38	30	■	Ammoniak	0,2	0,372
	PhalArii	0,088	Pseodomonas ■PP.	0,30	,37	6,8	An^inontak	0,2	0,311
	fl	0,088	B. Megath erium	0,35	36	6,6		0,2 .0,2	0,324
	ft	0,038 0,033	B. Stearo-	0,16 0,35	53 32	6,8	Ammoniak	0,2	0,377 ; 0,355 JQ •
O	η η	0,033	Aerobacter aerogen··	0,38	36	6,8 6,8	Amm^nlttk	0,2	0,351
Q9851/1	η	0,088	Escherichia ooU	··	33	. 6^8	ATW?nlfik		0,362
	η		Sbyzopcs ■ N.R.R.L 2710			4,5	Ammoniak
■ ·				AmTnnr>fa|[

O J> OO CD

Beispiel 9

Eine Probe weißen Klees wurde entnommen und der Saft, wie in Beispiel 2 beschrieben, abgetrennt. Eine Analyse des Saftes zeigte, daß er 91 »45* Feuchtigkeit und 4_t17# Protein enthält. Ein Teil dee. Saftes (1000 g) wurde zur Herstellung von proteinhaltigem Material verwendet· Dieses Verfahren bestand darin, daß der Saft dem in Beispiel 2 beschriebenen Fermentationsgefäß zugegeben wurde. Der Rührer wurde auf eine konstante Geschwindigkeit von 240 U/min eingestellt. Man läßt durch das Gaszuführungerohr gasförmiges Kohlenstoffdioxyd treten mit einer Geschwindigkeit γοη 300 ecm je Minute. Dem Saft in dem Gefäß wurden 1 g Harnstoff und Leitungswasser zur Auffüllung auf 1500 ccn zugegeben. Der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt. Ein gemischtes Impfmaterial wurde von dem Pansen eines Schafes und einer Kuh mittels eines Röhrchens (fistula) erzielt. 30 ecm dieses Liquors wurden dem Fermentationsgefäß zugegeben. Unter den Organismen in dem Impfmaterial befanden sich Bacteroides, Borrelia species. Entodlum species, Holotrichs, Ostracodinum species.

Ebenfalls waren Bakterien Lactobaellll species und Eurbaote- ' rium species anwesend. Nach Beendigung des Wachstums wurde der fermentierte Liquor durch die Bodenplatte abgezogen. Der Liquor wurde durch direkte Dampfeinblasung fünf Minuten lang auf 75⁰C erhitzt. Die flüeeige Suspension wurde auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt. Das suspendier Material wurde durch Zentrifugieren entfernt. Das Produkt wurde bei 70⁰C in einem Luftofen getrocknet. Die Analyse des Produktes berechnet auf eine 10#ige Feuchtigkeitsbasis ergab:

62,9 g Gesamtgewicht

55.« X Protein. BADOHICItW. .

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Beispiel 10

Eine Saftprobe mit einem Volumen von etwa 20 liter wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, von weißem Klee gewonnen. Eine Analyse des Saftes zeigte, daß er 9O,6ji Feuchtigkeit und 4,56$ Protein enthielt. Der Saft wurde zur kontinuierlichen Erzeugung von Protein verwendet. Bevor.der Saft fermentiert wurde, wurde das durch Wärmeeinwirkung koagulierte Material, ä wie in Beispiel 2 beschrieben, entfernt. Das Filtrat und die Waschflüssigkeiten wurden vereinigt. Weiterhin wurden Zugaben von Leitungswasser, Ammoniumphosphat und Hefeextrakt vorgenom-r men. Das bereits yon Moss und Bush (Biotech, und Bioeng.IX, 585-602 (1967))früher verwendete und beschriebene Fermentationsgefäß wurde an das flüssige Durchlaufsystem und an den Vorratsbehälter für das Medium angeschlossen, so daß die Fermentation kontinuierlich durchgeführt werden kann. Das Volumen des Mediums in der Fermentationseinriehtung wurde auf 2 liter gehalten. Das Medium wurde mit einer konstanten Geschwindigkeit von 500 ecm je Stunde zugeführt, so daß sich eine Verweilzeit von 4 Stunden und ein Verdünnungsverhältnis von 0,25 je Stunde ergab. In-das Gefäß wurde luft mit einer Ge- I schwindigkeit von 300 ecm je. Minute eingeblasen. Die Drehgeschwindigkeit des Rührers wurde automatisch geregelt, so daß eine gelöste Sauerstoffkonzentration von 15 Millimol je liter aufrecht erhalten wurde. Der pH-Wert wurde auf 4,8 eingeregelt. Das verwendete Impfmaterial enthielt eine Mischung der Zellen %on Candida utilis und Saccharomyoes cerevieiae var. ellipsoides. Die Fermentation wurde zwei Tage fortgesetzt.

Das bereite vorher koagulierte und von dem Saft entfernt· Material wurde bei 75⁰C in einem laboratoriumitrockner mit

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Luftumwälzung getrocknet. Während dee Verlaufe der Fermentation wurden von dem ausfließenden Liquor Proben entommen. Dan suspendierte Material wurde durch Zentrifugieren entfernt und in einem Vakuumgefriertrockner getrocknet. Genau berechnete Mengen jeden Produktes wurden zugegeben und analysiert. Die folgenden Daten wurden gesammelt:

Zeit in Stunden	Produkt	Produkt
nach der Impfung	g/100 g Saft	i» Protein
17	81,1	53,0
19	82,9	53,1
23	83,0	53,3
24	84,4	53,7
26	83,2	52,8
29	80,6	54,5
31	83,7	53,4
33	84,2	52,9

Die Ergebnisse sind auf

Feuchtigkeitsbasis berechnet.

009851/1241

Claims (1)

1. Patentansprüche

   "I. Verfahren zur Herstellung von Protein, dadurch gekennzeichnet, daß in einem von einem Blattmaterial extrahierten oder ausgepreßten Saft man eine oder mehrere nicht toxische Microorganismen unter Bedingungen wachsen läßt, in welchen diese Microorganisnen Protein synthetisieren, wobei die Microorganieoen so ausgewählt werden, daß sie in Gegenwart eines Proteine wachsen können, ohne dieses Protein zu zerstören.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß dem aus eines nicht giftigen Gras oder einem anderen Blattmaterial extrahierten oder ausgepreßten Saft eine Nichtprotein-Stickatoffquelle zugegeben wird und daß man dann auf dem Saft die Microorganismen wachsen läßt.

   3* Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Blattmaterial ein nicht giftiges Zellulosematerial ist, welches wenigstens 4O}6 w/w Wasser und 2J* w/w Protein ausgedrückt auf einer wasserfreien Basis enthält.

   4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Blattmaterial Veidegräeer und/oder Blätter von Pflanzen einschließlich Büschen, Sträuchern, Gemüsen, Bäumen und/oder Stengel und/oder Blumen und/oder Ernteprodukte und/oder Schoten und/oder Hülsen und Abfälle von GemUeen verwendet werden.

   5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, -daß als Blattmaterial luzerne, roter Klee, weißer Klee, Sudaxgrgeer, Sisalblätter, Phalarls, Zuckerrohrblätter, Karottengrünzeug, rote Beetegrünzeug und Mischungen derselben verwendet werden.

   4557

   009851/1249

   6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Proteingehalt in den von dem Blattmaterial extrahierten oder ausgepreßten Saft zwischen 1 und 57» w/v Pflanzenprotein enthält.

   7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das' in dem extrahierten Saft enthaltene Pflanzenprotein koaguliert wird, von den restlichen Liquor abgetrennt wird und daß man die Microorganismen in dem restlichen Liquor wachsen läßt·

   8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das koagulierte Pflanzenprotein und das durch den Microorganismus erzeugte Protein zwecks Erzielung eines Proteinnahrungszuschlages miteinander vereinigt werden.

   9. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das in dem extrahierten Saft enthaltene Pflanzenprotein koaguliert wird und daß man den Microorganismus in Gegenwart sowohl den koagulieren Pflanzenproteins als auch dee restlichen Liquors wachsen läßt.

   10. Verfahren nf.ⁿh Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Microor^anismus in Gegenwart sowohl der ausgepreßten Pulpe von Gras oder Pflanzenmaterial und des von demselben gewonnenen Haften wachsen läßt.

   11. Verfahren ->anh Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dnß der lüeroorga· ^λ °::up eine nicht giftige V.p.fe ist.

   12. Verfahr* u nach Anspruch 2, daduioh goiromr.nichnM , <inß der lüorooj,' >umuf< oiv. nj cht giftige Pak t (-.riuru iat.

   ⁴ - ^{b 7} ü 0 9 8 5 1 / 1 2 4 9 BAD

   13. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der mcroorganismus ein nicht giftiger Pilz ist.

   14. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Microorganismen nicht giftige Protozoen sind.

   15. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß

   als Hefe Eremascua, Endomycea, Schizosaccharomyces. Mono- ^ 3porella _t Nematospora, Coccidiascua, Lipomycea, Endomycopaia. " Saccharomyeea, Pi chi a _t Hanaenula, Schwanniomycea _t Debaromyces, Sacchomycoidea _t Henaenioapora, Nadaonia, Saccharomycopais, Sporobolomycea , Bullera, Tilletiopai8 _t Iteraonia, Cryptococcua (auagenommen jedoch Cryptococcua neoformana), !Porulopaia, Pityroaporum, Brettanomycea, Candida, Kloeckera. Trigonopais, Rhodotorula oder !Porula und Miachungen deraell)en verwendet werden.

   16. Verfahren nach Anapruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß ala Bakterien Paeudomonaa, Ilethanomonaa, Acetobacter, Vibrio, auagenoramen jedoch die Arten, die nicht im Erdboden leben, Cellvibrio, Cellfacicula, Spirillum,Azotobacter, Rhizobium, ί Iiactobacillua, Escherichia, Aerobacter, Erwinia, Bacterium, Cellumonag, Sarcina, Saccharobacterium, Methanobacterium, Bacillus subtilia, Bacillus pumilua. Bacillus coagulana, BacilluB lentia, Bacillus megatherium, Bacillua cereua, Bacillua brevis. Bacillus ate aro thermo phiIub, Bacillua thermodiastaticus verwendet bei 65° - 5⁰C, Bacillus robuatua, Bacillus thermo celluloIytious verwendet bei 65 - 5 C, Bacillus thermoliquifaciena verwendet bei 60 - 5⁰C, Bac.-.Lllua viridulua. Clostridium cellulyticum verwendet bei 60 - 5⁰C, Mycobacterium phlei _t Thermophilic strepto verwendet bei 55 - 60 - 5 C, Micromonoapora,

   4557 000851/12.49 BADORlGiNAL

   201048G

   SphaerotlluB, Caryophanon, Cytophaga, Aeetangium, Sarangium, Polyanglmn, Syrangium, Mellettangium, Podangium, Chrondromycea, Angiococcus, Sparocytophaga oder Spirochaeta und Mischungen derselben verwendet werden.

   17. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß ein Pilz Acrasiales, Kyxomycetea,* Chytridiomycetea, Hyphochytredimycetes, Oomycetes, Plasmodipharomycetea, Zygomycetes, Triehomycetes, Euaacomycetidae, Plectomycetea, Di8comycetea, Laboulbeniomycetea oder Baaidioraycetea und Mischungen derselben verwendet werden.

   18. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß als Protozoen Diplodinium, EudiρIodinium, Entodium species, Holotrichs oder Ostracodinum species und Mischungen derselben verwendet werden.

   19. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als MicroOrganismen Rhizopus oligosporus. Aspergillus ni^er. Aapergillus versicolor, Keurospora species. Neutrospora sitοphiHa, Streptomyces 3pecies, Candida tropicalis. Candida pulcherrima, Candida Iipolytica, Saccharomyces ellipsoidus, Saccharomyces carlsber^ensis, Saccharomycea fragilis« Hansenula anominala, Bacillus megatherium oder Aerobacter species acrogen'is und Mischungen derselben verwendet werden.

   20. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Microorganismen Candida utilis. Saccharomycea cereviaiae. AspergilluB oiyzae, Rhizopua species. Bacillus aubtilla. Bacillus stearothermophi!us oder Escherichia species verwendet werden.

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   21. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß dem Kulturmedium, ein.liineralnährBtoff zugegeben wird..

   22. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch.gekennzeichnet, daß die Nichtprotein-Stickstoffquelle Ammoniak, ein wasserlösliches Salz desselben oder Harnstoff ist. .

   25. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nichtprotein-Stickstoffquelle Biuret, Triuret, Tetrauret, | ein höheres Kondensationsprodukt des Harnstoffes, Ammelin, Annelid, Cyanursäure, Dicyandiamid und/oder Aminosäuren ist.

   24. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Nichtproteinstickstoffes, ausgedrückt als Stickstoff zwischen 0,01 bis 3£ v/v des klaren Saftea ist. . .

   25. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens während eines Teiles der Arbeitszeit das Verfahren in Gegenwart von 0,^ bis 250 Micromol Sauerstoff je Liter des flüssigen Yiachetunsinedixuns durchgeführt wird.

   26. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur zwischen 20 und 65⁰C liegt.

   27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur zwischen 40 und 55⁰C liegt, und daß die Microorganismen thermophyl sind.

   ₄₅₅₇ ^ßAD ORIGINAL

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   28. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Proteingehalt in dem flüssigen Medium, wie er während des Wachstumsprozesses erreicht wird, zwischen 0,3 und Tß> v/v liegt und daß der pH-Wert in dem flüssigen Medium zwischen 3 1/2 und 8 liegt.

   ?9· Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die vorliegende Sauerstoffmenge zwischen 1 und 10 Micromol je Liter des flüssigen Wachstumsmediums beträgt.

   30. Verfahren wie in einem der Beispiele 1 bis 9 beschrieben,

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