DE2050361A1

DE2050361A1 - Verfahren zur Herstellung von Zi tronensaure

Info

Publication number: DE2050361A1
Application number: DE19702050361
Authority: DE
Inventors: Robert Carl Wantagh Fitts Robert Aloysius Huntington Station Findlay Cordon Bowie New York N Y Nubel (V St A) P
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1969-10-23
Filing date: 1970-10-14
Publication date: 1971-05-13
Also published as: IE34558B1; NL7014759A; SE370548B; CA923058A; BE757141A; CH513237A; FR2065080A5; SU448652A3; IL35381A0; GB1304753A; IL35381A; US4155811A; CS150644B2; BR6915241D0; ES384356A1; IE34558L; IT1049258B

Description

RECHTSANWÄLTE

DR. JUR. DIPL-CHEM. WALTER BEIl
ALFRED HOEPPEHER
DR. JUR. DIPL-CHEM. H.-J. WOLFF
DR. JUR. HANS CHR. BEIL

623 FRANKFURT AM MAIN-HOCHST ADELONSIRASSt 58

13. Okt. 1970

Unsere Nummer 16 630

Pfizer Inc., lew York, N.Y., V.St

Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch Gärung, insbesondere auf ein G-ärungsverfahren, bei welchem die Zitronensäure als freie Säure anfällt, so daß eine direkte Kristallisation derselben aus der Gärbrühe möglich ist_o

V/egen ihrer leichten Assimilierbarkeit, ihres guten Geschmaekes und ihrer geringen Toxicität ist die Zitronensäure eine der am häufigsten in der Lebensmittelindustrie und der pharmazeutischen Industrie eingesetzten Säuren, Sie wird in großem Maßstab als Ansäuerungsmittel in Getränken sowie als Antioxidans zur Unterdrückung des Ranzigwerdens in Fetten und Ölen verwendet. Sowohl die freie Säure als auch die Salze derselben werden als Puffer bei der Herstellung von Marmeladen, Gelees und Gelatinepräparaten sowie als Stabilisatoren in verschiedenen Lebenamitteiprodukten benutzt*

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Die Hauptmenge des Weltbedarfes an Zitronensäure wird mit Hilfe von Gärverfahren gedeckt, bei welchen im allgemeinen bestimmte Stämme von Aspergillus niger mit Kohlehydraten wie Melasse und Dextrose als Hauptquelle für assimilierbaren Kohlenstoff verwendet werden . Obwohl diese Gärverfahren Mit Aspergillus niger an sich durchaus brauchbar sind, weisen sie doch viele Schwierigkeiten auf. So neigen beispielsweise die Aspergillus niger-Kulturen nach einer gewissen Zeit der Zitronensäureproduktion zur Degeneration«, Bei dem Verfahren muß außerdem die Zitronensäure in Form eines Salzes abgetrennt werdenj letzteres muß dann angesäuert werden, damit die freie Säure gewonnen wenden kann. Weiterhin ist eine verhältnjenäßig lange Zeitspanne, im allgemeinen mehr als 7 Tage, erforderlich, wenn große Mengen an Zitronensäure durch die Gärung erzeugt werden sollen. Die lange Gärdauer und die zusätzliche Verfahrensstufe, in welcher das Zitrat in die freie Säure umgewandelt wird, sind die Hauptkostenfaktoren bei der Produktion von Zitronensäure„ Die Entwicklung eines raeaJa, ablaufenden Gärverfahrens zur direkten Herstellung und Abtrennung von Zitronensäure wäre daher für die einschlägige Industrie wichtig und interessant.

In der belgischen Patentschrift 716 247 ist ein Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure beschrieben, bei welchem zum Impfen verschiedene Hefen der Gattung Candida verwendet werden, welche die Fähigkeit besitzen, Zitronensäure zu akkumulieren und Kohlenwasserstoffe zu assimilieren} die eigentliche Gärung wird bei einem pH-Wert von etwa 4 bis etwa 7,5 durchgeführt, und zwar so lange, bis sich erhebliche Mengen Zitronensäure in der Gärbrühe angesammelt haben. Auch bei diesem Verfahren fällt die Zitronensäure als Calciumzitrat an, welches dann, im allgemeinen mit Schwefelsäure, angesäuert werden muß, damit die gewünschte freie Zitronensäure gewonnen werden kann.

In der einschlägigen Iiiteratur sind weitere Glieder der Gattung Candida beschrieben, die in Medien, welche Kohlenwasstratojffe

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enthalten, Zitronensäure erzeugen: vgl. hierzu I₀ Tanabe, J. Okada und H. Ono, Agr. Biol. Chem., 30, 1175 (1966), E.J. Nyns, J.P. Auquiere, N. Chiang und A.L. Wiaux, Nature, 215» (1967); M.J. Klug und A.J₀ Markovetz, Appl. Microbiol«,, 15, (1967), J. Bacteriol., 93, 1847 (1967)ο Offensichtlich ist es jedoch bisher nicht möglich gewesen, freie Zitronensäure in solchen Kohlenwasserstoff-Systemen zu erzeugen₀ Eine charakteristische Eigenschaft der meisten Zitronensäure akkumulierenden Stämme von Candida "besteht darin, daß sich in der Gärbrühe mit den Zitraten mehrwertige Alkohole wie Erythrit, Arabit und Mannit gleichzeitig ansammeln₀ Ein Unterscheidungsmerkmal des Λ erfindungsgemäßen Verfahrens, welches in überlegener Weise die Herstellung von Zitronensäure erlaubt, gegenüber bekannten Verfahren, besteht darin, daß sich bei Verwendung des neuen Stammes Candida lipolytica nur eine Nebenproduktion von geringen Mengen an Erythrit ergibt; Arabit und Mannit werden überhaupt nur in Spuren gebildet© Die höhere Konzentration der Zitronensäure, die bei Äem niedrigen End-pH-Wert der G-ärbrühe in freier Form vorliegt, und die geringen Mengen an nebenbei gebildeten Verunreinigungen machen es möglich, daß die Zitronensäure direkt aus der initiierten Gärbrühe isoliert werden kann₀

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch aerobe Vergärung eines wässrigen Nährmediums, f welches einen Kohlenwasserstoff oder eine Mischung aus Kohlenwasserstoffen als Hauptquelle für assimilierbaren Kohlenstoff enthält, mit Hilfe eines bestimmten neuen Stammes der Gattung Candida in etwa 4 bis 7 lagen, toei welchem die freie Säure dann " direkt durch Konzentration der filtrierten Gärbrühe gewonnen wurden kann,. 3?ür das erfindungsgemäße aerobe Gärverfahren zur Herstellung von Zitronensäure wird der Stamm Candida lipolytica ATCC Nr. 20.228 in einem Nährmedium verwendet, welches wenigstens ein n-Alkan oder η-Alken mit 9 bis 19 Kohlenstoffatomen als Kohlenwasserstoff enthält. Der Kohlenwasserstoff liegt in inniger Mischung mit einer wässrigen Phase vor, die eine assimilierbare Stickstoffquelle, Mineralien und andere übliche Nähr-

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«. 4 —

stoffe enthält.

Bei dem erfindungsgemäßen. Verfahren i,s,t während dee Gärzyklus im allgemeinen keine Einstellung des pH-Wertes erforderlich; gegen das Ende des Gärprjozesses, d.h. nachdem wenigstens die Hälfte bis Dreiviertel des Gärzyklus abgelaufen sind, fällt der pH-Wert der Gärbrühe auf etwa 2 bis 3. Bei einem Vergleich mit dem Stamm Candida lipolytica IK)-1437, welcher in der bereits erwähnten belgischen Patentschrift 716 247 genannt ist, mit dem neuen Stamm Candida lipolytica ATCO Nr. 20.228 ergibt sich, daß der letztere etwa fünf- bis zehnmal so viel Zitronensäure erzeugte Zu keinem Zeitpunkt des Gärzyklus fällt der pH-Wert der Gärbrühe, die mit der bisher bekannten Art Candida lipolytica IJ¹Q-1437 geimpft worden ist, unter 3·, Dagegen hat sich jetzt überraschenderweise gezeigt, daß der pH-Wert der Gärbrühe bei Verwendung des neuen Stammes ATCO Hr _e 20.228 während des gesamten Gärzyklus nicht eingestellt v/erden muß und daß sich in dem EndpH-Bereich von etwa 2 bis 3 hohe Ausbeuten an Zitronensäure ansammeln. Die akkumulierte freie Zitronensäure wird direkt, abgetrennt, indem man die filtrierte Gärbrühe nach Entfernung der Metallionen des Puffers konzentriert bezw. einengt.

Es konnte jetzt festgestellt werden, daß ein bestimmter Stamm der Hefe Candida lipolytica die besondere Fähigkeit besitzt, Zitronen-

der

säure in Porm der freien Säure bei aeroben Vergärung eines wässrigen Mediums , welches einen Kohlenwasserstoff als Hauptquelle oder einzige Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff enthält, anzusammeln, wenn der pH-Wert bei der Vergärung niedrig gehalten wird, doh. wenn die Zitronensäure bei ihrer Erzeugung nicht neutralisiert wird« Zur Zeit ist nur der eine Stamm lipolytica bekannt, der die direkte Kristallisation der Zitronensäure aus der konzentrierten Gärbrühe gestattet. Alle öffentlich erhältlichen Stämmp wurden geprüft und es wurde festgestellt, daß keiner diese besondere Eigenschaft besitzt. Der für die Zwecke der Erfindung brauchbare Stamm ist in die öffentlich anerkannte Sammlung "American Type Culture Collection¹¹ eingereiht und dort mit der

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Nummer ATCC 20.228 "bezeichnet wordene

Um die Eigenschaften dieses Stammes voll ausnutzen zu können, ist es notwendig, daß die Vergärung "bzw. die Fermentation bei einem niedrigen pH-Wert durchgeführt wird, d.h. daß die Zitronensäure bei ihrer Herstellung nicht neutralisiert wird. Bs ist überraschend, entspricht jedoch den Tatsachen, daß der Stamm Ur. 20.228 selbst bei pH-Werten von etwa 2 bis 3 oder darunter lebensfähig und ein starker Zitronensäure-Erzeuger bleibt. Am Anfang ist es notwendig, den pH-Wert bei etwa 4 bis 7 (im allgemeinen etwa 5 bis 6) zu halten, damit das Zellwaohstum in Gang kommtο Sobald sich die Zellmasse entwickelt hat, läßt man den pH-Wert auf natürliche Weise absinken, indem man mit steigender Zitronensäureproduktion keinen Puffer oder eine andere Base, die mit dem gebildeten Produkt reagieren kann, zusetzt. Die Gärung ist im allgemeinen in 5 bis 7 Tagen abgeschlossen. Bßvor noch die ersten beiden Tage vorüber sind, ist der pH-Wert schon unter 4 gesunken und fällt dann allmählich immer weiter bis auf den Endbereich von etwa 2 bis 3· Wie weiter vorn bereits gesagt, bedeutet dies, daß das Produkt in Form der freien Säure und nicht als Zitrat vorliegt, so daß es leicht abgetrennt werden kann.

Die anfängliche Einstellung des pH-Wertes kann duroh Zugabe von Natronlauge oder einer anderen Base erreicht werden,, Am ein- g fachsten ist es jedoch, eine begrenzte Menge eines Carbonates am Anfang zuzusetzen, dessen Pufferfähigkeit durch die gebildete Zitronensäure zum Zeitpunkt, zu dem sich die Zellmasse soweit entwickelt hat, daß sie als Inoculum für die Gärung verwendbar ist, verbraucht ist. Vorzugsweise setzt man dem Medium Caloiumcarbonat als Puffer zu. Dieses reagiert mit der Zitronensäure, die sich während der Wachstumsstufe ansammelt, wodurch verhindert wird, daß der pH-Wert des Mediums zu sauer wird. Es ist allgemein bekannt, daß es in den Anfangsstufen der Hefeerzeugung zu einem Stillstand oder zu einer erheblichen Verringerung des Hefezellenwaohsturns kommt, wenn der pH-Wert des Mediums unter etwa 4»0 fällt. Es kann auch angenommen werden, daß ein Teil des bei der

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Reaktion von Zitronensäure mit Calciumcarbonat gebildeten Kohlendioxids am Stoffwechsel der Hefezellen teilnimmt und so deren Wachstum in dem Medium fördert. Außer Galoiumcarbonat können auch Bariumcarbonat, Calciumoxid, Bariumoxid und andere bekannte Puffer verwendet werden₀ .

Vorzugsweise verwendet man als hauptsächliche oder einzige Kohlenwasserstoffquelle bei der Gärung n-Hexadecan; jedoch können auch andere n-Alkane und n-1-Alkene verwendet werden. Man kann auch Mischungen aus Kohlenwasserstoffen sowie Rohmaterialien und halbraffinierte Materialien einsetzen; jedoch sollte in jedem Pail wenigstens ein Teil des Materiaies aus einem Kohlenwasserstoff mit einer Kettenlänge von etwa 9 bis 19 Kohlenstoffatomen bestehen.

Der Kohlenwasserstoff wird im allgemeinen in einer Konzentration von etwa 5 bis 9 Gewichtsprozent, bezogen auf das Medium, verwendet. Dieser Umstand ist jedoch nicht kritisch und es ist durchaus möglich, den Kohlenwasserstoff in geringeren oder größeren Konzentrationen zu verwenden₀ Von den zur Verfügung stehenden anorganischen Stickstoffquellen kommen vor allem Stickstoffsalze wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und,Ammoniumnitrat infrage. Auch zahlreiche organische Stickstoffquellen sind geeignet, so z.B. Weizenkleie, Sojabohnenmehl, Harnstoff, Aminosäuren und Peptone_o Als besonders geeignet hat sich das im Handel erhältliche "NZ Amine YTT" erwiesen; hierbei handelt es eich um ein als Peptonquelle geeignetes Produkt, welches von der Plrma Sheffield Chemical Co*., Norwich, N.Y₉ USA vertrieben wird. Es ist weiterhin begannt, daß Vitamine wie Biotin und Mineralkationen und -anionen wie Natrium, Kalium, Kobalt, Phosphat und Sulfat für das Wachstum der Hefen ebenfalls sehr günstig sind_e Die meisten dieser Spurenvitamine und -mineralien sind in Maisweiohwaeser sowie einigen Stickstoffquellen, z.B. Sojabohnenmehl enthalten, so daß es nicht notwendig ist, sie einzeln dem Gärmedium zuzusetzen. Das Gärmedium enthält also übliche Quellen für assimilierbaren Stioketoff, Mineralien und andere Waohitums-

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faktoren, die in der wässrigen Phase enthalten sindo Ein Medium, das sich für die Zwecke der Erfindung als besonders brauchbar erwiesen hat, ist eines, welches ein Ammoniumsalζ, Maisweichwasser und einen Kohlenwasserstoff enthalte Das Maisweichwasser kann gegebenenfalls auch durch Kaliumdihydrogenphosphat ersetzt werden,. Die Kohlenwasserstoffkonzentration sollte wenigstens etwa 3 Gewichtsprozent, besser etwa 5 bis 20 Gewichtsprozent, bezogen auf das Medium, betragen, damit die Ausbeuten an Zitronensäure ausreichend hoch sind. Das mitverwendete Wasser hat im wesentlichen die Aufgabe eines Mediums für die Stickstoff, Mineralien und Wachstumsfaktoren liefernden Materialien, jedoch j ist eine 'gewisse Menge Y/asser auch notwendig, um das Wachstum ™ der Hefezellen zu unterhalten. Obwohl es theoretisch möglich ist, den Kohlenwasserstoff in sehr hohen Konzentrationen, z.B. von 50 °/o oder noch mehr zu verwenden, ergibt sich in der Praxis eine optimale Zitronensäureproduktion dann, wenn die Kohlenwasserstoffkonzentrationen innerhalb der vorstehend genannten Grenzen gehalten werden.

Die Gärung kann in beliebiger Weise unter Anwendung einer aeroben Inkubation durchgeführt werden; es ist jedoch vorteilhaft, eine kontrollierte Belüftung durchzuführen, z.B. das Medium an der Luft zu rühren, oder Luft durch das Medium zu blasen«, Da der Kohlenwasserstoff in der wässrigen Phase nicht löslich bzw. mit dieser nicht mischbar ist, ist es ratsam, den Kohlenwasserstoff in feindispergierter Form in dem wässrigen Medium zu halten, damit während der Vergärung zwischen dem Kohlenwasserstoff und der wässrigen Phase eine große Berührungsfläche vorhanden ist«, Auf diese Weise erreicht man einen optimalen Kontakt zwischen den Hefezellen, der wässrigen Phase und dem Kohlenwasserstoff. Besonders günstig läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren als submerse Gärung unter raschem Rühren der Mischung bei gleichzeitigem Einleiten durch Luft, z.B. mit Hilfe von Düsen, durchführen. Zur weiteren Verbesserung der Dispersion des Kohlenwasserstoffes kann es günstig sein, ein oberflächenaktives Mittel in dem Medium mitzuverwenden.

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Die üblichen Temperaturen, die allgemein zur Züchtung von Hefen angewandt werden, z.B. etwa 20 bis 37 Ö, Können auch für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden; vorzugsweise arbeitet man bei etwa 25 bis 29 ö bei einer Gärungsdauer von 4 bis Tagen,, Die einleitende Waohstumsperiode der Hefezellen zur Herstellung des Inokulums beträgt vorzugsweise 24 bis 48 Stunden. Im übrigen verlaufen die Züchtung und die Vergärung sowie die anschließende Aufarbeitung der Gärbrühe auf Zitronensäure, z.B. durch Zentrifugieren, Filtrieren, Einengen unter Vakuum usw., in üblicher bekannter Weise.

Ein wesentliches Kennzeichen der Erfindung ist darin zu sehen, daß die freie Zitronensäure direkt aus der filtrierten Gärbrühe in ausgezeichneter Ausbeute und Reinheit isoliert werden kann. Wegen der einzigartigen Fähigkeiten des Öandida-Stammes ATCC Nr. 20.228 bleiben ein guter Hefestoffwechsel und eine hohe Zitronensäureproduktion erhalten, wenn der pH-Wert der Gärbrühe rasch auf etwa 2 bis 3 oder sogar darunter fällt, nachdem die· Vergärung eingeleitet worden ist. Ganz anders als bei den wässrigen kohlehydrathaltigen Medien, die bei der Zitronensäureproduktion mit Aspergillus niger oder den bisher bekannten Gandida-Arten anfallen, handelt es sich bei den blank filtrierten Kohlenwasserstoff-Gärbrühen gemäß der Erfindung um Produkte, deren Gehalt an Verunreinigungen niedrig ist und die fast farblos sind. Reine kristalline Zitronensäure kann direkt in Ausbeuten von 50 bis 75 $> oder darüber durch einfaches Eindampfen im Vakuum gewonnen werden_e Bei dem neuen erfindungsgemäßen Gärverfahren entfällt die Notwendigkeit einer kontinuierlichen pH-Wert-Einstellung} durch die direkte Abtrennung einer Zitronensäure mit hoher Reinheit und mit guter Ausbeute ergeben sich außerdem erhebliche Einsparungen durch die Ausschaltung der Zwischenbehandlungsstufen der Salzbildung und der anschließenden Umwandlung der Salze in die freie Säure unter Verwendung von Mineralsäuren, Ionenaustauschern oder Elektrodialyse.

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Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch mit Mutanten verschiedener C. lipolytica-Stämme durchgeführt werden; solche Mutanten lassen sich mit Hilfe verschiedener chemischer und physikalischer Mittel erzeugen. Dabei ist es selbstverständlich wichtig, daß auch die Mutanten die Säurebeständigkeit und die Zitronensäure-Ansammlungsfähigkeit des Stammes ATCC Ir. 20.228 besitzen«, Zu den Mitteln, mit denen die genannten Mutanten erzeugt werden können, gehören Röntgen- und Ultraviolettstraaen , Behandlungen mit Stickstoff-Senfgasen oder organischen Peroxiden sowie noch einige andere dem !Fachmann bekannte Methoden· Schließlich kann das erfindungsgemäße Verfahren auch mit Subkulturen, natürlichen Mutanten, Varianten u.a. durchgeführt werden.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung des Verfahrens.

Beispiel 1

Eine Kartoffel-Dextrose-Agar-Schrägbodenkultur, welche Zellen von Candida lipolytica ATCC 20«,228 enthält, wird in ein flüssiges Medium überführt, welches aus 3 g "KZ Amine YTT" (das ist ein im Handel erhältliches, assimilierbaren Stickstoff lieferndes Peptonprodukt, welches durch Abbau von Casein gewonnen wird ^ und von der Firma Sheffield -vgl. weiter vorn- erhältlich ist), 34,7 g 0-,--C-, g-n-Paraffinen (ein Produkt der Firma The Continental Oil Co., New York, N.Y. USA) und 600 ml Leitungswasser besteht. Das Medium wird zunächst 30 Minuten bei 120⁰C sterilisiert. Die Candida-Zellen werden dann der aeroben Inkubation bei Raumtemperatur (27 C) 48 Stunden lang unterworfen, wobei das Medium in Bewegung gehalten wird; um letzteres zu erreichen wird eine Drehschütte!vorrichtung verwendet. Am Ende der Behandlungszeit wird ein 5/^iges Inokulum des Candida-Wachsturns in ein wässriges sterilisiertes Fährmedium überführt, welches pro Liter Medium 5,0 g MaiBW-eichwaeser, 4,0 g Ammonlumsulfat, 15,0 g Caloiumcarbonat und 155 g 0,,-C-, ,--n-Paraffine enthält. Das geimpfte Medium

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wird 48 Stunden bei einer Temperatur von 26⁰C gerührt und dabei mit 29,7 1 Luft pro Stunde pro Liter Flüssigkeit belüftet. Während dieser 48stündigen Einleitungsperiode wird der pH-Wert zur Erzielung einer optimalen Zeilentwicklung bei etwa 5 bis 6 gehalten, indem man weiteres Calciumcarbonat zum Puffern in kleinen Teilmengen je nach Bedarf zusetzt. Diese begrenzte Puffermenge wird in dem Maße verbraucht, wie die Zellmasse Zitronensäure erzeugt, so daß am Ende der 48stündigen Periode der pH-Wert bereits etwas unter 4 liegt und dann rasch abfällt₀

Eine Teilmenge von 5 f° dieses aktiven wachsenden Inokulums wird dann in einen großen Gärbehälter überführt, der folgende Bestandteile pro Liter sterilisiertes Medium enthält: 4,7 g Harnstoff, 0,001 g Thiamin-Hydrochlorid, 180 g G-^-C-^-n-Paraffine und 0,375 g KHpPO. (getrennt sterilisiert)» Das Gärmedium wird 144 Stunden (6 Tage) mit 1 725 Umdrehungen pro Minute gerührt, wobei 2917 1 Luft pro Stunde pro Liter Flüssigkeit durchgeleitet werden; man arbeitet bei einer Temperatur von 26 C. Die Ausbeute an Zitronensäure-Monohydrat bei der Gärung beträgt 225 g pro Liter. Schon am Anfang der 6 Tag-Periode stellt sich der pH-Wert von selbst auf etwa 2 bis 3 ein, worauf keine weitere Einstellung notwendig ist ο Am Ende der 6 Tage-Periode werden die festen Substanzen und das Mycel abfiltriert} die filtrierte Gärbrühe wird unter Vakuum bei 45⁰O auf 4O⁰Be (Baume) eingeengte Die Zitronensäurekristalle, die sich beim Stehen über Nacht gebildet haben, werden abzentrifugiert. Eine zweite und eine dritte Ernte an Zitronensäure können erzielt werden, indem man die Mutterlaugen unter Vakuum auf 45⁰Be bei 75⁰C einengt. Die Ge.samtausbeute an freier Zitronensäure liegt bei etwa 50 Gewichtsprozent« Eine Restmenge an Produkt in den End-Mutterlaugen kann schließlich gewonnen werden, indem man durch Neutralisation mit Natriumhydroxid das Mononatriumsalz bildet und die Lösung unter Vakuum einengt. \..% - ;■<, ,

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Beispiel 2

Das Verfahren von Beispiel 1 wird wiederholt, wobei man die C. .-O^-n-Paraffine in dem Gärmedium durch n-Hexadecan ersetzt; die Ergebnisse sind entsprechend. Nach Abtrennung der freien Zitronensäure wird die verbleibende Mutterlauge wieder mit Natriumhydroxid neutralisiert und unter Vakuum eingeengt; die noch enthaltene Zitronensäure wird so in Form des Trinatriumsalzes gewonnene

Beispiel 3

Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wird wiederholt» jedoch wird in der Gärstufe anstelle von G.. --CLg-n-Paraffinen eine Mischung aus 28,9 g aller folgenden Kohlenwasserstoffe verwendet: n-Decan, n-Nonan, n-Undecan, n-Tridecan, n-Pentadecan, n-Hexadeoan und n-Octadecan. Es werden etwa die gleichen Ergebnisse erzielt, d.h. die Ausbeute an freier Zitronensäure liegt über 50 JO₀ Die zurückbleibende Mutterlauge wird anschließend auf einen pH-Wert von 8-10 eingestellt, indem man eine ausreichende Menge Calciumchlorid zusetzt. Auf diese Weise wird die gesamte noch enthaltene Zitronensäure in Calciumzitrat umgewandelt, welches durch Zentrifugieren abgetrennt wird.

Beispiel 4 ύ

Man stellt ein flüssiges Nährmedium aus 150 g Gerelose (das ist ein Maisweichprodukt, welches von der Firma Corn Products Sales Co., New York, N.Y., UbA vertrieben wird), 15 g Pepton, 5 g Hefeextrakt, 4 g Natriumchlorid und 1 Liter Wasser her. Nach dem Sterilisieren wird das Medium mit Zellen von Candida lipolytica ATCG 20.228 geimpft und anschließend bei Raumtemperatur inkubiert. Die Gärung verläuft unter Rühren unter submersen aeroben Bedingungen in 24 Stunden« Nach dieser Zeit liegt der ph-Wert bei etwa 6,5. Der Gehalt des Mediums (spindown) an Candida-Zeilen wird bestimmt, indem man eine 15 ml-Probe des Mediums bei 2000 g 15 Minuten zentrifugiert. Sobald eine Dichte von 0,5 ml Zellen

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pro 15 ml Wachstumsmedium erreicht ist, wird die 'Zellsuspension als Inokulum für ein entsprechendes Gärmedium verwendet.

Mehrere ml dieses 24 Stunden alten Inokulums werden dann zu einem wässrigen sterilisierten Nährmedium gegeben, welches pro Liter folgende Bestandteile enthält: 4,7 g Harnstoff, 0,01 g Thiamin-Hydrochlorid, 0,1 g MgSO. . 7 H₂O, 180 g C-^-C-^-n-Paraffine (Continental Oil Company) und 0,75 g KH₂PO, (getrennt sterilisiert).

Wk Das Gärmedium wurde 5 Tage bei 1725 Umdrehungen pro Minute gerührt, wobei mit. 29,7 1 luft p'ro Stunde pro Liter Lösung belüftet wurde. Die Gärung wurde bei einer Temperatur von 25 C durchgeführt. Der pH-Wert fiel innerhalb der ersten 2 Tage von etwa 6,5 auf etwa 2,5 und stabilisierte sich dann von selbst auf 2,0 bis 2,5· Die festen Substanzen und das Mycel wurden am Ende der 5 Tage-Periode abfiltriert. Die filtrierte Brühe wurde im Vakuum bei 45⁰C auf 4O⁰Be eingeengt. Nach Zugabe von Impfkristallen aus Zitronensäure kristallisierte beim Stehen über Nacht freie Zitronensäure aus; die Kristalle wurden abzentrifugiert. Eine zweite und eine dritte· Ernte an Zitronensäure konnten gewonnen werden, indem man die Mutterlauge bei 75°C auf 45⁰Be weiter einengte« Die danach vorliegende Mutterlauge wurde

P schließlich mit Natriumhydroxid neutralisiert und unter Vakuum eingeengt, so daß man die restliche darin enthaltene Zitronensäure als Mononatriumsalz gewinnen konnte.

Beispiel 5

Die Arbeitsweise von Beispiel 4 wurde wiederholt, wobei jedoch die G^-C-jg-n-Paraffine durch eine Kohlenwasserstoffmischung, NP-200, ersetzt wurde. Diese Kohlenwasserstoffmischung bestand aus n-Paraffinen mit 9 bis 19 Kohlenstoffatomen und ist von der Firma Union Carbide Company, New York, N.Y., USA erhältliche Nach 138stündiger Gärung konnte freie Zitronensäure in mehr als

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50fo±ger Ausbeute in der beschriebenen Weise abgetrennt werden. Zu der zurückbleibenden Mutterlauge wurde dann Kaliumhydroxid gegeben; aus der unter Vakuum eingeengten Lösung konnte die restliche Zitronensäure als Monokaliumsalz gewonnen werden.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch Vergärung einer Hefe der Gattung Candida, die die Fähigkeit zur Akkumulation von Zitronensäure und zur Assimilierung von Kohlen-» Wasserstoffen besitzt, in einem wässrigen Mhrmedium, welches als Hauptquelle für assimilierbaren Kohlenstoff wenigstens ein normales Paraffin mit etwa 9 bis 19 Kohlenstoffatomen
enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man die Vergärung mit einem Inokulum einleitet, das aus einer aktiv wachsenden
Kultur von Candida lipolytioa ATCC Wr. 20.228 besteht, und den Hauptteil der Vergärung bei einem unter 4 liegenden
pH-Wert durchführte

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert zwischen etwa 2 und 3 liegt₀

3ο Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Vergärung in etwa 4 bis 7 Tagen durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die gebildete Zitronensäure als freie Säure direkt aus der
filtrierten Gärbrühe abgetrennt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Inokulum zuerst hergestellt wird, indem man Candida lipolytica ATCO Nr · 20.228 in einem wässrigen Nährmedium bei einem pH-Wert zwischen etwa 4 und 8 etwa ein bis zwei Tage
züchtet.

Mr Pfizer Inc., New York,
N.Y., V.St.A.

Rechteanwalt

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