DE4000942C2

DE4000942C2 -

Info

Publication number: DE4000942C2
Application number: DE4000942A
Authority: DE
Inventors: August Ernst Dipl.-Ing. Stronegg At Kirkovits; Helga Laa At Edlauer
Original assignee: JUNGBUNZLAUER AG WIEN AT
Current assignee: Jungbunzlauer Austria AG
Priority date: 1989-03-10
Filing date: 1990-01-15
Publication date: 1992-01-16
Also published as: ATA55589A; DE4000942A1; US5079164A; FR2644178B1; AT391323B; FR2644178A1

Description

Die Erfindung betrifft den Stamm Bacillus coagulans DSM 5196 sowie ein Verfahren zur Herstellung von optisch reiner L(+)- Milchsäure durch Kultivieren dieses Mikroorganismus in oder auf einem geeigneten Nährmedium, wobei man eine L(+)-milchsäurehaltige Kulturflüssigkeit erhält, aus der vorzugsweise die gebildete L(+)-Milchsäure isoliert wird (vgl. die Patentansprüche).

Zur Herstellung von Milchsäure geeignete Nährmedien enthalten üblicherweise neben diversen Wuchsstoffen, wie Spurenelemente und Vitamine, und verwertbaren Kohlehydraten auch verschiedene Stickstoffquellen, wobei als organische N-Quelle vorzugsweise Hefeextrakt oder Maisquellwasser dient.

Die Herstellung von Milchsäure aus diversen kohlehydrathaltigen Ausgangsmaterialien unter Zusatz verschiedenster Stickstoffquellen, Phosphorverbindungen, Vitaminen und anderen produktionsfördernden Stoffen ist seit der Jahrhundertwende bekannt.

Als eine der ersten beschäftigt sich die FR-PS 6 79 418 aus dem Jahre 1929 mit diesem Verfahren. Nachfolgend werden in der EP-PS 69 291 der Einsatz von Hefen sowie in der EP-A 01 13 215 aus dem Jahre 1984 die Produktion von Milchsäure durch Bakterien der Species Lactobacillus beschrieben. Neuere Arbeiten beschäftigen sich mit Verfahrensoptimierungen, die vor allem durch Eintrag spezieller Stickstoffquellen gekennzeichnet sind, wie beispielsweise in der EP- PS 02 66 258 (1988). Auch hier gehört der milchsäureproduzierende Mikroorganismus der Genera Lactobacillaceae an.

Alle diese Verfahren haben jedoch nicht in befriedigendem Maße dem zunehmenden Bedarf an optisch reiner L(+)-Milchsäure Rechnung tragen können, der sich neben dem Einsatz in der Nahrungs- und Genußmittelindustrie aus der Verwendung von Milchsäure zur Herstellung biologisch abbaubarer Kunststoffe ergibt.

Es bestand somit die Aufgabe, ein Verfahren zur Produktion von optisch reiner L(+)-Milchsäure zu entwickeln, wobei besonders Stickstoffeintrag und Gärzeit zu minimieren waren. Gleichzeitig sollte eine Umsetzung von sowohl Glucose als auch Saccharose möglich sein, ungeachtet dessen, ob es sich dabei um reine Rohstoffe oder beispielsweise Melasse handelt.

Dazu wurde eine gezielte Isolierung von milchsäurebildenden Bakterien aus pflanzlichem Material durchgeführt.

Dabei konnte aus Silage ein Mikroorganismus isoliert werden, der zur Familie der Bacillaceae gehört. Überraschenderweise konnten durch gezielte Anreicherungsmethoden die Stoffwechselleistungen des Bakteriums dermaßen gesteigert werden, daß er in der Lage ist, Kohlehydrate, vorzugsweise Glucose oder Saccharose, im Gegensatz zu bisher publizierten Verfahren, bei Anfangskonzentrationen von mehr als 140 g/l in L(+)-Milchsäure umzusetzen.

Untersuchungen dieses erfindungsgemäßen Mikroorganismus führten zu dessen Identifizierung als Bacillus coagulans mit nachfolgend aufgelisteter taxonomischer Charakteristika:

- Gram positive Stäbchen mit einer Größe von 1,5-4×0,4-0,8 µm.
- Bildung von ellipsoiden bzw. zylindrischen Sporen
- nicht beweglich
- aerob bis fakultativ anaerob
- Wachstum bei 30-60°C optimale Temperatur bei 48-54°C
- Wachstum bei pH 4,5-7,0 optimaler pH-Bereich zwischen 5,8 und 6,2
- Katalase: positiv
- Säurebildung aus D-Glucose positiv
L-Arabinose negativ
D-Xylose negativ
D-Mannit negativ
Lactose positiv
- Gasbildung aus Glucose: negativ
- Desaminierung von Phenylalanin: negativ
- Reduktion von Nitrat: negativ
- Verwertung von Citrat oder Propionat: negativ
- Abbau von Stärke positiv
Casein negativ
Gelatine negativ
Tyrosin negativ
DNA positiv
- Bildung von Indol: negativ
- Gärungsverhalten: homofermentative L(+) Milchsäurebildung

Der durch oben angeführte Daten gekennzeichnete Stamm wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH gemäß den Bestimmungen des Budapester Abkommens am 31.1.1989 mit der Nummer DSM 5196 hinterlegt.

Es wurde gefunden, daß der erfindungsgemäße Mikroorganismus in der Lage ist, bei Temperaturen von bis zu etwa 60°C Milchsäure zu bilden; dementsprechend besteht ein weiteres Kennzeichen des erfindungsgemäßen Verfahrens darin, daß die Kultivierung des Mikroorganismus bei Temperaturen im Bereich von 30 bis 60°C, vorzugsweise im Bereich von 48 bis 54°C, insbesondere bei etwa 52°C, durchgeführt wird.

Weiterhin wurde gefunden, daß bei höheren Temperaturen, insbesondere zwischen 50 und 60°C, eine sterile Fahrweise nicht nötig ist, insbesondere eine Sterilisierung des Nährmediums (z.B. Erhitzen auf 121°C während 15 min) unterbleiben kann. Ein weiteres Kennzeichen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist somit, daß die Kultivierung des Mikroorganismus unter nichtsterilen Bedingungen durchgeführt wird.

Die Kultivierung des Mikroorganismus erfolgt weiterhin vorteilhaft unter aeroben Bedingungen.

Wie z.B. aus der EP-A 02 66 258 hervorgeht, war es bisher nicht möglich, mit Zuckerausgangskonzentrationen über 140 g/l zu arbeiten. Wie schon eingangs erwähnt, ist der erfindungsgemäße Mikroorganismus in der Lage, höherliegende Zuckerkonzentrationen zu verarbeiten.

Ein weiteres Kennzeichen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist demgemäß, daß die Kultivierung des Mikroorganismus in oder auf einem Medium durchgeführt wird, dessen Zuckerausgangskonzentration über 140 g/l, bevorzugt zwischen 180 und 200 g/l, insbesondere bei 190 g/l, liegt.

Technisch heißt dies vor allem, daß die gesamte zu vergärende Zuckermenge vorgelegt werden kann, das erfindungsgemäße Verfahren also als batch- Verfahren durchgeführt werden kann, zum Unterschied von bekannten Verfahren wie z.B. nach der EP-A 00 72 010, bei dem während der Kultivierung kontinuierlich oder diskontinuierlich Zucker nachgegeben wird.

Weiterhin wurde herausgefunden, daß das Nährmedium beim erfindungsgemäßen Verfahren einen weitaus geringeren Gehalt an organischem und anorganischem Stickstoff aufweisen muß als bisher.

Weitere Kennzeichen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind somit einerseits, daß die Kultivierung des Mikroorganismus in oder auf einem Medium durchgeführt wird, dessen Gehalt an Maisquellwasser höchstens bei 30 g/l oder an Hefeextrakt bei 3 g/l liegt, woraus sich ein Gehalt an Aminostickstoff von 0,15 bis 0,4 g/l ergibt und anderseits, daß die Kultivierung des Mikroorganismus in oder auf einem Medium durchgeführt wird, das höchstens 3 g/l Ammonphosphat enthält.

Dies hat zur Folge, daß die gebildete L(+)-Milchsäure durch weitaus weniger aufwendige Verfahren als bisher aus dem Kulturmedium isoliert und gewonnen werden kann. Es genügt z.B. die Neutralisierung mit Ca(OH)₂, worauf Ca-L(+)-Lactat auskristallisiert.

Gegebenenfalls können beim erfindungsgemäßen Verfahren Maßnahmen zur Schaumbekämpfung nötig sein.

Nachfolgende Beispiele dienen der näheren Beschreibung der Erfindung:

Beispiel 1: Isolation und Verbesserung eines Stammes der Art Bacillus coagulans

Pflanzliches Material wurde unter Luftabschluß bei 50°C während 7 Tagen inkubiert, danach in sterilem Wasser aufgenommen, geschüttelt und filtriert. Das resultierende Filtrat wurde soweit verdünnt, daß nach dem Überimpfen auf Petrischalen, welche Medium 1 enthalten, und Inkubation bei 50°C +/- 2°C Einzelkolonien vorlagen.

Medium 1: (Nähragar)
Fleischextrakt\|1 g/l
Hefeextrakt	2 g/l
Pepton	5 g/l
NaCl	5 g/l pH 7,4
Glucose	10 g/l
Saccharose	10 g/l
Agar	15 g/l

Nach 48 h wurden etwa 200 Kolonien isoliert und hinsichtlich ihrer Fermentationsleistung überprüft: Je 10 ml Medium 2 wurde mit entsprechendem Isolat beimpft und 5 Tage bei 50°C +/- 2°C bebrütet. Danach wurde die Milchsäurekonzentration enzymatisch in jedem Ansatz bestimmt.

Medium 2:
Saccharose\|120 g/l
(NH₄)₂HPO₄	1,5 g/l
CaCO₃	70 g/l
Hefeautolysat	5 g/l

Jenes Isolat, welches den höchsten Gehalt an L(+)-Milchsäure aufwies, wurde für die weiteren Selektionsarbeiten herangezogen. Von diesem Isolat wurden wieder Kolben mit Medium 2 beimpft, wobei Saccharose durch Glucose ersetzt und die Konzentration an Kohlehydraten um 10 g/l erhöht wurde. Die Inkubation wurde während 4 Tagen bei 50°C durchgeführt. Dieses Verfahren wurde solange wiederholt, bis jeweils 190 g/1 Saccharose bzw. Glucose innerhalb von 4 Tagen zu L(+)-Milchsäure umgesetzt worden sind.

Der hieraus resultierende Mikroorganismus wurde identifiziert und mit der Nummer DSM 5196 gemäß dem Budapester Abkommen hinterlegt.

Die entsprechend Beispiel 1 hergestellte und als Bacillus coagulans klassifizierte Kultur wurde zur Erhaltung des Stammes auf Medium 1 übertragen oder bei -15°C gelagert.

Beispiele 2-5: Produktion von L(+) Milchsäure
Zur Ausführung der Beispiele 2-5 wurde der nach Beispiel 1 isolierte und in regelmäßigen Abständen auf frisches Nährsubstrat (Medium 1) transferierte und anschließend bei 50°C inkubierte Mikroorganismus eingesetzt oder eine bei -15°C gelagerte Kultur verwendet. Es erfolgte eine Übertragung dieser Keime auf Medium 3, wobei darauf zu achten war, daß eine Inokulationsmenge von 1% nicht unterschritten wird.

Medium 3:

Kohlehydrate:
190 g/l Bezogen auf Glucoseäquivalent (in Beispiel 2+4: Saccharose in Beispiel 3+5: Glucose)

anorganischer Stickstoff:
1,5 g als (NH₄)₂HPO₄

organischer Stickstoff:
3 g/l als Hefeautolysat (in Beispiel 2+3), wobei als durchschnittlicher Gehalt an Aminostickstoff 4,8-5,8% bzw. an Protein (N × 6,25) 56-62% bei einer Trockensubstanz von 94-98% angenommen wird,

oder:
30 g/l als Maisquellwasser (in Beispiel 4+5), wobei als durchschnittlicher Gehalt an Aminostickstoff 2-3% bzw. an Protein (N × 6,25) 43-49% bei einer Trockensubstanz von 45% angenommen wird.

Die Produktionslösung wurde mittels geeigneter Vorkehrungen bei einer Temperatur von 52°C konstant gehalten und die Rührung so gewählt, daß eine optimale Durchmischung des Mediums erfolgte. Die pH-Werteinstellung auf 6,0 erfolgte durch Zugabe von Kalkmilch.

Ergebnisse

Der Anteil an D(-)-Milchsäure von 1 bis 1,5% in Beispiel 4 und 5 ist auf die üblicherweise als Racemat vorliegende Milchsäure des Maisquellwassers zurückzuführen.

Claims

1. Bacillus coagulans DSM 5196.

2. Verfahren zur Herstellung von optisch reiner L(+)-Milchsäure, gekennzeichnet durch die Kultivierung eines Mikroorganismus nach Anspruch 1 in oder auf einem Kohlenhydrate, Stickstoff und Protein enthaltenden Medium, wobei man eine L(+) -milchsäurehaltige Kulturflüssigkeit erhält, aus der vorzugsweise die gebildete L(+)-Milchsäure isoliert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung des Mikroorganismus bei Temperaturen im Bereich von 30 bis 60°C, vorzugsweise im Bereich von 48 bis 54°C, insbesondere bei 52°C, durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung des Mikroorganismus unter nichtsterilen Bedingungen durchgeführt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung des Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen durchgeführt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung des Mikroorganismus in oder auf einem Medium durchgeführt wird, dessen Zuckerausgangskonzentration über 140 g/l, bevorzugt zwischen 180 und 200 g/l, insbesondere bei 190 g/l, liegt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung des Mikroorganismus in oder auf einem Medium durchgeführt wird, dessen Gehalt an Aminostickstoff höchstens bei 0,4 g/l bzw. an Protein höchstens bei 6 g/l liegt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung des Mikroorganismus in oder auf einem Medium durchgeführt wird, das höchstens 3 g/l Ammonphosphat enthält.